Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Применение соединений, влияющих на уровень оксида азота в тканях глаза, в комплексной терапии увеита в эксперименте

На правах рукописи

ПЕРОВА Татьяна Сергеевна

ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, ВЛИЯЮЩИХ НА УРОВЕНЬ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ ГЛАЗА, В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ УВЕИТА В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14 00 08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003061395

Диссертационная работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им Гельмгольца Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (директор - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ В.В. Нероев)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор В.В. Нероев

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Е.С. Либман

Доктор медицинских наук, профессор Е.П. Тарутта

Ведущая организация: ГУ НИИ глазных болезней РАМН Защита диссертации состоится «/<f года в/^часов

на заседании диссертационного совета Д 208 042 01 Адрес института 105062 г Москва, ул Садовая-Черногрязская, 14/19 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ глазных болезней им Гельмгольца

Автореферат разослан ЦЛСиЛ 2007 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор М.Б. Код зов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В настоящее время проблема лечения увеитов является одной из важнейших в офтальмологии во всем мире Пациенты с увеитами и их осложнениями составляют от 5 до 18 % больных глазных стационаров При тяжелых формах заболевания слепота на оба глаза развивается в 10-15 %, а инвалидность по зрению составляет около 30 % (Кацнельсон JTA, Танковский В Э, 1998, Денисова ЕВ,1999, Катаргина Л А , Архипова А В ,2004, Либман Е С , 2004) Полиэтиологичность увеитов и сложность их патогенеза существенно затрудняют выбор препаратов для лечения

В настоящее время сформировалось несколько подходов к лечению увеитов консервативная терапия с использованием этиотропных препаратов, кортикостероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, иммунодепрессантов и иммуномодуляторов, хирургическое лечение, которое наиболее целесообразно проводить в комплексе с консервативной терапией, и экстракорпоральная терапия (гемосорбция, плазмаферез, квантовая аутогемотерапия), относящаяся к дополнительным методам лечения (Dick А D , 1995, Катаргина Л А , Хватова А В ,2000, Becker М D , Adamus G ,2000, СлеповаОС ,2001)

К сожалению, ряд препаратов, активно используемых в практике, имеет много противопоказаний и может привести к тяжелым осложнениям Поэтому поиск новых неспецифических противовоспалительных средств для лечения увеитов относится к числу актуальных проблем офтальмологии во всем мире

В этом плане большой интерес представляет изучение веществ, влияющих на метаболизм оксида азота Известно, что при увеитах эндо-и экзоантигены (липополисахариды, S-антиген сетчатки и др), а также цитокины (IL 10, IL 6 и др) вызывают активацию макрофагов и нейтрофилов, что приводит к активации индуцибельной NO-синтазы и синтезу оксида азота, являющегося одним из основных эффекторов системы

клеточного иммунитета Вырабатываясь в больших количествах при воспалении, N0 может оказывать цитостатическое - цитотоксическое действие, как на чужеродные клетки, так и на собственные клетки организма (Cunha F Q , Assreuy J ,1993, Chan С С , Li Q ,1998, Engelbert M, Mylonakis E ,2004)

В то же время, недостаточный синтез оксида азота также оказывает неблагоприятное влияние на течение воспаления (Crow J Р , Spruell С ,1994, Cross A H, Misco Т Р ,1995, Grus F H , Augustin A J ,2001)

В связи с этим, есть основания полагать, что направленная регуляция метаболизма оксида азота с помощью доноров NO и ингибиторов NO- синтаз может явиться новым способом в лечении воспалительных заболеваний глаз Несмотря на большое количество экспериментальных работ по изучению влияния оксида азота на течение воспалительного процесса, в настоящее время не существует единого мнения о патогенетической роли оксида азота в развитии увеита

Цель работы - изучить влияние экзогенных доноров оксида азота и ингибиторов NO- синтаз на течение экспериментального иммуногенного увеита для выбора нового неспецифического противовоспалительного средства, эффективного при увеитах

Задачи исследования:

1 Выбрать рабочую модель иммуногенного увеита, отличающуюся простотой моделирования, выраженной и длительной воспалительной реакцией и высокой воспроизводимостью

2 Изучить изменения биохимических показателей слезной жидкости и сыворотки крови у иммунизированных кроликов и у кроликов с иммуногенным увеитом

3 Изучить влияние различных групп доноров оксида азота на течение воспаления при использовании различных доз и сроков применения, оценить их влияние на показатели тонографии

