Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Прогностическое значение исследования маркеров ангиогенеза у больных первичным раком молочной железы

На правах рукописи

КИМ ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

Прогностическое значение исследования маркеров ангиогенеза у больных первичным раком молочной

железы

14.00.14- онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

003463194

Работа выполнена на кафедре онкологии лечебного факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, на базе хирургического отделения опухолей молочных желез, отделения клинической биохимии НИИ КО ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор

И.В. Высоцкая

Н.Е. Кушлинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

К.П. Лактионов A.A. Вишневский

Ведущее учреждение: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования

Защита диссертации состоится-^ 2009 года в часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан «¿^ф^б^рз 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор I л Ю.А. Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

В структуре онкологической заболеваемости женщин рак молочной железы занимает первое место. По последним статистическим данным его удельный вес составляет 19,8% (М.И. Давыдов, Е.М. Аксель, 2007). Несмотря на определенные успехи в диагностике и методах лечения, темпы прироста заболеваемости раком молочной железы неуклонно растут, причем значительную долю составляют местнораспространенные формы заболевания (М.И. Давыдов, В.П. Летягин, 2006). Лечение этих пациенток является сложной задачей. Вот почему проблема прогнозирования исхода болезни и выбора адекватных схем терапии, особенно в неоадъювантном режиме, считается первостепенной в клинической практике.

Решением этой проблемы может стать использование новых молекулярных маркеров, позволяющих увеличить эффективность диагностики и лечения больных раком молочной железы.

Для прогрессии опухоли необходима собственная система кровоснабжения, обеспечивающая ее питание. На сегодняшний день вопрос о неоангиогенезе в злокачественных новообразованиях - один из самых актуальных и перспективных в онкологии. В процессе неоангиогенеза ключевая роль отведена фактору роста эндотелия сосудов - VEGF и его рецепторам.

VEGF представляет собой гомодимерный белок с молекулярной массой 46-48 кДа (Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С.,2002; Ferrara N. et al., 2003). Рецептор VEGFR-2 является трансмембранным гликопротеидом с молекулярной массой 170-235 кДа, внутриклеточная часть которого представляет собой тирозинкиназный домен (Shibuya М. et al., 2003). Через связывание с этим рецептором VEGF осуществляет свои основные биологические эффекты, такие как стимуляция пролиферации эндотелиальных клеток, увеличение сосудистой проницаемости, подавление апоптоза и

противоопухолевого иммунного ответа (Gerber Н.Р. et al., 1998; Speirs V. et al.,1999; Dvorak H.F., 2002).

Высокий уровень экспрессии VEGF коррелирует с биологической агрессивностью рака молочной железы. Доказана достоверная корреляция между повышением содержания VEGF в опухоли и низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости больных раком молочной железы, особенно при ранних стадиях заболевания (Gasparini G. et al, 2000; Linderholm B.K. et al, 2003). В ряде работ сообщалось о значении VEGF как фактора, предсказывающего резистентность к традиционным видам лекарственного и лучевого лечения (Gasparini G. et al, 1999; Foekens J.A. et al, 2002).

Вместе с тем сложный механизм процесса, многокомпонентное влияние на него различных факторов, а также разница в методиках исследования и критериях оценки не позволяют выделить наиболее значимый для клиники показатель активности ангиогенеза при раке молочной железы. В связи с этим изучение экспрессии VEGF и его рецептора VEGFR-2 у больных первичным раком молочной железы, причем не только в опухолевой ткани, но и в сыворотке крови, представляется крайне важным, так как открывает новые возможности диагностики и контроля над течением заболевания. Кроме того, оценка влияния различных видов неоадъювантной терапии на продукцию ангиогенных факторов может стать основой назначения более адекватной тактики лечения уже на ранних стадиях рака молочной железы.

Цель исследования

Оценка влияния различных схем неоадъювантного лечения на содержание VEGF и VEGFR-2 в опухоли и сыворотке крови больных местнораспространенным раком молочной железы, определение клинической значимости этих показателей и их связи с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

Задачи исследования

1. Определить концентрацию УЕвИ и УЕОР11-2 в цитозоле опухолей и сыворотке крови больных местнораспространенным раком молочной железы, оценить взаимосвязь между полученными показателями.

2. Провести сравнительный анализ клинического значения исследования УЕвР и УЕОРИ.-2 у больных местнораспространенным раком молочной железы, выделить прогностически наиболее значимый показатель.

3. Изучить динамику уровней УЕСР и УЕСРЯ-2 в цитозоле опухолей и сыворотке крови больных раком молочной железы в процессе неоадъювантной терапии.

4. Проанализировать динамику экспрессии УЕвР и УЕСРИ-2 в опухоли и уровни маркеров в сыворотке крови больных раком молочной железы при различном предоперационном лечении, выявить их возможные корреляции с эффектом проведенной терапии.

5. Изучить взаимосвязь тканевых и сывороточных значений УЕСИ и УЕСРЯ-2 с клиническими, морфологическими и рецепторными характеристиками опухоли.

Научная новизна

С помощью иммуноферментного метода определено содержание ангиогенных факторов УЕСБ и УЕОРЯ-2 в сыворотке крови и цитозоле опухоли у больных местнораспространенным раком молочной железы. Впервые оценено влияние различных видов неоадъювантного лечения (химиотерапия, лучевая терапия и сочетанная химиолучевая терапия) на динамику показателей ангиогенеза. Исследована возможность их использования в качестве факторов, предсказывающих ответ на проводимую терапию. Проанализирована взаимосвязь опухолевой и сывороточной

концентрации VEGF и VEGFR-2 с основными параметрами, характеризующими клиническое течение заболевания.

Практическая значимость В результате проведенного исследования определена клиническая значимость важнейших факторов ангиогенеза (VEGF и VEGFR-2) у больных местнораспространенным раком молочной железы. Оценены приоритеты использования того или иного субстрата для определения уровня исследуемых показателей (кровь, опухоль). Доказана перспективность дальнейшего изучения экспрессии VEGF и его рецептора VEGFR-2 как прогностических маркеров рака молочной железы, а также факторов, определение которых может иметь решающее значение при выборе тактики противоопухолевой терапии.

Апробация работы состоялась 02 октября 2008 года на совместной научной конференции с участием кафедры онкологии ММА им. И.М. Сеченова, хирургического отделения опухолей молочных желез, лаборатории клинической биохимии, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, хирургического отделения диагностики опухолей, хирургического отделения реконструктивной и сосудистой хирургии, отделения радиохирургии, клинико-диагностической лаборатории НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, кафедры онкологии РГМУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Иллюстрирована 30 таблицами и 29 рисунками. Указатель литературы содержит 156 источников, из которых 15 отечественных и 141 зарубежный.

Содержание работы Общая характеристика больных и методов исследования

Материалом настоящей работы послужил анализ 120 исследований у 30 пациенток, наблюдавшихся и получавших лечение по поводу первичного местнораспространенного рака молочной железы в клиниках ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в 2005-2006 гг.

Возраст женщин находился в пределах от 23 до 69 лет, средний возраст составил 48,8±11,2 лет (медиана - 49,5 лет) (рис.1).

46.7%

10-20

21 -30

31 -40

возраст (лет)

61 -70

Рис. 1. Распределение больных РМЖ по возрасту.

Из них у 10 больных (33,3%) менструальная функция была сохранена, 7 пациенток (23,3%) находились в состоянии перименопаузы и 13 больных - в постменопаузе (43,3%).

Стандартный объем предоперационного обследования больных включал ультразвуковое исследование и маммографию обеих молочных желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических узлов, органов малого таза и печени, рентгенографию органов грудной клетки, сканирование костей скелета. По данным предоперационного исследования отдаленных метастатических изменений у пациенток, включенных в исследование, выявлено не было.

У всех пациенток клинический диагноз рака молочной железы был подтвержден данными морфологического исследования опухоли (кор- или трепанбиопсия). Наибольшее количество наблюдений относилось к ШЬ и IIb стадиям рака молочной железы - по 12 (40%) соответственно, остальные стадии выявлялись одинаково редко - по 3 клинических случая (10%) в каждой группе (табл.1).

Таблица 1.

