Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Применение титанового сплава в качестве носителя для стволовых клеток с целью ускорения регенерации дефекта челюсти в эксперименте

На правах рукописи

УДК 616 314-089.843. 615.242.

ФРОЛОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ТИТАНОВОГО СПЛАВА В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ЦЕЛЬЮ УСКОРЕНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕФЕКТА ЧЕЛЮСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00. 21 - «Стоматология» 14. 00. 16-«Патологическая физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3456383

Москва - 2008

003456383

Работа выполнена в ГОУ НПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные руководители:

кандидат медицинских наук, доцент

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор (ГОУ ВПО Московский государственный Медико-стоматологический университет Росздрава)

Малы инов Николай Николаевич

Воложин Александр Ильич Тополышцкий Орест Зиновьевич

кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией «Стромальной регуляции иммуногенеза» (ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им.Н.Ф. Гамалеи) Чайлахьян Рубен Карпович

Ведущее учреждение: ФГУ «Центральный научио-исслсдоватсльскин институт стоматологии и челюстно-лиурвой хирургии Росмедтехнологий»

Защита состоится «{() » у 2008 г. в О часов на заседании

диссертационного совет£^/Д 203.(141.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный мсдико-стоматологичсский университет» Росздрава по адресу: 127206, г. Москва, ул. Долгоруковская, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава по адресу: 125206, г. Москва, ул. Вучстича, д. 10А. Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

Автореферат разослан: «/3 »¿ЮИИЛ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских паук М.А. Зоткина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Развитие биомагериалов для стоматологии и челюстно-лицевой хирургии осуществляется параллельно с развитием тканевой инженерии. Среди этих материалов большое разнообразие полимеров, которые исследованы in vitro и in vivo с целыо развития технологий для получения носителей мезенхимальиых стромалыгых клеток (МСК), они должны обладать достаточными механическими свойствами, пористостью, биологической стабильностью или разлагаться при введении в организм (Yoshikavva and Myoiii, 2005). Среди природных материалов - биоактивных носителей: агароза, альгинаг, гиалуроновая кислота, желатин, фибриновый клей, коллаген. Недостаток этих конструкций - механическая нестойкость, серьезно 01раничивающая их клиническую ценность. Хотя эти материалы используются, но считается, что они хуже синтетических и гибридных материалов. Синтетические биоматериалы могут быть синтезированы по мере их использования и изготовлены с более или менее стандартными свойствами и чистотой. Например, полигликолевая кислота - давний, хорошо исследованный носитель стволовых клеток, но она деградирует с большей скоростью, чем образуется новая костная ткань (Martin I. et al., 200!; Noth U. al., 2002; Tuli R. et al.2004). Сополимер этиленгликоля был использован в качестве носителя МСК (Li W.J. et al.,2005), по он также быстро резорбируется, поэтому не приемлем в качестве носителя для костной ткани. Эта уникальная форма имела сходную микроструктуру с природным коллагеновым фибриллярным матриксом. Но в некоторых ситуациях, например, при заполнении костных и хрящевых дефектов jtií носители и их модификации могут быть использованы.

Большое распространение получили гибридные носители из синтетических и природных полимеров, как было показано, они являются эффективным средством для переноса стволовых клеток. Один из примеров гибридного

носителя

полилактид/альгинат, который

хондроиндуцирующис МСК человека in vitro (Caterson E.J. et al.,2001). Сополимеры полиэтиленгликоля (N-isopropylacrylamide) (PNI-PAAm) и водорастворимый хитозан являются хорошими носителями для хондрогенных MSCs (Cho J.H. et al.,2004). Предложено и множество других вариантов носителей стволовых клеток. Среди них нерезорбируемые полимеры (полиметилметакрилат, полиамид, полиэтилен и др.), физико-механические свойства которых приближаются к свойствам костной ткани (А. И. Воложин и соавт., 2005; 2006; Денисов-Никольский Ю.И. и соавт., 2005; Татаренко-Козмина Т.Ю., 2007.). Их можно использовать в качестве имплантатов, которые в последующем не требуется удалять, например, для замещения больших дефектов челюстей и других костей лицевого скелета. Полимеры также не лишены недостатков. Они подвергаются физико-химическому «старению», нередко выделяют токсические вещества. Также известно, что прикрепление и развитие МСК на их поверхности хуже, чем при использовании других носителей - металлов, в первую очередь, титана (А.И. Воложин и соавт., 1998 - 2006). Титан остается наиболее распространенным материалом для изготовления многих изделий медицинского назначения, в первую очередь, в хирургической практике. Его высокая биосовместимость, способность инициировать построение костной ткани и интегрироваться с ней, легко заселяться МСК и другие свойства делают титан пока самым распространенным материалов в стоматологии, травматологии и тканевой инженерии (Boyan B.D.et al., 2002; De Giglio E. et al., 2001; Kudelska-Mazur D. et al., 2005; Feng В. et al., 2003) и его сплавы (Spriano S. et al., 2005; De Giglio E. et al., 2001; Zreiqat H. et al., 2005; Advincula M.С. et al., 2006). К тому же дентальные имплантаты, все чаще используемые для восстановления целостности зубных рядов, как правило, изготавливаются из титановых сплавов. Опубликовано большое число работ, посвященных роли поверхности титана в проявлении их остеоинтегративных свойств. Модификация структуры поверхности самого титана, нанесение на него органических (аминокислот и др.) или неорганических субстанций

(гидроксиапапп, трнкальцийфосфат) в значительной степени изменяет свойства поверхности, проявляющееся в способности к остеоинтеграции -интефальной характеристики материала, имплантируемого в кость (Оеккег ЯЛ. е1 а1., 2005). Особенно большое значение это имеет в стоматологии и чслюстно-лицсвой хирургии, где изделия из титана широко используются. Однако до настоящего времени не было проведено исследования, в том числе, с использованием количественных критериев, по оценке влияния на заселение, прикрепление, размножение, остеогенную дифференцировку и способность оптимизировать заживление костной раны челюсти, титановых пластинок с различной структурой поверхности. Исследование этих вопросов имеет значение для развития реконструктивной хирургии в челюстно-лицевой области, устранения дефектов лицевого скелета, в дентальной имплантологии. В связи с теоретической и практической важностью разработки этой проблемы были сформулированы цель и задачи работы.

Цель работы

Провести в эксперименте сравнительную оценку репаративной регенерации в челюсти под влиянием мезенхимальных стромалышх клеток костного мозга, сформированных на поверхности имплантатов из титанового сплава.

Задачи исследовании

1. Определить цитотоксическис свойства имплантатов из титана, подвергнутых фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека, дать их морфологическую характеристику и уровень прикрепления к поверхности имплантатов.

2. Оценить по количественным критериям способность МСК к пролиферации на поверхности имплантатов из титана с разной структурой поверхности.

3. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов без культуры МСК.

4. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой инактивированных МСК.

5. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой живых МСК.