4 Оценить влияние донора оксида азота на протеиназно-ингибиторный баланс, общую антиокислительную активность и активность ферментов антиоксидантной системы (супероксиддисмутазы и каталазы) в слезной жидкости и сыворотке крови при иммуногенном увейте

5 Изучить влияние донора оксида азота на морфологические изменения тканей глаза при иммуногенном увейте

6 Изучить влияние различных групп ингибиторов ЫО-синтазы на течение воспаления при использовании различных доз и сроков применения, оценить их влияние на показатели тонографии

7 Оценить влияние ингибитора КО-синтазы на протеиназно-ингибиторный баланс, общую антиокислительную активность и активность ферментов антиоксидантной системы в слезной жидкости и сыворотке крови при иммуногенном увейте

8 Изучить влияние ингибитора ТЧО-синтазы на морфологические изменения тканей глаза при иммуногенном увейте

9 Выбрать эффективное противовоспалительное вещество и подобрать его оптимальную концентрацию

10 Сравнить влияние выбранного эффективного противовоспалительного вещества на течение иммуногенного увеита при изолированном применении и при совместном введении с дексаметазоном

Научная новизна работы.

Впервые показано, что при субконъюнктивальных инъекциях доноров оксида азота и ингибиторов ЫО-синтазы при иммуногеном увейте у кроликов происходят как локальные (в слезе), так и общие (в крови) изменения в протеиназно-ингибиторном балансе и антиоксидантной системе

На основании клинических, биохимических и морфологических данных доказано, что применение соединений, увеличивающих уровень оксида азота в тканях глаза, а именно, доноров оксида азота и N0-содержащего газового потока, при иммуногенном увейте приводит к

активации воспалительного процесса и увеличивает длительность его течения

Впервые изучено действие ингибиторов МО-синтазы (аминогуанидина, Б-метилтиомочевина и Ь-ММА) на коэффициент легкости оттока и офтальмотонус и показано, что они не оказывают влияния на эти показатели

На основании клинических, биохимических и морфологических исследований впервые установлено, что применение ингибитора МО-синтазы 8-метилтиомочевины при иммуногенном увейте оказывает выраженное противовоспалительное действие, подобран оптимальный режим его введения (дозы и сроки)

Впервые показана высокая эффективность сочетанного применения Б-метилтиомочевины и дексаметазона при иммуногенном увейте Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности применения селективного ингибитора индуцибельной МО-синтазы 8-метилтиомочевины в комплексной терапии увеита Основные положения, выносимые на защиту:

1_ При иммуногенном увейте происходят локальные и системные изменения протеиназно-ингибиторного баланса и эндогенного антиоксидантного потенциала

2_ Субконъюнктивальное введение как доноров оксида азота, так и ингибиторов ЫО-синтазы приводит к изменениям протеиназно-ингибиторного баланса и активности компонентов антиоксидантной системы в слезе и сыворотки крови

3 Морфологические исследования, характер локальных и системных изменений протеиназно-ингибиторного баланса, общей антиокислительной активности, компонентов антиоксидантной системы кроликов свидетельствуют о более тяжелом течении увеита при применении доноров N0

4 Введение ингибиторов МО-синтазы в виде субконъюнктивальных

инъекций не влияет на коэффициент легкости оттока водянистой влаги и офтальмотонус

5 При субконъюнктивальном введении ингибиторов МО-синтазы -аминогуанидина и Ь- нитроаргинина не выявлено противовоспалительного эффекта вводимых веществ

6 Субконъюнктивальное введение ингибитора индуцибельной ЫО-синтазы 0,15 % раствора 8-метилтиомочевины в начале воспаления и в момент максимальной выраженности воспалительной реакции существенно уменьшает интенсивность и длительность течения воспалительного процесса

7 Морфологические исследования, характер локальных и системных изменений протеиназно-ингибиторного баланса, общей антиокислительной активности, компонентов антиоксидантной системы свидетельствуют о более легком течении увеита у кроликов при применении 0,15 % раствора 8 метилтиомочевины

8 Сравнительное исследование влияния 0,15 % раствора метилтиомочевины, дексаметазона и их совместного применения показало, что при сочетанном их применении наблюдается наиболее выраженный противовоспалительный эффект

9 Б-метилтиомочевину можно рассматривать как возможное перспективное потенциальное лекарственное средство в комплексном лечении увеитов Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2006), на межотделенческой конференции Московского НИИ глазных болезней им Гельмгольца 08 06 2007 Публикации.