Распределение больных РМЖ по стадиям TNM

Стадия TNM Количество больных

Абс. %

IIb T2N1M0 12 40

Illa T2N2M0 2 6,7

T3N2M0 1 3,3

Illb T4N0M0 1 3,3

T4N1M0 2 6,7

T4N2M0 9 30

III с T2N3M0 1 3,3

T4N3M0 2 6,7

Итого: 30 100

Рак левой молочной железы был диагностирован в 17 клинических случаях (56,7%), рак правой молочной железы выявлен у 13 пациенток (43,3%).

До проведения настоящей работы никакого специфического лечения больным не проводили.

Основным гистологическим вариантом рака молочной железы был инфильтративный протоковый рак - 23 наблюдения (76,7%), в 3 случаях (10%) - дольковая форма опухоли. Инфильтративный протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента обнаружен у 3-х больных (10%) и в 1 клиническом случае - смешанная форма рака молочной железы (рис.2).

ИПР+ВПК

Смешанный 3%

.ИПР

ИДР

г ИПР+ВПК в Смешанный

ИПР

77%

Рис. 2. Распределение больных по гистологическому типу РМЖ.

Раковые эмболы в кровеносных и лимфатических сосудах как фактор неблагоприятного клинического течения заболевания обнаружены по периферии опухоли у 12 пациенток (40%), в остальных случаях (18 наблюдений; 60%) - этот признак отсутствовал.

По характеру неоадъювантной терапии больные были разделены на 3 равные группы: первая группа (10 пациенток) получила 2 курса полихимиотерапии по схеме РАС, вторая группа (10 пациенток) - лучевую терапию на область молочной железы и зоны регионарного лимфооттока средним фракционированием дозы (ЗГр) до суммарной очаговой дозы 38-44Гр по изоэффекту. Третьей группе (10 больных) проведена сочетанная химиолучевая терапия.

Через 2,5-3 недели у всех пациенток по клиническим и рентгенологическим данным оценена степень регрессии в процессе предоперационного лечения. У 16 больных местнораспространенным раком молочной железы удалось добиться более 50% регрессии опухоли (53,3%), в 14 случаях (46,7%) - менее 50%. Учитывая полученные результаты, 13 (43,3%) больным удалось выполнить органосохранные операции, 17 (56,7%) пациенткам произведена радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц.

Выраженность лечебного патоморфоза оценивали при гистологическом исследовании операционного материала: в 10 клинических случаях (33,3%) -

выявлены признаки II степени, у 9 больных - III степени (30%), у 5 - IV степени (16,7%) патоморфоза. В 6 наблюдениях определены изменения, соответствующие 0-1 степени дегенеративных изменений в опухолевой ткани (20%) (рис.3).

IV 0-1

17% 20%

33%

Рис. 3. Распределение больных РМЖ в зависимости от выраженности лечебного патоморфоза.

Рецепторный статус опухоли определен у всех больных до и после проведенного лечения. Исследование рецепторов проводили конкурентным радиолигандным методом на активированном угле, покрытом декстраном. Опухоли, отрицательные по обоим типам рецепторов (рецепторы к эстрогенам и прогестерону) до неоадъювантной терапии и после комбинированного лечения, составляли 15 (50%) и 11 (36,7%) наблюдений соответственно. Положительный статус опухоли по одному или двум типам рецепторов до лечения выявлен в 15 (50%), после лечения - в 19 (63,3%) случаях.

Экспрессия белка НЕЯ-2/пеи в парафиновых срезах опухолей всех больных раком молочной железы определена полуколичественным иммуногистохимическим методом с использованием наборов НегсерТез1® (ОАКОСуготаПоп Согр). Гиперэкспрессия НЕК-2/пеи (3+) выявлена в опухолях 7 (23,4%) больных, в остальных случаях (76,6%) гиперэкспрессии НЕ11-2/пеи не выявлено (реакция 0, 1+).

Всем больным до начала специфического лечения проводилось определение содержания VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови и в цитозоле опухоли, полученной в результате трепанобиопсии. Динамика экспрессии VEGF и его рецептора оценена в опухоли в результате исследования операционного материала, а также в сыворотке крови больных через 3-6 недель после хирургического этапа. Для этого использовали стандартные наборы для прямого иммуноферментного анализа: «Human VEGF ELISA» (BioSource International), «Quantikine® Human VEGF Immunoassay» для определения VEGF и «Quantikine® Human VEGFR-2 Immunoassay» (R&D systems, США) - для VEGFR-2.

Статистический анализ данных

Корреляционные зависимости оценивали с помощью теста корреляции рангов Спирмена (Spearman) (R). При сравнении и анализе взаимосвязи показателей использовали непараметрические тесты: U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney), медианный тест, критерий серий Вальда-Вольфовица (Wald-Wolfowits), парного критерия Wilcoxon. Во всех случаях различия считали статистически достоверными при р<0,05. Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с помощью программного пакета «Statistica 6.0» (StatSoft Inc).

Результаты исследования

Оба изучаемых фактора были обнаружены во всех образцах опухоли и сыворотки крови. Однако достоверной взаимосвязи между содержанием VEGF в сыворотке крови и в цитозоле опухолей больных раком молочной железы обнаружено не было (R=0,69; р=0,75). Корреляционной связи между тканевым уровнем VEGFR-2 и его значениями в крови также не выявлено (R=0,12, р=0,57). По-видимому, это свидетельствует о различных источниках поступления ангиогенных факторов в сыворотку крови, помимо опухоли. Следовательно, нами не доказано предположение о возможности

использования сывороточной концентрации маркеров как адекватной замене тканевым показателям ангиогенеза.

Значения экспрессии УЕвР и УЕОРЯ-2 в первичной опухоли достоверно коррелировали между собой (11=0,39; р=0,04) (рис.4), в то время как в сыворотке крови такой связи между уровнями исследуемых факторов не

Рис. 4. Взаимосвязь содержания УЕвЕ и УЕС№-2 в цитозоле опухолей больных РМЖ до лечения (И = 0,39; р=0,04).

Этот факт прослеживался и на фоне предоперационной терапии: динамика опухолевых УЕвР и УЕвР11-2 часто была аналогичной.

При анализе взаимосвязи исходного содержания ангиогенных факторов в первичной опухоли и сыворотке крови больных раком молочной железы с основными клинико-морфологическими характеристиками получены представленные ниже результаты.

На уровень УЕвИ в сыворотке крови достоверно влиял возраст и менструальный статус больных (табл. 2; 3): у молодых женщин с сохранной менструально-овариальной функцией содержание УЕСБ было достоверно выше, чем у пациенток старших возрастных групп, находящихся в постменопаузе (р=0,03; р=0,01 соответственно).

Таблица 2.

Содержание VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови больных РМЖ с учетом __их возраста_

Возраст Число больных VEGF, пг/мл Медиана (Квартили) VEGFR-2, нг/мл Медиана (Квартили)

До 40 лет 5 338' (214-356) 11,2 (8,7-12,4)

40-55 лет 17 1342 (86,7 - 224) 10,5 (9,9-12,1)

Старше 55 лет 8 1653 (90,6 - 253) 10,2 (9,0-11,7)

р=0,03 (медианный тест для всех групп УЕОР)

Таблица 3.

Содержание УЕвЕ и УЕСЕК-2 в сыворотке крови больных РМЖ с учетом

Менструальный статус Число больных VEGF, пг/мл Медиана (Квартили) VEGFR-2, нг/мл Медиана (Квартили)

Сохранная менстр. функция 10 281' (197-408) 11,8 (9,1 -13,8)

Перименопауза 7 1492 (93,0-437) 11,0(10,0-11,8)

Постменопауза 13 94,53 (75,4 - 135) 10,0 (9,7-10,4)

р=0,03 (медианный тест для всех групп) и plvs2=0,01 (критерий Манна-Уитни)

В то же время сывороточные показатели VEGF и VEGFR-2 были не связаны с таким прогностически важным фактором как распространенность процесса (критерии TNM). Нами отмечено существенное увеличение уровня VEGF в сыворотке крови больных со IIa стадией рака молочной железы (437 пг/мл) по сравнению с больными III стадии (86,7 пг/мл), однако данные были не достоверными.

При исследовании влияния уровней рецепторов стероидных гормонов в опухоли оказалось, что VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови выше у больных с РЭ-положительным раком молочной железы по сравнению с РЭ-отрицательными опухолями, хотя значения не достигли статистической значимости. Обратная тенденция наблюдалась относительно рецепторов к прогестерону: показатели свободного VEGF в сыворотке крови были выше в группе больных с РП-отрицательными опухолями.

