Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфологические и молекулярно-биологические факторы прогноза рака мочевого пузыря

09-4 2384

На правах рукописи

АНДРЕЕВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

14.00.14-онкология. 14.00.15-патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва -2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им, П.А. Герцена Росмедтехнологий»

(директор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.И. Чиссов)

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Франк Георгий Авраамович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дарьялова Софья Львовна

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена

доктор медицинских наук, профессор Мишнев Олеко Дмитриевич

Российский государственный медицинский университет им. И.Н. Пирогова

доктор медицинских наук, профессор Каприн Андрей Дмитриевич

Российский научный центр рентгенорадиологии

Ведущее учреждение: ФГУ «Научно-исследовательский институт урологии» Росмедтехнологий

Защита состоится 20 октября 2009 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.047.01 при ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Росмедтехнологий (125284, Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З)

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Росмедтехнологий (125284, Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З)

Автореферат разослан__2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

СЕДЫХ С.А.

I и u У и А р U Т В Е Н Н А Я

БИЬЛИ ОТЕКА _2 О О 9_

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря (РМП) занимает 8-е место среди мужчин и 18-е среди женщин. Заболеваемость раком мочевого пузыря в настоящее время составляет 11,9 у мужчин, и 1,7 на 100 тыс. населения у женщин. Приблизительно 90% опухолей мочевого пузыря (МП) представлены уротелиальной карциномой, также называемой переходноклеточным раком, при этом опухоли, прорастающие собственную пластинку слизистой оболочки и собственно мышечный слой, составляют 25%. Неинвазивный папиллярный уротелиальный рак низкой степени анаплазии прогрессирует до инвазивного менее чем в 5% случаев, однако рецидивы развиваются у 48-71% пациентов. Наиболее значимыми факторами прогноза РМП считают размеры опухоли, множественность очагов поражения, глубину инвазии, наличие метастазов, степень дифференцировки, наличие очагов карциномы in situ. Ведутся дискуссии о влиянии гистологического варианта рака на прогноз заболевания. Однако анализ перечисленных критериев не дает возможности индивидуального прогнозирования течения заболевания, между тем как опухоли одной стадии и степени анаплазии могут иметь различное клиническое поведение. Необходимо изучение индивидуальных свойств опухоли, ее биологической агрессивности, способности к инвазии, метастазированию, склонности к рецидивированию. В последние годы предпринимаются многочисленные попытки выявления самостоятельных иммуногистохимических факторов прогноза РМП. Активно изучаются процессы апоптоза и пролиферации. Избыточная экспрессия HER-2/neu в опухоли сопровождается резким снижением апоптоза, усилением пролиферации клеток, снижением эффективности химио- и гормонотерапии, однако, для РМП его роль изучена недостаточно. Онкогенная

трансформация клетки часто сопровождается мутацией в гене р53 и превращением его из индуктора в ингибитор апоптоза. Существует множество других факторов, регулирующих апоптоз. К ним относят семейство белков bcl-2, включающее более двух десятков протеинов: bct-2, mcl-1, Bcl-X, ВАХ, Bad, ВАК и некоторые другие. Их значимость для прогноза находится на этапе изучения и накопления материала.

Для опухолевых клеток характерно уменьшение или полная утрата адгезивных свойств, что ведет к дезорганизации ткани и хаотичности расположения отдельных гистологических структур. Важную роль в атом процессе играют молекулы кадхеринов. Показано, что супрессия активности Е-кадхеринов может стать пусковым моментом для миграции клеток опухоли за пределы первичного очага. В агрессивных формах рака инактивация генов, контролирующих экспрессию Е-кадхерина, встречается достаточно часто и является причиной не только событий, характерных для позднего карциногенеза (метастазирования и инвазии), но в некоторых гистологических типах опухолей человека имеют место уже на ранних стадиях развития новообразования. Изучение роли кадхерин-катениновой системы в развитии и прогрессировании РМП может оказать значительное влияние на выбор тактики лечения больных.

Важную роль в развитии опухоли, несомненно, играет внеклеточный матрикс (ВКМ). Матриксные металлопротеиназы (ММР) обеспечивают проницаемость ВКМ при инвазии и метастазировании рака. Для всех ММР существуют соответствующие специфические ингибиторы - тканевые ингибиторы металлопротеиназ (Т(МР). Скорость выделения металлопротеиназ увеличивается в пролиферирующих и опухолевых клетках, особенно локализованных в зонах инвазии опухоли. Они воздействуют на микроокружение новообразования, способствуя разрушению ВКМ, инвазии и формированию метастазов. Механизмы,

стимулирующие отделение металлопротеиназ от клеточной мембраны, сейчас активно изучаются. Значимость экспрессии ММР и их ингибиторов для РМП нуждается в тщательном изучении так же, как исследование компонентов ВКМ (коллагенов, протеогликанов, эластина, ламининов, фибронектина).

Кроме того, не всегда экспрессия белка вызвана поломкой определенного гена, и это также нуждается в изучении. В последние годы наши знания о молекулярных механизмах канцерогенеза мочевого пузыря существенно изменились. Хотя многие детали этого сложнейшего процесса остаются не до конца ясными, стало очевидным, что формируются научные основы повышения эффективности диагностики и лечения данной группы злокачественных новообразований. Однако недостаточность данных об особенностях течения РМП диктует необходимость проведения дальнейших исследований в этом направлении.

Цель исследования

Изучение комплекса морфологических и молекулярно-биологических характеристик, определяющих прогноз и биологическую агрессивность рака мочевого пузыря.

Задачи исследования

1. Изучить клинико-морфологические факторы, такие как стадия, степень дифференцировки, гистологический вариант опухоли, способ стромальной инвазии и наличие сосудистой инвазии у больных раком мочевого пузыря.

2. Изучить экспрессию и локализацию факторов, отражающих пролиферативную активность опухоли и уровень апоптоза, белков-регуляторов клеточного цикла и ростовых факторов.

3. Изучить экспрессию и локализацию матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов.

4. Изучить особенности экспрессии молекул межклеточной адгезии и их влияние на инвазивный и метастатический потенциал опухоли.

5. Изучить состояние некоторых составляющих межклеточного матрикса и базальных мембран.

6. Изучить интенсивность ангиогенеза и факторов его стимулирующих.

7. Исследовать роль вируса папилломы человека в возникновении рецидивов поверхностной уротелиальной карциномы.

8. Исследовать некоторые характерные хромосомные и генетические нарушения в уротелиальных карциномах.

9. Сравнить полученные данные и выявить прогностически значимые факторы для рака мочевого пузыря.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение широкого спектра иммуногистохимических факторов, участвующих в канцерогенезе рака мочевого пузыря и их сравнение с различными морфологическими характеристиками опухоли, такими как степень дифференцировки, наличие метаплазии, сосудистая инвазия, способ стромальной инвазии, а также стадией процесса.

Выявлены факторы, влияющие на клиническое течение рака мочевого пузыря. Установлено влияние белка р53 на прогрессирование и рецидивирование РМП. Обнаружена корреляция уровня экспрессии молекул адгезии, белков ВКМ и матриксных металлопротеиназ с прогнозом заболевания. Показана значимость количественного содержания тенасцина для определения инвазивной и метастатической активности РМП. Выявлены новые факты, подтверждающие участие матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в ангиогенезе РМП.

Разработана новая методика для определения плотности сосудистой сети, которая позволяет объективизировать изучение ангиогенеза в опухоли. Получено

положительное решение о выдаче патента на изобретение (заявка Na2008111921/15(012887).

Установлена связь ВПЧ 16 типа с рецидивами поверхностного рака мочевого пузыря, определено значение метода гибридизации in situ для выявления ДНК ВПЧ в опухоли и окружающих тканях.

Выявлена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16 в высокодифференцированных поверхностных карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением.

Полученные данные вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.

Практическая значимость

Разработаны рекомендации по применению иммуногистохимического метода с использованием конкретной панели антител, что позволит определить индивидуальный прогноз течения заболевания и выработать индивидуальный план лечения пациента.

Разработана оригинальная методика определения плотности сосудистой сети с проведением сканирования всей площади гистологического среза и использованием анализатора изображения, которая существенно облегчит анализ ангиогенеза в опухолях разных локализаций. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов. Предложенная методика количественного определения тенасцина в опухоли может успешно использоваться не только для этого гликопротеида, но и для оценки других иммуногистохимических реакций сходного типа на гистологических срезах.

