Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Прогностическое значение цитогенетических нарушений при хроническом В-клеточном лимфолейкозе

На правах рукописи

ЗАХАРОВА Анна Игоревна

Прогностическое значение цитогенетических нарушений при хроническом В-клеточном лимфолейкозе

14.00.29 - Гематология и переливание крови 03.00.15-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□34532Ю

Москва 2008

003453218

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: академик РАН А.И. Воробьев кандидат медицинских наук Т.Н. Обухова

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор М.А. Волкова Кандидат медицинских наук И.А. Демидова

Ведущее научное учреждение:

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена

Л /У /и $$

Защита состоится «"» ^ 2008 г. в час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.01 при Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д.4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан » . 2008 года

Ученый секретарь диссертационного Совета Кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хронический В-кпеточный лимфолейкоз (В-ХЛЛ) - наиболее распространенный и, следовательно, изученный лейкоз взрослых. В соответствии с современной классификацией гемобластозов ВОЗ 2001 года, В-ХЛЛ - хроническая опухоль, характеризующаяся клональной пролиферацией и накоплением С05+, СР23+ опухолевых лимфоцитов в костном мозге, периферической крови, лимфатических узлах и селезенке.

Заболевание впервые описано около полутора веков назад [\Zirchov РЗ., 1856].] и в настоящее время диагностика опухоли не вызывает затруднений. В то же время, ни одна из современных международных классификаций В-ХЛЛ не выделяет отдельные формы болезни, которые отечественные гематологи начали описывать еще в 50-х годах прошлого века. Каждая из этих форм представляет собой отдельную биологическую сущность в пределах В-ХЛЛ, вероятно имеющую специфические иммунологические, цитогенетические и молекулярно-биологические признаки и особенности ответа на терапию.

Помимо установления диагноза по стандартным критериям, одной из важнейших задач современной диагностики В-ХЛЛ является выявление ряда факторов, которые могут указывать на прогрессирующее или «тлеющее» течение лейкоза в будущем. Это стало особенно актуальным в последнее десятилетие, после появления эффективных препаратов и схем лечения В-ХЛЛ, позволяющих получать полные и молекулярные ремиссии опухоли у большинства больных. Подразделения В-ХЛЛ только на стадии [В1пе1 ^1.1.., е1 а1., 1977; КЛ., е1 а1., 1975] и формы [Воробьев А.И., Бриллиант М.Д., 1983] недостаточно, необходим ряд дополнительных факторов, которые позволяют прогнозировать клиническое течение опухоли в пределах одной формы или стадии болезни.

Стадии болезни - это простая клиническая прогностическая система, позволяющая унифицировать данные и сформировать группы пациентов для участия в клинических исследованиях; они действенны при апробации методов лечения на большом количестве пациентов, однако в дебюте заболевания не отражают индивидуальный прогноз больного.

Стадии не подчеркивают биологических особенностей болезни и неадекватно отражают массу опухоли. В то же время, более новые критерии, на которые сегодня ориентируются гематологи, например мутационный статус генов иммуноглобулинов, теряют свое прогностическое значение при Ш-1\/ стадиях болезни.

Классифицирование В-ХЛЛ по формам, отражающее биологическую сущность опухоли, в ряде случаев сопряжено с некоторыми сложностями: у 10% больных форму установить не удается, поскольку имеются признаки двух форм; форма может включать разновидности, как, например, при селезеночной форме В-ХЛЛ в большинстве случаев имеется массивная спленомегалия и гиперлейкоцитоз, но у небольшой части пациентов отмечают умеренную спленомегалию, невысокий лейкоцитоз, глубокий гуморальный иммунодефицит со снижением нескольких классов иммуноглобулинов и часто аутоиммунные цитопении. Доброкачественную форму В-ХЛЛ нелегко отличить от медленно прогрессирующей в первые годы болезни.

Сегодня известно более 20 признаков, имеющих влияние на время до необходимости начала терапии, результаты лечения и продолжительность жизни больных В-ХЛЛ. Эти факторы частично взаимозависимы, но не дублируют друг друга, поскольку отражают разные особенности опухолевых клеток - аберрантный иммунофенотип, активацию клеток по экспрессии С038, цитогентические нарушения, степень инфильтрации костного мозга, время удвоения количества лимфоцитов, наличие или отсутствие мутаций генов вариабельного региона иммуноглобулинов и т.д. Показания к началу лечения остаются клиническими, поскольку до настоящего времени нет доказательств, что раннее начало терапии у пациента с рядом факторов плохого прогноза приводит к увеличению продолжительности жизни.

Использование комбинации ряда прогностических факторов позволяет выделить группы пациентов в пределах каждой из форм болезни, у которых ожидается быстрая прогрессия лейкоза. Таким больным необходимо чаще проводить контрольные обследования для своевременного начала лечения.

Одними из важнейших факторов прогноза клинического течения В-ХПЛ являются цитогенетические нарушения. К настоящему времени выявлены наиболее часто встречающиеся при данном заболевании аберрации [йоЬпег Н., е1. а1., 2000].

Выяснено неблагоприятное прогностическое значение делеций 1^23(АТМ) и 17р13(ТР53): у больных с этими аберрациями, помимо прогрессирующего течения лейкоза, в большей или меньшей степени имеется резистентность к ключевым для В-ХПЛ цитостатикам - аналогам пуринов и алкилирующим препаратам. Отсутствие цитогенетических нарушений и делеция 13д14 в качестве единственного нарушения кариотипа считаются благоприятными прогностическими факторами при В-ХЛЛ.

В то же время недостаточно изучены комплексные нарушения кариотипа как отдельная цитогенетическая группа, имеющая определенную прогностическую

ценность. Остается спорным вопрос о характере прогноза заболевания у пациентов с трисомией хромосомы 12.

Кроме того, нет данных, касающихся частоты встречаемости тех или иных цитогенетических нарушений при различных клинических формах В-ХЛЛ, что, с учетом других прогностических факторов данного заболевания, позволило бы охарактеризовать отдельные клинико-генетические формы хронического В-клеточного лимфолейкоза.

Остается актуальным изучение морфологических и иммунологических особенностей больных с разными цитогенетическими нарушениями, а также вопрос связи того или иного цитогенетического нарушения с возможностью получения и продолжительностью ремиссии.

Цель исследования:

Определить прогностическое значение цитогенетических нарушений при хроническом В-клеточном лимфолейкозе.

Задачи исследования:

1. Определить спектр и частоту встречаемости цитогенетических аберраций у больных В-ХЛЛ.

2. Изучить цитогенетические особенности клинических форм В-ХЛЛ.

3. Провести корреляцию цитогенетических изменений с другими факторами прогноза при В-ХЛЛ.

4. Провести цитогенетический мониторинг эффективности терапии при В-ХЛЛ.

5. Оценить время до необходимости начала терапии и общую выживаемость

больных В-ХЛЛ в зависимости от выявленных хромосомных аномалий. Научная новизна

В работе проанализирована частота встречаемости цитогенетических нарушений при различных клинических формах В-ХЛЛ.

При анализе общей выживаемости больных с разными цитогенетическими нарушениями в условиях терапии флюдарабин содержащими курсами выделены три прогностические цитогенетические группы: с благоприятным, промежуточным и неблагоприятным прогнозом. Делеция '\'\ц23 отнесена к факторам «промежуточного» прогноза В-ХЛЛ.

Дана цитогенетическая характеристика опухолевой формы хронического В-клеточного лимфолейкоза.

Определено неблагоприятное прогностическое значение комплексных нарушений кариотипа как отдельной цитогенетической группы.

Научно-практическая ценность

В работе определено прогностическое значение каждого из наиболее часто встречаемых хромосомных нарушений при В-ХЛЛ, а также комплексных нарушений кариотипа. Это позволило выявить «группы риска» больных В-ХЛЛ, нуждающиеся в более частом контрольном обследовании.

Выявлена взаимосвязь отдельных цитогенетических нарушений с клиническими формами В-ХЛЛ. Дана цитогенетическая характеристика опухолевой и доброкачественной форм В-ХЛЛ.

Кроме того, изучена связь каждой из наиболее частых цитогенетических аберраций при В-ХЛЛ, а также комплексных нарушений кариотипа как отдельной цитогенетической группы с другими факторами прогноза данного заболевания.

Изучена общая выживаемость больных с каждой из наиболее часто встречаемых при В-ХЛЛ аберраций и с комплексными нарушениями кариотипа.'