Менструальная функция и возрастные характеристики больных раком молочной железы не оказывали значимого влияния на содержание УЕвР и УЕОРЯ-2 в цитозолях опухоли. Однако выявлена тенденция к положительной взаимосвязи концентрации УЕвР и УЕОР11-2 со стадией заболевания: медианы обоих показателей были выше у больных с ШЬ стадией по сравнению с группой больных со На стадией, причем уровень именно УЕвР был тем выше, чем больше размер первичной опухоли (Т). От количества пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов (И) показатели ангиогенных факторов в ткани опухоли не зависели.

Анализ взаимосвязи содержания УЕвР и УЕОРЯ-2 в ткани рака молочной железы с такими прогностически неблагоприятными факторами как гиперэкспрессия НЕЛ-2/пеи и наличие раковых эмболов в лимфатических и кровеносных сосудах по периферии опухоли показал, что с этими показателями взаимосвязана только экспрессия УЕСРЯ-2 (табл. 4; 5).

Таблица 4.

Содержание УЕСП1-2 в опухоли больных РМЖ в зависимости от статуса

НЕ1*-2/пе11

Статус НЕЯ-2/пеи Число больных \TGFR-2, пг/мг белка Медиана Квартили

0-1+ 19 165,2' 145,9-208,9

3+ 7 204,32 36,4 - 327,7

р1У52=0,03 (критерий Вальда-Вольфовица)

Таблица 5.

Содержание УЕСИ1-2 в опухоли больных РМЖ в зависимости от наличия __раковых эмболов_

Раковые эмболы Число больных УЕСПи, пг/мг белка Медиана Квартили

Нет 18 165,2' 136,6-208,0

Есть 12 183,б2 132,0-258,3

р1 \'б2=0,0 1 (критерий Вальда-Вольфовица)

Концентрация рецептора оказалась достоверно выше в опухолях с наличием раковых эмболов в лимфатических щелях (р=0,01) и при гиперэкспрессии белка НЕЯ-2/пеи (р=0,03). Необходимо отметить также достоверное увеличение уровня растворимого УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных с гиперэкспрессией НЕЯ-2/пеи в опухоли (р=0,04). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования УЕСРЛ-2 как дополнительного прогностического маркера у больных раком молочной железы.

Статус рецепторов эстрогенов не оказывал значимого влияния на тканевую экспрессию УЕСР и его рецептора, с другой стороны, обнаружена интересная закономерность относительно рецепторов прогестерона: в РП-положительных опухолях уровень УЕСР был существенно выше (379,5 пг/мг белка), чем в РП-отрицательных (88 пг/мг белка). Данные статистически достоверные (р=0,03).

При сравнительном анализе содержания ангиогенных факторов на фоне проведения неоадъювантного лечения наблюдали как увеличение, так и уменьшение УЕСР и УЕСРЯ-2 и в цитозоле опухолей, и в сыворотке крови пациенток.

Показатели динамики экспрессии УЕСР и УЕСР11-2 в опухоли достоверно коррелировали с их исходными значениями: чем выше была исходная концентрация УЕСР или УЕОРЯ-2 в опухолевой ткани, тем в большей степени она снижалась после проведения противоопухолевой терапии (Я—О,67; р<0,05; 11—0,79; р<0,05 соответственно). При этом нам удалось определить условные пороговые значения исследуемых показателей в первичной опухоли - 120 пг/мг белка для УЕСР и 200 пг/мг белка для УЕСР11-2. Содержание УЕСР и УЕСРЯ-2 в опухоли больных раком молочной железы выше указанных значений достоверно снижается после проведения специфического лечения. При значениях ниже пороговых уровней - существенно не меняется ни в сторону увеличения, ни в сторону уменьшения (р<0,001; р<0,001 соответственно) после

неоадъювантной терапии. Т.е. противоопухолевая терапия оказывает незначительное влияние на активность ангиогенеза в опухолевой ткани (рис.5).

Рис. 5. Сравнение уровней УЕвР и \nEGFR-2 в цитозоле опухоли больных РМЖ до и после неоадъювантной терапии (р<0,001; р<0,001 соответственно, по Вальду-Вольфовицу).

С учетом полученных данных возможно рекомендовать назначение более адекватной и эффективной схемы неоадъювантной терапии больных местнораспространенным раком молочной железы, включающей и антиангиогенные препараты.

В сыворотке крови пациенток исходные уровни свободного УЕСР и его растворимого рецептора достоверно коррелировали с их показателями после проведенного лечения (11=0,81; р<0,001; 11=0,45; р=0,024 соответственно), однако четких закономерностей в направлении динамики сывороточных показателей нами не выявлено.

Оценка динамики содержания УЕСР и УЕСРЯ-2 в сыворотке крови и в цитозоле опухолей на фоне неоадъювантного лечения в общей группе пациенток не выявила значимых корреляций найденных изменений с

клинической стадией заболевания, размером первичной опухоли, степенью злокачественности, статусом НЕ11-2/пеи.

Возраст и состояние менструальной функции сохранили свое влияние на концентрации УЕвР в сыворотке крови: у женщин в возрасте до 40 лет уровень УЕвИ оставался намного выше после лечения по сравнению со старшими возрастными группами (р=0,01). В то же время в группе больных, находящихся в перименопаузе, УЕвР возрос на достоверно меньшую величину, чем в сыворотке крови постменопаузальных больных (р=0,01). При этом динамические показатели растворимого УЕСРЯ-2 никак не зависели от указанных клинических характеристик.

Динамика цитозольных значений УЕвР и УЕСР11-2 была также взаимосвязана с менструальным статусом пациенток: в опухолях менструирующих больных концентрация ангиогенных факторов увеличивалась по сравнению с группами женщин в пре- и постменопаузе (р=0,01; р=0,01 соответственно).

Анализируя значение рецепторного статуса рака молочной железы на изменение уровней ангиогенных факторов в сыворотке крови и опухоли, наблюдалось более значимое влияние уровня рецепторов прогестерона: концентрация УЕСРЯ-2 в сыворотке крови больных с РП-положительным раком молочной железы на фоне неоадъювантного лечения достоверно увеличивалась по сравнению РП-отрицательными опухолями (р=0,018). Направление изменений содержания сывороточного УЕСРЯ-2 практически не зависело от РЭ-статуса опухоли. В ткани опухолей, отрицательных и по РЭ, и по РП, также наблюдалось достоверное снижение УЕСП1-2 после проводимой терапии по сравнению с рецепторопозитивным раком молочной железы (р<0,05 в обоих случаях). Те же тенденции наблюдались и при исследовании содержания свободного УЕвР в цитозолях опухоли, однако, различия не достигли статистической значимости.

Наличие раковых эмболов в просветах лимфатических и кровеносных сосудов оказывало влияние только на уровень УЕСРИ-2 в сыворотке крови -после лечения значения этого показателя увеличивались (1,4 нг/мл), а в отсутствии эмболов - достоверно снижались (-0,5 нг/мл) (р=0,02).

Еще один критерий оказался взаимосвязанным с динамикой опухолевой экспрессии именно УЕСР11-2: у больных с множественными метастазами в регионарных лимфоузлах (N3), определяемыми при гистологическом исследовании операционного материала, уровень УЕСРЯ-2 в опухоли оказался выше (249 пг/мг белка), чем у больных раком молочной железы без поражения регионарных лимфоузлов (N0) (138 пг/мг белка). Данные статистически достоверные (р=0,03). С уровнем УЕвИ в обоих субстратах значимых зависимостей с указанными критериями выявлено не было.

Нам удалось определить важную зависимость тканевой экспрессии и УЕвР, и УЕОРЯ-2 от эффекта проведенной терапии, установленного при гистологическом исследовании операционного материала (табл. 6).

Таблица 6.

