Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Прогностическая оценка уровня регуляторных Т-лимфоцитов у больных раком предстательной железы

005005323

АГАЕВ НАЗАР МУХАМЕДКЕРИМОВИЧ

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УРОВНЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ

14.01.23 -урология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 ДЕК 2011

Москва 2011г

005005323

Работа выполнена на кафедре урологии и оперативной нефрологии ГОУ ВПО Российского университета дружбы народов и в лаборатории клеточной биохимии ГУЗ Московского научно-исследовательского института медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.П.Авдошин,

доктор биологических наук, профессор Е.Ю. Москалева.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры нефрологии и гемодиализа ФППО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова доктор медицинских наук, профессор кафедры урологии и оперативной нефрологии ГОУ ВПО РГМУ

Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 20»декабря 2011 года в « 11» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.01 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117333, г. Москва, ул. Фотиевой, д.б. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Муклухо - Маклая, д.б) Автореферат разослан «18 »ноября 2011г.

В.В.Борисов.

А.К.Чепуров.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

И.М. Ордиянц 2

Список сокращений

ДГПЖ - Доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ДК - Дентритные клетки

ИЛ - Интерлейкин

ИФу - Интерферон -гамма

КТ - Компьютерная томография

МКБ - Мочекаменная болезнь

МРТ - Магнитно-резонансная томография

ОСА - Опухолеспецифический антиген

ПЖ - Предстательная железа

ПИН - Простатическая интраэпителиальная неоплазия

ПРИ - Пальцевое ректальное исследование

ПСА - Простатический специфический антиген

РПЖ - Рак предстательной железы

Трег - Т регуляторные лимфоциты

ТРУЗИ - Трансректальное ультразвуковое исследование

CTLA-4 - cytotoxic lymphocyte-associated, antigen-4

Dul45 - андрогеннонезависимая клеточная линия рака предстательной

железы

FOXP3 - ген, кодирующий фактор транскрипции GITR - индуцируемый глюкокортикоидами белок

Lck - (leucocyte-specific protein tyrosine kynase) - лимфоцит-специфическая тирозинкиназа

LNCaP - андрогеннозависимая клеточная линия рака предстательной железы TIL- Tumor Infiltrating Lymphocytes

TNF - glucocorticoid - induced tumor necrosis factor related protein VEGF- (vascular endothelial growth factor)^актор роста эндотелия сосудов

\3

Общая характеристика диссертации Актуальность проблемы

Одной из наиболее актуальных медико-социальных проблем современной урологии является распространенность таких заболеваний, как рак предстательной железы (РПЖ) и доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ). РПЖ - одно из наиболее часто встречающихся злокачественных заболеваний у мужчин среднего и пожилого возраста (Трапезников H.H., Аксель Е.М.,1999).

В Европе ежегодно диагностируется 2,6 миллионов новых случаев рака, из которых РПЖ составляет 11%, а смертность от него достигает 9%.

В Российской федерации в течение года летальность с момента установления диагноза злокачественного образования предстательной железы составляет 19.9%, что свидетельствует о крайне низкой выявляемое™ заболевания на ранних стадиях (Аполихин О.И. и соавт, 2002).

В патогенезе РПЖ ключевую роль играют гормональные факторы (Каприн А. Д., и соавт., 2007).

В тоже время, этиопатогенез онкологических заболеваний связан с нарушениями в развитии иммунного ответа на опухолевые антигены (Торопова Н.Е., и соавт., 1995).

Снижение функционального состояния компонентов иммунитета определяется уже на начальных стадиях РПЖ и усиливается по мере прогрессирования заболевания (Топузов М.Э., и соавт.,2007). У больных РПЖ отмечается уменьшение антигензависимой активности Т-лимфоцитов и угнетение функций натуральных киллеров (NK-клеток).

Однако в настоящее время окончательно не определено, какие иммунологические показатели и как коррелируют со стадиями РПЖ (Торопова Н.Е., и соавт., 2007). У онкологических больных, в том числе у больных РПЖ, очень важна оценка функциональных характеристик и согласованности работы всех компонентов иммунной системы, так как

количественные показатели, особенно у больных локализованной формой РПЖ, могут быть не изменены (Ladanyi, А., 2004).

Такие методы лечения больных РПЖ как гормональная, лучевая и химиотерапия с одной стороны позволяют надеяться на достижение благоприятных результатов, с другой — усугубляют имеющуюся иммунодепрессию (Жумагазин Ж.Д., 1996), что свидетельствует об актуальности исследований по улучшению диагностики иммунологических нарушений для оптимизации лечения онкоурологических заболеваний (Авдошин В.П., и соавт. 2003).

В исследованиях последних лет обнаружена важная роль клеток-супрессоров и, в первую очередь регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4CD25 в подавлении реакций специфического противоопухолевого иммунитета у онкологических больных (Wilke С.М. et al 2010). Эти же клетки могут иметь большое значение в подавлении клеточного иммунитета у больных РПЖ (Yokokawa J. et al. 2008, Miller A.M. et al. 2006).

В связи с этим целью настоящей работы явилась оценка состояния клеточного противоопухолевого иммунитета у больных раком предстательной железы.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку диагностической значимости неинвазивных методов обследования больных с подозрением на РПЖ.