6. Исследовать динамику репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика при его закрытии титановым имплантатом без клеток, с культурой инактивированных и живых МСК.

7. Провести морфометрический анализ с последующей статистической обработкой цифровых данных динамики репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика при его закрытии титановым имплантатом с культурой инактивированных и живых МСК.

Научная новизна

Впервые установлено, что имплантаты из титана, подвергнутые фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клегок, все они стимулировали пролиферацию МСК, которые многочисленны и плотно упакованы. Научной новизной отличаются данные о том, что имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК. Репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы в значительно большей степени способствует использование имплантатов с нанесенной на поверхность культурой живых, чем инактивированных МСК. По данным морфологического и морфометрического (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с инактивированными МСК не обеспечивает восстановления целостности

кости. Применение пластин с культурой живых МСК -значительно активируют процесс регенерации костной ткани, и приводит к 4-му месяцу к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом. Костная компонент регенерата и его созревание на протяжении всего эксперимента преобладает над соединительно-тканной компонентой.

Практическая значимость Имплантаты из титанового сплава, подвергнутые пескоструйной обработке или плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к стволовым клеткам, способствуют прикреплению к их поверхности, пролиферации и остсогснной дифференциации. Поэтому данный сшив может быть использован вместе с клеточными технологиями для стимулирования заживления костных дефектов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Для практического применения представляют ценность данные о том, что в результате применения МСК на носителе из титанового сплава значительно усиливается остеогенная направленность дифференциации прилежащих к имплантату тканевых структур и формирование зрелой костной ткани. С целью реализации современных клеточных технологий в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии необходимо проведение доклинических испытаний с применением количественного морфомегрического анализа в динамике репаративного процесса в костной ткани.

Апробация

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 3-ем Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (ЦИТО, Москва 2007), на IX ежегодном научном форуме «Стоматология 2007», посвященного 45-летию ЦНИИС (ЦНИИС, Москва 2007), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии», Москва (февраль 2008 г.).

Основные положения, выносимые па защиту

1. Титановые имплантаты с разной структурой поверхности, вызванной фрезерованием, пескоструйной обработкой и плазменным напылением не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток. Имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно нролифернровать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК.

2. Введение в дефект диафиза бедренной кости крысы титановых имплантатов без МСК приводило через 15 суток к формированию грануляционной ткани, подвергающейся созреванию через 30 и 60 суток. В группе с инактивированными МСК вокруг имплантата происходило непродолжительное ускорение образования костных структур и их превалирование над соединительнотканной компонентой регенерата. В группе с «живыми» МСК вокруг пмплантша наблюдалось вначале образование остсогенной соединительной ткани с выраженным анпюматозом, который служил основой для последующего замещения соединительной ткани новообразованными костными структурами.

3. По данным патоморфологичсского и морфомстричсского (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с ннактивированной культурой стволовых клеток не обеспечивает восстановления целостности кости, костные дефекты закрываются грубоволокнистой соединительной тканью. В опытах с имплантацией в область дефектов пластин с культурой живых стволовых клеток процесс регенерации костной ткани активируется и приводит за 4 месяца к заполнению дефекта ветви челюстной кости костным регенератом.

Личное участие

Автором лично изучены свойства поверхности титановых образцов, нх цитотоксичность по отношению к фибробластам и мезенхимальным стромальным клеткам, влияние на их прикрепление и пролиферацию. Цифровые данные автор обработал методами вариационной статистики. Соискателем лично проведены эксперименты на кроликах и изучены гистологические препараты с целью анализа репаративных процессов в челюсти под влиянием мезенхимальных стромальных клеток.

Внедрение результатов работы Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета и на кафедре госпитальной ортопедической стоматологии МГМСУ.

Объем и структура диссертации Диссертация написана на 158 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав, выводов, практических рекомендации, списка использованной литературы, в том числе 19 российских авторов и 127 иносгранных. В диссертации представлено 10 таблиц и 84 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа проведена в 4 этапа. На 1-м этапе были получены пластины из титанового сплава и изучены свойства их поверхности с помощью клеточных технологий. На 2-м этапе пластины были заселены МСК костного мозга для изучения их влияния на репаративную регенерацию кортикальной кости диафиза бедра крыс. На 3-м этапе изучено влияние титановых пластин, заселенных МСК на репаративную регенерацию ветви нижней челюсти кроликов. 4-й этап -- морфометрическая планиметрическая оценка репаративной регенерации челюсти под влиянием МСК с последующей статистической обработкой цифровых данных. Материалом для изготовления импдантатов был титан марки Grade 4 ASTM F -67-00 медицинского

назначения. Из этих материалов на фирме «Конмед» изготовлены пластинки размером 0,8 х 1,5 см и толщиной 1,5 мм. Поверхность пластин подвергнута обработке, в результате чего для последующего исследования образцы разделили на 3 группы. 1-я - Титан-1. Фрезерная обработка с шероховатостью поверхности Ra 0,63. 2-я - Титан-2. Пескоструйная обработка электрокорундом белым (А1203) №32 с размером зерна 355-300 мкм. 3-я -Титан-3. Плазменное напыление титановым порошком ВТ1-0. Размер зерна 10-20 мкм, толщина слоя 25-30 мкм.

Для осуществления 1-го этана пластинки изучены по следующим показателям: фактура поверхности, ее цитотоксичность по отношению к фибробластам и МСК, эффективность прикрепления клеток к поверхности и их способность к пролиферации. Индукция остеогеннон дифференциации проведена с помощью основного фактора роста фибробластов (Sigma, США) и дексаметазона (Sigma, США). Оценка количества клеток в слое, формирующемся на поверхности пластин, осуществлялась методом фотометрии и с помощью прямого подсчета в камере Горяева после снятия раствором трипсина. В оценке цитотоксичности образцов композитов использовали скршшнговый (МТТ) тест: МТТ-(3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид). Эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов оценивали но количеству прикрепленных клеток, их морфологии, жизнеспособности и распределению по поверхности образца. Все лабораторные исследования с клетками и заселение ими пластин проведены по методикам, подробно изложенным в литературе (А.И.Воложин и соавг., 2006; Лосев Ф.Ф. и соавт., 2006; Татаренко-Козьмина, 2007). Оценку остеоинтегративных свойств материалов на 2-м и 3-м этапе проводили с использованием в качестве модели крыс и кроликов. Соответственно этому для проведения экспериментов разработан вариант имплантатов специальной формы и размеров. Для изучения методом СЭМ организации клеточного слоя на поверхности имплантатов после 18 дней остеогенной дифференцировки их пометили в 2,5% раствор глутарового альдегида на

0,13 M какоднлатном буфере с рН=7,4. Затем образцы дофиксировали 2% раствором 0s04, обезвоживали и высушивали методом перехода критической точки на аппарате «Hitachi НСР-2» и исследовали в сканирующем электронном микроскопе. Эксперименты поставлены в 2 сериях опытов: 1- я на крысах, 2-я - на кроликах.