Содержания УЕвГ и УЕСП1-2 в опухоли больных РМЖ после лечения в зависимости от степени лечебного патоморфоза

Лечебный Число больных VEGF, VEGFR-2,

патоморфоз пг/мг белка пг/мг белка

Медиана Медиана

(Квартили) (Квартили)

0-1 ст. 6 367,2' 203,92

(77,3-436,0) (161,4-268,3)

Ист. 10 123,3 154,9

(75,0 - 394,9) (131,5-183,0)

III ст. 9 51,5 249,4

(42,6 - 168,9) (200,3-295,3)

IV ст. 5 46,5 170,0

(27,1-51,0) (131,6-191,7)

р=0,04 (медианный тест) 2 р=0,04 (критерий Крускала-Уоллиса)

Так, более выраженные изменения в опухолевых клетках (IV степень лечебного патоморфоза) коррелировали с низкими значениями VEGF и VEGFR-2 в остаточной опухоли (р=0,04; р=0,04 соответственно). Медиана VEGF в сыворотке крови, напротив, оказалась значительно выше после лечения в группе пациенток с IV степенью лечебного патоморфоза в опухоли (501,6 пг/мл) по сравнению с 0-1 степенью (205,1 пг/мл). Однако, эти изменения не достигли статистической значимости. Динамика растворимого VEGFR-2 вообще не имела направленности в зависимости от степени лечебного патоморфоза. Полученные данные подтверждают большую целесообразность определения экспрессии маркеров ангиогенеза именно в опухоли больных раком молочной железы по сравнению с исследованием сывороточных показателей.

Неоадъювантная терапия, несомненно, влияет на содержание изучаемых факторов, как в сыворотке крови, так и в цитозолях опухоли, но изменения сывороточных маркеров не имели определяющего значения и не зависели от вида специфического лечения. Во всех трех группах в целом мы наблюдали возрастание уровней VEGF, причем степень и направление этих изменений не зависели от стадии рака молочной железы и степени лечебного патоморфоза (рис.6).

j.d.D.D

Химиолучевая терапия

П.И_.

Лучеваятерапия

2 3 4 5 6 7 в 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Количество больных

Рис. 6. Изменение содержания УЕСР (%) в сыворотке крови больных РМЖ в зависимости от вида предоперационного лечения.

Растворимый УЕСРИ.-2 менялся более разнонаправлено, однако, четких закономерностей в динамике маркера в каждой конкретной группе нами не обнаружено (рис.7).

□

Химиолучевая терапия

□ □

Лучевая терапия

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1В 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2В 29 30 Количество больных

Рис. 7. Изменение содержания УЕСРИ-2 (%) в сыворотке крови больных РМЖ в зависимости от вида предоперационного лечения.

Динамика содержания показателей ангиогенеза в цитозоле опухолей больных, получавших лекарственное лечение, показала, что только в 30% случаев содержание УЕвР снизилось. У 70% больных наблюдалось возрастание исследуемого фактора. Аналогичные данные нами получены при исследовании динамики экспрессии УЕОР11-2 в этой группе (рис.8).

Химиотерапия

1200'

г* 1000-сч"

£ 800-

0 ш

1 600-

и.

(5

£ 400-

О) Ж

I 200-

а> 5

5 0'

-200-

О Изм УЕвР, % □ Изм УЕвРР-г, %

съ

а,

Рис. 8. Изменение содержания УЕвР и УЕСП*-2 в цитозолях опухолей больных РМЖ, получавших химиотерапию.

При этом в опухолях больных со IIb стадией рака молочной железы наблюдалось преимущественное увеличение VEGF и VEGFR-2, а снижение уровней либо возрастание в незначительных пределах отмечено у больных более поздними стадиями заболевания (Illb - Шс).

Необходимо отметить важную тенденцию: увеличение как самого фактора, так и его рецептора происходило в цитозолях опухоли со слабо выраженными признаками лечебного патоморфоза - 0-11 степени. Снижение показателей коррелировало с лечебным патоморфозом III-IV степени в остаточной опухоли. Полученные данные свидетельствуют о том, что более адекватной схемой неоадъювантного лечения больных

местнораспространенным раком молочной железы будет применение полихимиотерапии в сочетании с антиангиогенной терапией. Причем начинать ее необходимо на более ранних (IIb - Illa) стадиях, когда процессы ангиогенеза в опухоли, скорее всего, наиболее активны.

Лучевая терапия не оказывала значимого влияния на активность ангиогенеза в опухолях больных раком молочной железы: концентрация ангиогенных факторов снижалась и возрастала в равных пропорциях (по 50% наблюдений соответственно) (рис. 9).

Лучевая терапия

123456789 10

Рис. 9. Изменение содержания УЕСЕ и УЕСРК-2 в цитозолях опухолей больных РМЖ, получавших лучевую терапию.

С другой стороны, высоковаскуляризированные опухоли (содержание УЕвР > 120 пг/мг белка) оказались резистентны к предоперационному облучению. Возможно, это связано с воздействием УЕвР на интерстициальное давление, при котором доставка кислорода в ткани опухоли происходит неравномерно с формированием участков, нечувствительных для лучевой терапии.

Химиолучевая терапия, в целом, снижала содержание ангиогенных факторов в цитозоле опухолей. Однако, недостаточно эффективно, чтобы приостановить ангиогенез в опухолевой ткани, поскольку динамические изменения УЕвР и УЕОРЯ-2 не были взаимосвязаны с выраженностью лечебного патоморфоза в этой группе (рис. 10).

Химиолечевая терапия

7006002 500-и.

0

£ 400-х

& 300-

ш >

о» 200-х X

а

1 1002

£ о-

-1001 23456789 10

Рис. 10. Изменение содержания УЕСР и УЕСИ*-2 в цитозолях опухолей больных РМЖ, получавших химиолучевую терапию.

Этот факт свидетельствует о том, что, несмотря на достаточно мощную терапию, неоадъювантное лечение таких больных целесообразно дополнить препаратами с антиангиогенным действием.

Таким образом, количественное определение ангиогенных факторов именно в опухолевой ткани наиболее адекватно отражает активность неоангиогенеза при местнораспространенном раке молочной железы. Хотелось

ОИзм УНОГ\ % О Изм \ZEGFR-2.1

бы подчеркнуть перспективность исследования рецепторов УЕСР, в частности УЕСРЛ-2, с последующей возможностью использования их в качестве новых биологических маркеров прогноза заболевания и чувствительности больных РМЖ как к общепринятым схемам противоопухолевого лечения, так и к новейшим антиангиогенным препаратам.

ВЫВОДЫ

1. Уровни УЕСР и УЕСР11-2 в ткани опухоли не коррелируют с соответствующими сывороточными показателями у больных местнораспространенным раком молочной железы (разница статистически достоверная). Более важным для использования в клинической практике является определения уровня УЕОРЯ-2.

2. Гиперэкспрессия УЕвРК-2 в опухолевой ткани - фактор неблагоприятного прогноза, достоверно коррелирующий с основными отрицательными клиника-морфологическими прогностическими критериями.

3. Повышенный уровень УЕСРЯ-2 как в сыворотке крови, так и в цитозоле опухоли может считаться предсказательным фактором гиперэкспрессии НЕК-2/пеи, так как достоверно с ним коррелирует (р=0,04, р=0,03 соответственно).

4. Более выраженный клинический и морфологический эффект от проведенного лечения отмечается при уровнях УЕСР в опухоли выше 120 пг/мг белка и УЕСРЯ.-2 - выше 200 пг/мг белка, что является показателем эффективности проведенной индукционной терапии.

5. Степень лечебного патоморфоза достоверно коррелирует с уменьшением экспрессии УЕСР и УЕОРЯ-2 в опухоли, достигая минимальных значений при IV степени патоморфоза (р=0,04; р=0,04 соответственно).

6. Неоадъювантная лекарственная терапия по характеру влияния на УЕСР и УЕСР11-2 в опухоли является наиболее эффективным методом лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние предоперационной терапии на содержание VEGF в опухолях и сыворотке крови больных местнораспространенным раком молочной железы // Материалы X Российского онкологического конгресса. -Москва. - 2006г. - с. 145 (в соавт. с Щербаковым A.M., Максимовым К.В., Высоцкой И.В., Герштейн Е.С.)

2. Сравнительный анализ содержания факторов неоангиогенеза при различной неоадъювантной терапии рака молочной железы // Материалы научно-практической конференции «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи». - Барнаул. - 2006г. - с. 118 (в соавт. с Высоцкой И.В., Кушлинским Н.Е., Герштейн Е.С., Максимовым К.В., Широким В.П.)

3. Клиническое значение экспрессии VEGFR-2 в цитозолях опухоли и сыворотках крови больных местнораспространенным раком молочной железы // Материалы IV международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» Белые ночи С-П.-2007г.- с.67-68 (в соавт. с Высоцкой И.В., Кушлинским Н.Е., Герштейн Е.С., Широким В.П., Мартыновой Г.В.)