2. Оценить состояние иммунного статуса пациентов с РПЖ и ДГПЖ в сравнении с пациентами контрольной группы.

3. Исследовать количество регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4CD25 в периферической крови больных РПЖ и ДГПЖ и пациентов контрольной группы.

4. Исследовать количество, фенотип и продукцию Ифу лимфоцитами, после стимуляции дендритными клетками больных РПЖ in vitro в сравнении со здоровыми добровольцами.

5. Изучить уровень продукции Ифу лимфоцитами, стимулированными in vitro дендритными клетками, в зависимости от содержания в периферической крови CD4CD25 лимфоцитов.

6. Оценить прогностическую значимость повышения содержания в периферической крови CD4CD25 лимфоцитов при РПЖ и ДГПЖ.

Научная новизна исследования Впервые обнаружено статистически значимое повышение количества С04+СВ25+-лимфоцитов как при ДГПЖ, так и при РПЖ; при этом наиболее высокий уровень этих клеток наблюдался при РПЖ.

С использованием культуры лимфоцитов и ДК больных РПЖ и здоровых добровольцев впервые показаны широкие индивидуальные различия в степени подавления клеточного иммунитета у больных РПЖ.

Впервые показано, что подавление иммунного ответа на опухолевые антигены у больных РПЖ определяется особенностями лимфоцитов больных РПЖ.

Впервые показано, что степень подавления клеточного иммунитета у больных РПЖ коррелирует с уровнем ПСА и степенью распространенности опухолевого процесса.

С использованием модельной клеточной системы впервые показано, что степень подавления клеточного иммунитета у больных РПЖ коррелирует с уровнем регуляторных Т- лимфоцитов CD4CD25 в периферической крови больных.

Практическая значимость работы Обнаруженные индивидуальные различия в степени подавления клеточного иммунитета больных РПЖ и уровне регуляторных Т-лимфоцитов могут быть использованы для выбора персональных схем лечения больных РПЖ и для прогноза развития заболевания.

Повышение уровня регуляторных Т-лимфоцитов у больных ДГПЖ может быть использовано, как показатель возможного развития РПЖ на фоне

ДГПЖ, что требует более частого и пристального обследования таких больных для своевременной диагностики РПЖ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1.Наиболее диагностически значимым неинвазивным методом выявления РПЖ является определение уровня ПСА сыворотки крови, его чувствительность составляет 71.6%. Чувствительность ТРУЗИ составляет 51.4%, а пальцевого ректального исследования - 26.3 %.

2.У пациентов с ДГПЖ выявлено статистически значимые изменения иммунного статуса, заключающиеся в снижении уровня CD8+ лимфоцитов и в увеличении иммунорегуляторного индекса.

3. У больных РПЖ и ДГПЖ обнаружено повышение количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4CD25 до 0.33 - 0.47% против 0.11% в контрольной группе, которое коррелирует с повышенным уровнем ПСА и может служить отрицательным прогностическим признаком течения заболевания.

4. В культуре лимфоцитов больных РПЖ после стимуляции ДК обнаружен более низкий прирост количества клеток, чем у здоровых добровольцев, более низкий уровень С08+-клеток и подавление продукции ИФу лимфоцитами в ответ на стимуляцию ДК.

5. Повышение содержания CD4+CD25+ Т-лимфоцитов приводит к подавлению клеточного противоопухолевого иммунитета, оцениваемого по продукции ИФу в модельной системе in vitro.

6. Повышенное содержание CD4CD25 Т- лимфоцитов при ДГПЖ и РПЖ может рассматриваться как отрицательный прогностический признак течения заболевания.

Апробация материалов диссертации

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедры

урологии и оперативной нефрологии РУДН с участием сотрудников I и II

урологических отделений ГКБ№ 29,21 июня 2011 г. Материалы диссертации

были доложены и обсуждены на III Конгрессе Российского общества

7

онкоурологов 2-3 октября 2008г Москва; на объединённом иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008г; на VI Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" 10-11 ноября 2009 г. Москва; на X Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении», Санкт-Петербург 2011.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 56 отечественных и 174 зарубежных источников.

Работа содержит 16 рисунков, 10 таблиц и 1 схему.

Содержание диссертации.

Материалы и методы исследований

Клинические методы исследований. Для осуществления

поставленных задач было обследовано 127 пациентов (67 пациентов с

подозрением на РПЖ и 60 пациентов контрольной группы), которые

находились на стационарном лечении в I и II урологических отделениях

Городской клинической больницы № 29. Возраст пациентов с заболеваниями

предстательной железы, составил от 59 до 81 лет, средний возраст 68,7 лет

В модельных экспериментах были использованы образцы крови

здоровых добровольцев (ЗД).

Всем пациентам было проведено комплексное обследование,

включающее клиническое исследование, пальцевое ректальное исследование

предстательной железы, трансректальное, либо трансабдоминальное

ультразвуковое исследование, определение уровня простатоспецифического

а

антигена в сыворотке крови, обзорную рентгенографию органов мочевыделительной системы, экскреторная урография, рентгенография костей скелета и органов грудной клетки. Всем пациентам с подозрением на РПЖ с целью верификации диагноза и определения дальнейшей тактики лечения производилась мультифокальная биопсия предстательной железы трансректальным доступом с последующим патоморфологическим исследованием взятых образцов. Важно отметить, что в ходе обследования у 4 пациентов контрольной группы выявлен уровень ПСА выше порогового значения, что позволило нам отнести данных пациентов к группе пациентов с подозрением на РПЖ (п=71).