Показана необходимость подтверждения амплификации гена НЕИШеи в уротелиальных карциномах с гиперэкспрессией этого белка.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: Международной научно-практической конференции, Россия, Иркутск, 2003г., II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2005г., Съездах онкологов СНГ - Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов-на-Дону, 2005г., 19 Европейском конгрессе патологии, Германия, Берлин, 2001г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г., XXVI Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада, Монреаль, 2006г, Международном противораковом конгрессе, Швейцария, Женева, 2008г, XXVII Международном конгрессе Международной академии патологии, Греция, Афины, 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, их них - 3 пособия для врачей, 2 медицинские технологии, 1 глава в зарубежной монографии, 2 статьи в зарубежных сборниках и 5 публикаций в зарубежных журналах. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, включает: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение» и «Список литературы». Работа иллюстрирована 94 рисунками и 21 таблицей. Указатель литературы содержит 199 зарубежный источников и 16 - отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы

Материалом для исследования послужил операционный и биопсийный материал пациентов, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена по поводу рака мочевого пузыря с 1995 по 2004 год. В работу включены 372 больных. Исследован материал 266 биопсий, 229 трансуретральных резекций МП, 73 резекций, 113 цистэктомий (всего 681). Из 372 пациентов 294 были мужчинами, 78 - женщинами. Возраст мужчин от 23 до 82 лет (средний 61), женщин - от 37 до 81 года (средний 63). Распределение по стадии заболевания было следующим: Та -60 больных, Т1 - 187, Т2 - 63, ТЗ - 44, Т4 -18.

В соответствии с особенностями клинического течения и для оценки прогностической значимости изучаемых факторов пациенты были разделены на три группы: 1- группа с благоприятным течением заболевания (отсутствие рецидива заболевания или многолетняя ремиссия после 1-2 поверхностных рецидивов) , 2 - группа с упорно рецидивирующим течением (многократное поверхностное рецидивирование) , 3 - группа с неблагоприятным прогрессирующим течением (развитие более глубокой инвазии и/или метастазирование рака).

Иммуногистохимический метод

Для иммуногистохимического исследования были использованы более 20

коммерческих антител: РСЫА, К167, циклин 01 (маркеры пролиферативной

активности), Вс12, Вс1Х, С095 (маркеры апоптоза), мутантный р53, р16 (маркеры

супрессии опухолевого роста), НЕЯ2/пеи, ЕвРК (рецепторы эпидермального

фактора роста), \ZEGF (сосудистый эндотелиапьный фактор роста), С034 (маркер

эндотелия сосудов), ММР-1, ММР-2, ММР-9 (матриксные металпопротеинразы),

Т1МР-1 и Т1МР-2 (тканевые ингибиторы матриксных металлопротениназ), Е-

7

кадгерин, бета-катенин, CD44 (молекулы адгезии), тенасцин, коллаген IV типа, ламинин (компоненты внеклеточного матрикса), из них антитела к тенасцину, HER2/neu, ламинину - поликлональные, остальные - моноклональные. Большинство антител произведено фирмой «Dako»: PCNA, Ki-67(MIB.1), p53(D07), Bcl2, Е-кадгерин, В-катенин, тенасцин, EGFR, коллаген IV, CD44, р16, HER2/neu, ламинин, ММР9. Антитела к BclX, ММР1, ММР2 и их ингибиторам, CD95 произведены фирмой «NovoCastra», а к циклину D1 - фирмой «Pick Cell Laboratories». Иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике. Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (ММР, TIMP) и на мембранах клеток (молекулы адгезии) оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3 баллов с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 - отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция. При оценке реакции с антителами к HER2/neu и EGFR использовали общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ (Jacobs T.W. et al., 1999).

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, р53, bcl2 и др.) оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и выражая полученные результаты в процентах. Пролиферативную активность оценивали следующим образом:

1) 0% - 20% - низкая пролиферативная активность,

2) 21 % - 50% - умеренная пролиферативная активность,

3) 51% -100% - высокая пролиферативная активность Метод количественной оценки экспрессии тенасцина

Нами была разработана специальная оригинальная методика с использованием анализатора изображения и модифицированной компьютерной программы. Интенсивность экспрессии тенасцина оценивали путем измерения

площади среза, занятой положительной иммуногистохимической реакцией с антителами к тенасцину. Методика включала в себя следующие этапы:

Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп LEICA DMRB, сопряженный с телекамерой ProgRes 3012 и компьютером. Изображения захватывались при увеличении хЮО, что соответствовало размеру поля зрения 1,28x0,98 мм2 при разрешении 1440x1100 пикселей. С каждого микропрепарата захватывалось по 3 наиболее репрезентативных поля зрения. Перед определением площадей, занимаемых элементами изображения, проводились четкие границы между ними с использованием инструментов программы Adobe Photoshop 7,0. Последовательные шаги обработки изображения (названия инструментов приведены для англоязычной версии программы):

1. Регулировка яркостно-контрастных параметров, позволяющая визуализировать слабую реакцию и, по возможности, удалить фон.

2. Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста и облегчения выделения участков со слабой окраской белка.

3. Размывание изображения для более равномерной окраски участков, содержащих тенасцин.

4. Получение на изображении более четких, чем исходные, границ между участками с/без реакции.

5. Выделение всех участков изображения без реакции.

6. Инвертация выделения (SelectMnvers). Выделенными оказываются структуры, содержащие тенасцин.

7. Контроль точности выделения на исходном изображении.

8. Сохранение в а-канале.

9. Создание пустого слоя. Закрашивание выделения красным цветом. Инвертация и закрашивание выделения голубым цветом.

Таким образом, получено изображение, где все структуры, содержащие тенасцин, закрашены красным цветом, не содержащие - голубым; при этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются программами анализа изображений. Методика определения плотности сосудистой сети Нами разработана новая методика с использованием анализатора изображения, состоящая из нескольких этапов:

1. Проводится сканирование всей площади гистологического среза, на котором сосуды визуализированы при помощи иммуногистохимической реакции с антителами к эндотелию CD34.

2. Ручное выделение и закрашивание черным цветом участков изображения, не относящихся к опухоли.

3. Регулировка яркостно-контрастных параметров с улучшением визуализации слабой реакции удалением фона.

4. Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста.

5. Размывание изображения для равномерного окрашивания. Устранение мелких дефектов.

6. Выделение инструментом Magic Wang участков, соответствующих сосудам. Чувствительность инструмента подбирается под конкретное изображение. Выделение сохраняется в а-канале.

7. Контроль точности выделения на исходном изображении (слой Background).

8. Закрашивание выделенных объектов красным цветом.

9. Инвертация выделения (Select/lnvers). Выделенными оказываются структуры без сосудов. Выделение закрашивается голубым цветом.

10. Контроль правильности разметки.

11. Определение количества сосудов на единицу площади среза опухоли с помощью программы анализа изображения (Quontinut), т.е. определение плотности сосудистой сети.

По разработанной методике подана заявка на патент. Метод флуоресцентной гибридизации In situ (FISH)

Для определения амплификации гена HER2/neu и выявления анеуплоидии по хромосомам 3,7,17 и делеции локуса 9р21 использовались наборы для флуоресцентной гибридизации фирм «Dako» и «Vysis (Abbott)» и автоматический гибридайзер «Hybridazer Dako». Результаты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop 40» («Zeiss») с телекамерой «Axiocam» с использованием двойного фильтра для красителей FITC и Texas Red: подсчитывали количество зеленых меток, связанных с центромерным участком 17 хромосомы и количество красных меток, связанных с геном HER2/neu. Наличие или отсутствие амплификации определяли по соотношению красных (ген HER2) и зеленых сигналов (центромерный участок), амплификация считалась обнаруженной при соотношении больше чем 2,2. Анеуплоидию по хромосомам 3,7,17 и делецию локуса 9р21 оценивали с использованием набора Uro Vysion Bladder Cancer Kit (Abbott), содержащего 4 различные по цвету флуоресцентные метки: хромосома 17 - голубой, хромосома 7 - зеленый, хромосома 3 - красный, 9р21 - желтый. Оценку результатов проводили, подсчитывая количество каждой из флуоресцентных меток в 60 клетках опухоли, принимая, что нормой является содержание во всех клетках по 2 сигнала каждой цветной метки. Метод хромогенной гибридизации in situ (CISH)

Для определения наличия ДНК вируса папилломы человека в клетках уротелиального рака использовали детекционные наборы «Микровирус ВПЧ» (Экспериментальное медико-биологическое производство Кардиологического

научно-производственного центра, Россия) и «Rembrandt HPV» (PathPan, Нидерланды). Исследование проводили также с использованием автоматического гибридайзера. После ферментативной предобработки парафиновых срезов и нанесения зондов к ВПЧ разных типов (общему, 6,11,16, 18, 31, 33) денатурацию ДНК проводили при 95°С, а гибридизацию - при 37°С в течение 16-18 часов. В качестве хромогена использовали краситель АЕС. Реакцию оценивали с помощью анализатора изображения «Leica Q550».

Также для молекулярно-генетических исследований применялись следующие методы:

1. Лазерная микродиссекция

Микродиссекция выполнялась на депарафинированных срезах толщиной 7мкм с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Участки опухоли и окружающей ткани вырезали лазером и собирали в отдельные пробирки.

2. Полимеразно-цепная реакция для определения мутаций гена FGFR.

Для выявления мутаций 7 экзона гена FGFR ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед, Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCI, 10 мМ Трис-HCI (рН 8,4), 5 мМ MgCfe. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58°С - 2 мин 30 с. Нуклеотидная последовательность праймеров представлена в таблице 2. Продукты ПЦР разделяли в 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра.