4. Экспрессия VEGF в опухоли и сыворотке крови больных местнораспространенным раком молочной железы при различной неоадъювантной терапии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях». - Барнаул. - 2007г. - с.222 (в соавт. с Высоцкой И.В., Кушлинским Н.Е., Герштейн Е.С., Максимовым К.В., Субботиной A.A.)

5. Динамика экспрессии фактора роста эндотелия сосудов при различной неоадъювантной терапии рака молочной железы // Маммология. - 2007г. -

№3. - с. 38-43 (в соавт. с Субботиной A.A., Герштейн Е.С., Высоцкой И.В., Летягиным В.П.)

6. Содержание VEGF и VEGFR2 в цитозолях опухолей больных местнораспространенным раком молочной железы в процессе неоадъювантной терапии // Материалы XI Российского онкологического конгресса. - Москва. - 2007г. - с. 155 (в соавт. с Мартыновой Г.В., Высоцкой И.В., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.)

7. Экспрессия VEGF и VEGFR2 в опухолях в процессе неоадъювантного лечения больных раком молочной железы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008г. - Том 145. - № 2. -с.206-210 (в соавт. с Высоцкой И.В., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.)

8. Клиническое значение VEGFR-2 в опухолях и сыворотках крови больных раком молочной железы // Опухоли женской репродуктивной системы. -2008г. - №1- с.28-33 (в соавт. с Платовой A.M., Высоцкой И.В., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е., Летягиным В.П., Мироновой Е.Е.)

9. Влияние содержания факторов ангиогенеза на клинико-морфологические показатели у больных первичным раком молочной железы // Материалы V Съезда онкологов и радиологов СНГ. - Ташкент. - 2008г. - с. 240 (в соавт. с Высоцкой И.В., Герштейн Е.С., Летягиным В.П., Кушлинским Н.Е., Зикиряходжаевым А.Д., Платовой A.M.)

10. Влияние неоадъювантной терапии на уровни VEGF и VEGFR-2 в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы // Вопр. онкологии. - 2008г. - Том 54 - №3 - с.287-293 (в соавт. с Герштейн Е.С., Щербаковым A.M., Высоцкой И.В., Летягиным В.П., Кушлинским Н.Е.).

Подписано в печать 30.01.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

.__Тираж 100 экз. Заказ № 12 6_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы. В структуре онкологической заболеваемости женщин рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место, его удельный вес составляет 19,8% [5]. В России ежегодно РМЖ выявляется более чем у 49,5 тысяч женщин, заболеваемость достигает 64,6, а смертность - 29,4 на 100000 женского населения. При этом средний возраст больных составляет 50-59 лет. В 61% наблюдений РМЖ выявляется в 1-П стадиях, в 25,7% - в III стадии, в 13,1% - в IV стадии процесса [5].

Несмотря на определенные успехи в диагностике и методах лечения, темпы прироста заболеваемости РМЖ неуклонно растут, причем значительную долю составляют местнораспространенные формы заболевания [6, 7, 12]. Лечение данной категории пациенток является сложной задачей. Именно поэтому проблема прогнозирования исхода болезни и выбора адекватных схем терапии считается первостепенной в онкологической практике.

С целью углубленного понимания закономерностей опухолевого процесса возникает необходимость изучения роли биологически активных веществ в механизмах регуляции роста и метастазирования опухолей. Использование молекулярных маркеров, характеризующих метаболизм опухолевой клетки, позволяет выделить прогностически неблагоприятные группы пациентов, нуждающихся в более комплексном лечении, а также оценить индивидуальную чувствительность или резистентность опухоли к определенным видам терапии [2, 3, 8, 49].

Помимо этого ключевые факторы патогенеза опухоли уже сейчас активно и успешно используются как мишени стратегически новых методов лечения — таргетной терапии.

Неотъемлемым компонентом опухолевой прогрессии является неоангиогенез - образование новых сосудов из уже существующих. Интерес к проблеме неоангиогенеза в злокачественных новообразованиях за последние годы возрос многократно, что позволило по-новому взглянуть на взаимосвязь экспрессии ангиогенных факторов в опухолевой ткани с прогнозом заболевания и эффективностью проводимого лечения [41, 52, 149].

Важнейшим регулятором как физиологического, так и патологического ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (УЕОР). Доказано, что УЕОР играет ключевую роль и в неоваскуляризации РМЖ [24, 27, 143]. Помимо стимуляции роста опухоли путем индукции ангиогенеза, УЕОР повышает проницаемость сосудов [35], а также способствует выживаемости опухолевых клеток, препятствуя апоптозу [15, 19, 63].

Высокий уровень экспрессии УЕОР коррелирует с биологической агрессивностью опухоли. Показана достоверная корреляция между повышением содержания УЕОР в опухоли и низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости больных РМЖ, особенно при ранних стадиях заболевания [61, 96]. В ряде работ сообщалось о значении УЕОР как фактора, предсказывающего резистентность к традиционным видам лекарственного и лучевого лечения [47, 60].

Большое внимание уделяется также оценке клинического значения рецепторов УЕОБ - УЕОР11-1 (Ш-1) и УЕОРЯ-2 (Ак-1/БОЖ), экспрессия которых выявляется в опухолевой ткани [9, 133, 135]. Причем, установлено, что основные ангиогенные эффекты УЕОР в опухоли опосредованы через рецептор 2-го типа [115]. Показано достоверное увеличение уровней УЕОР, рецепторов УЕОРЯ-1, УЕОРИ-2 и антиапоптотического белка Вс1-2 в РМЖ по сравнению с окружающими гистологически неизмененными тканями. При этом экспрессия УЕОР и УЕОРЯ-2 существенно выше в отрицательных по рецепторам прогестерона опухолях [14].

И все же данные разных исследователей, определявших содержание ангиогенных факторов при РМЖ, нередко противоречивы. Так, в ряде работ не обнаружено достоверных корреляций УЕОР в ткани опухоли с такими прогностически важными характеристиками как стадия процесса и степень злокачественности. Сомнительна роль стероидных гормонов в регуляции экспрессии УБвР. Исследований, посвященных взаимосвязи уровней растворимых УЕОР и его рецепторов в сыворотке крови с клинико-морфологическими особенностями РМЖ практически нет. Все это свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этого направления.

В связи с тенденцией к увеличению выполнения органосохранных хирургических вмешательств, в современных онкологических клиниках актуален вопрос о тактике неоадъювантного лечения больных местнораспространенным РМЖ. С этих позиций чрезвычайно интересно оценить влияние предоперационной терапии на содержание УЕОР и его рецептора УЕОРЯ-2 в опухолях и сыворотках крови таких пациентов, сопоставить динамику этих показателей с эффектом проведенного лечения.

Цель работы - оценка влияния различных схем неоадъювантного лечения на содержание УЕОР и УЕОРК-2 в опухоли и сыворотке крови больных первичным РМЖ, определение клинической значимости этих показателей и их связи с основными клинико-морфологическими характеристиками РМЖ.

Задачи исследования:

1. Определить концентрацию УЕОР и УЕОРК-2 в цитозоле опухолей и сыворотке крови больных местнораспространенным РМЖ, оценить взаимосвязь между полученными показателями.

2. Провести сравнительный анализ клинического значения исследования УЕОР и УЕОРЯ-2 у больных местнораспространенным РМЖ, выделить прогностически наиболее значимый показатель.

3. Изучить динамику уровней УЕОР и УЕОРЯ-2 в цитозоле опухолей и сыворотке крови больных РМЖ в процессе неоадъювантной терапии.

4. Проанализировать динамику экспрессии УЕОР и УЕОРЯ-2 в опухоли и уровни маркеров в сыворотке крови больных РМЖ при различном предоперационном лечении, выявить возможные их корреляции с эффектом проведенной терапии. 5. Изучить взаимосвязь тканевых и сывороточных значений УЕСР и УЕСРК-2 с клиническими, морфологическими и рецепторными характеристиками опухоли.