Клиническое исследование было традиционным. Клиническую стадию РПЖ определяли по Международной классификации TNM (2002). Гистопатологическая дифференцировка железистых структур опухоли осуществлялась по градации Глисона.

Культивирование клеток аденокарциномы предстательной железы человека линии LNCaP и линии Ои145проводили с использованием сред RPMI 1640 и DMEM ("Sigma", США) с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота ("Gibco",CLIIA) и 5% сыворотки лошади ("Gibco", США), 50 мкг/мл гентамицина, в увлажненной среде при температуре 37°С в С02 инкубаторе при содержании С02 5%.

Приготовление лизатов опухолевых клеток проводили при замораживании (жидкий азот) - оттаивании (водяная баня, 37°С) в фосфатно-солевом буфере. Лизаты центрифугировали при 13000g 60 минут при +4°С. Супернатант отбирали, после определения концентрации белка тарировали и хранили при -70°С.

Получение лимфоцитов и дендритных клеток человека. Мононуклеарные

лейкоциты (МЛ) выделяли из периферической крови по методу Boyum

(1968). Часть МЛ использовали для определения фенотипа лимфоцитов, а из

основной части выделяли моноциты с помощью адгезии на пластике и

лимфоциты как неприкрепляющиеся клетки. Моноциты при

9

культивировании с ГМ-КСФ (8000 ед) и ИЛ-4 (10000 ед) в течение 7суток дифференцировались в ДК и к ним для индукции созревания добавляли лейкинферон (100 МЕ/мл), простагландин Е2 (1 мкг/мл) и ФНОа (50 нг/мл). На 8-9 день получали зрелые ДК.

Анализ фенотипа субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием проточной цитофлуориметрии на приборе EPICS-XL. Суспензию лимфоцитов инкубировали с моноклональными антителами фирмы Сорбент (Россия). При этом использовали двойную флуоресцентную метку: ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат, желто-зеленая люминесценция) для антител к CD25 и фикоэритрин (красная люминесценция) для антител, выявляющих CD4 антиген.

Нагрузка ДК опухолеспецифическими антигенами. Для нагрузки ДК комплексом антигенов ДК собирали, отмывали в бессывороточной среде RPMI 1640, ресуспендировали в среде AIM-V ("Gibco", США) и добавляли к ним на 18 часов смесь лизатов опухолевых клеток аденокарцином предстательной железы человека линии LnCaPn Dn 145. Индукция опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ). Контрольные и нагруженные опухолеспецифическими антигенами ДК смешивали с лимфоцитами в соотношении 1:10. На следующий день и далее два раза в неделю к клеткам добавляли 30 ед/мл ИЛ-2 ("Sigma", США). На восьмой день проводили повторную стимуляцию лимфоцитов ДК, нагруженными соответствующими антигенами в описанных выше условиях. Через 24 часа после стимуляции ДК собирали культуральную среду лимфоцитов для определения концентрации ИФу.

Определение ИФу методом ИФА. Для определения концентрации ИФу моноклональные антитела к ИФу (клон уС8) сорбировали на планшет в концентрации при температуре 4°С в течение ночи и проводили иммуноферментный анализ, используя в качестве вторых антител конъюгат моноклональных антител к ИФу (клон yFl) с пероксидазой хрена в ФБР-AT.

Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента с помощью компьютерной обработки данных в программе Microcal Origin 5,0.

Результаты исследований Дифференциальная диагностика рака предстательной железы

В процессе исследования было проведено обследование больных и были собраны результаты лабораторных, патоморфологических и иммунологических анализов 67 пациентов с подозрением на РПЖ и 60 пациентов с мочекаменной болезнью, с купированным приступом почечной колики (у данной категории больных имел место впервые возникший приступ почечной колики, у которых в ходе обследования патологических изменений со стороны мочевыделительной системы выявлено не было, что позволило нам отнести их в контрольную группу « условно здоровых пациентов»). Все пациенты находились на обследовании и лечении в I и II урологических отделениях Городской клинической больницы № 29 г. Москвы.

ПРИ проводилось всем больным. При этом уделялось внимание таким параметрам как размер, консистенция, состояние поверхности, наличие узловых образований, симметрии, границам железы, сохранение срединной бороздки, наличие смещаемости предстательной железы относительно окружающих органов и тканей. Изменения предстательной железы, которые позволили заподозрить ее злокачественное перерождение, такие как бугристая поверхность, нечеткие контуры железы и наличие изолированных узлов наблюдалось у 19 (15%) пациентов.

В ходе проведения ТРУЗИ обращалось внимание на искаженность контуров предстательной железы, неоднородность паренхиматозных сигналов, наличие пенетрации капсулы железы. Такие изменения выявлены у 37 (29%) пациентов. Таким образом, трансректальное ультразвуковое

исследование оказалось более чувствительным по сравнению с пальцевым ректальным исследованием.