Показана возможность цитогенетической оценки результатов терапии при В-ХЛЛ. Установлено, что при терапии флюдарабин содержащими курсами достижение цитогенетической ремиссии возможно у больных с делецией 13я14, трисомией хромосомы 12, и делецией 11д23.

Положения, выносимые на защиту.

1. Цитогенетические аберрации у больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом - важные факторы прогноза данного заболевания.

2. Отсутствие выявленных хромосомных аберраций и делеция 13я14 в качестве единственного нарушения кариотипа - благоприятные цитогенетические факторы прогноза. Делеция 1\'\ц23 и трисомия хромосомы 12 - факторы «промежуточного» прогноза при В-ХЛЛ. Делеция 17р13 и комплексные нарушения кариотипа - это неблагоприятные цитогенетические прогностические факторы.

3. Опухолевая форма В-ХЛЛ характеризуется наличием в большинстве случаев делеции

11д23, частым присутствием трисомии хромосомы 12 и отсутствием самой частой для В-ХЛЛ цитогенетической аберрации - делеции с1е113я14.

Для доброкачественной формы В-ХЛЛ характерно отсутствие цитогенетических нарушений.

4. У больных В-ХЛЛ с с1е113д14, трисомией хромосомы 12 и с!е111д23 возможно достижение цитогенетической ремиссии при терапии флюдарабин содержащими курсами.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезисных сообщения. Апробация диссертации.

Результаты работы были представлены на заседании Проблемной комиссии ГУ ГНЦ РАМН (19.06.2008). Основные положения работы были доложены на Международной Гематологической Школе (2005, Москва), заседании Гематологического Научного Общества (2006, Москва) и на XI конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации (2006, Амстердам).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 141 страницЕ, состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 163 ссылки. Диссертация выполнена в Кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (руководитель доктор медицинских наук, профессор Домрачева Елена Васильевна) при участии сотрудников других подразделений ГНЦ РАМН (директор академик РАН и РАМН Андрей Иванович Воробьев).

Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации, являются: к.м.н. Т.Н. Обухова, к.м.н. Ю.Ю. Лорие, к.м.н. Е.А. Никитин, д.м.н., проф. Домрачева., академик РАН Воробьев А.И., к.м.н. P.C. Самойлова, Б.В., Зингерман, Е.В., Водинская Л.А., Алимова Г.А.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных.

В работу включено 135 больных В-ХЛЛ, наблюдавшихся в клиниках ГНЦ РАМН с декабря 2002 по декабрь 2005 года, которым до начала терапии проводилось цитогенетическое исследование в кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (заведующая - д.м.н., проф. Домрачева Е.В.): 90 мужчин и 45 женщин (соотношение мужчины : женщины составляет 2) в возрасте от 23 до 84 лет (средний возраст 58 лет, медиана возраста 64 года); сроки наблюдения за этими больными варьировали от 6 месяцев до 28 лет (средняя продолжительность наблюдения 72 месяца, медиана времени наблюдения 56 месяцев).

Диагноз устанавливался на основании абсолютного лимфоцитоза в периферической крови и характерного иммунофенотипа опухолевых клеток - CD5+,

CD23+, CD19+, CD20+. Стадии В-ХЛЛ были определены по Rai, формы - по А. И. Воробьеву и М. Д. Бриллиант. Тип опухолевого роста устанавливался на основании гистологического исследования костного мозга и биопсированных лимфатических узлов. Особенности морфологии опухолевых клеток выявлялись на основании цитологического исследования периферической крови или других пораженных опухолью тканей. Распространенность процесса оценивалась при клиническом обследовании, а затем уточнялась с помощью ультразвукового, рентгенологического исследований и компьтерной томографии. Моноклональная секреция иммуноглобулинов, секреция р2-микроглобулина выявлялась с помощью иммунохимического анализа. Уровень экспрессии CD38 выявлялся при иммунофенотипировании. Кроме того, проводилось определение мутационного статуса генов вариабельного региона.

Распределение исследуемых больных по полу, стадиям и формам заболевания приведено в табл. 1. Для каждого пациента фиксировались дата диагностики, дата начала терапии, а также дата последнего наблюдения или смерти. Таблица 1. Характеристики больных В-ХЛЛ, включенных в исследование

Пациенты Все Цобр. ф. п=7 Прог. ф. п=107 Опух. ф. п=11 Селез.ф. п= 8 Кост. ф. п=1 Абд. ф. п=1

с; о с м 90 2 70 10 6 1 1

ж 45 5 37 1 2 0 0

Rai стадия 0 7 7 0 0 0 0 0

I 29 0 29 0 0 0 0

II 83 0 68 7 7 0 1

II-IV 16 0 10 4 1 1 0

Материал исследования.

В 109 случаях исследовали клетки крови, в 21- костного мозга, в 12-лимфатического узла и в 4 - селезенки. У 5 больных исследовали клетки нескольких тканей.

Методы исследования.

Культивирование. Клеточный материал (кровь, взвесь клеток костного мозга или другой исследуемой ткани) из расчета 1 - 2 млн. ядросодержащих клеток на 1

мл среды для культивирования добавляли в культуральную среду, содержащую 2 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 400 мкп L-глютамина, стимуляторы деления В-лимфоцитов - 25 нг ТРА (SIGMA, США) и 5 нг LPS E.coli (SIGMA, США), и питательную среду RPMI с антибиотиками (стрептомицин и пенициллин) в таком количестве, чтобы общий объем среды для культивирования был 10 мл. Флакон со средой для культивирования помещали в СОг-инкубатор (5% СОг) при температуре 37°С на 72 часа; последние 17 часов инкубировали с добавлением колцемида 0.004 мкг/мл среды. Обработку гипотоническим раствором, фиксацию клеток и приготовление препаратов хромосом проводили по стандартной методике.

Стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ). Осуществляли G-дифференциальную окраску хромосом по методике Seabright, 1971 г., с модификациями. Рабочий раствор трипсина готовили путем соединения 5 мл 0.25% трипсина (SIGMA, США) и 45 мл 0.9% NaCI. Препарат помещали в сосуд с раствором трипсина на 3-5 сек., 2 раза промывали в 0,9% растворе NaCI, затем быстро наносили краску Wright (Merck, Германия), приготовленную из 0.3 г сухой краски и 200 мл метанола, смешанную с раствором буфера рН=6.8 в соотношении 1:4, на 1-1,5 мин.

Хромосомный анализ проводили под иммерсионным объективом (увеличение 12,5x100). По возможности анализировали 20 метафаз. Кариотип описывали в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой ISCN, 1985.

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). Если исследуемым материалом являлась кровь, то первым этапом проводилось выделение мононукпеаров периферической крови. Разделение крови на слои проводилось на градиенте плотности 1.077 раствора Lympho Separation Medium (LSM, "ICN Biomedicals"). После наслоения 5 мл крови на 3 мл раствора LSM в каждой из 4 пробирок их центрифугировали в течение 30 минут при 1500 об/мин, собирали мононукпеары и трижды отмывали их в питательной среде RPMI 1640 (SIGMA, США): добавляли 10 мл среды, центрифугировали пробирки в течение 10 минут при 1000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Полученный материал подвергали гипотонической обработке и фиксации, переливали в эппендорф и в дальнейшем использовали для проведения FISH-исследования.

В работе использовали многоцветный зонд, разведенный гибридизационным буфером LSI р53 / LSI ATM and LSI D13S319 / LSI 13q34 / CEP 12 Multi-color Probe Sets ("Vysis", США), который включает в себя пробы к локусам, в которых наиболее часто происходят аберрации при В-ХЛЛ: LSI D13S319 -проба для детекции региона

13q14.3, -130 kb, окрашена оранжевым флюорохромом; LSI 13q34 - проба к субтеломерному региону хромосомы 13, ~550 kb, окрашена флюорохромом голубого цвета; СЕР12 - проба к альфа-сателлитному, центромерному участку хромосомы 12(12p11.1-q11), окрашена зеленым флюорохромом; LSI р53 (17р13.1) - проба, покрывающая локус гена р53, -145 kb, окрашена флюорохромом оранжевого цвета; LSI ATM - проба для детекции 11q23.3 региона, в котором расположен ген Ataxia telangiectasia mutated (ATM), ~184 kb, окрашена флюорохромом зеленого цвета. Этот зонд разделен на 2 набора проб: в первый входят пробы LSI D13S319, LSI 13q34, СЕР12, а во второй - LSI р53 и LSI ATM.