3. Секвенирование гена FGFR.

Для приготовления пробы на сиквенс вырезанный фрагмент агарозного геля с необходимой ДНК инкубировали при -70°С не менее 30 мин. В жидкость, выдавленную из геля и помещенную в отдельную пробирку, добавляли ЗМ раствор ацетата натрия (рН=5.2) (1/12 объема) и равный объем изопропанола. Смесь повторно инкубировали при -70°С в течении 30 мин, а затем центрифугировали 15 мин. (миницентрифуга MiniSpin, Eppendorf, 13000 об/мин). Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 15-25 мкл бидистиллированной воды. Секвенирование проводилось по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits ("Applied Biosystems", США). 4. Микросателлитный анализ.

Для идентификации потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности (МН) в хромосомных районах 17р13 и 9р21 были использованы 3 высокополиморфных маркера ТР53, D9S942, D9S169. В качестве контроля использовали ДНК лейкоцитов периферической крови. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50мМ KCl, ЮмМ Трис-HCI (pH 8,4), 5мМ MgCI2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-60°С - 2 мин 30с.

Нуклеотидная последовательность праймеров и режимы отжига представлены в таблице 1.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров.

Ген Праймеры Температура отжига, °C

ТР53 F: сад cct ддд саа taa gag et gaga ctc R: aac age tcc ttt aat ggc ag 58

D9S942 F: саа саа age aag acc ctg tc R: cat ctg egg ttc ttt cct с 60

D9S169 F: сад tgt aac ctg ддд go R: ctt teg aft agt tta gca gaa tga g 58

ЯЗЯ? F: tgg egg tgg tgg tga ggg agg R: cca gcc cag gag ccc cag egg 65

5. Электрофорез в ПААГ.

Электрофорез продуктом ПЦР проводили в 8% ПААГ при 4°С в течение 3-5 часов. Состав 8% ПААГ:

8.4 мл 30% раствора АА (29:1)

1.5 мл 10х буфера TBE, до 30 мл диет, воды,

600 мкл 10% аммония персульфата (APS), 26 мкл ТЕМЕД.

Визуальный контроль пробега проб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Для фиксации результатов ПААГ проводили ксерокопирование или сканирование гелей.

6. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5%

уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной

14

водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011 M AgN03 в течение 10-15 минут, трижды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75М NaOH; 0,5 M НСНО; 2,3mM Na(BH4) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей относительно контроля, на МН указывало появление дополнительной полосы.

7. Программное обеспечение.

Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ:

1) поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов по базам данных Blast и Fasta;

2) анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции при помощи программ Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN;

3) компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров и подбор условий для проведения ПЦР с использованием программы Oligo 4.0 и MethPrimer;

4) анализ хроматограмм секвенированных последовательностей и распечатка результатов - с помощью программ Executor и Chromas.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использованием программы Excel с пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» (Лапач С.Н., Чубенко A.B., Бабич П.Н., 2000г.).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Прогноз уротелиального рака в нашем исследовании был связан со степенью анаплазии. Опухоли с прогрессирующим течением преобладали в группе карцином вЗ - 47,2%, в группе в2 составляли 10,8%, а в - 5,9%. Мы не обнаружили связи степени дифференцировки с рецидивами. Возможно, имеет значение способ лечения и более агрессивная тактика, в частности хирургическая, применяемая при уротелиальном РМП с высокой степенью анаплазии.

Изучалась значимость метапластических изменений в РМП. Обнаружено, что в умеренно и низкодифференцированных уротелиальных карциномах плоскоэпителиальная и железистая метаплазия выявлена в 50,5% и 56,9% случаев соответственно, в то время как в высокодифференцированных карциномах - лишь в 2,15% наблюдений. Отмечено также нарастание метапластических изменений с увеличением стадии процесса. Однако достоверной зависимости прогноза от этого фактора получено не было, отмечено некоторое увеличение (47,3%) частоты метапластических изменений в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением. Это вероятнее всего связано не столько с клиническим поведением опухоли, сколько с повышением степени анаплазии, которая, безусловно, сопровождается изменением направления дифференцировки опухолевых клеток. Особенно это свойственно уротелиальной карциноме, так как и нормальный уротелий обладает свойствами и железистого и плоского эпителия.

Мы не выявили связи между наличием сосудистой инвазии и метастатическим поражением лимфатических узлов, однако обнаружили корреляцию со степенью дифференцировки. В карциномах инвазия опухоли в сосуды констатирована в 16,1% наблюдений, в2 -23,8%, вЗ - 51,4%. Таким

образом, более чем в половине низкодифференцированных уротелиальных карцином отмечается врастание в сосуды, что обусловлено, вероятнее всего, способностью этих опухолей вырабатывать значительное количество протеаз, разрушающих базальные мембраны и облегчающих проникновение клеток в сосудистое русло. Этим можно объяснить и значительное число наблюдений с сосудистой инвазией в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением (72,7%). В группе опухолей с упорно рецидивирующим течением инвазия сосудов обнаружена в 39,2% случаев, в группе с благоприятным прогнозом - 8,9%.

В исследовании Jimenez R.E. at al (2000) рекомендуется указывать не только глубину, но и способ стромальной инвазии. Считается, что опухоль, инфильтрирующая строму «широким фронтом», менее агрессивна, чем «щупальцеобразный» рост. Мы изучили способ стромальной инвазии у пациентов с уротелиальной карциномой стадии Т1. Не выявлено зависимости способа стромальной инвазии от степени дифференцировки опухоли. Также установлено, что способ стромальной инвазии рака достоверно не влияет на прогноз, однако нельзя не отметить тенденцию к некоторому повышению частоты щупальцеобразного роста в третьей прогностической группе.

Кроме формальных морфологических характеристик большое значение имеют индивидуальные молекулярно-генетические свойства опухоли, которые обуславливают ее биологическую агрессивность.

В результате проведенных исследований было выявлено достоверное увеличение пролиферативной активности при снижении степени дифференцировки уротелиальных карцином (G1 - среднее значение PCNA 35,2%, KÍ67- 27,5%. G2 - PCNA - 49,4%, KÍ67 - 41,9%. G3 -PCNA - 59,3%, KÍ67 - 49,4%. коэффициенты корреляции для PCNA и KÍ67 0,39 и 0,4 соответственно).

Экспрессия маркеров пролиферации не отличалась в опухолях разных стадий. Отмечено повышение пролиферативной активности и в опухолях с наличием сосудистой инвазии (среднее значение РСМД - 50,1 %, «¡67 - 42%, в опухолях без инвазии сосудов - РСЫА - 38,8%, «¡67 - 30,2%). По нашим данным, в опухолях с благоприятным прогнозом и упорно рецидивирующих пролиферативная активность не отличалась. Следует отметить, что высокая пролиферативная активность отмечалась в части неинвазивных высокодифференцированных уротелиальных карцином, а также в случаях благоприятного прогноза, поэтому, на наш взгляд, маркеры пролиферации не могут являться самостоятельными предикторными факторами.

При изучении факторов апоптоза Ьс1-2, Ьс1-х, С095 не было выявлено каких-либо закономерностей в экспрессии этих маркеров.

Огромное значение онкологи придают изменению функции белка р53 и его влияния на прогноз РМП. Существуют сведения о влиянии р53 на миграционную способность клеток. В эпителиальных клетках р53 способен к подавлению экспрессии Е-кадхерина на поверхности клеток, что ведет к нарушению межклеточных контактов и повышению миграционной способности и инвазии раковых клеток. При исследовании экспрессии мутантного белка р53 выявлена корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,43), стадией заболевания (коэффициент 0,37). (рис. 1) Также отмечено повышение экспрессии р53 в опухолях с наличием сосудистой инвазии и метастазами в лимфатических узлах. Регулируя активность гена \ZEGF-C, р53 может стимулировать размножение и миграцию лимфатического эндотелия, индуцируя лимфангиогенез в опухоли и регионарных лимфоузлах, способствуя, таким образом, лимфогенному метастазированию. Выявлена корреляция уровня экспрессии р53 с прогнозом заболевания (коэффициент 0,34).

су %

%% % ъ

ь % %

Рис. 1. Экспрессия р53 в РМП. (в1 - 63 - степень диффвренцировки; СИ сосудистая инвазия; N ~ статус лимфатических узлов; 1гр - Згр прогностические группы).

При сопоставлении результатов иммуногистохимического и генетического исследования (секвенирование гена ТР53) было показано отсутствие корреляции между содержанием белка р53 и мутациями его гена. Позитивная иммуногистохимическая реакция может быть обусловлена стрессиндуцированной стабилизацией белка дикого типа, а инактивирующие мутации ТР53 могут уменьшать или не изменять содержание белка.