Опыты на крысах. В опыт взято 54 крысы (самцы) Вистар весом 180 -220 грамм. Экспериментальные образцы имплантатов были заселены МСК и индуцированы к остеогенной дифференцировке в течение 2 недель. Заселение клеток происходило только на одной стороне имплаптата. Имплантаты изготовлены на фирме Конмед из титана медицинского назначения, марки Grade 4. Поверхность имплаптата обработана электрокорундом белым (А1203) №32 с размером зерна 355-300 мкм.

Под гексеналовым наркозом делали линейный разрез кожи по задней поверхности бедра, обнажали бедренную кость, с помощью фиссурного бора толщиной 2 мм, делали линейное трепанационнос отверстие длиной 5 мм вдоль середины диафиза и вставляли в него имплантат так, чтобы он одним краем достигал внутренней поверхности диафиза, а другим краем выступал над наружной поверхностью бедренной кости на 0,25 мм. Кожу и мышцы укладывали на место, накладывали швы из шелка. Животных разделили на 3 группы: в 1-й использованы образцы титанового имплантата без клеток, во 2-й - с мертвыми (инактивированными этиловым спиртом) клетками, в 3-й -с живыми клетками. Животных выводили из опыта под гексаналовым наркозом через 15, 30 и 60 суток после операции. Извлекали бедренные кости, фиксировали их в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в Трилоне Б и после общепринятой обработки заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Опыты па кроликах. В эксперимент были взяты 18 половозрелых кролика породы шиншилла, весом около 3,5 кг. Под гексеналовым наркозом у кроликов с соблюдением правил асептики делали разрез кожи, тупым путем обнажали угол и ветвь челюсти. В области угла челюсти с помощью фрезы.

при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором, создавали круглый дефект диаметром около 8 мм, нижний край челюсти не повреждали. Дефект закрывали одним из имнлантатов, который фиксировали по краям к кости с помощью титановых шурупов через заранее приготовленные отверстия. Имплаитат перемещали из культуралыюй среды к дефекту челюсти в течение 5-10 сек для предотвращения гибели клеток. Мягкие ткани укладывали на место, на кожу накладывали швы. Для профилактики послеоперационных осложнений кроликам вводили антибиотики под кожу в течение трех дней. Сроки наблюдения: 1, 2 и 4 месяца после операции.

Животные были разделены на 3 равные группы, различающихся по клеточному составу на поверхности имплантата. Две группы - сравнения и I группа - основная. Группа сравнения 1 - костный дефект закрывали титановой пластиной без клеток. Группа сравнения 2 - костный дефект закрывали титановой пластиной, несущей на поверхности культуру инактивированных 70° раствором этанола МСК. Основная группа - костный дефект закрывали титановой пластиной, несущей на поверхности живую культуру МСК. Животных выводили из эксперимента под наркозом путем введения воздуха в ушную вену. Фрагменты нижней челюсти кроликов с имплантатами фиксировали в нейтрализованном растворе формальдегида в течение 1 недели. Тканевый материал декальцинировали в 25% растворе Трилона Б, подвергали обезжириванию и дегидратации в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Гистоморфометрическое исследование проведено совместно с профессором А.С.Григорьяном. Морфометрию проводили по микрофотограммам с серией гистологических срезов, полученных на микротоме фирмы Микром (ФРГ) НМ-325, толщиной 8 мкм. С каждого тканевого блока получали по 12 гистологических препаратов. Общая толщина тканевого материала (по срединной плоскости каждого тканевого

фрагмента), подвергнуюго гпстоморфометрнчсскому исследованию составила 4')5 мкм ил» -0,5 мм. Гистопрспараты изучали и микрофотосъемку осуществляли в оптической системе Axioplan-2 фирмы Zeiss (фотокамера фирмы Hitachi). Гистоморфометрическую оценку проводили па микрофотограммах с увеличениями х25, xlOO и х200. Полученные цифровые данные обрабатывали на компьютере IDM PC Pentium IV с использованием пакета прикладных программ - Statistica. Различия между группами считали достоверными t>2 и при р<0,05.

Результаты собственных исследовании

Рельеф поверхности образцов из титана зависит от их обработки. После фрезерования поверхность образована параллельными канавками. После пескоструйной обработки рельеф образца неровный, изломанный. В результате напыления титановым порошком рельеф образца титана выглядит более сглаженным с мелкими гранулами.

Поверхность пластин нетоксична для МСК (табл. 1) и фибробластов.

Таблица 1.

Оценка цитотоксичности исследованных материалов для МСК

Опт. плоти, ед. Образец

контр. 1 2 3

1 0,497 0,486 0,492 0,469

2 0,493 0,478 0,484 0,485

3 0,599 0,495 0,476 0,474

Среди знач. 0,530±0,0491 0,48610,0085 0,484x0,0080 0,476-Ю,0082

Отн опт плогн., % 100,0 ±9,81 92,1 ±1,70 91,7 ±1,60 90,2 ±1,64

Обозначения: К - Контроль (лунки), 1 - титан-1,2 - титан 2,3 - титан-3.

Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток (табл. 2), все они стимулируют пролиферацию МСК (за 3 дня культивирования произошло удвоение популяции клеток), и количество клеток на них превышало количество клеток в контроле (лунка).

Таблица 2.

Прикрепление МСК к поверхности образцов.

Опт. плот. ед. Образец

контр. I 2 3

1 0,389 0,443 0,562 0,519

2 0,409 0,444 0,557 0,528

3 0,415 0,442 0,559 0,52

Средн. знач. 0,39810,0049 0,443±0,0011 0,55910,0028 0,522±0,0056

Кол-во клеток х 103 108 ±1,1 127 ±0,3 164 ±0,6 156 ±1,35

Обозначения: К - Контроль (лунки), 1 - титан-1,2- титан 2, 3 - титан-3

Установлено, что в случае образца титана-1 произошло увеличение клеток более, чем в три раза, но эффективность пролиферации оказалась все же ниже чем у образцов из титана 2 и 3. Это может быть обусловлено особой структурой поверхности образца, которая специфическим образом стимулирует клетки. На образцах титана-2 и 3 суммарное количество клеток в лунках и па образцах превышало таковое в контроле, что может быть связано как с увеличением поверхности, пригодной для роста клеток, так и со стимулирующим действием этих образцов на МСК.Таким образом, образцы из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно иролиферировагь, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК.

Результаты планиметрического исследования препаратов показали, что между группами сравнения 1 и 2 существенного различия не было, поэтому эти данные объединены. При гистоморфометрическом анализе гистопрепаратов групп сравнения отмечено, что во все сроки наблюдений в составе регенерата значительные площади занимала соединительная ткань, которая имела преимущественно грубоволокнистый характер. Удельный вес соединительнотканной компоненты регенерата выражалась на 1-й, 2-й и 4-й месяцы следующими величинами: 9,4±2,2, 64,7±5,7, 65,8±17,8 (рис. 1).