По теме диссертации опубликованы 9 работ (3 статьи в центральной печати)

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации

Работа содержит 11 таблиц, 25 рисунков Список литературы включает 328 источников, из них 118 отечественных и 210 иностранных авторов

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте глазных болезней им Гельмгольца в отделе патологии сетчатки и зрительного нерва (руководитель д м н, проф В В Нероев) Проводились исследования на базе отделения патофизиологии и биохимии (руководитель д б н ,проф Н Б Чеснокова), патогистологии (руководитель д м н ,проф И П Хорошилова-Маслова) и лаборатории патоморфологии Московской медицинской академии им И М Сеченова (руководитель д м н, проф А Б Шехтер)

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

Работа представляет собой экспериментальное исследование, в котором наряду с офтальмологическими методами были использованы биохимические и морфологические методы исследования

Для моделирования иммуногенного увеита использовали нормальную жидкую лошадиную сыворотку крови (HJIC), производитель «Биомед» (Россия)

Работа выполнена на 235 кроликах (470 глаз) породы «шиншилла» Проведено биохимическое исследование 165 образцов слезной жидкости, 85 образцов крови, взятой до иммунизации животных, после иммунизации, на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки после введения разрешающей дозы НЛС иитравитреально или подкожно

Морфологические исследования проведены на 36 энуклеированных глазах кроликов на 2, 5, 14 сутки увеита

Клиническую оценку течения воспалительного процесса глаз кроликов проводили с помощью биомикроскопии и офтальмоскопии Оценку клинических проявлений воспаления проводили на 1, 2, 3, 5, 7, 10 сутки (после введения разрешающей дозы) в условных баллах по следующим признакам отек век, инъекция конъюнктивы, отек роговицы, преципитаты на эндотелии, экссудат в передней камере (фибрин и гипопион), гиперемия и отек радужки, образование задних синехий, опалесценция хрусталика и преципитаты на передней капсуле хрусталика, экссудация в стекловидном теле В те же дни проводили фоторегистрацию глаз кроликов

Работа состоит из 4-х частей В первой части работы проведен выбор оптимальной модели иммуногенного увеита у кроликов Требования к модели 1) технически удобна для выполнения, те наличие оптимального времени для предварительной сенсибилизации, 2) длительное течение и выраженная активность воспалительной реакции, 3) высокая воспроизводимость однотипной клинической картины

Основываясь на литературных данных, нами были выбраны 6 способов моделирования иммуногенного увеита Животных разделили на 6 групп по 4 кролика в каждой группе Группы составлялись в зависимости от дозы и способа введения нормальной лошадиной сыворотки, а также сроков введения разрешающей дозы сыворотки в стекловидное тело (табл 1)

Таблица № 1. Моделирование экспериментального иммуногенного увеита

№ группы Число глаз Антиген Доза введения НЛС (мл) Путь введения Введение разрешающей дозы (сутки)

1 8 нлс 5 в/в 14

2 8 нлс 10 в/в 14

3 8 нлс 5 подкожно 9

4 8 нлс 10 подкожно 9

5 8 нлс 10 в/в 9

6 8 нлс 0,1 - 9

Во второй части работы изучали влияние доноров КО и ингибиторов ЫО-синтазы на течение воспаления при использовании различных доз и сроков введения, оценивали их влияние на показатели тонографии и исследовали влияние ингибитора МО-синтазы на течение иммуногенного увеита как при изолированном применении, так и при совместном введении с дексаметазоном

Для изучения влияния доноров N0 и ингибиторов 1чЮ-синтазы на клиническое течение иммуногенного увеита животных разделили на 18 групп по 5 кроликов (10 глаз) в каждой, где контрольная группа - увеит +субконъюнктивальное введение физиологического раствора (табл 2,3,4)

Таблица № 2. Схема эксперимента по изучению влияния доноров N0 на течение иммуногенного увеита

Группы Препараты Сроки введения после разрешающей Кратность введений

дозы

1 0,02 % р-р молсидомина на 2,3 сутки 2

2 0,04 % р-р молсидомина на 2,3 сутки 2

3 1,0 % р-р молсидомина на 2,3 сутки 2

4 0,4 % р-р Ка нитропруссида на 2,3 сутки 2

5 1,0 % р-р Ь - аргинина на 2,3 сутки 2

6 0,01 % р-р молсидомина через 2 часа 1

7 контрольная - -

Таблица № 3 Схема эксперимента по изучения влияния Ж)-СГП на течение иммуногенного увеита

Группы Начало воздействия после 1 Режим воздействия введения разрешающей дозы | КО-СГП Кол-во воздействий