Материал, подготовленный для проведения FISH-исследования, раскапывали на предметные стекла. Затем на каждое предметное стекло наносили по 1,5 мкл каждого из 2 вышеуказанных наборов проб. Место нанесения зонда закрывали круглым покровным стеклом с диаметром 10 мм, которое по краю заклеивали резиновым клеем. Подготовленные таким образом стекла помещали в специальный прибор для денатурации и гибридизации - ThermoBrite™ Slide Hybridization / Denaturation System (Abbott Molecular). Время денатурации составляло 2 минуты, температура денатурации 74°С; время гибридизации составляло 16-24 часа, температура гибридизации 37°С. Далее с препаратов удаляли покровные стекла и клей, и помещали их в находящийся в водяной бане при 73°С сосуд Коплина с раствором 0.4SSC / 0.3%NP-40 на 2 минуты, а затем в находящийся при комнатной температуре сосуд Коплина с раствором 2SSC / 0.1%NP-40 на 1 мин.

Стекла высушивали в темноте, затем на них наносили 8 мкл красителя DAPI II (Abbot Molecular и накрывали квадратными покровными стеклами размером 22x22 мм.

В ядре нормальной клетки при использовании набора проб многоцветного зонда клокусам 13q14.3, 13q34 и 12p11-q11 определяются 2 оранжевых, 2 зеленых и 2 голубых сигнала. При интерстициальной делеции локуса 13q14.3 визуализируются 1 оранжевый, 2 голубых и 2 зеленых сигнала (моноаллельная делеция) или 2 голубых и 2 зеленых сигнала при отсутствии оранжевых (биаллельная делеция). Моносомия хромосомы 13 или 13q- визуализируется как 1 оранжевый, 1 голубой и 2 зеленых сигнала. Таким образом, проба к теломерному локусу 13q34 позвопяет отличить интерстициальную делецию 13q14.3 от моносомии 13 хромосомы (или делеции ее q-плеча). При трисомии 12 хромосомы визуализируются 2 оранжевых, 2 голубых и 3 зеленых сигнала.

При использовании набора проб многоцветного зонда к локусам 11q22.3 и 17р13.1 в ядре нормальной клетки визуализируются 2 оранжевых и 2 зеленых сигнала. При делеции в ATM - локусе определяется 1 зеленый и два оранжевых сигнала, а при делеции локуса р53 -1 оранжевый и два зеленых сигнала.

Визуализацию сигналов проводили под флюоресцентным микроскопом Zeiss-Axioscope (ФРГ) с использованием тройного фильтра Rod/FITC/DAPI, а для пробы LSI 13q34 - фильтра Aqua. В каждом случае анализировали 200 интерфазных ядер с четкими сигналами.

Определение границ нормы для каждой из проб многоцветного зонда.

Анализировали 1000 ядер мононуклеаров периферической крови от каждого из 5 здоровых доноров. Граница нормальных значений количества «позитивных» ядер для каждой пробы многоцветного зонда LSI® р53 / LSI ATM and LSI D13S319 / LSI 13q34 / CEP® 12 Multi-color Probe Sets ("Vysis", США) определялась по формуле р + 35, где р - среднее по совокупности, равное (гн+пг+пз+гц+пэуб (гн, п2... и т.д. -количество «позитивных» ядер у первого, второго ... и т.д. доноров; 5 - количество доноров), а 5 - стандартное отклонение, равное:

V [(щ- м)2+(п2 - р)2 +(пз- м)2 + (п4 - р)2 +(п5- р)2]/(5-1).

Границы нормы для количества «позитивных» ядер: для трисомии хромосомы 12 < 3%, для del 13q14 < 9%, для del 13q34 < 2%, для del 11q23 < 4%, для del 17p13 < 5%.

Цитогенетическая оценка эффективности терапии. Всем больным В-ХЛЛ, у которых проводилась цитогенетическая оценка эффективности терапии, лечение проводилось по протоколу FMC-R: ритуксимаб 375 мг/м21 день, флударабин 25 мг/м2 со 2 по 4 сутки, митоксантрон 6 мг/м2 2 день, циклофосфамид 200 мг/м2 со 2 по 4 сутки. Следующий курс начинался на 28 сутки; проводилось 6 курсов.

Повторные цитогенетические исследования проводились 7 больным В-ХЛЛ, находящимся в клинической ремиссии. В каждом случае анализировали 1000 интерфазных ядер с четкими сигналами. Цитогенетическая ремиссия констатировалась, если количество «позитивных» ядер оказывалось не выше предельно допустимых нормальных значений, определенных нами для данной аберрации.

Цитогенетическая оценка прогрессии В-ХЛЛ. В случае прогрессии заболевания больным проводились повторные исследования с целью выявления изменений цитогенетической картины: появления новых, не обнаруживавшихся

ранее, цитогенетических нарушений, а также увеличения количества интерфазных ядер с первично выявленными аберрациями. Такие исследования были проведены 9 больным. В каждом случае анализировали 200 интерфазных ядер с четкими сигналами.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью компьютерной программы BIOSTAT [Гланц С., 2000 г.]. Зависимости между цитогенетическими нарушениями и другими прогностическими факторами B-XJ1J1 были подтверждены методом оценки х2 с поправкой Йейтса, а в случаях малого числа наблюдений -методом точного критерия Фишера. Кривые общей выживаемости и кривые времени до начала терапии строились по методу Каплан-Мейера. Для подтверждения статистической достоверности этих данных использовался логранговый критерий с поправкой Йейтса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты цитогенетических исследований.

Аберрации были найдены у 75 (55,6%) больных: у 53 (39,3%) из них была найдена 1 аберрация, у 14 (10,4%) - две и у 8 (5,9%) - три аберрации и более (комплексные нарушения кариотипа).

При стандартном цитогенетическом исследовании делящиеся клетки были обнаружены у 72 (53%) больных. Нормальный кариотип был выявлен у 47 (35%) пациентов, но при FISH у 25 (53%) из них были обнаружены цитогенетические аберрации. Эти ложноотрицательные результаты при СЦИ объясняются тем, что анализируемый нами нормальный кариотип может являться результатом деления остаточной популяции неопухолевых Т-лимфоцитов.

В-ХЛЛ характеризуется крайне низкой митотической активностью опухолевых клеток; применение В-кпеточных митогенов лишь немного увеличивает количество делящихся клеток [Stilgenbauer S.,et.al., 1996]. В нашей работе стандартное цитогенетическое исследование выявило del13q14 в 2 случаях (рис. 6а), del11q23 - в 2 случаях (рис. 66), трисомию 12 хромосомы - в 6 случаях (рис. 6в) и de! 17р13 - в 1 случае (рис. 6г).

\ £ щ щ Щ

. М_ * - *** За.

13 11 12 17

а б в г

Рисунок 1. Наиболее распространенные хромосомные нарушения у больных В-ХЛЛ при СЦИ.

Как правило, при В-ХЛЛ метафазные пластинки плохого качества, вследствие чего идентификация аберраций затруднена. Особенно это относится к мелким аберрациям, таким как del13q14, del17p13 и del11q23, именно поэтому частота определения трисомии 12 с помощью FISH превышает частоту определения этой аберрации с помощью СЦИ всего в 2,4 раза, в то время как частота выявления del13q 14, del17p13 и del11q23 методом FISH в 8 и более раз превышает частоту выявления этих аберраций при СЦИ.

Таким образом, чувствительность FISH несоизмеримо выше, чем СЦИ.

Однако только СЦИ позволяет в случае наличия аберрантных кариотипов, определить весь спектр цитогенетических нарушений, что наблюдалось в нашем исследовании у 8 (6%) больных (при FISH они не были выявлены вследствие отсутствия соответствующих зондов). Чаще всего эти изменения выявлялись в составе комплексного кариотипа.

С помощью FISH были выявлены следующие хромосомные аберрации.

Делеция del 13q14 обнаружена в 34 (25%) случаях, из них в 1 случае -биаллельная, сочетание моно- и биаллельной делеций - в 2 случаях; отсутствие q-плеча хромосомы 13 - в 3 (2%) случаях. В качестве единственного нарушения кариотипа моноаллельная делеция del 13q 14 была выявлена в 22 случаях, в сочетании с другими аберрациями - у 12 пациентов.

Трисомия хромосомы 12 выявлена в 17 (13%) случаях, из них в качестве единственного изменения кариотипа - в 9 случаях, в сочетании с другими хромосомными нарушениями - в 8 случаях.