Контроль. Соотношение костной и соединительнотканной компонент регенерата в различные сроки наблюдений

Сроки наблюдений

Рис. 1. Гистограмма. Из диаграммы видно, во все сроки наблюдений значительные площади регенерата занимает соединительная ткань и отмечается прогрессивное её снижение на 2-й и 4-й месяцы наблюдений.

Через 1-й месяц цифровое выражение соотношения тканевых компонент в гистопрепаратах в полной мере отражало структурную организацию регенерата, заполнившего костный дефект в эти сроки эксперимента: костное вещество составляло в долевом отношении от площади всего регенерата 9,4±2,2, а соединительная ткань - 87,8±2,4. Значительную часть регенерата на 2 и 4 месяцы, по-прежнему, составляла грубоволокнистая соединительная ткань (соответственно, 30,6±4,5 и 23,7±16,7). На 2-й и 4-й месяцы эксперимента отмечалась значительная структурная гетерогенность центральных и периферических участках регенерата. В сводных таблицах (табл. 1, 2) отражены гистоморфометрические характеристики распределения структурных детерминант в долях от площади регенерата. Характерно отсутствие в периферических отделах регенерата костных лакун, в то время как в центральных отделах, они занимали заметные по величине доли площадей регенератов.

Таблица 1.

Относительные показатели долен площадей, занимаемых различными тканевычн структурами в центральных участках petснерага на 2-ii и 4-ii месяцы наблюдений

Тканевые структуры Кос мат] 11 i.i рикс Плас ко< чат тинч. 1И. 1ИКС Фнброзн. КОС 111. чагрнкс Педиффср KOCIII. матрикс Кости, лакуны Фиброзная сосл. Ткань

Сроки набл. ср 311 Ст ош Ср зп Ст. откл Ср 311. Ci. огкл Ср 311 С г огкл Ср 311. Ci о гкл Ср. 311. Ci. ОI кл

2 .чес 91,3 2.3 40,6 9,7 46,2 11,4 0 0 28,3 15,5 0 0

4 чес 78.7 7,3 53.2 18.5 59,1 15.5 10.2 7,3 9.9 5,5 12,8 | 9.6

Примечание: Здесь и датсе в таблицах аббревиации «Ср зн.» и «Ст. откл» обозначают, соответственно - «срсднсс значение» и «стандартное отклонение»

Таблица 2

Относительные показатели долей площадей, занимаемых различными тканевыми структурами в периферических участках регенерата на 2-й и 4-й месяцы наблюдений

Тканевые ст руктуры Кос иат] п ый рикс Плас ко< чат гинч. :тн. рикс Фиб ко< чат эозн. :тн. рикс Нсдиффср кости, чатрикс Кости, лакуны Фиброзная соед. ткань

Сроки набл. Ср. зн Ст. откл Ср ¡и. Ст. откл Ср. зн. Ст. откл Ср 311. Ст. откл Ср. 311 Ст. откл Ср 311. Or. Откл

2 .чес 43,6 3,8 36.3 11,8 47,9 13.3 14,5 4.1 0 0 26.4 4.6

4 чсс 60.1 8,4 25.8 15.2 37,5 12,5 13.5 7,3 6,95 4,5 22 7 12,1

Соотношение структурных образований в центральной части регенерата, согласно морфометрическим данным, характеризовалось некоторым превалированием фиброзного костного матрикса над пластинчатым в сроки 2 месяца (р=0,06)< и значимым превалированием пластинчатого над фиброзным на 4 месяца наблюдений (р=0,009), что указывало на созревание костного матрикса. Однако к 4 месяцу, наряду с возрастанием удельного веса пластинчатого матрикса, в костном веществе появлялось недифференцированное костное вещество. Отмечались так же различия в структурной характеристике регенерата в зависимости от сроков наблюдения. Так в центральных отделах регенерата имело место достоверное нарастание удельного веса пластинчатого типа костного матрикса на 4-й месяц, по сравнению с предыдущим сроком: соответственно, 53,2±18,5 и 40,6¿9,7 (р<0,009). Эта динамика свидетельствовала о созревании костного матрикса. В периферических отделах регенерата наблюдались обратные отношения показателей: площадь пластинчатого матрикса на 2-й месяц характеризовалась показателем 46,3+11,8, а на 4-й месяц - 25,8^-15,2 (р=(),ОООЯ4). то есть имело место снижение уровня дифференциации

костного матрикса. Наряду с этим, на 4-й месяц, судя по данным таблицы 2, в регенерате появлялись участки недифференцированного костного матрикса и грубоволокнистой соединительной ткани. Это так же указывало на некоторую дедифференцировку периферических отделов регенерата.

Таким образом, и группе сравнения через I месяц от начала эксперимента в костном дефекте наблюдалось формирование преимущественно соединительнотканного регенерата, который в сроки 2 и 4 месяца замещался преимущественно костным регенератом. В последующие два срока отмечалась структурная разнородность центрального и периферического участков регенерата: в центральных участках. Он характеризовался большим удельным весом пластинчатого костного матрикса, что отражало повышенный по сравнению периферическими отделами регенерата уровень дифференциации новообразованной костного вещества.

При исследовании тканевого материала наблюдений основной группы с помощью гистоморфометрического метода на обзорных гистопрепаратах было установлено, что удельный вес площади фиброзной соединительной ткани в составе регенератов падал в сроки 1, 2 и 4 месяца от 32,2±15,8 и 9,7±7,1 до нуля (рис. 2). Эти соотношения структурных компонент в динамике характеризовало процесс созревания регенерата, заполнившего экспериментально воспроизведенные дефекты, в целом.

Особый интерес представляла гистоморфометрическая характеристика исследованных регенератов, в частности, распределения структурных детерминант костного регенерата в различных его участках, в центральных и периферических его зонах. Удельный вес пластинчатого костного матрикса в определённой мере позволял оценить степень зрелости костной ткани в центральных и периферических отделах регенерата. Так через 1 месяц от начала опыта в центральных отделах регенерата он составлял 10,9±4,6, а в периферических - 7,2±1,4, т.е. на периферии его было существенно меньше.

Опыт 1. Динамика соотношения площадей костной и соединительнотканной компонент регенерата по срокам наблюдения

О Костная часть □ Соединительнотк. часть

?иес Сроки наблюдения

Рис. 2. Гистограмма. Распределение показателей удельного веса площадей тканевых структур регенерата в различные сроки наблюдений. По мере развития регенерата соединительнотканная часть регенерата иечезанет.

В го же время значительно в составе костной части регенерата были представлены соединительнотканные элементы: в центральной части -!5,6±14,6. а в периферической 21,9±7,7 {¡>-'0,08). Кроме того в составе костного матрикса обнаруживались участки ннзкодифференцировапного костного вещества: в центральных отделах их удельный вес составлял 1,6±1,4, а в периферических отделах - 7,8±2,2, т.е. значительно больше (табл. 3 и 4).