8 на 2 и 3 сутки конц N0 300 ррш, экспозиция 10 сек 2

9 через 2 часа конц N0 300 ррт, экспозиция 10 сек 1

Изучаемые препараты были выбраны из различных групп доноров

оксида азота В качестве экзогенных доноров N0 использовали молсидомин, № нитропруссид, относящиеся к группе периферических вазодилататоров, Ь - аргинин, являющийся представителем гуанидинов, и Т\тО-содержащий газовый поток (ЫО-СГП), производимый аппаратом «Плазон»

Ингибиторы индуцибельной НО-синтазы были выбраны также из различных групп аминогуанидин - производный гуанидина, Б-метилтиомочевина - относится к группе амидиновых производных, И-нитро-Ь-аргинин - производный Ь-аргинина Известно, что аминогуанидин и Б-метилтиомочевина (ЯМТ) селективны к индуцибельной КО-синтазе, а М-нитро- Ь-аргинин (Ь-№4А) ингибирует и индуцибельные, и конститутивные формы фермента

Таблица № 4. Схема эксперимента по изучению влияния ингибиторов N0-синтазы на течение иммуногенного увеита

Группы Препараты Сроки введения после разрешающей дозы Кратность введений

10 7,0 % р-р Ь-№МА через 0,5 часа 1

11 1,5 % р-р аминогуанидина через 3 часа 1

12 0,015% р-р БМТ через 3 часа 1

13 0,15% р-р БМТ через 3 часа 1

14 1,0% р-р БМТ через 3 часа 1

15 р-р дексаметазона через 3 часа 1

16 0,15% р-р БМТ + дексаметазон на 2,3 сутки 2

17 р-р дексаметазона на 2,3 сутки 2

18 0,15% р-р БМТ на 2,3 сутки 2

Для введения препаратов были выбраны разные сроки воспаления ранние - первые 3 часа после введения разрешающей дозы (до начала действия индуцибельной N0 - синтазы и выработки эндогенного оксида азота) и в момент максимальной выраженности воспалительного процесса -на 2 и 3 сутки после введение разрешающей дозы (при активном эндогенном синтезе оксида азота индуцибельной N0 - синтазой) Дозировки препаратов были выбраны исходя из рекомендуемых доз для экспериментальных животных из литературных данных

Препараты растворяли в физиологическом растворе и вводили субконьюнктивально в количестве 0,2 мл

Тонографию интактным животным проводили до воздействия, через 2 часа и через 24 часа после введения препаратов или после воздействия N0-СГП в указанных концентрациях В работе использовали тонометр, тонограф ТНЦ-100-С № 9156 До введения препаратов проводили тонографию в течение двух дней два раза в день для оценки естественных колебаний истинного внутриглазного давления и коэффициента легкости оттока (фоновое исследование)

Третья часть работы изучение влияния донора N0 и ингибитора NO -синтазы на биохимические показатели слезной жидкости и сыворотки крови Измеряли общую антиокислительную активность (АОА), трипсиноподобную (ТПА), антитриптическую активность (ATA) и уровень а2. макроглобулина (а2.-МГ), активность ферментов антиоксидантной системы супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы

Животных разделили на 5 групп по 5 кроликов (10 глаз) в каждой 1 группа - иммунизированные животные, без увеита, 2 группа — увеит +субконъюнктивальное введение физиологического раствора, 3 группа -увеит с введением донора, 4 группа - увеит с введением ингибитора, 5 группа - интактная для контроля биохимических показателей

В четвертой части работы исследовали влияние донора N0 и ингибитора NO-синтазы на морфологические изменения тканей глаза при иммуногенном увейте Для этого животных разделили на 4 группы по 5 кроликов (10 глаз) в каждой 1 группа - увеит без лечения, 2 группа - увеит и введение донора N0, 3 группа - увеит и введение ингибитора NOS, 4 группа -контроль, субконъюнктивальное введение физиологического раствора

Все полученные в ходе работы цифровые данные были статистически обработаны с использованием коэффициента Стьюдента Результаты исследований и их обсуждение. В результате изучения характера течения увеита при различных способах его воспроизведения для дальнейших исследований была выбрана рабочая модель иммуногенного увеита, отличающаяся простотой выполнения, активным и длительным течением воспалительного процесса

Для постановки этой модели кроликам подкожно вводили 5 мл нормальной лошадиной сыворотки, а затем, на 9-ый день, вводили 0,1 мл разрешающей дозы лошадиной сыворотки интравитреалыго