Делеция del 11 q23 обнаружена у 26 (19%) пациентов, из них у 14 больных - в качестве единственной аберрации и у 12 пациентов - в сочетании с другими цитогенетическими нарушениями.

Делеция del 17р13 была выявлена у 9 (7%) больных: в качестве единственного цитогенетического нарушения - у 5 больных, в сочетании с другими нарушениями кариотипа - в 4 случаях.

У 5 больных мы исследовали клетки различных тканей (крови, костного мозга, лимфатических узлов, селезенки); значимые различия в количестве интерфазных ядер с определенным цитогенетическим нарушением в клетках различных тканей отсутствовали.

Самое частое сочетание цитогенетических нарушений при В-ХЛЛ - это del13q14+del11q23. В нашей работе было 6 больных с таким сочетанием аберраций, все - с прогрессирующей формой В-ХЛЛ. Причем количество ядер с делецией 13q14 было всегда больше, чем количество ядер с делецией 11q23 (разница составляла от 4 до 148 «позитивных» ядер, в среднем 35).

Связь цитогенетических нарушений с другими факторами прогноза.

Больные В-ХЛЛ по результатам проведенных СЦИ и FISH были разделены на 7 групп с разными цитогенетическими нарушениями: с отсутствием аберраций, с единственным нарушением кариотипа - делецией 13q14, с делецией 13q14 в сочетании с другим цитогенетическим нарушением, с делецией 11q23, с трисомией хромосомы 12, с делецией 17р13 и с комплексными изменениями кариотипа. Традиционно больных, у которых делеция 13q14 - единственное нарушение кариотипа, рассматривают как отдельную прогностическую группу, поскольку при сочетании этой делеции с другими аберрациями она перестает быть благоприятным фактором прогноза. Мы изучали распределение больных этих цитогенетических групп по клиническим формам и стадиям, а также их связь с различными прогностическими факторами для В-ХЛЛ.

При доброкачественной форме В-ХЛЛ, в отличие от других форм, цитогенетических нарушений выявлено не было. При опухолевой форме достоверно чаще, чем при других, были выявлены del 11q23 (р<0.0001) и трисомия 12 (р=0.02). При опухолевой форме в нашем исследовании не было выявлено ни одного случая делеции del13q14 и делеции 17р13. При селезеночной форме не было выявлено трисомии 12 и комплексных нарушений кариотипа (рис. 2).

У больных со стадиями II-IV В-ХЛЛ значительно чаще выявляются изменения кариотипа, чем у больных с ранними (0-I) стадиями (р=0.009). Ни у одного больного В-ХЛЛ со стадией 0 (у всех была определена доброкачественная форма) не были выявлены изменения кариотипа. Del 11q23 более характерна для поздних стадий

(р=0.01). Ни у одного из больных с ранними стадиями В-ХЛЛ не были обнаружены с1е117р13 и комплексные нарушения кариотипа. Ни у одного из больных с Ш-1\/ стадиями не было выявлено с!е11 Зц14 в качестве единственного нарушения кариотипа (рис.2).

100% 80% 60% 40% 20%

И комплексный

кариотип mdell7pl3

О трис 12

т delllq23

eadell3ql4 + l

др. аб. □ dell3ql4

Рисунок 3. Распределение больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями по времени удвоения числа лимфоцитов.

100°. ь

804-0 60% 40% 200/Ь O'1'o

добрскач. селезён. гтюгресс^. опухолевая

ООО h

ВОЧ'о

604 о

404-0

204 о

□ ка-гтега-tn гар-ютт

о del 17р 13

□ TT>i 12

■del llq23

и dal I3q 14 J-1 др. аб.

□ del 13q 14

□ отсутствие аберраций

I 11 III-IV

Рисунок 2. Распределение больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями по клиническим формам и стадиям по Rai.

У больных с отсутствием цитогенетических нарушений или с единственной делецией del13q14 время удвоения числа лимфоцитов достоверно чаще превышает 12 месяцев (р<0.05). Со статистической достоверностью для пациентов с del11q23, del17p13 и комплексными нарушениями кариотипа характерно время удвоения количества лимфоцитов менее 12 месяцев (р<0.01) (рис. 3).

Для пациентов, у которых цитогенетические нарушения не были выявлены, реже определялась диффузная инфильтрация костного мозга по сравнению с теми больными, у которых мы обнаружили цитогенетические аберрации (р<0.025) (рис. 4).

100% во% 60% 40% 20% 0%

недифф.

дифф.

вкшапеко-ьи

карготил исй17р13

□ три; 12

■ с!е111я23

асШЭдИ-И до, аб.

□ сН 13я14

ВОТСуТСТВИЗ

аберрэцж

Рисунок 4. Распределение больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями по типу инфильтрации костного мозга, п=97.

Пролимфоциты в периферической крови достоверно чаще встречаются у больных с трисомией хромосомы 12 и у больных с комплексными нарушениями кариотипа (р<0.05). Более 10% пролимфоцитов в периферической крови было выявлено в нашем исследовании у 7 больных, причем у 4 из них не было обнаружено цитогенетических аберраций, у одного были диагностированы комплексные нарушения кариотипа, и у 2 - трисомия хромосомы 12 (рис. 5).

100% 90% 60% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 1(1% 0%

/I мн Щш ЙЁ

' ,-¡¡Д

/г

Езкемтгекп-ьи

кариэтт-п о ей 17р13

□ три: 12

нсШ1я23

гасИ13ч14 + 1 лр. аб.

□ ей 13ч 14

в отсутствие аберрэцж

нетпрлф естьпряф

Рисунок 5. Наличие пролимфоцитов в периферической крови у больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями.

Уровень секреции (32-микроглобулина был определен у 52 из 135 больных.

Не было выявлено ни одного больного с единственной делецией с!еИЗд14, у которого уровень секреции (32-М был выше 4мг/мл. С другой стороны, все больные с делецией 17р13 или комплексным кариотипом, у которых был измерен данный показатель, оказались с завышенным уровнем секреции р2-микроглобулина (рис. 6).

60% 4041) 20% 0%

<4 мг/мп

>4 мг/мл

иютгтега-ьи

каризтап и del 17р13

еприс 12

■ del llq23

a del I3ql4 + 1

др. аб, □ dell3ql4

в отсутствие аберращ<й

Рисунок 6. Распределение больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями в зависимости от уровня секреция (32-микроглобулина.

Уровень экспрессии CD38 определялся у всех пациентов. Экспрессия CD38 менее, чем на 30% клеток была характерна для больных с единственной аберрацией - del 13q14 (р<0.05), а экспрессия CD38 не менее, чем на 30% клеток-для больных с делецией 11q23 (р<0.05) и комплексными нарушениями кариотипа (р<0.05). Среди пациентов с делецией 17р13, так же как и с трисомией хромосомы 12, оказалось примерно одинаковое количество тех, у кого низкий уровень экспрессии CD38 и тех, у кого этот уровень высокий (рис.7).

вгемтЕш-ьй гариэпл

ndsl 17р13

□три: 12

■delllq23

actell3ql4 + 1

др. аб. Sdel 13ql4

ВОТСуГСГТВИЭ

аберраций

Рисунок 7. Распределение больных В-ХЛЛ с разными цитогенетическими нарушениями в зависимости от уровня экспрессии СР38 и мутационного статуса 1д\/Н.

Мутационный статус \/н был изучен у 61 из 135 больных. У больных с мутированными генами вариабельного региона иммуноглобулинов (< 98% гомологии)

юоад

ВО°/Ь 60% 40ВД) 20<Vo 0%

IgVH£9B4m IgVH>984tl

чаще не выявляются хромосомные аберрации (р<0.05). Ни у одного больного с комплексными нарушениями кариотипа не было выявлено мутаций генов Vh. У всех больных с единственной делецией del13q14 также был немутированный вариант генов Vh. Среди больных с del11q23, del17p13, трисомией хромосомы 12 оказалось меньше пациентов с мутированным вариантом генов вариабельного региона иммуноглобулинов (рис.7).

Общая выживаемость больных В-ХЛЛ с разными аберрациями.

Для оценки выживаемости пациентов с разными цитогенетическими нарушениями мы выделили 6 групп больных В-ХЛЛ: без выявленных цитогенетических нарушений; с del 13q14 - единственным нарушением кариотипа; с трисомией хромосомы 12; с del 11q23; с del 17р13; с комплексными нарушениями кариотипа. Судьбу 12 пациентов (9%) проследить не удалось, поэтому выживаемость больных В-ХЛЛ мы анализировали у 123 пациентов (рис. 8).