Таблица 3.

Относительные показатели долей площадей, занимаемых различными тканевыми

Тканевые структуры Кос маг нын рмке Плас кос маг гинч. тн. рикс Фиб кос мат 30311. тн. зикс Недиффер кости, матрике Кости, лакуны Фиброзная соед. ткань

Сроки набл. Ср. зн. Ст. огкл Ср. «. Ст. откл Ср. зн. Ст. откл Ср. Зн. Ст. откл Ср. зн. Ст. откл Ср. зн. Ст. откл

1 мсс 73.7 7.6 10,9 4,6 78,3 13,1 1,6 1.4 21,3 4,4 15.6 14,6

2 мсс 84 2,8 2.4 0.9 80,2 4.9 16,3 5,1 14,9 7,8 0 0

4 мсс Х6,7 3.9 9.3 6.96 86.2 5.9 0 0 19,8 30.8 2.6 2.3

Примечание: Здесь и далее в таблицах аббревиации «Ср зн.» и «Ст. откл» обозначают, соответственно - «среднее значение» и «стандартное отклонение».

Таблица 4.

ОI носи и-, н.ш,К' показатели долей площадей, занимаемых различными зкапеиыми

структурами в периферических участках рег енерата на 2-й и 4-й месяцы наблюдений

Тканевые структуры Костный мат пике Плас К0( мат тинч. 111. 1)11 КС Фиб КОС маг 10311. 7 И. рнкс Нед» К0( ма! ффер Т[1. 111КС Костн. лакуны Фиброзная соед. ткань

Сроки набл. Ср. зн. Ст. 01 кл Ср. зн. Ст. 01КЛ Ср. зн Ст. ОТКЛ Ср. 311 Ст огкл Ср. Чн Ст. 01КЛ Ср зн Ст. 01 кл

1 мсс 65,97 10,4 7,2 1,4 84,1 3.6 7,8 2,2 29,4 5,6 21,9 7,7

2 мое 77,7 10,9 12,7 7,2 64,1 30,2 6,2 2 13,9 7,96 10,3 8,9

4 мес 81,9 11,8 38,4 8,6 52,3 2,6 3,9 | 4,5 12,6 4,8 5.3 4.7

Через 2 месяца опыта доля пластинчатого матрикса имела тенденцию к снижению. В центральных отделах она составляла 2,4±0,9, а в периферических - 12,7±7,2. Наряду с этим в центральных отделах возрастала доля недифференцированного костного вещества 1б,3±5,1 (по отношению к показателям 1 месяца р<(),0001), на периферии это повышение было не достоверным, доля площади недифференцированного костного матрикса составила 6,2±2 (р=0,02). Одновременно в центральных отделах происходила компактичацня костной ткани, о чём свидетельствовало падение площади костных лакун в сроки от 1 до 2 месяцев (с 21,3± 4,4 до 14,9±7,8; р—0,0008), тот же процесс наблюдался на периферии (табл.3,4). Наряду с этим в центральных отделах к 2 месяцам наблюдалось практически полное исчезновение фиброзных прослоек на вновь образованной костной ткани, а на периферии было отмечено значимая убыль (10,3±8,9). Описанное повышение доли недифференцированного матрикса, при сохранении примерного паритета с другими показателями периферических отделов, возможно, отражает повышенную костеобразовательную функцию тканевых элементов в центральных отделах регенерата. Через 4 месяца от начала опыта снизилась доля недифференцированного костного матрикса соединительной ткани по всему регенерату.

Следовательно, в основной группе регенерат уже через 1 и 2 месяца был построен преимущественно из костной ткани, а к 4 месяцам произошло полное замещение соединительнотканной компоненты регенерата вновь образованной костной тканью. Однако процесс созревания костного

матрикса был замедлен, и в его структуре превалировало фиброзное костное вещество.

Таким образом, в опытах с имплантацией в область костных дефектов пластин с культурой живых стволовых клеток, отмечалась активация процесса регенерации костной ткани, приводящая в сроки экспериментальных наблюдений к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом. Это говорит в пользу того, что ксеногенные стволовые клетки, нанесенные на поверхность титановых имплантатов, могут обеспечить при определённых условиях такую интенсивность регенерации костной ткани, которая достаточна для восстановления целостности челюстной кости, что не наблюдается при физиологической регенерации костной ткани в дефектах указанной области.

Таким образом, клетки с остеогенным фенотипом, выращенные на имплантате и имплантированные в место дефекта, могут стимулировать собственный остеогенез ткани за счет секреции ряда факторов роста (в том числе, стимулирующие нсоангиогенез и кроветворение) и отложения костного матрикса. Принимая во внимание эффективность ксеногенных стволовых клеток, полученная в нашем эксперименте и выражающаяся в стимулировании построения костной ткани у другого вида, можно предположить, что белки внеклеточного матрикса, специфичные для костной ткани, не обладают строгой видовой специфичностью.

Известно, что для заживления костной раны в ее области должно быть необходимое количество МСК, а также их плотное расположение и условия для размножения, дифференциации этих клеток в остсогенном направлении, выделении остеогенньтх факторов и секреции костного межклеточного вещества. Это условие не соблюдается при больших (критических) костных дефектах, нарушении кровообращения, метаболических, наследственных и др. формах патологии. В этих случаях введение в костную рану большого количества стволовых клеток будет способствовать заживлению костного дефекта. Обязательным условием для этого является использование носителя

МСК, свойства которого (биосгабильность, резорбируемость. пористость и

другие свойства) определяется конкретными условиями практики

ВЫВОДЫ

1. Имплантаты из титана, подвергнутые фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана имеется высокий уровень прикрепления клеток и пролиферации МСК, которые многочисленны и плотно упакованы.

2. Имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК. Плазменное напыление создает оптимальные условия для жизнедеятельности клеток с целью их последующего применения для стимулирования ренаративного остеогенеза.

3. Введение титановых имплантатов без МСК в дефект диафнза бедренной кости крысы приводило через 15 суток к формированию грануляционной ткани, подвергающейся созреванию. В сроки 30 и 60 суток в иериимплантационной зоне формировались ноля фиброзной соединительной ткани, кнаружи от которой активно строилась трабекулярная костная ткань, на значительном расстоянии заполняющей вместе с фиброзной компонентой регенерата костномозговой канал.

4. В группе с инактивированными МСК вокруг имплантата через 15 и 30 суток опыта в периимплантационной зоне у крыс ускоряется образование костных структур с их превалированием над соединительнотканным компонентом регенерата. В сроки 60 суток уравнивается соотношение новообразованной костной и мягкотканной компонент периимплантационных структур до уровня контрольной группы.

5. В группе с «живыми» МСК через 15 суток вокруг имплантата в бедре крыс образуется остеогенная соединительная ткань с выраженным ангиоматозом, который служил основой для последующего новообразования костных структур. В сроки 30 и 60 суток опыта дефект

на месте имплантата ограничивался костной пластинкой. По сравнению с контрольной группой и группой с инактивированными клетками, ■значительно усилилась остеогенная направленность дифференциации прилежащих к имплантату тканевых структур.

6. Пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами не обеспечивает восстановления целостности кости в течение 4-х месяцев. Закрытие дефекта титановой пластиной с ннактивированной культурой МСК так же не активирует костно-регенсраторной процесс. В опытах с имплантацией пластин с культурой живых МСК активируется регенерация костной ткани, приводящая на 4-й месяц к заполнению дефектов костным регенератом.

7. По данным морфометрического исследования, пластика дефектов челюстной кости титановыми пластинами с инактивированными МСК не обеспечивает восстановление целостности кости. Применение пластин с культурой живых МСК значительно активируют процесс регенерации костной ткани, и приводит на 4-й месяц к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом Костная компонента регенерата и его созревание на протяжении всего эксперимента преобладала над соединительно-тканной компонентой.

Практические рекомендации

1. С целью обоснования эффективности использования клеточных технологий для стимулирования регенерации костных дефектов в челюсти рекомендуется проведение доклинических испытаний с участием двух экспериментальных моделей.

2. Дефект ветви нижней челюсти у кролика диаметром 8 мм следует считать критическим, то есть не заполняющимся костной тканью в процессе регенерации. Этот дефект рекомендуется использовать для оценки влияния МСК на носителе в качестве средства, способствующего заживлению «критических» дефектов.

3. Морфометрический (планиметрический) анализ гистологических препаратов с выделением костных, не костных и других структур в

процессе репаративнон регенерации является объективным методом количественной оценки эффективности остеопластических материалов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Денисов-Никольский Ю.И., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Воложин А.И., Лосев В.Ф., Лосев Ф.Ф., Докторов A.A., Мальгинов H.H., Холодов C.B., Вольиерт У.В., Е.Н.Фролова. Технология применения мезенхимальных стромальных клеток для усиления остеоинтеграции имплантационных материалов. // Материалы 5-й международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века. 29 октября - 5 ноября 2006 года.. Испания Бенидорм, С 29.

2. Воложин А.И., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Денисов-Никольский Ю.И., Мальгинов H.H., Докторов A.A., Лосев В.Ф., Холодов C.B., Вольперт У.В., Е.Н.Фролова, Янушевич О.О. Цитотоксичность имплантационных материалов и их влияние на прикрепление и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток человека. // В кн.: Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии. Материалы 3-го Всероссийского симпозиума с международным участием, 25-26 апреля 2007, С 60.

3. Мальгинов H.H., Фролова E.H. Репаративная регенерация кости крыс при введении титановых имплантатов заселенных ксеногенными мезенхимальными стволовыми клетками. // Материалы третьего Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии»,- Москва 25-26 апреля,- 2007,- с. 83-84.

4. Фролова E.H. Особенности регенерации костной ткани при введении титановых имплантатов с ксеногенными стволовыми клетками костного мозга. // Сборник трудов XXIX итоговой конференции молодых ученых МГМСУ. Москва.-2007.-с.420-421.

5. Н.Н.Мальгинов, Б.Н.Фролова Остеостнмулирующая активность ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга,

// Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007» посвященного 45-летию ЦНИИС, М, 2007, С 277 - 279.

6. Воложин Л.И., Денисов-Никольский Ю.И., Докторов Л Л. Мальгинов H.H., Лосев Ф.Ф., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Б.А.Жилкин,

Т.В.Тстюхин, Лосев В.Ф., Вольпсрт У.В., О.О.Янушеавич, Е.Н.Фролова, Г.А. Воложин. Характеристика пролнферативных свойств стволовых клеток костного мозга на поверхности титана и золота. // Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007» посвященного 45-летию ЦНИИС, М, 2007, С 226 - 229.

7. Фролова E.H. Применение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для заживления костных дефектов челюсти в эксперименте.

// Труды XXX Юбилейной итоговой конференции молодых ученых.-Москва,- 2008.-с.355-356.

8. Мальгинов H.H., Е.Н.Фролова, А.С.Григорьян, B.I¡.Матвеева,

Г.А. Воложин, Калашникова Т.С., Воложин А.II. Ксеногенные мезенхимальные стромальные клетки на поверхности титана как инициатор остсогенеза (экспериментальное исследование). // Сборник трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии» 12-15 февраля 2008 года, М., С 58-61.

9. Е.Н.Фролова, Н.Н.Мальгинов, А.С.Григорьян, Е.В.Киселева, A.A. Докторов, В.Н. Матвеева, А.И.Воложин Заживление костного дефекта в челюсти кроликов иод влиянием ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановых носителях. // Российский стоматологический -журнал, 2008, №3, С 12-14.

Подписано »печать 11 11 OS Закл Jy .Ч(>2 Ъграж НИ) ж ¡

О том J. мно в ООО •«Фирма Иечатш-ш Д»ор»> 1140ÍÍ.I М(Ч Kfi.l, Т|оиу\1(1К КИИ КС]) <j

IV'i ¿(.4-80-11,

Актуальность проблемы

Развитие биоматериалов для стоматологии и челюстно-лицевой хирургии осуществляется параллельно с развитием тканевой инженерии. Среди этих материалов большое разнообразие полимеров, которые исследованы in vitro и in vivo с целью развития технологий для получения носителей мезенхимальных стромальных клеток (МСК), они должны обладать достаточными механическими свойствами, пористостью, биологической стабильностью или разлагаться при введении в организм (Yoshikawa and Myoui, 2005). Среди природных материалов - биоактивных носителей: агароза, альгинат, гиалуроновая кислота, желатин, фибриновый клей, коллаген. Недостаток этих конструкций - механическая нестойкость, серьезно ограничивающая их клиническую ценность. Хотя эти материалы используются, но считается, что они хуже синтетических и гибридных материалов. Синтетические биоматериалы могут быть синтезированы по мере их использования и изготовлены с более или менее стандартными свойствами и чистотой. Например, полигликолевая кислота - давний, хорошо исследованный носитель стволовых клеток, но она деградирует с большей скоростью, чем образуется новая костная ткань (Martin I. et al., 2001; Noth U. et al., 2002; Tuli R. et al., 2004). Сополимер этиленгликоля был использован в качестве носителя МСК (Li W.J. et al., 2005), но он также быстро резорбируется, поэтому не приемлем в качестве носителя для костной ткани. Эта уникальная форма имела сходную микроструктуру с природным коллагеновым фибриллярным матриксом. Ио в некоторых ситуациях, например, при заполнении костных и хрящевых дефектов эти носители и их модификации могут быть использованы.