Проведенные исследования показали, что N0 активно влияет на течение экспериментального иммуногенного увеита Установлено, что воздействие оксидом азота в виде газового потока в низкой дозе -концентрация 300 ррт с экспозицией 10 секунд - в первые часы воспаления и в момент максимальной выраженности признаков воспаления (на 2, 3 сутки после введения разрешающей дозы сыворотки) приводит к активации воспалительного процесса и увеличивает длительность его течения (воспалительный процесс в контрольной группе длился около 6,5 суток, в опытных группах - на трое суток дольше) У животных, которым проводили воздействие КО-СГП, воспаление сопровождалось более выраженной экссудативной реакцией (массивный выброс фибрина, гипопион во всех глазах) по сравнению с контрольной группой Усиление воспалительной активности продолжилось и после повторного воздействия ЫО-содержащим газовым потоком (на 3 сутки с момента введения разрешающей дозы сыворотки (рис 1))

Рис 1 Динамика выраженности признаков воспаления при увейте после двукратного воздействия ХО-СГП на 2 и 3 сутки с момента введения разрешающей дозы

гипопион

- N0-071

контроль

Важно отметить, что при введении доноров N0 на ранних сроках воспаления и в момент максимальной выраженности воспалительной реакции также наблюдалось более тяжелое (массивный выброс фибрина, гипопион, выраженные передние и задние синехии) и длительное течение воспалительного процесса по сравнению с контрольной группой (воспалительный процесс в опытных группах длился около 9 суток, в контрольной группе около 6,5 суток)

Влияние молсидомина носило дозозависимый эффект, т е чем выше была концентрация препарата, тем тяжелее и длительнее протекала воспалительная реакция у животных (рис 2)

Рис.2. Динамика выраженности признаков воспаления при увейте, после субконъюнктивального введения молсидомина двукратно на 2 и 3 сутки после введения разрешающей дозы

баллы отек роговицы баллы гипопион

Результаты исследования влияния ингибиторов ]\тО-синтазы - Ь-МЫА и аминогуанидина показали, что эти ингибиторы практически не влияли на интенсивность и длительность течения воспалительного процесса средняя продолжительность увеита после введения Ь-НКА составила 7,3 суток, при введении аминогуанидина - 6,4, тогда как в контрольной группе - 6,5 суток

Результаты изучения влияния ингибитора Ж)-синтазы 5-метилтиомочевины на ранних сроках воспаления показали, что после введения Б-метилтиомочевины в различных концентрациях (0,015 %, 0,15 %)

123456789 сутки

123456789 сутки

м-н 0,04% • контроль д м-н 0,02% м-н 1%

отмечалось значительное уменьшение активности и длительности воспалитечьной реакции (средняя продолжительность увеита в группах, где животным вводили Б-метилтиомочевины, была около 5 суток, в контрольной группе - 6,5) Необходимо отметить, что проявлялся и дозозависимый эффект вещества при введении 0,15% раствора Б-метилтиомочевины, воспалительная реакция протекала легче, чем у животных, которым вводили 0,015% раствор

Однако при введении 1,0 % раствора Б-метилтиомочевины обнаружилось отсутствие влияния на интенсивность и длительность течения воспалительного процесса средняя продолжительность увеита после введения Б-метилтиомочевины составила 6,3 суток, тогда как в контрольной группе - 6,5 суток

При совместном введении 0,15 % Б-метилтиомочевины и дексаметазона на ранних сроках воспаления отмечалось значительное уменьшение активности и длительности воспалительного процесса (средняя продолжительность увеита - 3,5 суток, в контрольной группе- 6,7, при изолированном их введении около 5 суток (рис 3))

Рис 3 Динамика выраженности признаков воспаления при увейте при совместном введении 8-метилтиомочевины с дексаметазоном и при изолированном их введении на ранних сроках воспаления

баллы преципитаты на преципитаты на

эндотелии

баллы

хрусталике

1,5

1,0 -

0,5

0,0

1 2 3 йутК£ 6 7 8 1 2 3 4 тки5 6 7 8

-в- контроль

дексаметазои -•-ЭМТ 1%

-а—БМТ 0,15 %

-Ж- БМТ 0,15 %+дексаметазон

Совместное введение S- метилтиомочевины и дексаметазона в момент максимальной выраженности признаков воспаления также сопровождалось уменьшением активности и длительности воспаления (при совместном введении продолжительность увеита около 4 суток, в контрольной группе-6,5, при изолированном введении каждого из препаратов - около 5 суток)