При исследовании уровня ПСА в сыворотке крови обнаружено, что у 91 (72%) пациентов уровень ПСА находился в пределах до 10 нг/мл, причем у 56 (44%) пациентов уровень ПСА составлял не более 4 нг/мл. У 36 (28%) пациентов уровень ПСА был 10 нг/мл и более, в связи с этим с высокой степенью вероятности можно прогнозировать при последующей биопсии выявление у данной категории обследуемых РПЖ.

У 35 (28%) пациентов при уровне ПСА в пределах 4,1-10,0 нг/мл можно прогнозировать последующее выявление РПЖ с меньшей вероятностью.

Таким образом, при исследовании уровня ПСА выявлено, что у 71 пациента уровень ПСА составил более 4 нг/мл, т.е. был выше порогового значения, превышение которого является показанием к биопсии предстательной железы.

71 пациенту с целью верификации диагноза и определения дальнейшей тактики лечения произведена мультифокальная биопсия предстательной железы трансректальным доступом с последующим патоморфологическим исследованием образцов. При этом, распределение больных по нозологическим формам заболеваний предстательной железы было следующим: у 48 пациентов верифицирован РПЖ, у 19 пациентов - ДГПЖ, и у 4 пациентов - ПИН высокой степени.

В зависимости от стадии развития РПЖ системы ТЫМ пациентов разделили на 4 группы: I клиническая стадия - ТШ0М0 - 5 (10%) пациентов, Н-я клиническая стадия - Т2Ы0Мо -26 (54%) пациентов, III клиническая стадия - ТЗЫоМо, ТЗЫХМ0- 14 (30%) пациентов, IV- клиническая стадия - Т4 ИхМо, ТзК-Мь Т4ИХМ1 - 3 (6%) пациентов.

Таблица №1. Заболевания предстательной железы, диагностированные у пациентов при гистологическом исследовании биопсийного материала в зависимости от результатов трансректалыюго ультразвукового исследования предстательной железы.

Конт РПЖ РПЖ РПЖ РПЖ РПЖ

Показател Труп дгп ПИН I ст. Ист. III ст. IV ст. всего,

И (п=60 (п=19) (п=4) (п=5) (п=26) (п=14) (п=3) (п=48)

Объем предстательной железы:

-до 30 см3 56 93% 0 1 25% 1 0 0 0 1 2%

Более 30 4 15 3 4 26 14 3 47

см' 7% 79% 75% 98%

Эхоструктура предстательной железы:

Изоэхоген- 58 12 4 5 9 1 1 16

ная 97% 63% 100% 33%

Гипоэхоге 2 3 0 0 17 13 2 32

н-ная 3% 16% 67%

Контуры предстательной железы:

сохранены 60 100% 15 79% 4 100% 5 16 3 0 24 50%

нечеткие 0 0 0 0 10 11 3 24 50%

Форма предстательной железы:

Симметри 60 15 4 4 17 6 0 27

чная 100% 79% 100% 56%

ассиммет 0 0 0 1 9 8 3 21

ричная 44%

Таблица 2. Заболевания предстательной железы, диагностированные у пациентов при гистологическом исследовании биопсийного материала в зависимости от уровня ПСА.

Уровень ПСА Контр дгпж пин РПЖ РПЖ РПЖ РПЖ РПЖ

ПСА общ. группа п=19 п=4 1 ст. На. III ст. IV ст. всего

нг/мл п=60 11=5 п=2б П=14 п=3 п=48

0-2,5 18 15% 0 0 0 0 0 0 0

2,5-4,0 38 78% 0 0 0 0 0 0 0

4,1-9,9 4 ТА 15 79% 4 100% 4 7 1 0 12 25%

10-19,9 0 0 0 1 16 7 0 24 50%

20-29,9 0 0 0 0 3 5 0 8 17%

30-100 и выше 0 0 0 0 0 1 3 4 13%

Следует отметить, что у 1 пациента при биопсии предстательной железы данных о РПЖ получено не было, однако, рак был выявлен при патоморфологическом исследовании материала после аденомэктомии.

В таблице 1 и 2 представлены типы заболеваний предстательной железы в зависимости от особенностей, выявляемых с помощью ТРУЗИ (таблица 1) и от уровня ПСА в сыворотке крови (таблица 2).

Как показывают результаты исследования биопсийного материала пациентов с различными заболеваниями предстательной железы, выявленных при помощи ТРУЗИ, в группе пациентов, страдающих РПЖ,

ассиметрия железы (у 21 пациентов (17%)), наличие гипоэхогенных зон (у 37 пациентов (29%)) и нечеткие контуры простаты ( у 24 пациентов (19%)) прослеживались чаще, чем в других исследуемых группах (таблица2).

Результаты исследования ПСА у больных показали, что уровень ПСА в сыворотке крови не является абсолютным показателем, позволяющим поставить диагноз РПЖ, т.к. ПСА может повышаться до значительных величин и при ДГПЖ.

Исследование иммунного статуса пациентов с РПЖ в сравнении с больными ДГПЖ и МКБ.