Белок циклин входит в семейство циклинов, функционально он связан с важными регуляторными белками клетки, такими как р53, р1б, Р?Ь и другими. При изучении экспрессии этого белка были получены результаты, сходные с экспрессией р53. Обнаружена значимая корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,49), наличием сосудистой инвазии (коэффициент 0,38) и метастазами в лимфатических узлах. Выявлено повышение

экспрессии циклина 01 с увеличением стадии заболевания, однако корреляция не является значимой. Кроме того, отмечено повышение экспрессии циклина Р1 в опухолях с метастазами в лимфатических узлах, а также в карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением, (рис. 2) Эти данные подтверждают мнение о циклине 01 как о маркере неблагоприятного прогноза для РМП.

75 50 25

О

п V < - , С/; : •

55,8

56,2

57,4

38,3

21Д

49,8

30,2

35,7

37,6

30,8

^ ^ % % ^ ** Ъ % ^

Рис. 2. Экспрессия циклина 07 в РМП.

Значимую роль в канцерогенезе играет ген-супрессор опухолевого роста

/Л/К4а, продует этого гена - белок р16 является ингибитором циклин-Д-зависимых

киназ и задерживает клетку в Б-фазе. При мутациях гена белок не

вырабатывается, что приводит к пролиферации и неконтролируемому делению

клеток. Известно, что при раке шейки матки уровень р16 наоборот повышается,

это обусловлено участием белка Е7 вируса папилломы человека. РМП является

опухолью урогенитальной зоны и в части случаев связан с папилломавирусной

инфекцией, поэтому изучение р16 представляет значительный интерес. При

анализе экспрессии этого белка не было выявлено статистически значимых

20

различий в зависимости от степени дифференцировки опухоли, стадии заболевания и наличия сосудистой инвазии. Отмечена лишь тенденция к некоторому снижению экспрессии р16 со снижением степени дифференцировки опухоли. Кроме того, уровень экспрессии р16 отличался в опухолях с метастазами в регионарные лимфатические узлы и без метастазов. Средний показатель в группе с метастазами составил 38,1%, в группе без метастазов -19,8%. В отличие от карциномы шейки матки не обнаружена достоверная связь с вирусной инфекцией, было отмечено лишь некоторое повышение его экспрессии в опухолях, содержащих ДНК ВПЧ. ДНК ВПЧ 16 и 18 типов выявлена у 23 из 79 больных (29,1%), при этом не проводилось специального отбора образцов, в которых присутствуют морфологические признаки вирусной инфекции в виде койлоцитоза (при таком отборе число опухолей с ДНК ВПЧ может достигать 50%). В исследованных опухолях чаще выявлялась ДНК ВПЧ 16 типа, причем отмечалась заметная тенденция к преобладанию этого вируса в опухолях с рецидивирующим течением заболевания. ДНК ВПЧ 16 типа обнаружена в 30% карцином с рецидивирующим течением и в 14% - 1 прогностической группы (благоприятный прогноз).

Экспрессия рецепторов эпидермальных факторов роста НЕР12/пеи и ЕСР1Ч в нашем исследовании не была связана с прогнозом заболевания. Отмечена гиперэкспрессия этих белков лишь в немногочисленных, хотя преимущественно низкодифференцированных карциномах, а также в опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Однако нельзя не отметить низкий процент амплификации гена НЕИ2/пеи в опухолях с гиперэкспрессией соответствующего белка (амплификация гена обнаружена в 8,7% случаев с НЕИ2-статусом 2+ и в 41,7% с НЕР*2-статусом 3+). При генетическом исследовании установлено, что в карциномах с гиперэкспрессией НЕК2/пеи, имела место

полисомия 17 хромосомы, что, по всей видимости, и обусловило гиперпродукцию белка, однако наличие полисомии не является основанием для назначения таргетной терапии.

Не только биология клеток опухоли определяет ее инвазивный и метастатический потенциал, но и изменения в структуре белков межклеточного матрикса. Замена белков типичной соединительной ткани на тенасцин приводит к утрате клетками адгезивных свойств и способствует их миграции и имплантации на отдалении. Доказано, что большое значение для прогноза РМП имеет не столько появление тенасцина, сколько повышение его количества, которое мы определяем по разработанной в отделении методике. Выявлено, что количественное содержание тенасцина достоверно возрастало с понижением степени дифференцировки опухоли, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Обнаружено высокое содержание тенасцина в РМП у пациентов третьей прогностической группы (опухоли с прогрессирующим течением), (рис. 3)

Рис. 3. Количественное содержание тенасцина в РМП.

Нормальные белки, входящие в состав БМ и ВКМ, коллаген IV типа и ламинин, активно участвуют в межклеточных взаимодействиях и клеточно-субстратной адгезии. В нашем исследовании выявлено значительное снижение экспрессии ламинина и коллагена в низкодифференцированных карциномах МП. (рис. 4) Кроме того, обнаружена обратная корреляция со стадией процесса и сосудистой инвазией. Достоверных отличий в выработке этих белков у больных с метастазами и без метастазов в лимфатических узлах выявлено не было, также как и в группах с различными способами стромальной инвазии. Нет оснований считать уровень экспрессии ламинина и коллагена независимым прогностическим фактором, хотя в опухолях третьей прогностической группы было снижено их содержание.

Рис. 4. Экспрессия ламинина и коллагена IV в РМП.

Помимо белков ВКМ важную роль в процессе инвазии и метастазирования играют молекулы адгезии, Е-кадхерин и (3-катенин, которые обеспечивают прочные межклеточные контакты и препятствуют миграции клеток опухоли за пределы первичного очага. Достоверно снижается экспрессия этих

гликопротеидов при повышении степени анаплазии опухоли. Кроме того, сниженное содержание молекул адгезии ассоциировано с наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах, (рис. 5) Очевидно, что утрата адгезивных свойств ведет к повышению инвазивной и метастатической активности. Отмечено заметное снижение экспрессии этих гликопротеидов в уротелиальных карциномах третьей прогностической группы, при этом связи с рецидивами РМП мы не обнаружили.

Рис. 5. Экспрессия Е-кадхерина и р-катенина в РМП.

Большая часть исследованных опухолей вырабатывает неспецифические молекулы адгезии Сй44, существенно влияющие на инвазивный и метастатический потенциал опухолевых клеток. При изучении характера экспрессии СР44 мы обнаружили, что имеет значение не только интенсивность реакции, но и локализация специфического окрашивания в опухоли. Именно перераспределение из клеток в строму сопровождает повышение агрессивности опухоли. Обнаружено значительное увеличение экспрессии 0044 в строме низкодифференцированных карцином, в опухолях с наличием сосудистой инвазии

Е-кадхерин

р-катенин

и метастазами в лимфоузлах. Обнаружены различия и при анализе прогностических групп, однако здесь они статистически не достоверны, (рис. 6)

100%

50

62

23,2 22

61,6

25,4

35,4

tr'i*.

и

75

71,2

37,5

21,1

Qp % % % % % % %

Рис. в. Экспрессия CD44 в РМП.

Опухолевые клетки выделяют металлопротеиназы, которые расщепляют компоненты ВКМ. Особенно увеличивается количество и скорость выделения ММР в зонах инвазивного роста опухоли. Мы изучали не только экспрессию ММР, но и их ингибиторов. Отмечено существенное повышение экспрессии ММР-2 и 9 в низкодифференцированных карциномах в совокупности с понижением уровня TIMP. Подобный характер реакций наблюдался в карциномах с сосудистой инвазией, (рис. 7) Вместе с тем, уровень экспрессии ММР-1 не связан со степенью анаплазии рака, однако отмечено значительное снижение экспрессии этой протеазы в инвазивном РМП (стадии Т2-4). В карциномах с метастазами в лимфатические узлы отмечена повышенная экспрессия ММР-2 и ММР-9 в 79 и 71% случаев соответственно и сниженная экспрессия ингибиторов металлопротеиназ.

Рис. 7. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в РМП.

Прогностическое значение для РМП имели преимущественно ММР-2 и 9, Т1МР-1 и Т1МР-2. (рис. 8) Мы обнаружили значительное повышение экспрессии ММР-2 и ММР-9 и лишь относительное повышение ММР-1 в опухолях с прогрессирующим характером течения. Вместе с тем, в этой группе отмечается устойчивое снижение экспрессии ингибиторов металлопротеиназ. На наш взгляд, уровень экспрессии ММР-2, ММР-9, Т1МР-1 и Т1МР-2 может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП.

Рис. 8. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в разных прогностических группах РМП.