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

о—

1 АЛ АЛА—А 4 J # » » •• » »

1 «М-* .. .

■ ♦......>■♦••"♦•—1 *

I

1-

месяцы

• отсутствие аберраций

del 13q 14 ■ единств.

трисомия 12

delllq23 -dell7pl3

■ компл. кариотип

Рисунок 8. Кривые выживаемости 6 цитогенетических групп больных.

Медианы выживаемости у пациентов с del17p13 и комплексным кариотипом составили 36 и 26 месяцев, соответственно. У пациентов этих двух цитогенетических групп значительно более низкая выживаемость по сравнению с общей выживаемостью всех остальных больных (р<0.0001). В группах без выявленных цитогенетических аберраций, с единственной del 13q14, с трисомией хромосомы 12 и del 11q23 живы более половины больных, поэтому медианы выживаемости определить невозможно.

Трёхлетняя выживаемость в группе без выявленных цитогенетических аберраций составила 83%, в группе с единственной del 13q14 - 78%, с del 11q23 -67%, с трисомией хромосомы 12 - 61%, с делецией 17р13 - 17% и с комплексным кариотипом - 38% (рис.8). В чем причина значительно более низкой выживаемости больных с del11q23 в исследовании S. Stilgenbauer и Н. Dohner по сравнению с нашими данными? По данным S. Stilgenbauer и Н. Dohner, выживаемость больных с del11q23 старше 55 лет достоверно лучше этого показателя у больных с del11q23 моложе 55 лет. Этот факт подтверждается и результатами нашего исследования -разница в выживаемости вышеуказанных групп пациентов спустя 5,5 лет от начала исследования оказалась достоверной, р<0,02. Возможно, среди больных, включенных в исследование S. Stilgenbauer и Н. Dohner, оказалось больше пациентов моложе 55 лет, что и привело к гораздо более низкой выживаемости больных с этой аберрацией по сравнению с группой наблюдаемых нами пациентов, где было больше пациентов старше 55 лет с делецией 11q23 (16 из 26).

Мы объединили больных в цитогенетические группы следующим образом: в I группу были включены больные без выявленных цитогенетических нарушений и с единственной del13q14, во II группу - больные cdel11q23 и трисомией хромосомы 12, в III группу - больные с del 17р13 и комплексным кариотипом. Общая выживаемость больных этих трех групп достоверно различается между собой (р<0.05) (рис. 9).

Рисунок 9. Кривые выживаемости 3 объединенных цитогенетических групп больных.

Время до начала терапии больных В-ХЛЛ с разными аберрациями.

Лечение потребовалось меньше, чем половине больных, у которых не было найдено

цитогенетических нарушений или определена единственная делеция 13я14 (рис. 10). Больные этих цитогенетических групп значительно реже всех остальных пациентов нуждались в химиотерапевтическом лечении (р<0.001). Столь же достоверным оказался тот факт, что при сочетании делеции 13я14 с другой аберрацией больному будет необходимо проводить химиотерапию (р<0.001).

Всем больным с делецией 11 д23 была необходима химиотерапия. В течение первых 13 месяцев заболевания химиотерапия потребовалась 50% больных с делецией ~\~\с\23. Всем пациентам с делецией 17р13 лечение требовалось в первые полгода с момента выявления аберрации (р<0.001), половине таких больных начато лечение в течение первого месяца после выявления аберрации (рис.10).

У 3 пациентов, включенных в наше исследование, мы обнаружили появление делеции 17р13 при прогрессии В-ХЛЛ в части интерфазных ядер. Обнаружение новой аберрации в части интерфазных ядер говорит о появлении субклона клеток, кариотип которых отличается от кариотипа остальных клеток. Делеция с!е117р13 сама по себе является крайне неблагоприятным цитогенетическим фактором прогноза, поэтому появление данной аберрации у больного, у которого она не обнаруживалась ранее, резко ухудшает прогноз заболевания.

Поскольку делеция 17р13 появляется при прогрессии заболевания, являясь поздним цитогенетически нарушением, и всегда означает качественное изменение болезни, время до необходимости начинать терапию у больных с данной аберрацией мы считали с момента выявления делеции 17р13. А от момента установления

диагноза В-ХЛЛ половине больных с делецией 17р13 начато лечение в течение 19 месяцев.

Повторные цитогенетические исследования.

Кроме вышеописанных 3 случаев обнаружения делеции 17р13, при прогрессии В-ХЛЛ у 8 пациентов было выявлено лишь увеличение количества «позитивных» интерфазных ядер с тем или иным ранее обнаруженным нарушением. Такие изменения свидетельствуют, по всей видимости, просто об увеличении опухолевой массы. У 5 больных не было выявлено никаких хромосомных аберраций как при первичном цитогенетическом исследовании, так и при повторном, при прогрессии опухоли.

Повторные цитогенетические исследования больных, находящихся в клинической ремиссии после проведения химиотерапии по протоколу РМС-К зафиксировали значительное снижение количества интерфазных ядер с аберрациями у 4 пациентов. Кроме того, у 5 больных была достигнута цитогенетическая ремиссия, т.е. при Р15Н-исследовании пациента в ремиссии, при анализе 1000 интерфазных ядер, количество ядер с аберрацией не превышало границ контрольных значений. Апробированный нами метод цитогенетической оценки эффективности терапии В-ХЛЛ обладает высокой чувствительностью - 10"3 - т.е. позволяет выявить 1 «позитивное» ядро из 1000 обследованных.

Ремиссия, в том числе и цитогенетическая, после проведения курсов химиотерапии по протоколу ЯМС-Р может быть достигнута у больных В-ХЛЛ с делецией 13д14, трисомией хромосомы 12 и даже делецией 11д23. Длительность цитогенетической ремиссии колебалась в широких пределах, от 3 до 54 месяцев. Ни у одного больного с с!е117р13 или комплексными нарушениями кариотипа не было отмечено клинической ремиссии после проведения курсов цитостатической терапии по протоколу РМС-Р?.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические факторы прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза уже на ранних стадиях развития опухоли позволяют выявить больных, относящихся к группе риска. Раннее выявление таких больных стало актуальным, поскольку появились методы лечения, позволяющие получать полные продолжительные ремиссии у большинства пациентов. К молекулярно-генетическим прогностическим факторам В-ХЛЛ относятся мутационный статус генов

вариабельного региона иммуноглобулинов и цитогенетические нарушения, которые и стали предметом исследования.

Нами выделено 3 группы цитогенетических нарушений, имеющих разное прогностическое значение: к благоприятным факторам прогноза относятся отсутствие хромосомных нарушений и делеция 13д14 в качестве единственного нарушения кариотипа, к факторам «промежуточного» прогноза - трисомия хромосомы 12 и делеция 11д23, к неблагоприятным прогностическим факторам -делеция 17р13 и комплексные нарушения кариотипа.

Благоприятный прогноз у больных с нормальным кариотипом или с единственной делецией 13д14 ранее уже был установлен; наши результаты его подтверждают. Однако, в отличие от проводившихся исследований, по нашим данным прогноз у больных с делецией 13я14 в качестве единственного нарушения кариотипа хуже, чем у пациентов без цитогенетических нарушений.

Результаты нашего исследования объясняют, почему большинство современных исследователей относят трисомию хромосомы 12 к факторам «промежуточного» прогноза. Данная аберрация с одинаковой вероятностью встречается у пациентов с благоприятными и неблагоприятными факторами прогноза, т.е. среди больных с данным цитогенетическим нарушением есть и те, у которых заболевание отличается спокойным, медленно прогрессирующим течением, и пациенты с агрессивным В-ХЛЛ. Возможно, именно поэтому у данной группы больных «промежуточные» показатели общей выживаемости.

С делецией "\1q23, которая, как показали результаты нашего исследования общей выживаемости больных, также может быть отнесена к факторам «промежуточного» прогноза, ситуация иная. Безусловно, делеция 11д23 - фактор риска при В-ХЛЛ, что подтверждается корреляцией данной аберрации с большинством неблагоприятных прогностических факторов, быстро возникающей необходимостью начинать специфическое лечение, а также наличием этого нарушения почти у всех больных с агрессивной опухолевой формой В-ХЛЛ. Наличие делеции 1^23 у молодых пациентов (моложе 55 лет) еще больше ухудшает прогноз. Однако раннее начало флюдарабин содержащих курсов приводит к тому, что выживаемость этих пациентов не отличается от выживаемости больных с трисомией хромосомы 12 и достоверно выше, чем у пациентов с неблагоприятными цитогенетическими факторами прогноза.