Научная новизна. С помощью иммуноферментного метода определено количественное содержание ангиогенных факторов УЕвР и УЕСРЯ-2 в сыворотке крови и цитозоле опухоли у больных местнораспространенным РМЖ. Оценено влияние различных видов неоадъювантного лечения (химиотерапия, лучевая терапия и сочетанная химиолучевая терапия) на динамику показателей маркеров ангиогенеза. Исследована возможность их использования в качестве факторов, предсказывающих ответ на проводимую терапию. В результате проведенного исследования выявлена положительная корреляция между концентрациями УЕвР и его рецептора УЕСРЯ-2 в ткани первичной опухоли. Проанализирована взаимосвязь опухолевой и сывороточной концентрации УЕОР и УЕвРК-2 с основными параметрами, характеризующими клиническое течение заболевания. Установлена достоверная зависимость уровней УЕСР в сыворотке крови от возраста и менопаузного статуса больных РМЖ. Опухолевая экспрессия УЕСРЯ-2 оказалась взаимосвязана с такими неблагоприятными прогностическими факторами как гиперэкспрессия НЕЯ-2/пеи и наличие раковых эмболов по периферии опухоли. Показано, что предоперационная терапия влияет на уровень изучаемых факторов как в опухоли, так и в сыворотке крови больных РМЖ. При этом динамика опухолевой экспрессии маркеров указывала на целесообразность применения антиангиогенной терапии совместно с традиционными цитотоксическими препаратами. Определена взаимосвязь концентрации УЕвР и УЕСРЯ-2 в остаточной опухоли после проведенной специфической терапии с выраженностью лечебного патоморфоза, т.е. данные критерии являются достоверными показателями ответа на проводимую терапию.

Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования определена клиническая значимость важнейших факторов ангиогенеза (УБвР и УЕОРК-2) у больных местнораспространенным РМЖ. Оценены приоритеты использования того или иного субстрата для определения уровня исследуемых показателей (кровь, опухоль). Доказана перспективность дальнейшего изучения экспрессии УЕОР и его рецептора УЕОРЯ-2 как прогностических маркеров РМЖ, а также факторов, определение которых может иметь решающее значение при выборе тактики противоопухолевой терапии.

выводы

1. Уровни УЕОБ и УЕОРЯ-2 в ткани опухоли не коррелируют с соответствующими сывороточными показателями у больных местнораспространенным раком молочной железы (разница статистически достоверная). Более важным для использования в клинической практике является определения уровня УЕОРЯ-2.

2. Гиперэкспрессия УЕОБК-2 в опухолевой ткани - фактор неблагоприятного прогноза, достоверно коррелирующий с основными отрицательными клинико-морфологическими прогностическими критериями.

3. Повышенный уровень УЕОРЯ-2 как в сыворотке крови, так и в цитозоле опухоли может считаться предсказательным фактором гиперэкспрессии ЫЕК-2/пеи, так как достоверно с ним коррелирует (р=0,04, р=0,03 соответственно).

4. Более выраженный клинический и морфологический эффект от проведенного лечения отмечается при уровнях УЕОБ в опухоли выше 120 пг/мг белка и УЕОРЯ-2 - выше 200 пг/мг белка, что является показателем эффективности проведенной индукционной терапии.

5. Степень лечебного патоморфоза достоверно коррелирует с уменьшением экспрессии УЕОБ и УЕОРЯ-2 в опухоли, достигая минимальных значений при IV степени патоморфоза (р=0,04; р=0,04 соответственно).

6. Неоадъювантная лекарственная терапия по характеру влияния на УЕОР и УЕОРЯ-2 в опухоли является наиболее эффективным методом лечения.

Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак молочной железы остается наиболее часто встречающейся патологией среди онкологических заболеваний у женщин и, к сожалению, частой причиной смерти. Несмотря на значительные достижения последних лет в области канцерогенеза, общеизвестно, что опухоли, имеющие одинаковую стадию классификации ТИМ, зачастую радикально отличаются по агрессивности течения заболевания и чувствительности к проводимой терапии. Это, скорее всего, объясняется индивидуальными биологическими особенностями конкретной популяции злокачественных клеток.

До сих пор выбор адъювантного лечения основывался на учете степени местно-регионарного распространения опухоли, уровня экспрессии рецепторов к половым стероидным гормонам (РЭ и РП) и репродуктивном статусе (или возрасте) больных. Как показывают результаты клинических исследований, этой информации недостаточно для планирования адекватного лечения. В связи с этим лидирующие позиции в прогнозировании течения злокачественного процесса все чаще занимает молекулярная морфопатология, учитывающая наличие или отсутствие активаторов и супрессоров опухолевого роста [3].

Для прогрессии опухоли необходима развитая сосудистая сеть, обеспечивающая новообразование кислородом и питательными веществами. В процессе неоангиогенеза ключевая роль отведена УЕОБ и его рецепторам (УЕОИ1-1 и УЕСРЯ-2), через которые опосредуются такие биологические эффекты как увеличение сосудистой проницаемости, стимуляция пролиферации эндотелиальных клеток, подавление апоптоза и противоопухолевого иммунного ответа [11, 44].

УЕОР представляет собой гомодимерный белок с молекулярной массой 46-48 кДа. Рецептор УЕОБК-2 является трансмембранным гликопротеидом с молекулярной массой 170-235 кДа, внутриклеточная часть которого представляет собой тирозинкиназный домен. Именно через связывание с этим рецептором VEGF осуществляет свои основные функции [133]. Высокий уровень экспрессии рецепторов VEGF на клеточной поверхности является отличительной особенностью опухолевого эндотелия [103].

Анализ данных литературы свидетельствует о большом научном интересе к изучаемым факторам как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях. Доказано значительное увеличение содержания свободного VEGF в опухоли по сравнению с гистологически не измененными тканями молочной железы, коррелирующее со снижением общей и безрецидивной выживаемости больных ранними формами РМЖ [4, 59, 93, 142].

Влияние химиотерапии на продукцию ангиогенных факторов при раке молочной железы до сих пор не определено, хотя в последнее время все чаще выдвигается мнение об антиангиогенной активности некоторых противоопухолевых препаратов [46]. Некоторое число работ посвящено изучению влияния эндокринотерапии на процессы ангиогенеза в опухолевой ткани больных РМЖ [14, 91, 99, 125]. Утрата опухолью гормональной зависимости может быть ассоциирована с повышенной продукцией ангиогенных факторов, что позволяет рассматривать VEGF и его рецепторы, в частности, VEGFR-2, в качестве перспективных маркеров, предсказывающих ответ на проводимое лечение [15, 82, 124].

Проанализированные данные свидетельствуют о положительной корреляции между гиперэкспрессией HER-2 и VEGF [88, 109], что может являться дополнительным маркером неблагоприятного прогноза для выживаемости и поводом назначения комбинированной анти-НЕК-2 и анти-VEGF терапии для таких пациентов.

В последнее время возрос интерес исследователей к определению VEGF в сыворотке/плазме крови больных РМЖ в качестве адекватного маркера активности ангиогенеза в опухолевой ткани. Так, было продемонстрировано достоверное увеличение концентрации фактора при метастатическом РМЖ по сравнению с доброкачественными заболеваниями молочных желез и с группой здоровых женщин [126, 138]. Однако данные разных авторов противоречивы и на сегодняшний день наличие четкой взаимосвязи между экспрессией УЕвР в опухоли и его содержанием в крови не доказано.

Учитывая очевидную перспективность изучения УЕОБ, как важнейшего регулятора неоангиогенеза в злокачественных опухолях, основной целью современных исследователей является возможность применения принципиально нового направления в лечении - анти-УЕвР терапии. Большое количество публикаций посвящено изучению тех или иных групп препаратов, обладающих антиангиогенным действием. В то же время уже не вызывает сомнений тот факт, что для полной ремиссии опухолевого процесса применения только блокаторов ангиогенеза недостаточно. Наиболее эффективной, скорее всего, будет комбинация их с традиционной цитотоксической терапией.

В связи с этим в задачи нашего исследования вошли не только анализ взаимосвязей уровней УЕвР и УЕСРЯ-2 в сыворотке крови и опухолях больных местнораспространенным РМЖ с важнейшими клинико-морфологическими характеристиками заболевания, но и оценка этих показателей на фоне различных видов неоадъювантной терапии с динамических позиций, сопоставляя их с эффектом лечения.

Материал настоящей работы составили 120 исследований у 30 пациенток, наблюдавшихся и получавших лечение по поводу первичного РМЖ в клиниках ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2005-2006 гг. Возраст женщин находился в пределах от 23 до 69 лет, средний возраст составил 48,8±11,2 лет (медиана - 49,5 лет). Из них у 10 больных (33,3%) менструальная функция была сохранена, 7 пациенток (23,3%) находились в состоянии перименопаузы и 13 больных - в постменопаузе (43,3%).