Для характеристики иммунного статуса в периферической крови пациентов исследовали содержание CD8+, CD4+ и CD25+ лимфоцитов и рассчитывали иммуно- регуляторный индекс (ИРИ) - соотношение CD4+ и CD8+лимфоцитов. Гематологические показатели у обследованных лиц были в пределах уровня нормы и лейко- и лимфопении, а также лейкоцитоза не наблюдали. Уровень нормы для исследуемых показателей при использовании антител фирмы "Сорбент" по данным фирмы-производителя составляет для CD8+, CD4+ и CD25+ лимфоцитов 23±4%, 39±5%, и 0±0% соответственно. Полученные результаты представлены в таблице № 3.

Таблица № 3. Иммунный статус обследованных пациентов с мочекаменной болезнью, доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы. * - р<0,05 для указанных групп._

Группы обследованных больных

Исследуемые показатели Контрольная группа 1 ДГПЖ 2 РПЖ 3

CD4, % 45,70±3,40 33,40±2,70 *,.2 50,40±3,20 *2-з

CD8, % 17,30±1,80 7,90 ±1,80 *,.2 14,70±1,00 *2-з

ИРИ, усл. ед. 2,90±0,50 7,60 ±2,40 *,.2 2,50±0,50

CD25, % 0,20±0,04 0,52±0,17 0,89±0,28

Из приведенных данных следует, что при МКБ иммунный статус пациентов практически не отличается от иммунного статуса здоровых добровольцев, за исключением присутствия в периферической крови небольшого количества СШ5+ лимфоцитов, что подтверждает

правомочность использования параметров, наблюдаемых у пациентов при МКБ, в качестве контроля.

У пациентов с ДГПЖ обнаружены статистически значимые изменения иммунного статуса, заключающиеся в снижении уровня CD8+ лимфоцитов и, соответственно, в увеличении ИРИ. Уровень С025+-лимфоцитов у пациентов с ДГПЖ был выше, чем в контрольной группе (у пациентов с МКБ и в норме).

У пациентов с РПЖ статистически значимых изменений изученных показателей иммунного статуса по сравнению с МКБ не обнаружено, но уровень С025+-лимфоцитов был также выше нормы и был наиболее высоким среди рассматриваемых групп урологических заболеваний.

Исследование содержания CD4 CD25 лимфоцитов в периферической крови больных РПЖ, ДГПЖ и МКБ.

Уровень С04+С025+-лимфоцитов анализировали у больных МКБ, ДГПЖ и РПЖ. Необходимо отметить статистически значимое повышение этого показателя как при ДГПЖ, так и при РПЖ (рис1). При этом наиболее высоким уровень Трег был при РПЖ. Необходимо отметить значительные межиндивидуальные различия в уровне Трег при ДГПЖ и РПЖ. Содержание Трег было повышено лишь у части пациентов, в то время как у другой части больных этот показатель не отличался от соответствующих значений в контрольной группе. В контрольной группе межиндивидуальные различия содержания С04+С025+-лимфоцитов были незначительны.

Следует отметить, что у пациентов сравниваемых групп различалось количество С04-лимфоцитов (таблица 3). Поэтому, помимо содержания С04+С025+-лимфоцитов, определяли и долю CD4+CD25+-iüieTOK во фракции С04+-лимфоцитов. Полученные результаты, представленные на Рис. № 2, свидетельствуют о том, что и при ДГПЖ и при РПЖ содержание CD4+CD25+-icneTOK во фракции С04+-лимфоцитов значительно превышает этот показатель в контрольной группе - группе пациентов с МКБ.

Для оценки роли уровня Трег в прогнозе клинического течения заболевания при РПЖ сравнивали содержание СВ4+С025+-лимфоцитов в группах пациентов с разным уровнем ПСА, т.к. известно, что определение

го 1.8 Н 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Л

МКБ ДГПЖ РПЖ

Рис. 1. Содержание С04+СБ25+ лимфоцитов у мочекаменной болезнью (МКБ), доброкачественной (ДГПЖ) и раком предстательной железы (РПЖ). * сравнению с пациентами с МКБ. В группах больных ДГПЖ и РПЖ обнаружены значительные межиндивидуальные различия.

пациентов с гиперплазией р<0,05 по

о

о

5

Рис. 2. Содержание СП4+СБ25+ лимфоцитов в процентах от уровня СБ4+ лимфоцитов у пациентов с мочекаменной болезнью (МКБ), доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) и раком предстательной железы (РПЖ).

концентрации ПСА является общепринятым подходом не только для диагностики РПЖ, но и для мониторинга течения заболевания и эффективности его лечения. Обнаружено, что содержание CD4+CD25+ наиболее высоко в группе больных с более высоким уровнем ПСА. Это позволяет полагать, что высокий уровень содержания CD4+CD25+-лимфоцитов в периферической крови при РПЖ и, по-видимому, при ДГПЖ может рассматриваться как дополнительный показатель плохого прогноза.

Для характеристики функциональной активности

иммунокомпетентных клеток пациентов РПЖ исследовали особенности ответа лимфоцитов на стимуляцию дендритными клетками в культуре клеток in vitro.

Характеристика клеточного иммунного ответа у больных раком предстательной железы с использованием модельной клеточной системы для изучения индукции специфического противоопухолевого иммунного ответа in vitro.