Тонографические исследования после введения ингибиторов N0-синтазы и применения N0 в газовом потоке показали отсутствие их влияния на коэффициент легкости оттока и офтальмотонус

После однократного введения под конъюнктиву доноров NO во всех группах уже через 2 часа наблюдалось снижение истинного внутриглазного давления и значительное увеличение коэффициента легкости оттока Важно отметить, что при введении 1,0 % раствора молсидомина отмечался более выраженный и длительный гипотензивный эффект Через 24 часа после введения доноров N0 показатели тонографии практически не отличались от уровня фоновых измерений Результаты проведенного исследования подтверждают литературные данные о гипотензивном эффекте доноров N0

Биохимические исследования были проведены у иммунизированных кроликов без увеита (подкожное введение разрешающей дозы сыворотки) и у иммунизированных кроликов с развитием увеита (интравитреальное введение разрешающей дозы сыворотки) У иммунизированных животных в сыворотке крови наблюдалось достоверное (р<0,01) снижение ТПА и некоторое увеличение активности агАТ, тогда как в группе животных, получивших разрешающую дозу антигена интравитреально отмечалось повышение активности ТПА и снижение активности ATA (р<0,005) Это свидетельствует о том, что наблюдаемые нами изменения активности агАТ и ТПА в крови отражают именно течение увеита, а не общую реакцию организма на иммунизацию Что же касается ингибитора протеолиза - а2.МГ, то динамика изменения его активности в крови полностью совпадала во всех группах животных, имелись некоторые разчичия в амплитуде пиков Из этого

можно сделать вывод, что изменения данного показателя в большей степени отражают общую реакцию на иммунизацию

В слезе иммунизация также вызвала увеличение ATA, тогда как развитие увеита вызывало некоторое снижение ATA по сравнению с животными, которым разрешающая доза была введена подкожно

При данном способе иммунизации не происходит статистически значимого снижения АОА слезной жидкости Однако при увейте отмечается достоверное (р<0,05) снижение АОА Это снижение является следствием развития воспалительного процесса во внутренних структурах глаза

В слезной жидкости на 4 сутки после иммунизации отмечается статистически значимое снижение активности СОД (р<0,005) После интравитреального введения разрешающей дозы происходит достоверное увеличение этого показателя (р<0,005) В крови на 1 сутки после интравитреального введения разрешающей дозы активность фермента достоверно снижается (р<0,005)

В слезной жидкости иммунизированных животных происходит статистически достоверное снижение активности каталазы, тогда как при увейте на 1-7 сутки происходит достоверное увеличение активности этого фермента (р<0,05)

Таким образом, биохимические исследования показали, что сама иммунизация вызывает как местные, так и системные изменения в протеиназно-ингибиторном балансе и состоянии антиоксидантной защиты Развитие увеита на фоне иммунизации сопровождается изменениями этих показателей Происходит повышение активности ТПА в крови, и снижение активности ATA в слезе и крови, снижение АОА в слезе, снижение активности СОД и увеличение активности каталазы в острый период течения воспаления

Оценка влияния изменения уровня оксида азота в тканях глаза на биохимические показатели и морфологические изменения в глазу при увейте

была проведена на примере донора оксида азота - Na нитропруссида и

ингибитора NO-синтазы - S-метилтиомочевины

Обнаружено, что введение доноров и ингибиторов приводит к

противоположным изменениям исследуемых биохимических показателей при

увейте. Введение донора N0 вызвало некоторое снижение ТГТА в сыворотке

крови, в то время как введение ингибитора NO-синтазы, напротив, вызвало

увеличение ТПА на 1-14 сутки. Активность Ш-МГ также имела тенденцию к

снижению при введении донора N0, тогда как активность а2 - МГ в группе,

получавшей ингибитор NO-синтазы, повышалась (рис.4).

Рис. 4. Влияние введения донора N0 и ингибитора NOS на активность оь_МГ в крови при иммуногенном увейте.

введение ингибитора

О 4 10 12 16 19 23 сутки

G метилтшмачев/на Ж контроль

140 120 100 80 60 40 20 0

введение донора

о

4 8 9 11 14 17 21 сутки

Ш жгтропрусащ На к контроль

ось ординат-активность в % от уровня интактных животных В слезе введение донора N0 также вызывало снижение ATA, после введения ингибитора ATA достоверно повысилась (на ! сутки р<0,02) и оставалась выше, чем в контрольной группе до конца эксперимента. Введение донора N0 сопровождалось повышением активности а2 - МГ, тогда как при введении ингибитора она увеличивалась только в острую фазу увеита и снижалась при стихании воспалительного процесса (рис. 5),

Рис. 5. Влияние введения донора N0 и ингибитора N05 на активность а2 -МГ в слезе при иммуиогенном увейте.