У всех пациенток клинический диагноз РМЖ был подтвержден данными морфологического исследования опухоли. Наибольшее количество наблюдений относилось к Illb и IIb стадиям РМЖ - 12 (40%) и 9 (30%) соответственно, остальные стадии выявлялись одинаково редко — по 3 клинических случая (10%) в каждой группе.

Основным гистологическим вариантом РМЖ был инфильтративный протоковый рак (ИПР) - 23 наблюдения (76,7%), в 3 случаях (10%) -инфильтративный дольковый рак (ИДР). Инфильтративный протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента обнаружен у 3-х больных (10%) и в 1 клиническом случае — смешанная форма РМЖ.

Раковые эмболы в кровеносных и лимфатических сосудах как фактор неблагоприятного клинического течения РМЖ обнаружены по периферии опухоли у 12 пациенток (40%), в остальных случаях (18 наблюдений; 60%) -этот признак отсутствовал.

До проведения настоящего исследования никакого специфического лечения больным не проводили.

По характеру иеоадъювантной терапии больные были разделены на 3 группы: первая группа (10 пациенток) получила 2 курса полихимиотерапии по схеме FAC, вторая группа (10 пациенток) - лучевую терапию на область молочной железы и зоны регионарного лимфооттока средним фракционированием дозы (ЗГр) до суммарной очаговой дозы 38-44 Гр по изоэффекту. Третьей группе (10 больных) проведена сочетанная химиолучевая терапия.

Через 2,5-3 недели по клиническим и рентгенологическим данным оценена степень регрессии в процессе предоперационного лечения у всех пациенток. У 16 больных местнораспространенным РМЖ удалось добиться частичного ответа на проводимую терапию (53,3%), в 14 случаях -стабилизации процесса (46,7%). Учитывая полученные результаты, 13 (43,3%) больным удалось выполнить органосохранные операции, 17 (56,7%) пациенткам произведена радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц.

Выраженность лечебного патоморфоза оценивали при гистологическом исследовании операционного материала: в 10 клинических случаях (33,3%) — выявлены признаки II степени, у 9 больных - III степени (30%), у 5 - IV степени (16,7%) патоморфоза. В 6 наблюдениях определены изменения, соответствующие 0-1 степени дегенеративных изменений в опухолевой ткани (20%).

Рецепторный статус опухоли определен у всех больных до и после проведенного лечения. Исследование рецепторов проводили конкурентным радиолигандным методом на активированном угле, покрытом декстраном. Опухоли, отрицательные по обоим типам рецепторов (РЭ и РП) до неоадъювантной терапии и после комбинированного лечения, составляли 15 (50%) и 11 (36,7%) наблюдений соответственно. Положительный статус опухоли по одному или двум типам рецепторов до лечения выявлен в 15 (50%), после лечения - в 19 (63,3%) случаях.

Экспрессия белка HER-2/neu в парафиновых срезах опухолей всех больных РМЖ определена полуколичественным иммупогистохимическим методом с использованием наборов HercepTest® (DAKOCytomation Corp). Гиперэкспрессия HER-2/neu (3+) выявлена в опухолях 7 (23,4%) больных, в остальных случаях (76,6%) гиперэкспрессии HER-2/neu не выявлено (реакция 0, 1+).

Определение содержания VEGF и VEGFR-2 проводили дважды в сыворотке крови и цитозолях опухоли, полученной до специфического лечения в результате трепанобиопсии, а после - из операционного материала. Для этого использовали стандартные наборы для прямого иммуноферментного анализа: «Human VEGF ELISA» (BioSource International), «Quantikine® Human VEGF Immunoassay» для определения VEGF и «Quantikine® Human VEGFR-2 Immunoassay» (R&D systems, CUTA) -для VEGFR-2.

В результате проведенной работы нами были выделены некоторые особенности, позволяющие оценить активность ангиогенеза в процессе противоопухолевой терапии, а также определить наибольшее значение исследования ангиогенных факторов в том или ином субстрате (кровь, опухоль) у больных местнораспространенным РМЖ.

Так, нами не было обнаружено достоверной взаимосвязи между содержанием УЕОР в сыворотке крови и в цитозоле опухолей больных РМЖ (11=0,69; р=0,75). Корреляционной связи между тканевым уровнем УЕОРЯ-2 и его значениями в крови также не выявлено (11=0,12, р=0,57). По-видимому, это свидетельствует о различных источниках поступления ангиогенных факторов в сыворотку крови, помимо опухоли. Следовательно, нами не доказано предположение о возможности использования сывороточной концентрации маркеров как адекватной замене тканевым показателям ангиогенеза.

Значения экспрессии УЕвР и УЕОР11-2 в первичной опухоли достоверно коррелировали между собой (11=0,39; р=0,04), в то время как в сыворотке крови такой связи между уровнями исследуемых факторов не выявлено (11=0,11, р>0,05). Этот факт прослеживался и на фоне предоперационной терапии: динамика опухолевых УЕвР и УЕОРЯ-2 часто была аналогичной.

При анализе взаимосвязи исходного содержания ангиогенных факторов в первичной опухоли и сыворотке крови больных РМЖ с основными клинико-морфологическими характеристиками получены представленные ниже результаты.

На уровень УЕОР в сыворотке крови достоверно влиял возраст и менструальный статус больных: у молодых женщин с сохранной менструально-овариальной функцией содержание УЕвР было достоверно выше, чем у пациенток старших возрастных групп, находящихся в постменопаузе (р=0,03; р=0,01 соответственно). В то же время сывороточные показатели УЕОР и УЕОРЯ-2 были не связаны с таким прогностически важным фактором как распространенность процесса (критерии ТЫМ). Нами отмечено существенное увеличение уровня УЕвБ в сыворотке крови больных со Па стадией РМЖ по сравнению с больными III стадии, однако данные были не достоверными.

При исследовании влияния уровней рецепторов стероидных гормонов в опухоли оказалось, что УЕОБ и УЕОЕК-2 в сыворотке крови выше у больных с РЭ-положительным РМЖ по сравнению с РЭ-отрицательными опухолями, хотя значения не достигли статистической значимости. Обратная тенденция наблюдалась относительно рецепторов к прогестерону: показатели свободного УЕОБ в сыворотке крови были выше в группе больных с РП-отрицательными опухолями.

Менструальная функция и возрастные характеристики больных РМЖ не оказывали значимого влияния на содержание УЕОБ и УЕОРК-2 в цитозолях опухоли. Однако выявлена тенденция к положительной взаимосвязи концентрации УЕОБ и УЕОРК-2 со стадией заболевания: медианы обоих показателей были выше у больных с ШЬ стадией РМЖ по сравнению с группой больных со Па стадией, причем уровень именно УЕОБ был тем выше, чем больше размер первичной опухоли (Т). От количества пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов (К) показатели ангиогенных факторов в ткани опухоли не зависели.

Статус рецепторов эстрогенов не оказывал значимого влияния на тканевую экспрессию УЕОБ и его рецептора, с другой стороны, обнаружена интересная закономерность относительно рецепторов прогестерона: в РП-положительных опухолях уровень УЕОБ был существенно выше, чем в РП-отрицательных (р=0,03).

Анализ взаимосвязи содержания УЕОБ и УЕОЕК-2 в ткани РМЖ с такими прогностически неблагоприятными факторами как гиперэкспрессия НЕЯ-2/пеи и наличие раковых эмболов в лимфатических и кровеносных сосудах по периферии опухоли показал, что с этими показателями взаимосвязана только экспрессия УЕОЕК-2. Концентрация рецептора оказалась достоверно выше в опухолях с наличием раковых эмболов в лимфатических щелях (р=0,01) и при гиперэкспрессии белка HER-2/neu (р=0,03). Необходимо отметить также достоверное увеличение уровня растворимого VEGFR-2 в сыворотке крови больных с гиперэкспрессией HER-2/neu в опухоли (р=0,04). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования VEGFR-2 как дополнительного прогностического маркера у больных РМЖ.

При сравнительном анализе содержания ангиогенных факторов на фоне проведения неоадъювантного лечения наблюдали как увеличение, так и уменьшение VEGF и VEGFR-2 и в цитозоле опухолей, и в сыворотке крови больных РМЖ.