Для характеристики изменений клеточного иммунного ответа у больных РПЖ in vitro исследовали культуры лимфоцитов после стимуляции ДК.

ДК, полученные из моноцитов периферической крови больных РПЖ и ЗД, нагружали опухолеспецифическими антигенами (ОСА), которые готовили из опухолевых клеток перевиваемых линий аденокарциномы предстательной железы. При стимуляции лимфоцитов ДК было показано, что прирост количества лимфоцитов в культурах, стимулированных ДК больных РПЖ, был в среднем значительно ниже, чем в аналогичных культурах клеток от ЗД. В то же время необходимо отметить, что наблюдались значительные индивидуальные различия в приросте клеток в культурах лимфоцитов, полученных от разных больных.

Более медленный прирост клеток в культурах лимфоцитов больных свидетельствует о подавлении иммунного ответа при РПЖ.

При исследовании фенотипа культивируемых лимфоцитов обнаружено,

18

Увеличения числа клеток, усл.ед

РПЖ Здоровые добровольцы

Рис.3. Прирост числа клеток в культурах лимфоцитов больных РПЖ и здоровых

добровольцев через две недели после стимуляции ДК, нагруженными опухолевыми антигенами РПЖ.

что в культурах лимфоцитов, полученных от больных РПЖ, существенно снижена доля С08-лимфоцитов - основной субпопуляции лимфоцитов-эффекторов и существенно увеличена по сравнению со ЗД величина иммунорегуляторного индекса - отношение CD4/CD8.

Полученные данные свидетельствуют о подавлении клеточного иммунитета у больных РПЖ. В основе более медленного общего прироста количества клеток в культурах лимфоцитов от больных РПЖ и, что особенно важно, клеток-эффекторов с фенотипом CD8+, возможно, лежит изменение регуляторных механизмов, с участием регуляторных Т-лимфоцитов.

Для исследования уровня продукции ИФу лимфоцитами больных РПЖ в сравнении со ЗД при взаимодействии лимфоцитов с ДК in vitro через сутки после стимуляции и рестимуляции лимфоцитов ДК собирали культуральную среду и определяли в ней концентрацию ИФу.

Контролем служила культуральная среда лимфоцитов, которые культивировались в тех же условиях с использованием ИЛ-2 (30 ед/мл), но без стимуляции ДК. Полученные результаты представлены на Рис.4.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

3500 -3000 2500 2000 -1500 -1000 -500 -0

1РПЖ

1 неделя 2 недели

□ Здоровые

ШШ .

1 неделя 2 недели

Рис. 4. Продукция ИФу лимфоцитами здоровых добровольцев и больных РПЖ через 24 часа после 1-(1 неделя) и 2-го (2 недели) добавления дендритных клеток к лимфоцитам.

А - дендритные клетки перед добавлением к лимфоцитам нагружены опухолеспецифическими антигенами - смесью лизат клеток РПЖ человека лин* ЬпСаР и Би145.

Б - контрольные лимфоциты,

культивировавшиеся с ИЛ

Обнаружено, что при РПЖ продукция ИФу культивируемыми лимфоцитами в ответ на стимуляцию ДК существенно и статистически значимо снижена по сравнению со ЗД. В то же время при стимуляции лимфоцитов и ЗД и больных РПЖ ДК происходит индукция антигенспецифических лимфоцитов и в ответ на повторную стимуляцию ДК в обоих случаях обнаружена более высокая продукция ИФу, однако концентрация ИФу в культуральной среде лимфоцитов больных РПЖ была значительно ниже, чем в среде лимфоцитов ЗД.

Необходимо подчеркнуть, что спонтанная продукция ИФу контрольными лимфоцитами, культивировавшимися без добавления ДК,

также была более низкой при РПЖ. Эти данные также подтверждают предположение о наличии клеток-супрессоров во фракции лимфоцитов периферической крови больных РПЖ.

С использованием этой модели были обследованы больные РПЖ с разной распространенностью процесса, оцениваемой по системе ТЫМ. Между больными Т2 Их Мо и ТЗ № Мо-М1 по уровню продукции ИФу в культуре лимфоцитов, стимулированных ДК, различий не обнаружено, поэтому эти больные были объединены в одну группу Т2.3 № Мо-М1, которую сравнивали с группой больных Т4ЫхМо-М 1. На рис.5 приведены данные по уровню ПСА у этих больных, а на рис.6 - данные по уровню продукции ИФу лимфоцитами, стимулированными ДК, нагруженными антигенами РПЖ (Рис. 6 А), и не стимулированными лимфоцитами (Рис.6 Б).

Как следует из рис.5, уровень ПСА в сыворотке крови больных был достоверно более высоким в группе больных РПЖ Т4 Их Мо-М1.

Уровень ПСА нг/мл

45 ± 22,8

Т2-3№М0-М1 Т4МхМ0-М1

Рис.5. Уровень ПСА у больных РПЖ в зависимости от распространенности опухолевого процесса.