введение ингибитора

введение донора

10 12 16 19 23 сутки

1 метилтио моче вина ■ контроль

9 11 14 17 21 сутки

нитропруссид Ма ■ контроль

ось ординат-активность в % от уровня интактных животных Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение донора N0, вызывающего усиление воспалительной реакции, сопровождается снижением антипротеолитического потенциала в слезе и крови, а примеиение ингибитора МО-синтазы, напротив, приводит к увеличению активности ингибиторов протеиназ, что обычно сопровождает более благоприятное течение воспалительного процесса.

Субконъюнктивальные иньекции донора N0 не вызывали достоверных изменений АОА слезной жидкости. В то же время применение ингибитора ЬГО-синтазы приводило к достоверному увеличению АОА слезной жидкости на 7 сутки увеита по сравнению с контрольной группой. Такие изменения могут свидетельствовать о положительном действии ингибитора МО-синтазы в лечении увеита.

Применение донора N0 приводило к увеличению активности СОД в слезной жидкости с последующим снижением этого показателя на 7 сутки по сравнению с контрольной группой. При применении ингибитора Тч'О-синтазы достоверных изменений активности СОД в слезе не выявлено. "Указанные

изменения активности СОД свидетельствуют об усилении воспаления, вызванное донором N0, что подтверждено клинически.

В сыворо~ке крови н обоих случаях достоверных различий между активностью СОД у леченных и нелеченных животных не выявлено.

Применение донора N0 приводило к достоверному снижению

активности катал азы в слезе на стадии неактивного воспаления, тогда как

при введении ингибитора №>синтазы активность каталазы снижалась в

острый период, а на стадии неактивного воспаления активность каталазы

была достоверно выше таковой у нелеченных животных (рис.6).

Рис. 6. Влияние введение донора N0 и ингибитора на активность каталазы в слезе при иммуногенном увейте.

введение метилтиомочевины

введение Ма нитропруссида

4 ю до иммун 1

12 16 19 23 10 14

3 7 сутки

□ ингибитор N0 ■ увеот

Ш донор Ш «увеит

ось ординат-активность в % от уровня интактных животных В сыворотке крови в обоих случаях достоверных различий между активностью каталазы у леченных и нелеченных животных не выявлено.

Повышение активности каталазы на стадии неактивного воспаления в группе, получавшей ингибитор МО-синтазы. по-видимому, является компенсаторной реакцией, направленной на снижение развития свобод норад и кального окисления. Тогда как снижение активности каталазы б

этот период в группе, получавшей донор N0, может свидетельствовать об усилении воспаления

Сопоставление характера течения увеита и локальных и системных изменений антипротеолитической активности и активности ферментов антиоксидантной системы свидетельствует о более тяжелом течении увеита у кроликов, получавших донор N0 и более раннем завершении острого периода увеита у кроликов, получавших ингибитор МО-синтазы

По данным морфологического исследования в группе животных, которым вводили донор N0, выявлялись более выраженные признаки увеита переднего отрезка (массивная лимфоцитарная инфильтрация роговицы, густая лимфоплазмоцитарная инфильтрация в цилиарном теле и радужке, передние и задние синехии), по сравнению с контрольной группой

Введение Б-метилтиомочевины на ранних сроках воспаления сопровождается уменьшением воспалительной клеточной инфильтрации, отека, сосудистых реакций, дистрофических изменений тканей глаза и длительности течения воспалительного процесса

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют с уверенностью утверждать, что субконъюнктивальное введение 0,15% раствора Б- метилтиомочевины оказывает выраженный противовоспалительный эффект даже при таком интенсивном генерализованном воспалительном процессе в глазу, каким является иммуногенный увеит Совместное применение дексаметазона с 0,15% раствором Б-метилтиомочевины потенцирует противовоспалительный эффект Б-метилтиомочевины

Выводы

1 Воспроизведена модель экспериментального иммуногенного увеита с выраженной и длительной воспалительной реакцией

2 Иммуногенный увеит сопровождается локальными и системными изменениями протеиназно-ингибиторного баланса (повышением протеолитической активности в крови и повышением активности а2 - МГ в слезе) и активности антиоксидантных ферментов (снижение активности СОД и увеличение активности каталазы в острый период, то есть снижением эндогенного антиоксидантного потенциала) по сравнению с иммунизированными животными