Показатели динамики экспрессии VEGF и VEGFR-2 в опухоли достоверно коррелировали с их исходными значениями: чем выше была исходная концентрация VEGF или VEGFR-2 в опухолевой ткани, тем в большей степени она снижалась после проведения противоопухолевой терапии (R=-0,67; р<0,05; R=-0,79; р<0,05 соответственно). При этом HáM удалось определить условные пороговые значения исследуемых показателей в первичной опухоли - 120 пг/мг белка для VEGF и 200 пг/мг белка для VEGFR-2. Содержание VEGF и VEGFR-2 в опухоли больных РМЖ выше указанных значений достоверно снижается после проведения специфического лечения. При значениях ниже пороговых уровней -существенно не меняется ни в сторону увеличения, ни в сторону уменьшения (р<0,001; р<0,001 соответственно) после неоадыовантной терапии. Стало быть, противоопухолевая терапия оказывает незначительное влияние на активность ангиогенеза в опухолевой ткани. С учетом полученных данных возможно назначение более адекватной и эффективной схемы неоадъювантной терапии больных местнораспространенным РМЖ, включающей и антиангиогенные препараты.

В сыворотке крови больных РМЖ исходные уровни свободного VEGF и его растворимого рецептора достоверно коррелировали с их показателями после проведенного лечения (11=0,81; р<0,001; Я=0,45; р=0,024 соответственно), однако четких закономерностей в направлении динамики сывороточных показателей нами не выявлено.

Оценка динамики содержания УЕОБ и УЕОР11-2 в сыворотке крови и в цитозоле опухолей на фоне неоадъювантного лечения в общей группе пациенток не выявила значимых корреляций найденных изменений с клинической стадией заболевания, размером первичной опухоли, степенью злокачественности, статусом НЕЯ-2/пеи.

Возраст и состояние менструальной функции сохранили свое влияние на концентрации УЕОБ в сыворотке крови: у женщин в возрасте до 40 лет уровень УЕОБ оставался намного выше после лечения по сравнению со старшими возрастными группами (р=0,01). В то же время в группе больных, находящихся в перименопаузе, УЕОБ возрос на достоверно меньшую величину, чем в сыворотке крови постменопаузальных больных (р=0,01). При этом динамические показатели растворимого УЕОРЯ-2 никак не зависели от указанных клинических характеристик.

Динамика цитозольных значений УЕОБ и УЕОРЫ-2 была также взаимосвязана с менструальным статусом пациенток: в опухолях менструирующих больных концентрация ангиогенных факторов увеличивалась по сравнению с группами женщин в пре- и постменопаузе (р=0,01; р=0,01 соответственно).

Анализируя значение рецепторного статуса РМЖ на изменение уровней ангиогенных факторов в сыворотке крови и опухоли, наблюдалось более значимое влияние уровня рецепторов прогестерона: концентрация УЕвРК-2 в сыворотке крови больных с РП-положительным РМЖ на фоне неоадъювантного лечения достоверно увеличивалась по сравнению РП-отрицательными опухолями (р=0,018). Направление изменений содержания сывороточного УЕОРЯ-2 практически не зависело от РЭ-статуса опухоли. В ткани опухолей, отрицательных и по РЭ, и по РП, также наблюдалось достоверное снижение УЕОР11-2 после проводимой терапии по сравнению с рецепторопозитивным РМЖ (р<0,05 в обоих случаях). Те же тенденции наблюдались и при исследовании содержания свободного VEGF в цитозолях опухоли, однако, различия не достигли статистической значимости.

Наличие раковых эмболов в просветах лимфатических и кровеносных сосудов оказывало влияние только на уровень VEGFR-2 в сыворотке крови -после лечения значения этого показателя увеличивались, а в отсутствии эмболов - достоверно снижались (р=0,02).

Еще один критерий оказался взаимосвязанным с динамикой опухолевой экспрессии именно VEGFR-2: у больных с множественными метастазами в регионарных лимфоузлах (N3), определяемыми при гистологическом исследовании операционного материала, уровень VEGFR-2 в опухоли оказался достоверно выше, чем у больных РМЖ без поражения регионарных лимфоузлов (N0) (р=0,03). С уровнем VEGF в обоих субстратах значимых зависимостей с указанными критериями выявлено не было.

Однако нам удалось определить важную зависимость тканевой экспрессии и VEGF, и VEGFR-2 от эффекта проведенной терапии, установленного при гистологическом исследовании операционного материала. Так, более выраженные изменения в опухолевых клетках (IV степень лечебного патоморфоза) коррелировали с низкими значениями VEGF и VEGFR-2 в остаточной опухоли (р=0,04; р=0,04 соответственно). Медиана VEGF в сыворотке крови, напротив, оказалась значительно выше после лечения в группе пациенток с IV степенью лечебного патоморфоза в опухоли по сравнению с 0-1 степенью, однако, эти изменения не достигли статистической значимости. Динамика растворимого VEGFR-2 вообще не имела направленности в зависимости от степени лечебного патоморфоза. Полученные данные подтверждают большую целесообразность определения экспрессии маркеров ангиогенеза именно в опухоли больных РМЖ по сравнению с исследованием сывороточных показателей.

Большой интерес в нашей работе представлял вопрос о влиянии вида противоопухолевой терапии (химиотерапия, лучевая терапия, сочетанная химиолучевая терапия) на показатели ангиогенеза и как полученные результаты могут отразиться на выборе тактики неоадъювантного лечения больных местнораспространенным РМЖ. Однако, учитывая небольшие для анализа группы пациентов, которым проводилась различная предоперационная терапия, наши выводы носили тенденциозный характер.

Неоадъювантная терапия, несомненно, влияет на содержание изучаемых факторов, как в сыворотке крови, так и в цитозолях опухоли, однако изменения сывороточных маркеров не имели определяющего значения и не зависели от вида специфического лечения. Во всех трех группах мы наблюдали, в целом, возрастание уровней VEGF, причем степень и направление этих изменений не зависели от стадии РМЖ и степени лечебного патоморфоза. Растворимый VEGFR-2 менялся более разнонаправлено, однако, четких закономерностей в динамике маркера в каждой конкретной группе нами не обнаружено.

Динамика содержания VEGF и VEGFR-2 в цитозоле опухолей в группах больных, получавших различную неоадъювантную терапию, показала, что наиболее целесообразным является применение полихимиотерапии в сочетании с антиангиогенной терапией у больных местнораспространенным РМЖ, причем начинать ее необходимо на более ранних стадиях (IIa - IIb), когда процессы ангиогенеза в опухоли, видимо, наиболее активны.

Лучевая терапия не оказывала значимого влияния на активность ангиогенеза в опухолях больных РМЖ: концентрация ангиогенных факторов снижалась и возрастала в равных пропорциях (по 50% наблюдений соответственно). С другой стороны, высоковаскуляризированные опухоли (содержание VEGF > 120 пг/мг белка) оказались резистентны для предоперационного облучения. Возможно, это связано с воздействием VEGF на интерстициальное давление, при котором доставка кислорода в ткани опухоли происходит неравномерно с формированием участков, нечувствительных для лучевой терапии. Эти данные подтверждают исследования С.О.Ьее а1. (2000) и У.К.Оир1а а1. (2002), в которых при облучении УЕОР-/- и УЕОР+/+ ксенотрансплантатов опухолей у мышей оказалось, что УЕОР+/+ ксенотрансплантаты более устойчивы к цитотоксическим эффектам ионизирующей радиации, чем УЕОР-/-ксенотрансплантаты [68].

Химиолучевая терапия, в целом, снижала содержание ангиогенных факторов в цитозоле опухолей, однако, видимо, недостаточно эффективно, чтобы приостановить ангиогенез в опухолевой ткани, так как динамические изменения УЕОР и УЕОРЯ-2 не были взаимосвязаны с выраженностью лечебного патоморфоза. Этот факт свидетельствует о том, что, несмотря на достаточно мощную терапию, неоадъювантное лечение таких больных целесообразно дополнить препаратами с антиангиогенным действием.

Таким образом, количественное определение ангиогенных факторов именно в опухолевой ткани наиболее адекватно отражает активность неоангиогенеза при местнораспространенном РМЖ. Хотелось бы подчеркнуть перспективность исследования рецепторов УЕОР, в частности УЕОРЯ-2, с последующей возможностью использования их в качестве новых биологических маркеров прогноза заболевания и чувствительности больных РМЖ как к общепринятым схемам противоопухолевого лечения, так и к новейшим антиангиогенным препаратам.