При сопоставлении иммуногистохимических факторов была обнаружена корреляция между некоторыми маркерами. Высокая экспрессия циклина 01 сопровождается снижением уровня р-катенина, ламинина, коллагена и Т1МР, однако сочетается с повышенным уровнем тенасцина и ММР. Стромальная гиперэкспрессия неспецифической молекулы адгезии С044 коррелирует с повышением уровня тенасцина и ММР и понижением Т1МР. (рис. 9)

р-кат лам кол С 044 Цикл тен

Цикл 01 0 О 0

р53 0

тен 0 о о • •

ММР о • • •

Т1МР • О О

С 044 0

Рис. 9. Корреляция экспрессии исследуемых маркеров. • прямая (коэкспрессия) О обратная

Кроме состояния ВКМ, уровня протеаз и их ингибиторов, важную роль играет неоангиогенез в опухоли, который во многом определяет ее клиническое поведение и прогноз. Раковые клетки секретируют факторы роста, стимулирующие миграцию эндотелия, пролиферацию и образование капилляров. Степень развития микроциркуляторного русла может влиять на чувствительность опухоли к химиотерапии, определять метастатический потенциал. Наиболее целесообразным представляется изучение не только плотности сосудов, но и уровня экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (\ZEGF), являющегося одним из основных факторов ангиогенеза. При изучении плотности сосудов микроциркуляторного русла выявлена значимая корреляция между интенсивностью васкуляризации и степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). (рис. 10) Отмечено увеличение числа сосудов в карциномах с наличием мышечной инвазии (стадии Т2-3). (рис. 11) Не было

обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от наличия

метастазов в лимфатических узлах.

О 100 200 300 400

Количество сосудов на 1мм2

Рис. 10. Плотность микрососудистого русла в РМП разной степени дифференцировки.

0 100 200 300 400

Количество сосудов на 1мм2

Рис. 11. Плотность микрососудистого русла в РМП различных стадий.

Интересно, что наиболее выраженная экспрессия \ZEGF отмечена в опухолях со средними значениями плотности васкуляризации (102-150 сосудов на 1мм2), причем реакция наблюдалась как в паренхиме, так и в сгроме РМП. Возможно, существуют механизмы регуляции синтеза и выделения эндотелиального фактора роста, действующие по принципу обратной связи. Отмечена тенденция к увеличению плотности сосудов в карциномах с метастазами в лимфатических узлах. Известно, что \ZEGF принимает участие в образовании новых лимфатических сосудов, способствуя лимфогенному распространению опухоли. Имеются также данные о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму. При сравнительном анализе ангиогенеза и экспрессии ММР обнаружена прямая корреляция с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты корреляции 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем ингибиторов металлопротеиназ Т1МР1 и Т1МР2 (коэффициенты корреляции 0,4 и 0,41). Гиперэкспрессия металлопротеиназ отмечалась в опухолях с высокой плотностью васкуляризации, однако для ММР2 данные статистически не достоверны. Эти результаты подтверждают, что металлопротеиназам принадлежит важная роль в стимуляции ангиогенеза.

Учитывая гетерогенность морфологического строения некоторых уротелиальных карцином, мы изучали наиболее характерные генетические повреждения в различных участках опухоли и окружающей ткани с использованием предварительной лазерной микродиссекции. Не выявлено генетической гетерогенности РМП. Делеции гена р16 выявлены в 60% случаев, причем в 66,7% из них аналогичное повреждение обнаружено в окружающем нормальном уротелии. Микросателлитная нестабильность локуса 9р выявлена в 6,7%

образцов уротелиальной карциномы при отсутствии мутаций в участке нормального эпителия. Делеции гена ТР53 установлены в 53 случаях, в половине из них и в окружающей неизмененной слизистой оболочке. Мутации в 7-м экзоне гена обнаружены в 40% случаев только в клетках опухоли и не

обнаружены в нормальном уротелии. Мутации ЯЗРЯЗ были выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке.

Было проведено исследование на гистологических срезах с использованием Р13Н-набора 1)го\/узюп. Обнаружены хромосомные аберрации во всех изученных образцах, причем в 80% - сочетание потрем исследуемым хромосомам (3,7 и 17). Делеция гена р16 выявлена в 70% случаев. Для умеренно и низкодифференцированных карцином, а также инвазивных опухолей (Т2-3) была характерна выраженная полиплоидия хромосомы 3, а в высокодифференцированных поверхностных карциномах 3 прогностической группы отмечена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16.

Повышение степени анаплазий РМП связано с прогрессирующим течением заболевания, но не с местными рецидивами. Наличие плоскоклеточной или железистой метаплазии выявляется в уротелиальной карциноме в2-3, однако не оказывает прямого влияния на прогноз заболевания, а обусловлено изменением направления дифференцировки опухолевых клеток при нарастании уровня анаплазии. Сосудистая инвазия не повышает частоту лимфогенных метастазов, однако, коррелирует со степенью дифференцировки, рецидивирующим и прогрессирующим течением процесса. Способ стромальной инвазии в карциномах Т1 не имеет прогностической значимости.

Маркеры пролиферативной активности РСЫА и «¡67 и факторы апоптоза Ьс!-2, Ьс1-х, С095 не могут являться самостоятельными прогностическими факторами. Уровень экспрессии цикпина коррелировал со степенью дифференцировки опухоли, стадией, наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах. Средний уровень циклина 01 в опухолях с прогрессирующим течением составил 57,4%, а в опухолях с благоприятным прогнозом и рецидивирующим течением не превышал 38%.

Белок р53 является самостоятельным фактором прогноза, уровень его экспрессии повышен в опухолях с рецидивирующим и прогрессирующим характером течения (коэффициент корреляции 0,34), кроме того, усиливается его экспрессия в низкодифференцированных и инвазивных карциномах (более 25%), в том числе с наличием сосудистой инвазии, а также в опухолях с метастазами в лимфатических узлах (более 32%).

Уровень экспрессии белка р16 не связан со степенью дифференцировки опухоли, стадией заболевания, сосудистой инвазией и статусом лимфатических узлов, нет значимой корреляции и с вирусной инфекцией. Имеется связь ВПЧ 16 типа с рецидивами поверхностной уротелиальной карциномы (ДНК ВПЧ выявлена в 30,2% рецидивирующих опухолей и в 14% карцином с благоприятным прогнозом).

Гиперэкспрессия эпидермальных факторов роста НЕЯ2/пеи и ЕвРЯ выявлена в немногочисленных случаях, преимущественно низкодифференцированных карциномах, опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Нет прямой связи статуса этих рецепторов с прогнозом РМП. Повышение выработки НЕИ2/пеи было обусловлено в большинстве случаев (58,3%) не амплификацией соответствующего гена, а полисомией 17 хромосомы.

Количественное содержание антиадгезивного гликопротеида - тенасцина значительно возрастает с понижением степени дифференцировки опухоли, началом инфильтративного роста, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. При этом отмечается значительное снижение экспрессии нормальных компонентов ВКМ, ламинина и коллагена. Более чем в два раза повышается содержание тенасцина в РМП у пациентов с прогрессирующим течением заболевания (в среднем 46,3%).

Происходит заметное снижение экспрессии молекул адгезии, Е-кадхерина и р-катенина в уротелиальных карциномах с прогрессирующим течением, наличием метастазов в лимфатических узлах и сосудистой инвазией, однако нет связи с рецидивами РМП. В низкодифференцированных карциномах выявляется не только значительное увеличение экспрессии С044, но и

перераспределение белка из клеток в строму опухоли (коэффициент корреляции 0,39). Выявлено также значительное увеличение стромальной экспрессии СР44 в опухолях с наличием сосудистой инвазии (61,6%) и метастазами в лимфоузлах (75%).

8. Уровень экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП, В опухолях с прогрессирующим характером течения выявлено значительное повышение основных факторов инвазии - ММР-2 и ММР-9 (гиперэкспрессия обнаружена в 75,1 и 88% опухолей соответственно) и устойчивое снижение экспрессии Т1МР-1 и Т1МР-2. Аналогичное распределение выявлено в низкодифференцированных карциномах, опухолях с метастазами в лимфатические узлы и наличием сосудистой инвазии.

9. Интенсивность васкуляризации достоверно связана со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). Не обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от стадии процесса и наличия метастазов в лимфатических узлах, однако по сравнению с поверхностными карциномами отмечено увеличение числа сосудов с появлением мышечной инвазии (стадии Т2-4). Имеется прямая корреляция неоангиогенеза с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем Т1МР1 и Т1МР2 (коэффициенты -0,4 и -0,41). Эти данные свидетельствуют о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму.

В уротелиальных карциномах разной степени дифференцировки и стадий обнаружены сходные молекулярно-генетические нарушения ДНК. Выявленные делеции генов р16 и ТР53 более чем в половине случаев сочетаются с аналогичными повреждениями в морфологически нормальном уротелии, что свидетельствует о более ранних поломках в геноме клеток. Мутации НЗРЯЗ выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке МП.

Для умеренно и низкодифференцированных карцином, а также инвазивных опухолей (Т2-3) характерна выраженная полиплоидия хромосомы 3. В высокодифференцированных поверхностных карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением отмечена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16.

Практические рекомендации

Результаты проведенных исследований выявили ряд значимых прогностических факторов для РМП. Показано значение комплексного подхода к индивидуальной оценке биологического потенциала опухоли. Полученные результаты позволяют сформулировать следующие практические рекомендации:

1. Для выявления риска рецидивирования поверхностного РМП необходимо определение уровня экспрессии мутантного белка р53, а при наличии множественных очагов поражения и локализации опухоли в области шейки МП или треугольника Льето - проведение анализа на наличие ДНК ВПЧ.