3 Субконъюнктивальные инъекции доноров N0 и ингибиторов NO-синтазы оказывают влияниие на протеиназно-ингибиторный баланс и состояние антиоксидантной системы как в слезной жидкости так и в крови

4 Морфологические исследования, характер локальных и системных изменений протеиназно-ингибиторного баланса, общей антиокислительной активности, компонентов антиоксидантной системы свидетельствуют о более тяжелом течении увеита у кроликов при применении доноров N0

5 Доноры оксида азота обладают выраженным гипотензивным действием, в то время как NO-содержащеий газовый поток и ингибиторы NO-синтазы не влияют на коэффициент легкости оттока и офтальмотонус

6 Изучение влияния ингибиторов NOS на течение иммуногенного увеита у кроликов показало, что наибольшей противовоспалительной активностью обладает 0,15 % раствор метилтиомочевины при введении его как на ранних сроках воспаления, так и в момент максимальной выраженности воспалительного процесса

7 Морфологические исследования, характер локальных и системных изменений протеиназно-ингибиторного баланса, общей антиокислительной активности, компонентов антиоксидантной системы свидетельствуют о более легком течении увеита у кроликов при применении ингибиторов NO-синтазы

8 Сравнительное исследование влияния 0,15 % раствора Б-метилтиомочевины, дексаметазона и их совместное применение обнаружило, что при сочетанном их применении наблюдается наиболее выраженный противовоспалительный эффект

9 Результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности применения селективного ингибитора Ж)-синтазы Б-метилтиомочевины при увейте

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1) Применение доноров оксида азота и ингибиторов ЫО-синтаз при увеитах, травмах и другой офтальмопатологии / Нероев В В , Давыдова Г А, Перова Т. С. // Клиническая офтальмология - 2005 - № 4 , Том 6 - С 172-174

2) Моделирование иммуногенного увеита у кроликов / Нероев В В, Давыдова Г А , Перова Т.С. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2006 -№11,Том142 - С 598-600

3) Влияние экзогенных доноров оксида азота - молсидомина и нитропруссида Ка на течение увеита у кроликов / Нероев В В , Чеснокова Н Б, Давыдова Г А, Перова Т.С // Сборник научных трудов, посвященных 80-летию Уфимского НИИ ГБ «Проблемы современной офтальмологии» -2006 - С 136-137

4) Изучение влияния молсидомина на течение воспалительного процесса в глазу у кроликов / Давыдова Г А , Нероев В В , Чеснокова Н Б , Перова Т.С. // Сборник научных трудов всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» - 2006 - С 384386

5) Изучение влияния нитропруссида № на течение воспалительного процесса в глазу у кроликов / Давыдова Г А, Нероев В В , Чеснокова Н Б , Перова Т.С. // Сборник научных трудов всероссийской научной

конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» -2006 - С 386-387

6) Влияние КГО-содержащего газового потока на течение экспериментального иммуногенного увеита у кроликов / Нероев В В , Кваша О И, Давыдова Г А , Перова Т.С. //Сборник материалов конгресса 14 российского национального конгресса «Человек и лекарство» - 2007 -

7) Влияние донора оксида азота нитропруссида Ка на течение иммуногенного увеита у кроликов и биохимические показатели слезы и крови / Нероев В В , Чеснокова Н Б , Давыдова Г А, Давыдова Н Г, Перова Т.С., Столярова Е П, Безнос О В // Сборник материалов конгресса 14 российского национального конгресса «Человек и лекарство» - 2007 - С 855

8) Влияние доноров оксида азота нитропруссида Ыа и Ь-аргинина на течение экспериментального увеита, антиоксидантный и антипротеолитический потенциал слезной жидкости и крови в эксперименте / Нероев В В , Чеснокова Н Б , Давыдова Г А , Давыдова Н Г , Перова Т,С , Столярова ЕП, Безнос О В //Вестник Офтальмологии, № 3, 2007 - С 22-25

9) Результаты применения МЭ-содержащего газового потока при иммуногеном увейте у кроликов / Т.С. Перова, В В Нероев, О И Кваша, Г А Давыдова //11 Всероссийская научная конференция молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии»Москва -2007-С316

С 855

Заказ № 345. Объем 1 п л Тираж 100 экз

Отпечатано в ООО «Tleipopyiu» I. Москва, у 1 Палиха-2а, тел 250-92-06 www posta tor ru