Делеция 17р13 всеми исследователями характеризуется как крайне неблагоприятный независимый фактор прогноза В-ХЛЛ; наши результаты

подтверждают как неблагоприятность этого цитогенетического нарушения, так и его независимое прогностическое значение.

Больные с комплексными нарушениями кариотипа ранее не исследовались в качестве отдельной цитогенетической прогностической группы. В нашей работе было показано, что вне зависимости о того, какие конкретно цитогенетические аберрации имеются у того или иного больного, наличие двух и более аберраций - это неблагоприятный прогностический фактор. У таких пациентов низкая общая выживаемость, плохой ответ на проводимое химиотерапевтическое лечение, для них характерны другие факторы неблагоприятного прогноза В-ХЛЛ. В большинстве случаев комплексные нарушения кариотипа выявляются только при стандартном цитогенетическом исследовании.

Разнообразие клинического течения и прогноза В-клеточного хронического лейкоза, а также необходимость использовать принципиально разные терапевтические подходы в лечении данного заболевания требовали выделения в пределах данной нозологии отдельных клинических групп. Стадии В-ХЛЛ, отражающие этапы накопления опухолевой массы, незаменимы для унификации данных, апробации новых методов лечения в клинических исследованиях на больших группах больных; однако они не описывают биологии опухоли. В 1983 году А.И. Воробьевым и М.Д. Бриллиант были описаны клинические формы В-ХЛЛ, охарактеризованы клинические и морфологические особенности каждой из них, а также описаны особенности терапии и прогноз при каждой из выделенных форм данного заболевания. Добавление к этому описанию особенностей цитогетической картины клинических форм В-ХЛЛ позволило бы полнее охарактеризовать и более четко разграничить эти формы, являющиеся, возможно, самостоятельными заболеваниями, объединенными общим названием «хронический В-клеточный лимфолейкоз».

В данной работе нам удалось цитогенетически охарактеризовать опухолевую форму В-ХЛЛ: наличие в большинстве случаев делеции 11я23, частое присутствие трисомии хромосомы 12 и отсутствие делеции 13д14, являющейся самой частой аберрации при В-ХЛЛ. Установлено, что для доброкачественной формы В-ХЛЛ характерно отсутствие цитогенетических нарушений.

Таким образом, цитогенетические аберрации являются одними из наиболее важных факторов прогноза В-ХЛЛ.

выводы

1. Хромосомные нарушения выявлены у 56% больных В-ХЛЛ: самой частой аберрацией является делеция del13q14 (25% случаев); делеция del11q23/ATM определена у 19% пациентов, трисомия хромосомы 12 - в 13% случаев, делеция del 17р13/ТР53 - у 7% и комплексные нарушения кариотипа - у 6% больных.

2. К благоприятным факторам прогноза относятся отсутствие выявленных хромосомных нарушений и делеция del13q14 в качестве единственного нарушения кариотипа (3-летняя общая выживаемость составила 83% и 78% соответственно).

3. К факторам «промежуточного» прогноза относятся трисомия хромосомы 12 и делеция del11q23 (3-летняя общая выживаемость составила 69% и 65% соответственно).

4. Неблагоприятными прогностическими факторами являются делеция del17p13 и комплексные нарушения кариотипа (3-летняя общая выживаемость составила 17% и 38%, медиана выживаемости - 36 и 26 месяцев соответственно).

5. Делеция del17p13 и комплексные нарушения кариотипа в нашем исследовании не встречались в дебюте В-ХЛЛ и выявлялись только в прогрессии заболевания.

6. Благоприятные цитогенетические факторы прогноза коррелируют с длительным удвоением количества лимфоцитов (больше 12 месяцев); кроме того, при отсутствии выявленных аберраций характерен мутированный вариант генов вариабельного региона иммуноглобулинов и очаговое или интерстициальное поражение костного мозга, а при делеции 13q14 - экспрессия CD 38 менее, чем на 30% клеток. Напротив, для больных с делецией 11q23, 17р13 и комплексным кариотипом характерно быстрое удвоение количества лимфоцитов (меньше 12 месяцев); кроме того, делеция 11q23 и комплексный кариотип коррелируют с экспрессией CD38 более чем на 30% клеток.

7. Цитогенетическими особенностями опухолевой формы В-ХЛЛ являются наличие в большинстве случаев делеции del11q23, частое присутствие трисомии хромосомы 12 и отсутствие самой частой для В-ХЛЛ цитогенетической аномалии -делеции 13q14.

8. Для доброкачественной формы В-ХЛЛ характерно отсутствие цитогенетических аберраций.

9. У больных В-ХЛЛ с del13q14, трисомией хромосомы 12 и del11q23 возможно достижение цитогенетической ремиссии при проведении флюдарабин содержащих курсов цитостатической терапии. У больных с del17p13 или с комплексными

нарушениями кариотипа не была достигнута даже клиническая ремиссия после проведения курсов терапии по протоколу FMC-R.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Захарова А И.. Обухова Т.Н. Молекулярно-генетические маркеры как факторы прогноза при хроническом В-клеточном лимфолейкозе. Онкогематология, 2007, №1, С. 17-23.

2. А И. Захарова. Т.Н. Обухова, Ю.Ю. Лорие, Е.А. Никитин, Р.С. Самойлова, Б.В. Зингерман, Е.В. Домрачева. Цитогенетические нарушения при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и их связь с клинико-биологическими особенностями и прогнозом заболевания. Терапевтический архив, 2006, № 7, С. 57-62.

3. Захарова А И.. Обухова Т.Н., Лорие Ю.Ю., Домрачева Е.В. Цитогенетика хронического В-кпеточного лимфолейкоза. Медицинская генетика, 2006, №3 (45), стр.27-32.

4. Zakharova A I.. Obukhova T.N., Lorie Y.Y., Domracheva E.V Cytogenetic characterization of B-ceil chronic lymphocytic leukemia / B-cell small lymphocytic leukemia (B-CLL7B-SLL). National Center for Hematology, Moscow, Russian Federation, Haematologica 0793, V 91 (1), p.291, 11th Congress of the European Hematology Assosiation, Amsterdam, June 15-18, 2006.

5. Обухова Т.Н., Захарова А.И.. Зубашева Е.И., Водинская Л.А., Алимова Г.А., Домрачева Е.В. Современные цитогенетические методы в диагностике лимфатических опухолей. Тезисы доклада на всероссийском съезде медицинских генетиков. Уфа 25-27 мая 2005г. Медицинская генетика, 2005, №4, стр.31.

6. Обухова Т.Н., Лорие Ю.Ю., Захарова А.И.. Водинская Л.А., Алимова Г.А., Домрачева Е.В., Воробьев А.И. Цитогенетика хронического В-кпеточного лимфолейкоза. Тезисы доклада на всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» Москва 25-27 ноября 2003г. Медицинская генетика, 2003, т.2, №10, стр.433.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарю свою семью за бесконечное терпение и постоянную поддержку.

Огромную признательность выражаю моему научному руководителю Т.Н.Обуховой за неоценимую помощь в осуществлении работы, ценные советы, терпение, внимание и поддержку.

Я особенно благодарна директору ГНЦ РАМН и моему научному руководителю А.И.Воробьеву за концепцию подхода к В-клеточному хроническому лимфолейкозу, которая позволила автору избежать многочисленных ошибок.

Выражаю бесконечную благодарность заведующей Кариологической лаборатории Е.В.Домрачевой за возможность проведения данного исследования, организацию этой работы, внимание и поддержку. Я искренне признательна всем сотрудникам Кариологической лаборатории за поддержку и добрые советы; особенно благодарю Г.А.Апимову, Л.А.Шишигину и Л.В.Дяченко за помощь в проведении цитогенетических исследований.

Выражаю особую признательность Ю.Ю.Лорие за большую помощь на всех этапах создания этой работы, за ценные замечания, благодаря которым работа была значительно улучшена. Благодарю за сотрудничество докторов различных отделений ГНЦ РАМН: Е.А.Никитина, Л.С.Аль-Ради, А.Л.Меликян, Е.А.Барях, Ю.Э.Виноградову, К.С.Момотюк, Н.Г.Чернову и Е.Е.Звонкова. Я благодарна руководителям и сотрудникам различных лабораторий и подразделений ГНЦ РАМН, внесшим важный вклад в создание этой работы: Е.А.Никитину, Р.С.Самойловой, И.Б.Капланской, Е.Ю.Варламовой, И.А.Воробьеву, Б.В.Зингерману.