2. Уточнение инвазивного и метастатического потенциала РМП требует оценки уровня металлопротеиназ и их ингибиторов.

3. Для оценки возможности проведения таргетной терапии необходимо Р18Н-исследование по выявлению амплификации генов.

4. Оценку биологической агрессивности опухоли целесообразно проводить иммуногистохимическим методом с использованием следующей панели антител: к циклину т, р53, Е-кадхерину, р-кэтенину, С044, коллагену IV типа, тенасцину, матриксным металлопротеиназам (ММР-1, ММР-2), тканевым ингибиторам металлопротеиназ 1 и 2 типа.

5. Необходимо не только качественное, но и количественное определение тенасцина с использованием предложенной оригинальной методики.

Публикации по теме диссертации

1. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Маныкин A.A., Андреева Ю.Ю. Выявление ДНК вируса папилломы человека при переходноклеточном раке мочевого пузыря. // Русский журнал ВИЧ/СПИД, 2001, том 5, № 1, с.23.

2. Frank J., Zavalishina L., Andreeva Yu. Immunohistochemical study of hihg-grade intraurothelial neoplasia and early carcinoma of bladder. // Virchows Archiv, 2001, Vol. 439, №3, p. 397.

3. Франк Г.А., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э. Кишечная метаплазия мочевого пузыря. II Архив патологии, 2002, №6, с. 56-57,

4. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимическая характеристика и степень дифференцировки рака мочевого пузыря. // Архив патологии, 2002, №6, с. 16-19.

5. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Изучение прогностически значимых иммуногистохимических характеристик рака мочевого пузыря. // "Актуальные вопросы онкологии", Материалы международной научно-практической конференции. Иркутск, 2003, с.162-164.

6. Маныкин A.A., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Детекция ДНК вируса папилломы человека методом гибридизации in situ в тканях шейки матки, гортани и мочевого пузыря с различной патологией этих органов. II Молекулярная медицина, 2003, №1, с.1-8.

7. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Изучение морфологических факторов прогноза рака мочевого пузыря. //Тезисы доклада съезда онкологов СНГ, Минск, 2004, с.78.

8. Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Головина Д.А, Андреева Ю.Ю. Экспрессия белка р16 в клетках некоторых распространенных форм карцином. //Архив патологии, 2004, №5, с.8-13.

9. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю., Маныкин A.A. Выявление вирусов папилломы человека при опухолях эпителиальной природы. II Пособие для врачей, Москва, 2004.

10. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Yu. Morphologycal prognostic factors of the bladder cancer, immunohistochemical study. II Pathology International, 2004, vol.54, №2, p.142.

11. Алексеев Б.Я., Русаков И.Г., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Первично-множественный рак мочевого пузыря и предстательной железы у больных, перенесших радикальную цистэктомию. // Онкоурология, 2005, №2, с. 40-45.

37

12. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Состояние внеклеточного матрикса и маркеры адгезии в уротелиальном раке мочевого пузыря. II Архив патологии, 2005, №3, с.11-14.

13. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Yu. Immunohistochevica! prognosticfactors of uroihelial carclnoma. И Virchows Archiv, 2005, Vol 447, №2, p.348.

14. Франк Г.А., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э. Актуальные аспекты современной классификации эпителиальных опухолей мочевого пузыря. И Практическое пособие, Москва, 2005.

15. Русаков И. Г., Алексеев Б.Я., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Первично-множественный рак мочевого пузыря и предстательной железы у больных, перенесших радикальную цистэктомию. // Материалы IV Всероссийского съезда онкологов, 2005, г.Ростов-на-Дону, с.415-416.

16. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимические факторы прогноза рака мочевого пузыря и легкого. II Материалы IV Всероссийского съезда онкологов, 2005, г.Ростов-на-Дону, с.174-175.

17. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Молекулы адгезии и состояние внеклеточного матрикса как прогностические факторы при раке. II Сборник тезисов II Международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность», Москва, 2005, с. 134.

18. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Прогностическое значение молекул адгезии и внеклеточного матрикса в уротелиальной карциноме мочевого пузыря. // Российский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы,

2005, том.9, №1, с,72.

19. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Yu. Immunohisnochemical study of urothelial carcinoma in patients with différent tumor progression risk. // Modem pathology,

2006, V.19, Suppl.3, p.115.

20. Завалишина Л.Э., Франк Г.А.. Андреева Ю.Ю. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы при уротелиальном раке мочевого пузыря и светлоклеточном раке почки. II Материалы съезда онкологов СНГ, Баку, 26-28 сентября, 2006, с. 58.

21. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимическое исследование прогностических факторов при уротелиальной карциноме. II Актуальные вопросы морфологической, иммуногистохимической и цитологической диагностики злокачественных новообразований, Томск, 2006, электронная версия.

22. Volgareva G.M., Zavalishlna L.E,Goiovina D.A., Andreeva Yu.Yu., Petrov A.N.,Ermilova V.D., Petrenko A.A., Katargin A.N., Bateva M.V., Kissetjova N.P, Frank G.A. The protein p16INK4a as a reliable indicator of the HPV-induced carcinogenesis. // New Research on Cervical Cancer (roliand GZ, ed). Nova Science Publishers, 2006.

23. Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Андреева Ю.Ю. Уточняющая диагностика при раках некоторых локализаций с использованием иммуногистохимических маркеров. II Практическое пособие, Москва, 2006.

24. Андреева Ю.Ю., Завалишина Н.Э., Франк Г.А. Эпителиальные опухоли мочевого пузыря. Классификация. //Архив патологии, 2006, №5, с.46-52.

25. Андреева Ю.Ю..Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Молекулярно-биологические факторы прогноза уротелиальной карциномы мочевого пузыря. // Межрегиональный сборник научных трудов под ред. Е.П. Куликова, Рязань: Узорочье, 2006, с.14-16.

26. Алексеев Б.Я.,Воробьев Н.В.,Быстрое С.В.,Майновская О.А., Батева М.В., Андреева Ю.Ю. Радикальная цистпростатвезикулэктомия при инвазивной аденокарциноме мочевого пузыря с атипичным клиническим течением. Н Российский онкологический журнал, 2006, №5, с.16-21.

27. Volgareva G.M., Zavalishlna L.E, Goiovina D.A., Andreeva Yu.Yu.,Cheban N.I., Ermliova V.D., Petrov A.N., Bateva M.V., Matveev V.B., Shtil A.A., Frank G.A. In search of bladder cancer markers: are human papillomaviruses and cellular INK4a expression associated?// New Research on Tumor Markers (Sinise GA, ed). Nova Science Publishers, 2006.

28. Volgareva G.M., Zavalishina L.E., Goiovina D.A., Andreeva Yu.Yu., Petrov A.N., Ermilova V.D., Petrenko A.A., Katargin A.N., Bateva M.V., Kisseljova N.P., Frank G.A. The protein p16INK4a as a relitable indicator of the HPV-induced carcinogenesis. // New Research on Cervical Cancer, Editor G.Z. Roliand, Nova Biomedical, 2007 by Nova Science Publishers, Inc, Chapter 5, p.129-147.

29. Немцова M.B., Землякова B.B., Кузнецова E.B., Бабенко О.В., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Батева М.В., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Анализ корреляции генетических и иммуногистохимических маркеров (гены-регуляторы клеточного цикла RB1, р16 и р53) при спорадическом раке молочной железы. II Архив патологии, 2007, том 69, №2, с.3-6.

30. Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Петров А.Н.,Франк Г.А Значимость экспрессии онкопротеина Her-2/neu и компонента межклеточного матрикса тенасцина для метастатической активности рака мочевого пузыря. II Онкоурология, 2007, №1, с.37-39.

31. Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Факторы прогноза рака мочевого пузыря. // Российский онкологический журнал, 2007, №3, с. 47-51.

32. Немцова М.В., Михайленко Д.С., Кекева Т.В., Кузнецова О.А., Башкатов С.В., Курынин Р.В., Попов A.M., Попова О.П., Шегай П.В., Андреева Ю.Ю., Алексеев Б.Я., Еникеев М.Э., Аляев Ю.Г., Карякин О.Б., Русаков И.Г., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии. II Молекулярная медицина, 2007,№3, с.43-54.

33. Андреева Ю.Ю., Завалишина Н.Э., Майновская О.А., Батева М.В., Франк Г.А. Персгневидноклеточный рак мочевого пузыря. II Архив патологии ,2007, №6, с.32-34.

34. Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Морозов А.А., Русаков И.Г., Франк Г.А. Выявление ДНК вируса папилломы человека в поверхностной уротелиальной карциноме мочевого пузыря.// Онкоурология, 2008, N91, с.34-35.