Большое распространение получили гибридные носители из синтетических и природных полимеров, как было показано, они являются эффективным средством для переноса стволовых клеток. Один из примеров гибридного носителя — полилактид/альгинат, который поддерживает хондроиндуцирующие МСК человека in vitro (Caterson E.J. et al., 2001). Сополимеры полиэтиленгликоля (N-isopropylacrylamide) (PNI-PAAm) и водорастворимый хитозан являются хорошими носителями для хондрогенных MSCs (Cho J.H. et al., 2004). Предложено и множество других вариантов носителей стволовых клеток. Среди них нерезорбируемые полимеры (полиметилметакрилат, полиамид, полиэтилен и др.), физико-механические свойства которых приближаются к свойствам костной ткани (Воложин А.И. и соавт., 2005; 2006; Денисов-Никольский Ю.И. и соавт., 2005; Татаренко-Козмина Т.Ю., 2007). Их можно использовать в качестве имплантатов, которые в последующем не требуется удалять, например, для замещения больших дефектов челюстей и других костей лицевого скелета. Полимеры также не лишены недостатков. Они подвергаются физико-химическому «старению», нередко выделяют токсические вещества. Также известно, что прикрепление и развитие МСК на их поверхности хуже, чем при использовании других носителей - металлов, в первую очередь, титана (Воложин А.И. и соавт., 1998 - 2006). Титан остается наиболее распространенным материалом для изготовления многих изделий медицинского назначения, в первую очередь, в хирургической практике. Его высокая биосовместимость, способность инициировать построение костной ткани и интегрироваться с ней, легко заселяться МСК и другие свойства делают титан пока самым распространенным материалов в стоматологии, травматологии и тканевой инженерии (De Giglio Е. et al., 2001; Boyan B.D.et al., 2002; Feng B. et al., 2003; Kudelska-Mazur D. et al., 2005) и его сплавы (De Giglio E. et al., 2001; Spriano S. et al., 2005; Zreiqat H. et al., 2005; Advincula M.C. et al., 2006). К тому же дентальные имплантаты, все чаще используемые для восстановления целостности зубных рядов, как правило, изготавливаются из титановых сплавов. Опубликовано большое число работ, посвященных роли поверхности титана в проявлении их остеоинтегративных свойств.

Модификация структуры поверхности самого титана, нанесение на него органических (аминокислот и др.) или неорганических субстанций (гидроксиапатит, трикальцийфосфат) в значительной степени изменяет свойства поверхности, проявляющееся в способности к остеоинтеграции — интегральной характеристики материала, имплантируемого в кость (Беккег ЯЛ. е! а1., 2005). Особенно большое значение это имеет в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, где изделия из титана широко используются. Однако до настоящего времени не было проведено исследования, в том числе, с использованием количественных критериев, по оценке влияния на заселение, прикрепление, размножение, остеогенную дифференцировку и способность оптимизировать заживление костной раны челюсти, титановых пластинок с различной структурой поверхности. Исследование этих вопросов имеет значение для развития реконструктивной хирургии в челюстно-лицевой области, устранения дефектов лицевого скелета, в дентальной имплантологии. В связи с теоретической и практической важностью разработки этой проблемы были сформулированы цель и задачи работы.

Цель работы

Провести в эксперименте сравнительную оценку репаративной регенерации в челюсти под влиянием мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, сформированных на поверхности имплантатов из титанового сплава.

Задачи исследования

1. Определить цитотоксические свойства имплантатов из титана, подвергнутых фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека, дать их морфологическую характеристику и уровень прикрепления к поверхности имплантатов.

2. Оценить по количественным критериям способность МСК к пролиферации на поверхности имплантатов из титана с разной структурой поверхности.

3. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов без культуры МСК.

4. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой инактивированных МСК.

5. Изучить динамику репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы под влиянием титановых имплантатов с культурой живых МСК.

6. Исследовать динамику репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика при его закрытии титановым имплантатом без клеток, с культурой инактивированных и живых МСК.

7. Провести морфометрический анализ с последующей статистической обработкой цифровых данных динамики репаративной регенерации костного дефекта ветви нижней челюсти кролика при его закрытии титановым имплантатом с культурой инактивированных и живых МСК.

Научная новизна

Впервые установлено, что имплантаты из титана, подвергнутые фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток, все они стимулировали пролиферацию МСК, которые многочисленны и плотно упакованы. Научной новизной отличаются данные о том, что имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК. Репаративной регенерации дефекта диафиза бедра крысы в значительно большей степени способствует использование имплантатов с нанесенной на поверхность культурой живых, чем инактивированных МСК. По данным морфологического и морфометрического (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с инактивированными МСК не обеспечивает восстановления целостности кости. Применение пластин с культурой живых МСК значительно активируют процесс регенерации костной ткани, и приводит к 4-му месяцу к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом. Костная компонента регенерата и его созревание на протяжении всего эксперимента преобладает над соединительно-тканной компонентой.

Практическая значимость Имплантаты из титанового сплава, подвергнутые пескоструйной обработке или плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к стволовым клеткам, способствуют прикреплению к их поверхности, пролиферации и остеогенной дифференциации. Поэтому данный сплав может быть использован вместе с клеточными технологиями для стимулирования заживления костных дефектов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Для практического применения представляют ценность данные о том, что в результате применения МСК на носителе из титанового сплава значительно усиливается остеогенная направленность дифференциации прилежащих к имплантату тканевых структур и формирование зрелой костной ткани. С целью реализации современных клеточных технологий в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии необходимо проведение доклинических испытаний с применением количественного морфометрического анализа в динамике репаративного процесса в костной ткани.

Апробация

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 3-ем Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (ЦИТО, Москва 2007), на IX ежегодном научном форуме «Стоматология 2007», посвященного 45-летию ЦНИИС (ЦНИИС, Москва 2007), 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии», Москва (февраль 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Титановые имплантаты с разной структурой поверхности, вызванной фрезерованием, пескоструйной обработкой и плазменным напылением не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток. Имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК.

2. Введение в дефект диафиза бедренной кости крысы титановых имплантатов без МСК приводило через 15 суток к формированию грануляционной ткани, подвергающейся созреванию через 30 и 60 суток. В группе с инактивированными МСК вокруг имплантата происходило непродолжительное ускорение образования костных структур и их превалирование над соединительнотканной компонентой регенерата. В группе с «живыми» МСК вокруг имплантата наблюдалось вначале образование остеогенной соединительной ткани с выраженным ангиоматозом, который служил основой для последующего замещения соединительной ткани новообразованными костными структурами.

3. По данным патоморфологического и морфометрического (планиметрического) исследования пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами с инактивированной культурой стволовых клеток не обеспечивает восстановления целостности кости, костные дефекты закрываются грубоволокнистой соединительной тканью. В опытах с имплантацией в область дефектов пластин с культурой живых стволовых клеток процесс регенерации костной ткани активируется и приводит за 4 месяца к заполнению дефекта ветви челюстной кости костным регенератом. Личное участие

Автором лично изучены свойства поверхности титановых образцов, их цитотоксичность по отношению к фибробластам и мезенхимальным стромальным клеткам, влияние на их прикрепление и пролиферацию. Цифровые данные автор обработал методами вариационной статистики. Соискателем лично проведены эксперименты на кроликах и изучены гистологические препараты с целью анализа репаративных процессов в челюсти под влиянием мезенхимальных стромальных клеток.