Благодарю рецензентов этой работы Е.Ю.Варламову и Т.Н.Моисееву за проделанный ими огромный труд, внимание к работе, ценные замечания.

Выражаю признательность своим оппонентам М.А.Волковой и И.А.Демидовой за кропотливый анализ диссертации, критичные замечания и доброжелательное отношение к автору.

Заказ №251/10/08 Подписано в печать 28.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 1www.cfr.ru; е-таН:ш/о@с/г.ги

Актуальность проблемы

Хронический В-клеточный лимфолейкоз (B-XJIJI) - наиболее распространенный и, следовательно, изученный лейкоз взрослых. В соответствии с современной классификацией гемобластозов ВОЗ 2001 года, В-XJIJI - хроническая опухоль, характеризующаяся клональной пролиферацией и накоплением CD5+, CD23+ опухолевых лимфоцитов в костном мозге, периферической крови, лимфатических узлах и селезенке.

Заболевание впервые описано около полутора веков назад Р. Вирховым [159] и в настоящее время диагностика опухоли не вызывает затруднений. В то же время, ни одна из современных международных классификаций B-XJIJI не предполагает существования отдельных форм болезни, которые отечественные гематологи начали описывать еще в 50-х годах прошлого века. Каждая из этих форм представляет собой отдельную биологическую сущность в пределах В-XJIJI, вероятно имеющую специфические иммунологические, цитогенетические и молекулярно-биологические признаки и особенности ответа на терапию.

Помимо установления диагноза по стандартным критериям, одной из важнейших задач современной диагностики B-XJIJI является выявление ряда факторов, которые могут указывать на прогрессирующее или «тлеющее» течение лейкоза в будущем. Это стало особенно актуальным в последнее десятилетие, после появления эффективных препаратов и схем лечения B-XJIJI, позволяющих получать полные и молекулярные ремиссии опухоли у большинства больных. Подразделения B-XJIJI только на стадии [28, 133] и формы [7] недостаточно, необходим ряд дополнительных факторов, которые позволяют прогнозировать клиническое течение опухоли в пределах одной формы или стадии болезни.

Стадии болезни — это простая клиническая прогностическая система, позволяющая унифицировать данные и сформировать группы пациентов для участия в клинических исследованиях; они действенны при апробации методов лечения на большом количестве пациентов, однако в дебюте заболевания не отражают индивидуальный прогноз больного.

Стадии не подчеркивают биологических особенностей болезни и неадекватно отражают массу опухоли. В то же время, более новые критерии, на которые сегодня ориентируются гематологи, например мутационный статус генов иммуноглобулинов, теряют свое прогностическое значение при Ш-1У стадиях болезни.

Классифицирование В-ХЛЛ по формам, отражающее биологическую сущность опухоли, в ряде случаев сопряжено с некоторыми сложностями: у 10% больных форму установить не удается, поскольку имеются признаки двух форм; форма может включать разновидности, как, например, при селезеночной форме В-ХЛЛ в большинстве случаев имеется массивная спленомегалия и гиперлейкоцитоз, но у небольшой части пациентов отмечают умеренную спленомегалию, невысокий лейкоцитоз, глубокий гуморальный иммунодефицит со снижением нескольких классов иммуноглобулинов и часто аутоиммунные цитопении. Доброкачественную форму В-ХЛЛ нелегко отличить от медленно прогрессирующей в первые годы болезни.

Сегодня известно более 20 признаков, имеющих влияние на время до необходимости начала терапии, результаты лечения и продолжительность жизни больных В-ХЛЛ. Эти факторы частично взаимозависимы, но не дублируют друг друга, поскольку отражают разные особенности опухолевых клеток — аберрантный иммунофенотип, активацию клеток по экспрессии С038, цитогентические нарушения, степень инфильтрации костного мозга, время удвоения количества лимфоцитов, наличие или отсутствие мутаций генов вариабельного региона иммуноглобулинов и т.д. Показания к началу лечения остаются клиническими, поскольку до настоящего времени нет доказательств, что раннее начало терапии у пациента с рядом факторов плохого прогноза приводит к увеличению продолжительности жизни.

Использование комбинации ряда прогностических факторов позволяет выделить группы пациентов в пределах каждой из форм болезни, у которых ожидается быстрая прогрессия лейкоза. Таким больным необходимо чаще проводить контрольные обследования для своевременного начала лечения.

Одними из важнейших факторов прогноза клинического течения В-ХЛЛ являются цитогенетические нарушения. К настоящему времени выявлены наиболее часто встречающиеся при данном заболевании аберрации [57].

Выяснено неблагоприятное прогностическое значение делеций 1Ц23(АТМ) и 17р13(ТР53): у больных с этими аберрациями, помимо прогрессирующего течения лейкоза, в большей или меньшей степени имеется резистентность к ключевым для В-ХЛЛ цитостатикам — аналогам пуринов и алкилирующим препаратам. Отсутствие цитогенетических нарушений и делеция 13ql4 в качестве единственного нарушения кариотипа считаются благоприятными прогностическими факторами при В-ХЛЛ.

В то же время недостаточно изучены комплексные нарушения кариотипа как отдельная цитогенетическая группа, имеющая определенную прогностическую ценность. Остается спорным вопрос о характере прогноза заболевания у пациентов с трисомией хромосомы 12.

Кроме того, нет данных, касающихся частоты встречаемости тех или иных цитогенетических нарушений при различных клинических формах В-ХЛЛ, что, с учетом других прогностических факторов данного заболевания, позволило бы охарактеризовать отдельные клинико-генетические формы хронического В-клеточного лимфолейкоза.

Остается актуальным изучение морфологических и иммунологических особенностей больных с разными цитогенетическими нарушениями, а также вопрос связи того или иного цитогенетического нарушения с возможностью получения и продолжительностью ремиссии.

Цель исследования:

Определить прогностическое значение цитогенетических нарушений при хроническом В-клеточном лимфолейкозе.

Задачи исследования:

1. Определить спектр и частоту встречаемости цитогенетических аберраций у больных В-ХЛЛ.

2. Изучить цитогенетические особенности клинических форм В-ХЛЛ.

3. Провести корреляцию цитогенетических изменений с другими факторами прогноза при В-ХЛЛ.

4. Провести цитогенетический мониторинг эффективности терапии при В-ХЛЛ.

5. Оценить время до необходимости начала терапии и общую выживаемость больных В-ХЛЛ в зависимости от выявленных хромосомных аномалий.

Научная новизна

В работе проанализирована частота встречаемости цитогенетических нарушений при различных клинических формах В-ХЛЛ.

При анализе общей выживаемости больных с разными цитогенетическими нарушениями в условиях терапии флюдарабин содержащими курсами выделены три прогностические цитогенетические группы: с благоприятным, промежуточным и неблагоприятным прогнозом. Делеция 11ц23 отнесена к факторам «промежуточного» прогноза В-ХЛЛ.

Дана цитогенетическая характеристика опухолевой формы хронического В-клеточного лимфолейкоза.

Определено неблагоприятное прогностическое значение комплексных нарушений кариотипа как отдельной цитогенетической группы.

Научно-практическая ценность

В работе определено прогностическое значение каждого из наиболее часто встречаемых хромосомных нарушений при В-ХЛЛ, а также комплексных нарушений кариотипа. Это позволило выявить «группы риска» больных В-ХЛЛ, нуждающиеся в более частом контрольном обследовании.

Выявлена взаимосвязь отдельных цитогенетических нарушений с клиническими формами В-ХЛЛ. Дана цитогенетическая характеристика опухолевой и доброкачественной форм В-ХЛЛ.

Кроме того, изучена связь каждой из наиболее частых цитогенетических аберраций при В-ХЛЛ, а также комплексных нарушений кариотипа как отдельной цитогенетической группы с другими факторами прогноза данного заболевания.

Изучена общая выживаемость больных с каждой из наиболее часто встречаемых при В-ХЛЛ аберраций и с комплексными нарушениями кариотипа.

Показана возможность цитогенетической оценки результатов терапии при В-ХЛЛ. Установлено, что при терапии флюдарабин-содержащими курсами достижение цитогенетической ремиссии возможно у больных с делецией 13я14, трисомией хромосомы 12, и делецией 11д23.

Положения, выносимые на защиту

1. Цитогенетические аберрации у больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом - важные факторы прогноза данного заболевания.