35. Volgareva G.M., Kuevda D.A., Zavalishina L.E., Shipulina O.Y., Trofimova O.B., Golovina D.A., Andreeva Y.Y., Ermilova V.D., Cheban N.L., Glasunova V.A., Bateva M.V., Petrov A.N., Matveev V.B., Stil A A., Frank G.A. Human papilloma viruses: is bladder urothelium a target of their carcinogenic action? // International Union Against Cancer UICC World Cancer Congress 27-31 August, 2008, Geneva, Switzerland, POS-C215

36. Frank G., Zavalishina L., Andreeva Y., Golovina D„ Volgareva G. Can P16 INK4a overexpression serve as an indicator of HPV-assoclated carcinogenesis in bladder uronhelium?// XXVII International Congress of the International Academy of Pathology, 2008, October, Athens, Greece, p. 274.

37. Волгарева Г. M., Завалишина Л. Э., Андреева Ю. Ю., Штиль А. А., Франк Г. А. Гиперэкспрессия клеточного белка p1elNK4a в эпителиальных злокачественных опухолях, индуцированных вирусами папиллом человека. // Архив патологии,

2008, №5, с. 57-60.

38. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Уточняющая диагностика рака с использованием иммуногистохимического определения маркеров. // Медицинская технология, Москва, 2009.

39. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Методы иммуногистохимии и гибридизации in situ в онкоморфологии. // Медицинская технология, Москва,

2009.

40. Volgareva G., Trofimova О., Kuevda D., Zavalishina L., Golovina D., Andreeva Y„ Ermilova V., Cheban N., Glazunova V., Matvejev V., Shipulina O., Frank G. HPV and urinary bladder cancer. II 25-th International Papillomavirus Conference, May 8-14 2009, Malmo, Sweden. Conferencebook, P-18.42.

Подписано в печать: 09.07.2009 Исполнено: 10.07.2009 Заказ № 2321 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

- 1 5 0 9 7

2008172053

2008172053

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Рак мочевого пузыря (РМП) занимает седьмое место из девяти самых распространенных локализаций в мире и составляет 3,2% всех карцином. В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря занимает 8-е место среди мужчин и 18-е среди женщин. Заболеваемость раком мочевого пузыря в настоящее время составляет 11,9 у мужчин, и 1,7 на 100 тыс. населения у женщин. Около 80% пациентов относятся к возрастной группе 50-80 лет, а пик заболеваемости приходится на седьмое десятилетие жизни.[Лоран О.Б. с соавт., 2001]. Приблизительно 90% опухолей мочевого пузыря (МП) представлены уротелиальной карциномой, также называемой переходноклеточным раком, при этом опухоли, прорастающие собственную пластинку слизистой оболочки и собственно мышечный слой, составляют 25%. Неинвазивный папиллярный уротелиальный рак низкой степени анаплазии прогрессирует до инвазивного менее чем в 5% случаев, однако рецидивы развиваются у 48-71% пациентов. При неинвазивном папиллярном раке высокой степени анаплазии риск прогрессирования повышается от 15 до 40%, по разным данным. Кроме того, эти опухоли имеют высокий риск ассоциации с инвазивным раком на момент установления диагноза. При инвазивных карциномах большое значение имеет как степень анаплазии, так и глубина прорастания в стенку МП. [Zhou М., Magi-Galluzzi С., 2007]

Наиболее значимыми факторами прогноза РМП считают размеры опухоли, множественность очагов поражения, глубину инвазии, наличие метастазов, степень дифференцировки, наличие очагов карциномы in situ. Ведутся дискуссии о влиянии гистологического варианта рака на прогноз заболевания. Однако анализ перечисленных критериев не дает возможности индивидуального прогнозирования течения заболевания, между тем как опухоли одной стадии и степени анаплазии могут иметь различное клиническое поведение. Необходимо изучение индивидуальных свойств опухоли, ее биологической агрессивности, способности к инвазии, метастазированию, склонности к рецидивированию. В последние годы предпринимаются многочисленные попытки выявления самостоятельных иммуногистохимических факторов прогноза РМП. Активно изучаются процессы апоптоза и пролиферации. Снижение способности к апоптозу у опухолевых клеток играет существенную роль в развитии многих опухолей, в том числе и РМП, однако осуществляется это с помощью различных механизмов, анализ которых может быть полезен для оценки существующих и поиска новых путей подавления опухолевого роста. Избыточная экспрессия HER-2/neu в опухоли сопровождается резким снижением апоптоза, усилением пролиферации клеток, снижением эффективности химио- и гормонотерапии и т.д., однако для РМП его роль изучена недостаточно. Онкогенная трансформация клетки часто сопровождается мутацией в гене р53 и превращением его из индуктора в ингибитор апоптоза. [Cordon-Cardo С.1995, Tang D.G.,1996]. Существует множество других факторов, регулирующих апоптоз. К ним относят семейство белков bcl-2, включающее более двух десятков протеинов: bcl-2, mcl-1, Bcl-X, ВАХ, Bad, ВАК и некоторые другие [Matias-Guiu Х.,1998]. Их значимость для прогноза находится на этапе изучения и накопления материала.

Для опухолевых клеток характерно уменьшение или полная утрата адгезивных свойств, что ведет к дезорганизации ткани и хаотичности расположения отдельных гистологических структур. Одну из важных ролей в этом процессе играют молекулы кадхеринов. Прогрессирование опухоли часто связано именно с инактивацией генов, контролирующих экспрессию Е-кадхерина. Показано, что супрессия активности Е-кадхеринов может стать пусковым моментом для миграции клеток опухоли за пределы первичного очага. В агрессивных формах рака инактивация генов, контролирующих экспрессию Е-кадхерина, встречается достаточно часто и является причиной не только событий, характерных для позднего карциногенеза (метастазирования и инвазии), но в некоторых гистологических типах опухолей человека имеют место уже на ранних стадиях развития новообразования. К сожалению, исследованию Е-кадхерина и катенинов в РМП посвящено совсем немного работ. Изучение роли кадхерин-катениновой системы в развитии и прогрессировании РМП может оказать значительное влияние на выбор тактики лечения больных.

Важную роль в развитии опухоли, несомненно, играет внеклеточный матрикс (ВКМ). Матриксные металлопротеиназы (ММР) обеспечивают проницаемость ВКМ при инвазии и метастазировании рака. Для всех ММР существуют соответствующие специфические ингибиторы - тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP). Эти энзимы принимают активное участие в неопластической трансформации, обеспечивая клеткам опухоли способность к инвазии и метастазированию. Скорость выделения металлопротеиназ увеличивается в пролиферирующих и опухолевых клетках, особенно локализованных в зонах инвазии опухоли, где они выделяются непрерывно и в большом количестве. Они воздействуют на микроокружение опухоли, способствуя разрушению ВКМ, инвазии и формированию метастазов [Hirohashi S.,1998] Механизмы, стимулирующие отделение металлопротеиназ от клеточной мембраны, сейчас активно изучаются. Значимость экспрессии ММР и их ингибиторов для РМП нуждается в тщательном изучении также, как исследование компонентов ВКМ (коллагенов, протеогликанов, эластина, ламининов, фибронектина).

Кроме того, не всегда экспрессия белка вызвана поломкой определенного гена, и это также нуждается в изучении. В последние годы наши знания о молекулярных механизмах канцерогенеза мочевого пузыря существенно изменились. Хотя многие детали этого сложнейшего процесса остаются не до конца ясными, стало очевидным, что формируются научные основы повышения эффективности диагностики и лечения данной группы злокачественных новообразований. Однако недостаточность данных об особенностях течения РМП диктует необходимость проведения дальнейших исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования Исходя из актуальности выше изложенных проблем, целью настоящего исследования явилось изучение комплекса морфологических и молекулярно-биологических характеристик, определяющих прогноз и биологическую агрессивность рака мочевого пузыря.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Изучить клинико-морфологические факторы, такие как стадия, степень дифференцировки, гистологический вариант опухоли, способ стромальной инвазии и наличие сосудистой инвазии у больных раком мочевого пузыря.

2. Изучить экспрессию и локализацию факторов, отражающих пролиферативную активность опухоли и уровень апоптоза, белков-регуляторов клеточного цикла и ростовых факторов.

3. Изучить экспрессию и локализацию матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов.

4. Изучить особенности экспрессии молекул межклеточной адгезии и их влияние на инвазивный и метастатический потенциал опухоли.

Введение

5. Изучить состояние некоторых составляющих межклеточного матрикса и базальных мембран.

6. Изучить интенсивность ангиогенеза и факторов его стимулирующих.

7. Исследовать роль вируса папилломы человека в возникновении рецидивов поверхностной уротелиальной карциномы.

8. Исследовать некоторые характерные хромосомные и генетические нарушения в уротелиальных карциномах.

9. Сравнить полученные данные и выявить прогностически значимые факторы для рака мочевого пузыря.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование, включающее изучение морфологических, иммуногистохимических и генетических факторов, отражающих различные аспекты биологической агрессивности рака мочевого пузыря.