Внедрение результатов работы

Полученные данные используются в учебном процессе и в дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета и на кафедре госпитальной ортопедической стоматологии МГМСУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Денисов-Никольский Ю.И., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Воложин А.И., Лосев В.Ф., Лосев Ф.Ф., Докторов A.A., Мальгинов H.H., Холодов C.B., Вольперт У.В., Е.Н.Фролова. Технология применения мезенхимальных стромальных клеток для усиления остеоинтеграции имплантационных материалов. // Материалы 5-й международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века. 29 октября - 5 ноября 2006 года. Испания Бенидорм, С 29.

2. Воложин А.И., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Денисов-Никольский Ю.И., Мальгинов H.H., Докторов A.A., Лосев В.Ф., Холодов C.B., Вольперт У.В., Е.Н.Фролова, Янушевич О.О. Цитотоксичность имплантационных материалов и их влияние на прикрепление и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток человека // В кн.: Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии. Материалы 3-го Всероссийского симпозиума с международным участием, 25-26 апреля 2007, С 60.

3. Мальгинов H.H., Фролова E.H. Репаративная регенерация кости крыс при введении титановых имплантатов заселенных ксеногенными мезенхимальными стволовыми клетками. // Материалы третьего Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии».-Москва 25-26 апреля.- 2007.- с. 83-84.

4. Фролова E.H. Особенности регенерации костной ткани при введении титановых имплантатов с ксеногенными стволовыми клетками костного мозга. // Сборник трудов XXIX итоговой конференции молодых ученых МГМСУ, Москва.-2007.-с.420-421.

5. Н.Н.Мальгинов, Е.Н.Фролова Остеостимулирующая активность ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, // Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007» посвященного 45-летию ЦНИИС, М, 2007, С 277 - 279.

6. Воложин А.И., Денисов-Никольский Ю.И., Докторов A.A. Мальгинов H.H., Лосев Ф.Ф., Татаренко-Козьмина Т.Ю., Б.А.Жилкин,

Т.В.Тетюхин, Лосев В.Ф., Вольперт У.В., О.О.Янушеавич, Е.Н.Фролова, Г.А. Воложин. Характеристика пролиферативных свойств стволовых клеток костного мозга на поверхности титана и золота. // Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007» посвященного 45-летию ЦНИИС, М, 2007, С 226 - 229.

7. Фролова E.H. Применение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для заживления костных дефектов челюсти в эксперименте. // Труды XXX Юбилейной итоговой конференции молодых ученых.- Москва.- 2008.-С.355-356.

8. Мальгинов H.H., Е.Н.Фролова, А.С.Григорьян, В.Н.Матвеева,

Г.А. Воложин, Калашникова Т.С., Воложин А.И. Ксненогенные мезекнхимальные стромальные клетки на поверхности титана как инициатор остеогенеза (экспериментальное исследование). Сборник трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии» 12-15 февраля 2008 горда, М., С 58-61.

9. Е.Н.Фролова, Н.Н.Мальгинов, А.С.Григорьян, Е.В.Киселева, A.A. Докторов, В.Н. Матвеева, А.И.Воложин Заживление костного дефекта в челюсти кроликов под влиянием ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановых носителях. // Российский стоматологический журнал, 2008, №3, С 12-14.

12

ВЫВОДЫ

1. Имплантаты из титана, подвергнутые фрезерованию, пескоструйной обработке и плазменному напылению титановым порошком не проявляют цитотоксических свойств по отношению к фибробластам кожи и мезенхимальным стромальным клеткам человека. Для всех образцов титана имеется высокий уровень прикрепления клеток и пролиферации МСК, которые многочисленны и плотно упакованы.

2. Имплантаты из титана с фрезерной обработкой поверхности позволяют МСК активно пролиферировать, а с пескоструйной обработкой и плазменным напылением стимулируют пролиферацию МСК. Плазменное напыление создает оптимальные условия для жизнедеятельности клеток с целью их последующего применения для стимулирования репаративного остеогенеза.

3. Введение титановых имплантатов без МСК в дефект диафиза бедренной кости крысы приводило через 15 суток к формированию грануляционной ткани, подвергающаяся созреванию. В сроки 30 и 60 суток в периимплантационной зоне формировались поля фиброзной соединительной ткани, кнаружи от которой активно строилась трабекулярная костная ткань, на значительном расстоянии заполняющей вместе с фиброзной компонентой регенерата костномозговой канал.

4. В группе с «инактивированными» МСК вокруг имплантата через 15 и 30 суток опыта в периимплантационной зоне у крыс ускоряется образование костных структур с их превалированием над соединительнотканным компонентом регенерата. В сроки 60 суток уравнивается соотношение новообразованной костной и мягкотканной компонент периимплантационных структур до уровня контрольной группы.

В группе с «живыми» МСК через 15 суток вокруг имплантата в бедре крыс образуется остеогенная соединительная ткань с выраженным ангиоматозом, который служил основой для последующего новообразования костных структур. В сроки 30 и 60 суток опыта дефект на месте имплантата ограничивался костной пластинкой. По сравнению с контрольной группой и группой с «инактивированными» клетками, значительно усилилась остеогенная направленность дифференциации прилежащих к имплантату тканевых структур. Пластика дефектов челюстной кости кролика титановыми пластинами не обеспечивает восстановления целостности кости в течение 4-х месяцев. Закрытие дефекта титановой пластиной с «убитой» культурой МСК так же не активирует костно-регенераторной процесс. В опытах с имплантацией пластин с культурой живых МСК активируется регенерация костной ткани, приводящая на 4-й месяц к заполнению дефектов костным регенератом

По данным морфометрического исследования, пластика дефектов челюстной кости титановыми пластинами с «мертвыми» МСК не обеспечивает восстановление целостности кости. Применение пластин с культурой живых МСК значительно активируют процесс регенерации костной ткани, и приводит на 4-й месяц к заполнению дефектов ветви челюстной кости костным регенератом Костная компонента регенерата и его созревание на протяжении всего эксперимента преобладала над соединительно-тканной компонентой.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью обоснования эффективности использования клеточных технологий для стимулирования регенерации костных дефектов в челюсти рекомендуется проведение доклинических испытаний с участием двух экспериментальных моделей.

2. Дефект ветви нижней челюсти у кролика диаметром 8 мм следует считать критическим, то есть не заполняющимся костной тканью в процессе регенерации. Этот дефект рекомендуется использовать для оценки влияния МСК на носителе в качестве средства способствующего заживлению «критических» дефектов.

3. Морфометрический (планиметрический) анализ гистологических препаратов с выделением костных, не костных и других структур в процессе репаративной регенерации является объективным методом количественной оценки эффективности остеопластических материалов.