2. Отсутствие выявленных хромосомных аберраций и делеция 13ql4 в качестве единственного нарушения кариотипа - благоприятные цитогенетические факторы прогноза. Делеция llq23 и трисомия хромосомы 12 — факторы «промежуточного» прогноза при B-XJIJI. Делеция 17р13 и комплексные нарушения кариотипа - это неблагоприятные цитогенетические прогностические факторы.

3. Опухолевая форма B-XJIJI характеризуется наличием в большинстве случаев делеции llq23, частым присутствием трисомии хромосомы 12 и отсутствием самой частой для B-XJIJI цитогенетической аберрации - делеции dell3ql4. Для доброкачественной формы B-XJIJI характерно отсутствие цитогенетических нарушений.

4. У больных В-ХЛЛ с dell3ql4, трисомией хромосомы 12 и dell lq23 возможно достижение цитогенетической ремиссии при терапии флюдарабин-содержащими курсами.

выводы

1. Хромосомные нарушения выявлены у 56% больных В-ХЛЛ: самой частой аберрацией является делеция (25% случаев); делеция с!е11Ц23/АТМ определена у 19% пациентов, трисомия хромосомы 12 — в 13%случаев, делеция 17р13/ТР53 — у 7% и комплексные нарушения кариотипа - у 6% больных.

2. К благоприятным факторам прогноза относятся отсутствие выявленных хромосомных нарушений и делеция 13д14 в качестве единственного нарушения кариотипа (3-летняя общая выживаемость составила 83% и 78% соответственно).

3. К факторам «промежуточного» прогноза относятся трисомия хромосомы 12 и делеция \ \о(2Ъ (3-летняя общая выживаемость составила 67% и 61% соответственно).

4. Неблагоприятными прогностическими факторами являются делеция 17р13 и комплексные нарушения кариотипа (3-летняя общая выживаемость составила 17% и 38%, медиана выживаемости - 36 и 26 месяцев соответственно).

5. Делеция 17р13 и комплексные нарушения кариотипа не встречались в дебюте В-ХЛЛ и выявлялись только в прогрессии заболевания.

6. Благоприятные цитогенетические факторы прогноза коррелируют с длительным удвоением количества лимфоцитов (больше 12 месяцев); кроме того, при отсутствии выявленных аберраций характерен мутированный вариант генов вариабельного региона иммуноглобулинов и очаговое или интерстициальное поражение костного мозга, а при делеции 13д14 — экспрессия СБ 38 менее, чем на 30% клеток. Напротив, для больных с делецией 1Ц23, 17р13 и комплексным кариотипом характерно быстрое удвоение количества лимфоцитов (меньше 12 месяцев); кроме того, делеция 1Ц23 и комплексный кариотип коррелируют с экспрессией СБ38 более чем на 30% клеток.

7. Цитогенетическими особенностями опухолевой формы В-ХЛЛ являются наличие в большинстве случаев делеции 1Ц23, частое присутствие трисомии хромосомы 12 и отсутствие самой частой для В-ХЛЛ цитогенетической аномалии — делеции 13ц14.

8. Для доброкачественной формы В-ХЛЛ характерно отсутствие цитогенетических аберраций.

9. У больных В-ХЛЛ с <1е113д14, трисомией хромосомы 12 и с!е11Ц23 возможно достижение цитогенетической ремиссии при проведении флюдарабин-содержащих курсов цитостатической терапии. У больных с с1е117р13 и с комплексными нарушениями кариотипа не была достигнута даже клиническая ремиссия после проведения курсов терапии по протоколу РМС-Я.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические факторы прогноза B-клеточного хронического лимфолейкоза уже на ранних стадиях развития опухоли позволяют выявить больных, относящихся к группе риска. Раннее выявление таких больных стало актуальным, поскольку появились методы лечения, позволяющие получать полные продолжительные ремиссии у большинства пациентов. К молекулярно-генетическим прогностическим факторам B-XJIJI относятся мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов и цитогенетические нарушения, которые и стали предметом исследования.

Нами выделено 3 группы цитогенетических нарушений, имеющих разное прогностическое значение: к благоприятным факторам прогноза относятся отсутствие хромосомных нарушений и делеция 13ql4 в качестве единственного нарушения кариотипа, к факторам «промежуточного» прогноза — трисомия хромосомы 12 и делеция llq23, к неблагоприятным прогностическим факторам — делеция 17р 13 и комплексные нарушения кариотипа.

Благоприятный прогноз у больных с нормальным кариотипом или с единственной делецией 13ql4 ранее уже был установлен; наши результаты его подтверждают. Однако, в отличие от проводившихся исследований, по нашим данным прогноз у больных с делецией 13ql4 в качестве единственного нарушения кариотипа хуже, чем у пациентов без цитогенетических нарушений.

Результаты нашего исследования объясняют, почему большинство современных исследователей относят трисомию хромосомы 12 к факторам «промежуточного» прогноза. Данная аберрация с одинаковой вероятностью встречается у пациентов с благоприятными и неблагоприятными факторами прогноза, т.е. среди больных с данным цитогенетическим нарушением есть и те, у которых заболевание отличается спокойным, медленно прогрессирующим течением, и пациенты с агрессивным В-ХЛЛ. Возможно, именно поэтому у данной группы больных «промежуточные» показатели общей выживаемости.

С делецией llq23, которая, как показали результаты нашего исследования общей выживаемости больных, также может быть отнесена к факторам промежуточного» прогноза, ситуация иная. Безусловно, делеция 1Ц23 -фактор риска при В-ХЛЛ, что подтверждается корреляцией данной аберрации с большинством неблагоприятных прогностических факторов, быстро возникающей необходимостью начинать специфическое лечение, а также наличием этого нарушения почти у всех больных с агрессивной опухолевой формой В-ХЛЛ. Наличие делеции 1Ц23 у молодых пациентов (моложе 55 лет) еще больше ухудшает прогноз. Однако раннее начало флюдарабин содержащих курсов приводит к тому, что выживаемость этих пациентов не отличается от выживаемости больных с трисомией хромосомы 12 и достоверно выше, чем у пациентов с неблагоприятными цитогенетическими факторами прогноза.

Делеция 17р13 всеми исследователями характеризуется как крайне неблагоприятный независимый фактор прогноза В-ХЛЛ; наши результаты подтверждают как неблагоприятность этого цитогенетического нарушения, так и его независимое прогностическое значение.

Больные с комплексными нарушениями кариотипа ранее не исследовались в качестве отдельной цитогенетической прогностической группы. В нашей работе было показано, что вне зависимости о того, какие конкретно цитогенетические аберрации имеются у того или иного больного, наличие двух и более аберраций — это неблагоприятный прогностический фактор. У таких пациентов низкая общая выживаемость, плохой ответ на проводимое химиотерапевтическое лечение, для них характерны другие факторы неблагоприятного прогноза В-ХЛЛ. В большинстве случаев комплексные нарушения кариотипа выявляются только при стандартном цитогенетическом исследовании.

Разнообразие клинического течения и прогноза В-клеточного хронического лейкоза, а также необходимость использовать принципиально разные терапевтические подходы в лечении данного заболевания требовали выделения в пределах данной нозологии отдельных клинических групп. Стадии В-ХЛЛ, отражающие этапы накопления опухолевой массы, незаменимы для унификации данных, апробации новых методов лечения в клинических исследованиях на больших группах больных; однако они не описывают биологии опухоли. В 1983 году А.И. Воробьевым и М.Д. Бриллиант были описаны клинические формы В-ХЛЛ, охарактеризованы клинические и морфологические особенности каждой из них, а также описаны особенности терапии и прогноз при каждой из выделенных форм данного заболевания. Добавление к этому описанию особенностей цитогетической картины клинических форм В-ХЛЛ позволило бы полнее охарактеризовать и более четко разграничить эти формы, являющиеся, по сути, самостоятельными заболеваниями, объединенными общим названием «хронический В-клеточный лимфолейкоз».

В данной работе нам удалось цитогенетически охарактеризовать опухолевую форму В-ХЛЛ: наличие в большинстве случаев делеции 1^23, частое присутствие трисомии хромосомы 12 и отсутствие делеции 13ql4, являющейся самой частой аберрации при В-ХЛЛ. Установлено, что для доброкачественной формы В-ХЛЛ характерно отсутствие цитогенетических нарушений.

Таким образом, цитогенетические аберрации являются одними из наиболее важных факторов прогноза В-ХЛЛ.