Проведено сопоставление показателей пролиферативной активности и факторов апоптоза, включая регуляторы клеточного цикла и ростовые факторы. Проведена оценка экспрессии протеаз, способствующих разрушению клеточных мембран и метастазированию рака, а также значимости их ингибиторов. Изучены характеристики внеклеточного матрикса с использованием оригинального объективного автоматизированного метода оценки количества тенасцина в гистологических срезах при иммуногистохимическом окрашивании. Проведены корреляции между состоянием внеклеточного матрикса, уровнем экспрессии молекул адгезии и инвазивным и метастатическим потенциалом РМП.

Впервые разработан оригинальный автоматизированный метод определения плотности сосудистой сети с использованием анализатора изображения, получено положительное решение о выдаче патента на изобретение (заявка №2008111921/15(012887).

Проведены молекулярно-генетические исследования по выявлению генетических и эпигенетических нарушений в РМП на гистологических срезах с использованием метода лазерной микродиссекции. Научно-практическая значимость

Выявлены факторы, влияющие на рецидивирование и прогрессию рака мочевого пузыря. Обнаружена корреляция уровня экспрессии молекул адгезии, белков ВКМ и матриксных металлопротеиназ с прогнозом заболевания. Выявлены новые факты, подтверждающие участие матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в ангиогенезе РМП. Разработанная методика определения плотности сосудистой сети с использованием анализатора изображения существенно облегчит анализ ангиогенеза в опухолях разных локализаций. Методика рекомендуется для применения в патологоанатомических отделениях онкологических центров и научно-исследовательских институтов.

Разработаны рекомендации по применению иммуногистохимического метода с использованием конкретной панели антител, что позволит определить индивидуальный прогноз течения заболевания и выработать индивидуальный план лечения пациента.

Определено значение метода гибридизации in situ с выявлением ДНК ВПЧ для уточнения риска рецидива поверхностного рака МП.

Показана необходимость подтверждения амплификации гена HER2/neu в уротелиальных карциномах с гиперэкспрессией этого белка.

Выявлена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16 в высокодифференцированных поверхностных карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением.

Введение

Полученные данные вносят значительный вклад в исследование механизмов канцерогенеза.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены на ряде всероссийских и международных конференций и съездов: Международной научно-практической конференции, Россия, Иркутск, 2003г., II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность ", Россия, Москва, 2005г., Съездах онкологов СНГ - Белоруссия, Минск, 2004г., Азербайджан, Баку, 2006г., IV Всероссийском съезде онкологов, Россия, Ростов-на-Дону, 2005г., 19 Европейском конгрессе патологии, Германия, Берлин, 2001г., 20 Европейском конгрессе патологии, Франция, Париж, 2005г., XXV Международном конгрессе Международной академии патологии, Австралия, Брисбен, 2004г., XXVI Международном конгрессе Международной академии патологии, Канада, Монреаль, 2006г, Международном противораковом конгрессе, Швейцария, Женева, 2008г, XXVII Международном конгрессе Международной академии патологии, Греция, Афины, 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, их них - 3 пособия для врачей, 2 медицинские технологии, 1 глава в зарубежной монографии, 2 статьи в зарубежных сборниках и 5 публикаций в зарубежных журналах.

ВЫВОДЫ

1. Повышение степени анаплазии РМП связано с прогрессирующим течением заболевания, но не с местными рецидивами. Наличие плоскоклеточной или железистой метаплазии выявляется в уротелиальной карциноме 02-3, однако не оказывает прямого влияния на прогноз заболевания, а обусловлено изменением направления дифференцировки опухолевых клеток при нарастании уровня анаплазии. Сосудистая инвазия не повышает частоту лимфогенных метастазов, однако коррелирует со степенью дифференцировки, рецидивирующим и прогрессирующим течением процесса. Способ стромальной инвазии в карциномах Т1 не имеет прогностической значимости.

2. Маркеры пролиферативной активности РСЫА и КЮ7 и факторы апоптоза Ьс1-2, Ьс1-х, СР95 не могут являться самостоятельными прогностическими факторами. Уровень экспрессии циклина коррелировал со степенью дифференцировки опухоли, стадией, наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах. Средний уровень циклина в опухолях с прогрессирующим течением составил 57,4%, а в опухолях с благоприятным прогнозом и рецидивирующим течением не превышал 38%.

3. Белок р53 является самостоятельным фактором прогноза, уровень его экспрессии повышен в опухолях с рецидивирующим и прогрессирующим характером течения (коэффициент корреляции 0,34), кроме того, усиливается его экспрессия в низкодифференцированных и инвазивных карциномах (более 25%), в том числе с наличием сосудистой инвазии, а также в опухолях с метастазами в лимфатических узлах (более 32%).

4. Уровень экспрессии белка р16 не связан со степенью дифференцировки опухоли, стадией заболевания, сосудистой инвазией и статусом лимфатических узлов, нет достоверной корреляции и с вирусной инфекцией. Имеется связь ВПЧ 16 типа с рецидивами поверхностной уротелиальной карциномы (ДНК ВПЧ выявлена в 30,2% рецидивирующих опухолей).

5. Нет прямой связи статуса эпидермальных факторов роста НЕР?2/пеи и ЕвРК с прогнозом РМП, хотя немногочисленные случаи гиперэкспрессии этих белков были низкодифференцированными карциномами, а, кроме того, повышение НЕР?2-статуса отмечено в опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Амплификации гена НЕР2/пеи выявлена лишь в 41,7% случаев опухолей с гиперэкспрессией соответствующего белка. Гиперэкспрессия НЕР?2/пеи была обусловлена полисомией 17 хромосомы, значение которой не установлено для обоснования таргетной терапии, что ставит под сомнение целесообразность применения герцептина.

6. Количественное содержание антиадгезивного гликопротеида - тенасцина достоверно возрастает с понижением степени дифференцировки опухоли, началом инфильтративного роста, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. При этом отмечается значительное снижение экспрессии нормальных компонентов ВКМ, ламинина и коллагена. Более чем в два раза повышается содержание тенасцина в РМП у пациентов с прогрессирующим течением заболевания (в среднем 46,3%).

7. Происходит заметное снижение экспрессии молекул адгезии, Е-кадхерина и р-катенина в уротелиальных карциномах с прогрессирующим течением, наличием метастазов в лимфатических узлах и сосудистой инвазией, однако нет связи с рецидивами РМП. В низкодифференцированных карциномах выявляется не только значительное увеличение экспрессии Сй44, но и перераспределение ее из клеток в строму опухоли (коэффициент корреляции 0,39). Выявлено также значительное увеличение стромальной экспрессии С044 в опухолях с наличием сосудистой инвазии и метастазами в лимфатических узлах.

8. Уровень экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП. В опухолях с прогрессирующим характером течения выявлено значительное повышение основных факторов инвазии - ММР-2 и ММР-9 и устойчивое снижение экспрессии Т1МР-1 и Т1МР-2. Аналогичное распределение выявлено в низкодифференцированных карциномах, опухолях с метастазами в лимфатические узлы и наличием сосудистой инвазии.

9. Интенсивность васкуляризации достоверно связана со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). Не обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от стадии процесса и наличия метастазов в лимфатических узлах, однако по сравнению с поверхностными карциномами отмечено увеличение числа сосудов с появлением мышечной инвазии (стадии Т2-4). Имеется прямая корреляция неоангиогенеза с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем Т1МР1 и Т1МР2 (коэффициенты -0,4 и -0,41). Эти данные свидетельствуют о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму.

10. В уротелиальных карциномах разной степени дифференцировки и стадий обнаружены сходные молекулярно-генетические нарушения ДНК. Выявленные делеции генов р16 и ТР53 более чем в половине случаев сочетаются с аналогичными повреждениями в морфологически нормальном уротелии, что свидетельствует о более ранних поломках в геноме клеток. Мутации РвРЯЗ выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке МП.

11. Для умеренно и низкодифференцированных карцином, а также инвазивных опухолей (Т2-3) характерна выраженная полиплоидия хромосомы 3. В высокодифференцированных поверхностных карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением отмечена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р7б.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных исследований выявили ряд значимых прогностических факторов для РМП. Показано значение комплексного подхода к индивидуальной оценке биологического потенциала опухоли. Полученные результаты позволяют сформулировать следующие практические рекомендации:

1. Для выявления риска рецидивирования поверхностного РМП необходимо определение уровня экспрессии мутантного белка р53, а при наличии множественных очагов поражения и локализации опухоли в области шейки МП или треугольника Льето - проведение анализа на наличие ДНК ВПЧ.

2. Уточнение инвазивного и метастатического потенциала РМП требует оценки уровня металлопротеиназ и их ингибиторов.

3. Для оценки возможности проведения таргетной терапии необходимо Р15Н-исследование по выявлению амплификации генов.

4. Оценку биологической агрессивности опухоли целесообразно проводить иммуногистохимическим методом с использованием следующей панели антител: к циклину р53, Е-кадхерину, р-катенину, СР44, коллагену IV типа, тенасцину, матриксным металлопротеиназам (ММР-1, ММР-2), тканевым ингибиторам металлопротеиназ 1 и 2 типа.

5. Необходимо не только качественное, но и количественное определение тенасцина с использованием предложенной оригинальной методики.