Уровень продукции ИФ-у нг/106нг/млн клеток

1762 ±585

Т2-ЗМхМ0-М1 Т4МхМ0-1

Уровень продукции ИФу, нг/10в клеток

30 - 25 X 9,4

Т2-3|МхМ0-1 Т4№сМ0-1

Рис.6. Уровень продукции ИФу лимфоцитами больных РПЖ с разной степенью распространенности опухолевого процесса через 2 недели культивирования. А - иммунные лимфоциты, индуцированные ДК, нагруженными антигенами РПЖ. Б-контрольные, нестимулированные лимфоциты, культивировавшиеся в тех же условиях.

Части больных проводили хирургическую кастрацию и антиандрогеную терапию. В группах больных после кастрации и без нее сравнивали уровень ПСА и продукцию ИФу лимфоцитами после стимуляции ДК. Полученные результаты представлены на рис.7 и 8.

Как видно из рис. 7, уровень ПСА был повышен в обеих группах больных. Более высоким он был у тех больных, которым проводили хирургическую кастрацию и антиандрогенную терапию. Это коррелирует с приведенными выше данными о более высоком уровне ПСА у больных с более тяжелой стадией заболевания, характеризующейся большей степенью распространенности опухолевого процесса, оцениваемой по системе ТОМ, т.к. в этой группе больных оказались лица с РПЖ со стадией рака Т3ЫхМо -Т4КхМо-М1. Метастазы наблюдались в области костей таза.

Рис.7 .Уровень ПСА у больных РПЖ после хирургической кастрации и андрогенотерапии (1) и без кастрации и антиандрогенной терапии (2).

Уровень ПСА нг/мл

И Фу, нг/мл 2168,4±б20,0

663±277,7'

Рис.8.Уровень продукции И Фу лимфоцитами больных РПЖ после кастрации и антиандрогенной терапии (1) и без антиандрогенной терапии (2), через 2 недели после стимуляции ДК, нагруженными антигенами РПЖ._

Из данных, представленных на рис.8, видно, что у больных РПЖ, подвергавшихся кастрации и антиандрогенной терапии, наблюдается наиболее глубокое подавление специфического клеточного иммунного ответа на антигены РПЖ.

Совокупность полученных результатов позволяет полагать, что хотя обнаруженное подавление индукции клеточного противоопухолевого иммунного ответа у больных РПЖ может быть связано как с особенностями ДК, так и с присутствием клеток-супрессоров в пуле лимфоцитов периферической крови больных, последнее предположение представляется более вероятным. Поэтому следующий раздел работы был посвящен анализу связи подавления клеточного иммунитета у больных РПЖ, с уровнем регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4/CD25 в периферической крови.

Характеристика клеточного иммунного ответа in vitro у больных в зависимости от содержания CD4/CD25 лимфоцитов в периферической крови.

Для решения вопроса о том, в какой степени обнаруженное с использованием модельной клеточной системы подавление клеточного иммунного ответа может определяться повышением содержания регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови больных, было проведено специальное исследование. У пациентов РПЖ (группа 1) и ДГПЖ (группа 2) определяли уровень CD4CD25 лимфоцитов и получали ДК и лимфоциты для индукции опухолеспецифических ЦТЛ. Через 2 недели после стимуляции лимфоцитов больных группы 1 и 2 ДК измеряли концентрацию ИФу в кулиуральной среде. Полученные результаты представлены на рис.9.

Содержание CD4CD25 в периферической крови пациентов группы 1 (РПЖ) составило 0,86 ± 0,26%, а в группе 2 (ДГПЖ + МКБ) - 0,46 ± 0,13%, а продукция ИФу 246 ± 90 и 610 ± 74 пг/мл соответственно.

Содержание СР4СР25 0,86 ±0,26% 0,46 ±0,13%

Рис.9. Корреляция продукции ИФу лимфоцитами больных в ответ на стимуляцию нагруженными опухолевыми антигенами ДК с уровнем С04+СБ25+ лимфоцитов.

Таким образом, при более высоком содержании С04СБ25 лимфоцитов наблюдался достоверно более глубокое подавление клеточного иммунного ответа. Полученные данные позволяют заключить, что повышенное содержание СВ4СБ25 Т-лимфоцитов в периферической крови больных при ДГПЖ и РПЖ может рассматриваться как отрицательный прогностический признак течения заболевания.

Выводы

1. Сравнительная оценка неинвазивных методов диагностики рака предстательной железы показала, что наиболее чувствительным методом является определение уровня ПСА сыворотки крови - его чувствительность 71.7%, чувствительность ТРУЗИ 51.4%, а чувствительность пальцевого ректального исследования 26.4%. Окончательный диагноз устанавливается

при морфологическом исследовании материала, полученного при мультифокальной биопсии предстательной железы.

2. Выявлены статистически значимые изменения иммунного статуса у пациентов с ДГПЖ, характеризующиеся снижением уровня CD8+ лимфоцитов до 7,9 ± 1,8 % и увеличением иммуно-регуляторного индекса.

3. Проведенные исследования свидетельствуют о статистически значимом повышении количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+ как при ДГПЖ, так и при РПЖ; наиболее высокий уровень этих клеток обнаружен при РПЖ (0.33 и 0.47% соответственно).

4. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в культурах контрольных и стимулированных дендритными клетками лимфоцитов больных раком предстательной железы по сравнению с условно здоровыми добровольцами снижено содержание С08-лимфоцитов, общий прирост клеток и продукция ИФу лимфоцитами.

5. Повышение содержания CD4+CD25+ Т-лимфоцитов приводит к подавлению клеточного противоопухолевого иммунитета, оцениваемого по продукции ИФу в модельной системе in vitro.

6. Повышенное содержание CD4CD25 Т-лимфоцитов при ДГПЖ и РПЖ может рассматриваться как отрицательный прогностический признак течения заболевания.

Практические рекомендации

1. Для диагностики РПЖ на ранних стадиях рекомендуется проводить комплексное обследование больных с использованием ПРИ, ТРУЗИ и определением уровня ПСА с целью определения показаний для проведения мультифокальной биопсии предстательной железы.

2. С целью оценки состояния иммунного статуса у больных с подозрением на РПЖ рекомендуется исследование уровня CD8 и CD 4 лимфоцитов с определением иммуно-регуляторного индекса и уровня CD4CD25T-лимфоцитов.

3. При повышении уровня С04С025Т-лимфоцитов рекомендуем проводить иммуномодулирующую терапию для предотвращения подавления клеточного противоопухолевого иммунитета.

Список опубликованных работ

1. Исследование состояния специфического противоопухолевого иммунитета у больных раком предстательной железы// Материалы III Конгресса Российского общества онкоурологов 2-3 октября 2008г Москва.- стр 27.

(В .П. Авдошин, ЕЛО. Москалева, С.А. Пульбере).

2. Исследование содержания CD4CD25 лимфоцитов в периферической крови больных раком предстательной железы и способности к развитию клеточного иммунного ответа in vitro // Российский иммунологический журнал. 2008г.-Том 2 (11). - Стр 155-156 (Е.Ю.Москалева, В.П. Авдошин).

3. Исследование содержания CD4+CD25+ -клеток у больных раком предстательной железы// Сборник материалов. VI Международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность" 10-11 ноября 2009 г. Москва.- С.160. ММА им. И.М. Сеченова, 2009. (Москалева Е.Ю., Авдошин В.П., Попова О.Н.)

4. Исследование содержания CD25+CD4+ регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови при раке и аденоме предстательной железы// Вестник Российского университета дружбы народов. Серия Медицина. 2010г. - №4. Стр 77. (Авдошин В.П., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Северин С.Е.)

5. Уровень CD25+CD4+ регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови больных при доброкачественной гиперплазии и раке предстательной железы// Вестник Российской Военно-медицинской академии. ТОМ 1 (33) -2011.- стр 319-320. (Авдошин В.П., Москалева Е.Ю., Северин С.Е).

АГАЕВ НАЗАР МУХАМЕДКЕРИМОВИЧ

Работа посвящена одной из актуальных проблем урологии - изучению состояния клеточного противоопухолевого иммунитета у больных раком предстательной железы (РПЖ). Проведено исследование уровня регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+ в периферической крови больных РПЖ и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) в сравнении с контрольной группой - пациентами с мочекаменной болезнью. Исследована продукция ИФу лимфоцитами и фенотип лимфоцитов после их стимуляции in vitro дендритными клетками больных РПЖ в сравнении с лимфоцитами здоровых добровольцев. Обнаружено статистически значимое повышение количества CD4+CD25+-лимфоцитов как при РПЖ, так и при ДГПЖ. Наиболее высокий уровень этих клеток наблюдался при РПЖ. Показано, что степень подавления клеточного иммунитета у больных РПЖ коррелирует со степенью распространенности опухолевого процесса, а также с уровнем CD4+CD25+ лимфоцитов в периферической крови больных. У больных РПЖ обнаружены значительные индивидуальные различия, как в степени подавления клеточного иммунитета, так и в уровне регуляторных Т-лимфоцитов. Исследование уровня CD4+CD25+ лимфоцитов может быть использовано для выбора персональных схем лечения больных и для оценки прогноза развития заболевания.

AGAEV NAZAR MUHAMEDKERIMOVICH

Work is devoted to one of the actual problems of the urology - to the investigation of the cellular antitumor immunity in patients with prostate cancer (PC). The levels of CD4+CD25+ cells in peripheral blood of PC patients and of benign prostatic hypertrophy (BPH) patients were studied in comparison with urolithiasis patients as control group. The interferon у production and the lymphocytes phenotype were studied after lymphocytes stimulation in vitro by dendritic cells of the PC patients and of the healthy volunteers. The levels of the CD4+CD25+ peripheral blood lymphocytes were significantly higher as in PC and in BPH patients than those in control group. The highest level of CD4+CD25+ cells was seen in PC patients. It was shown that the extent of the cellular antitumor immunity suppression in PC patients was correlated with the prevalence of the tumor process and with the level of CD4+CD25+ peripheral blood lymphocytes. The significant individual distinctions were found out both in the degree of cellular immunity suppression and in the level of regulatory T lymphocytes in PC patients. Investigation of the CD4+CD25+ lymphocytes level can be used for a choice of the personal circuits of PC patients treatment and for the estimation of the disease development forecast.

Подписано в печать: 14.11.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 782 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru