Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Применение препарата цитофлавин в комплексной терапии хронического генерализованного пародонтита (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи

ОРДЯН Лёва Леонидович

ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА ЦИТОФЛАВИН В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА

(экспериментально-клиническое исследование)

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология 14.01.14 — стоматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14 МАР 2013 005050597

Старая Купавна - 2013

005050597

Работа выполнена на кафедрах фармакологии и ортопедической стоматологи: Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профес сионального образования «Кубанский государственный медицинский универси тет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВП( КубГМУ Минздрава России)

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Галенко-Ярошевский Павел Александрович,

доктор медицинских наук, профессор Попков Виктор Леонидович

Официальные оппоненты: Яворский Александр Николаевич,

доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждент «Научный центр экспертизы средств медицинскоп применения» Минздрава России, научно-аналитичсскш отдел, руководитель отдела;

Лепилин Александр Викторович,

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учрежде ние высшего профессионального образования «Саратов ский государственный медицинский университет имен] В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения Рос сийской Федерации, кафедра хирургической стоматоло гии и челюстно-лицевой хирургии, заведующий кафед рой

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учрежде

ние высшего профессионального образования «Ставро польский государственный медицинский университет) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 года в «/С » часов на заседании

диссертационного совета Д 7.004.01, созданного на базе ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ». Автореферат разослан «Ф » 13 г.

~/7

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В перечне основных заболеваний пародонта превалируют воспалительно-дистрофические процессы, сопровождающиеся значительным разрушением тканей пародонтального комплекса, лишая естественные зубы опорной поддержки и приводящие к их потере (Леонтьев В.К. и соавт., 2012). Преобладающей патологией в структуре этих заболеваний является хронический генерализованный пародонтит (XI11), сопровождающийся частыми обострениями, трудно поддающийся эффективному лечению (Орехова Л.Ю. и соавт., 2006; Грудя-нов А.И., 2009; Цепов Л.М. и соавт., 2010; Kaner D. et al., 2009).

Согласно современным представлениям, в этиопатогенезе ХГП важное место занимает активация процессов свободнорадикального окисления (СРО), которые обусловливают возникновение нарушения баланса между про- и антиоксидант-ной системами, что является одним из пусковых механизмов деструктивных процессов в пародонте (Грудянов А.И., Чупахин П.В., 2005; Шумский А.В., Железняк В .А., 2008; Aurer A. et al., 2001; D'Attillio М. et al., 2004). Основную роль в этих процессах играют свободные радикалы (CP), которым характерна высокая реакционная способность и окислительная модификация биополимеров, влекущие за собой нарушение тканевого дыхания в митохондриях и процессов гидроксилирования в микросомах (Дмитриева Л.А., Просвирова Е.П., 2004; Галенко-Ярошевский П.А., Гацура В.В., 2009; Andreyev A.Y. et al., 2005). Значительные успехи в расширении сведений о природе отмеченных реакций сделали актуальными поиски новых подходов к терапии заболеваний пародонта, которые обеспечивали бы возможность влиять на метаболические реакции, происходящие в пораженном пародонте, и устранять их деструктивное воздействие на его ткани (Дмитриева Л .А. и соавт., 2007; Попкова Л.В., 2009).

В этом плане медикаментозная терапия ХГП является наиболее рациональным, обоснованным и распространенным методом лечебного воздействия (Николаев А.И., Цепов Л.М., 2001), так как современные лекарственные препараты способны эффективно тормозить каскад патологических биохимических реакций на клеточном уровне и стимулировать репаративные процессы в тканях пародонта (Соколова Н.А., 2004; Галенко-Ярошевский П.А., Гацура В.В., 2009).

Исходя из вышеизложенного, представлялось перспективным использование

нового отечественного препарата метаболического типа действия (ПМТД) цитофлавина, содержащего янтарную кислоту, рибоксин, никотинамид и рибофлавин, которые в избранном сочетании способны проявлять выраженные противо-ишемический и антиоксидантный эффекты и обеспечивать энергокорригирующее действие в тканях (Коваленко А.Л. и соавт., 2000; Коваленко А.Л., Алексеева Л.Е., 2001; Коваленко А.Л., 2005; Румянцева С.А. и соавт., 2008; Афанасьев В.В. и соавт., 2010), для комплексного лечения больных, страдающих ХГП.

Следует также отметить, что цитофлавин, в отличие от известных ПМТД обладает определенным преимуществом, так как содержащийся в нем метилглюка-мин способствует проникновению сукцината и других его компонентов как через неповрежденную, так и поврежденную клеточную мембрану (Коваленко А.Л., Алексеева Л.Е., 2001; Афанасьев В.В., 2005; Румянцева С.А. и соавт., 2008; Афанасьев В.В., 2010).

Цель исследования: повысить эффективность комплексного лечения пациентов с ХГП путем использования цитофлавина.

Задачи исследования:

1. Провести исследование влияния цитофлавина на течение экспериментального пародонтита (ЭП) у крыс.

2. Изучить влияние цитофлавина на показатели энергетического метаболизма, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции в условиях ЭП у крыс.

3. Исследовать влияние цитофлавина в сочетании блокатором дыхательной цепи натрия цианидом (КаСЫ) и разобщителем процессов фосфорилирования 2,4-динитрофенолом (ДНФ) на пролиферативную и метаболическую активность культивируемых остео- и фибробластов крыс.

4. Изучить эффективность лечения пациентов с ХГП средней и тяжелой степени цитофлавином в сочетании с «традиционной» медикаментозной терапией (ТМТ).

5. Провести патоморфологические и гистохимические исследования влияния цитофлавина в сочетании с ТМТ на регенеративные процессы в тканях пародон-тального комплекса при лечении пациентов с ХГП средней и тяжелой степени.

Научная новизна

Впервые установлено, что цитофлавин:

1. В условиях ЭП у крыс проявляет выраженное терапевтическое действие, значительно превосходя в этом отношении ТМТ; активирует энергетический метаболизм в тканях пародонта, нивелирует оксидативный стресс и эндотелиаль-ную дисфункцию.

2. При культивировании остео- и фибробластов крыс повышает их пролифе-ративную и метаболическую активность.

3. В клинических условиях на фоне ТМТ существенно повышает эффективность лечения больных с ХГП средней и тяжелой степени, способствуя увеличению площади регенерации патологически измененных тканей десны, восстановлению гистологической структуры и нормализации ее эпителиального покрова.

Научно-практическая значимость работы

На основании полученных результатов экспериментальных и клинических исследований показана возможность и целесообразность использования цитофла-вина в качестве лекарственного средства для коррекции метаболических процессов в комплексном лечении больных с ХГП средней и тяжелой степени.

Предлагаемый метод сочетанного применения цитофлавина и ТМТ при лечении пациентов с ХГП средней и тяжелой степени позволяет более эффективно купировать выраженность воспалительной реакции, активировать метаболические процессы и стимулировать остеоинтегральную перестройку в пародонте, что влечет за собой сокращение сроков лечения, увеличение периода ремиссии, уменьшение числа осложнений, сведение до минимума количества рецидивов и повышение функциональной эффективности зубочелюстной системы в целом.

Полученные данные патоморфологических и гистохимических исследований расширяют представления о структурных изменениях в тканях десны пациентов с ХГП средней и тяжелой степени и проливают свет на механизмы восстановления пародонтальной поддержки зубов при использовании цитофлавина в сочетании с ТМТ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При ЭП у крыс цитофлавин проявляет выраженное терапевтическое действие, значительно превосходя в этом отношении ТМТ, а также обладает протекторным эффектом относительно тканей пародонта. Препарат нормализует биоэнергетические процессы, уменьшает оксидативный стресс, повышает уровень

сосудистого эндотелиального фактора (СЭФ) и улучшает процессы микроциркуляции в пародонте.

2. Цитофлавин не оказывает цитотоксического действия на культивируемые остео- и фибробласты крыс, повышает их пролиферативную активность при метаболической гипоксии.

3. В клинических условиях цитофлавин в сочетании с ТМТ, в отличие от отдельно проводимой ТМТ, более эффективно купирует воспалительную реакцию в пародонтальном комплекса, активирует обменные (энергетические) процессы в его тканях, стимулирует репаративную регенерацию костных структур, сокращает сроки лечения больных с ХГП средней и тяжелой степени, уменьшает количество рецидивов и увеличивает периоды клинической ремиссии.

4. Цитофлавин в сочетании с ТМТ проявляет выраженное фармакотерапев-тическое действие у пациентов с ХГП средней и тяжелой степени, увеличивая площадь полной регенерации патологически измененных тканей десны, восстанавливая типичную гистологическую структуру и нормализует ее эпителиальный покров.

Личный вклад автора. На основе проведенного автором аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы им осуществлялась разработка методических подходов и протоколов исследований. Автор принимал непосредственное участие в выполнении экспериментальных, клинических и морфологических исследований, проведении статистической обработки полученных результатов, их анализе, обобщении и подготовке публикаций.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы обсуждены на: юбилейной научно-практической конференции «Прошлое служит современности», посвященной 85-летию кафедры фармакологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (21.12.2007 г.); конгрессе «Человек и лекарство. Краснодар 2008» (18.10.2008 г.); 12-й Международной стоматологической выставке и конференции «Стоматология» г. Санкт-Петербург (11.05.2009 г.); VI Всероссийском научно-практическом форуме «Дентал-ревю», г. Москва (12.02.2009 г.); 1-м Международном научно-практическом конгрессе «Управление качеством в стоматологии» и стоматологической выставке г. Сочи (24-27.02.2010 г.), а также на расширенных заседаниях (29.10.2009, 17.03.2010, 25.05.2011 и 12.04.2012 гг.)

кафедр фармакологии, клинической фармакологии и профильных кафедр стоматологического факультета ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ, одна коллективная монография и одно учебное пособие для студентов медицинских вузов, а также получен диплом на открытие № 396 «Явление активации репаративной регенерации тканей десны организма человека» (регистрационный №496 от 19.04.2010 г.).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 185 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, одной главы собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 50 рисунками и 8 таблицами. Библиография включает 362 источника литературы, из которых 287 работ отечественных и 75 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть выполнена на 86 нелинейных крысах-самцах массой 255 - 280 г. Эксперименты проведены в соответствии со статьей 11-й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ и СР РФ № 708н от 29.08.2010 г.).

Исследование влияния цитофлавина на течение ЭП у крыс проводили по методу, описанному A.M.Polson et al. (1983) и G.Keles et al. (2005). Цитофлавин включали в состав десневых повязок, а также вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг (в перерасчете на янтарную кислоту) в течение 12 дней.

В качестве ТМТ, описанной Л.В.Попковой (2009), использовали: орошение ротовой полости раствором гипохлорита натрия (0,06%), внутримышечное введение линкомицина (30% раствор 0,1 мл на 100 г), наложение десневых

повязок [метилурацил (0,5 г), метронидазол (0,25 г), анестезин (1,0 г), каротолин (1,0 мл) и водный дентин (1,0 г)] курсом, составляющим 12 дней. Измерения количества десневой жидкости (КДЖ) проводили по внутрибороздковому методу, описанному N.Brill и В.Krasse (1961).

Изучение влияния цитофлавина на показатели энергетического метаболизма, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции в условиях ЭПу крыс. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг 2 раза в сутки в течение 10 дней. Затем в гомогенатах десны определяли содержание АТФ, цитохрома С, лактата и пирувата, активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и НАДН-убихинон-редуктазы, состояние про- и антиоксидантной систем [по содержанию супероксидного аниона ("02") и изменению ингибирования восстановления цитохрома С супероксиддисмутазой (СОД)], скорость образования Н202 [с использованием флуоресцентного метода и малонового диальдегида (МДА)] (Галенко-Ярошевский В.П. и соавт., 2005, 2006), функции эндотелиальной системы [по содержанию эндотелина-1 с использованием тест-системы R&D Systems for Human Endothelin-1 Immunoassay (Великобритания)] и СЭФ роста [с использованием тест-системы VEGFELISA kit (Quantikine human VEGF; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)].

Для регистрации спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) использовали радиоспектрометр РЭ-1307, при этом образцы ткани пародонта измельчали в жидком азоте (-196°С). ЭПР сигналы прооксидантной [интенсивность свободнорадикального сигнала и его полуширину, NO и появление сигнала метгемоглобина (MetHb) (g = 6,0)] и антиоксидантной [церулоплазмина (g = 2,05), Ре3+-трансферрина (g = 4,3), железо-серных центров (FeS) (g = 1,94)] систем анализировали по методу, описанному М.К. Пулатовой и соавт. (1989). Для определения содержания свободного NO в гомогенатах пародонта использовали спин-ловушку - 1 М раствор диэтилдитиокарбамата натрия (в дозе 500 мг/кг), Ре2+-цитрат (50 мг FeS04+ 6Н20 + 250 мг натрия цитрата) (Beitran В. et al. 2000).

Исследование влияния цитофлавина на пролиферативную активность остео- (теменной кости) и фибробластов (кожи) крыс осуществляли с помощью МТТ-теста (Фисенко В.П. и соавт., 2000; Mossman Т.,1983).

Для оценки действия цитофлавина на остео- и фибробласты в условиях ги-

поксии использовали NaCN и ДНФ, описанные В.В. Соколовским (1971), А. Laborit (1970). Оптическую плотность исследуемых образцов регистрировали на анализаторе иммуноферментных реакций «УНИПЛАН» АИФР-01 (при длине волны 530 нм). Конечные результаты выражали в % от контрольных значений.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью методов вариационной статистики с использованием t критерия Стью-дента (Герасимов А.Н., 2007), а также компьютерной программы «Statistica 6.0». Полученные результаты считали достоверными при р < 0,05.

Клиническая часть работы выполнена на материале, включающем 167 больных в возрасте от 39 до 64 лет с диагнозом ХГП средней (110 человек) и тяжелой (57 человек) степени. Среди пациентов было 102 женщины и 65 мужчин. Больные были ранжированы как по полу, так и возрасту и клинической патологии. Давность заболевания пациентов с ХГП составляла более 10 лет.

Больные были разделены на две группы: основную (81 человек) и группу сравнения (86 человек), которой проводили ТМТ. Основной группе пациентов в комплекс лечебных мероприятий дополнительно к ТМТ назначался цитофлавин: по 2 таблетки 2 раза в сутки в течение 25 дней; местно раствор цитофлавина в виде орошений и аппликаций на слизистую оболочку десны (30 мин) в течение 25 дней.

Оценку пародонтального статуса пациентов проводили с использованием па-родонтального (ПИ) (Rüssel A.A., 1967) и папиллярно-маргинально-альвеолярного (ПМА) (Mussler, Schour, 1949; Parma, 1960) индексов, а также индекса Н. Kotzsche (1969). С целью суждения о гигиене ротовой полости применяли индекс Ю.А. Федорова — В.В. Володкиной (1976). Клиническое состояние тканей пародонта оценивали с помощью пробы Шиллера-Писарева.

Измерение глубины и наличие пародонтальных карманов проводили с четырех сторон пуговчатым градуированным зондом, применяя «гуляющую» методику Е.В. Попковой и соавт. (1999).

Наличие патологической подвижности зубов определяли до, в процессе и после проводимого лечения по методу, предложенному А.И. Евдокимовым (1961).

Наличие и локализацию зубных отложений определяли, используя 1 — 2% раствор метиленового синего. Скалинг зубных отложений осуществляли при

помощи ультразвукового аппарата «Satelec Suprasson Р5 Booster» (Франция). Для окончательной обработки и полировки поверхности корней зубов применяли пескоструйный аппарат Kavo PROPHYflex 3 2018 (Германия).

Оценку функциональности окклюзии проводили в покое и в динамике. Положения нижней челюсти (в покое) определяли в интеркуспидальном контакте и ретроконтактном; контролировали точность межокклюзионных контактов при различных смещениях нижней челюсти (Ховат А.П. и соавт., 2005; Хватова В.А., 2005). Окклюзионную реабилитацию (пришлифовывание зубов) проводили после купирования острых воспалительных явлений (Хватова В.А., 2005); выраженные супраконтакты окклюзии ликвидировали в первое посещение.

Комплексное лечение пациентов с XI11 средней и тяжелой степени осуществляли в четыре этапа: 1 — общие и специальные подготовительные мероприятия, временное шинирование; 2 — проведение фармакотерапии пародонта; 3 — ортопедическое лечение; 4 — диспансерное наблюдение.

Пациентам, составляющим основную группу, дополнительно к ТМТ назначали цитофлавин на втором этапе комплексного лечения.

Согласно алгоритму, разработанному И.А. Баранниковой и соавт. (1990), клиническую эффективность проводимого лечения изучали в динамике: до лечения, через 25 дней, 6 и 12 месяцев после начала комплексного лечения.

Дополнительно для визуализации результатов проводимого лечения использовали цифровую видеокамеру «Sony DCR-TRV 40Е». Оригинальный фотоматериал обрабатывали и анализировали при помощи программы PIXELA Image Mixer Ver. 1.0 for Sony, Adobe® Photoshop® CS6.

Рентгенологические исследования (по данным ортопантомограмм — ОПТГ и дентальных прицельных рентгенограмм - ДПР) проводили у всех больных до лечения, а затем у пациентов, явившихся на диспансерное наблюдение, через 6, 12, 24 и 48 месяцев после окончания основного лечения. Изучено 687 ОПТГ и 411 ДПР.

Измерение периодонтальной щели проводили на ДПР по методу E.J1. Карасу-ловой, Л.В. Попковой (2005) с использованием компьютерной морфометрии.

Отдаленные результаты медикаментозного лечения учитывались у пациентов, прибывших на обследование (спустя 12, 24 и 48 месяцев после окончания

и

лечения), профилактические осмотры, а также поддерживающую терапию. При этом рецидивом считалось появление хотя бы одного из основных симптомов обострения ХГП, имевших место до начала лечения.

Статистическую обработку результатов клинических исследований осуществляли по методам, описанным A.M. Мерковым, JI.E. Поляковым (1974), В.И. Сергиенко, И.Б. Бондаревой (2001). Различия считали статистически достоверными при р < 0,05.

Патоморфологические и гистохимические исследования проводили с использованием биоптатов слизистой оболочки маргинальной части десны прише-ечной области зубов у 86 больных с ХГП средней и тяжелой степени в стадии обострения. Забор биопсийного материала осуществляли при первом обращении пациентов и на 26 день после начала их комплексного лечения. Полученные парафиновые срезы (5 — 7 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином. Коллаге-новые и эластические волокна, тучные клетки, гликопротеиды, мышечную ткань, эритроциты окрашивали посредством комбинирования альдегид-фуксина, хромо-тропа, анилина синего (Фаустов Л.А., 2009). Кроме этого окраску гистологических срезов проводили альциановым синим и нейтральным красным после их окисления раствором перманганата калия (Сычева Н.Л., Сычев В.А., 2002). Кислые гликозаминогликаны выявляли (при pH 2,5) альциановым синим (Лилли Р., 1969). Нейтральные гликозаминогликаны окрашивали по методу Мак-Мануса - Хочкисса (Пирс Э., 1962).

Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа МБИ 15 ЛОМО. Для микрофотографирования морфологического материала использовали систему анализа изображения Nikon eclipse Е200 с цифровой камерой Olympus DR10.

Для наиболее корректной оценки морфологических исследований использовалась морфометрия. Линейные параметры морфологических структур определяли с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х. Морфометрию площадей проводили с применением стереометрической измерительной сетки Г.Г.Автандилова (1984), при этом использовали результаты случайных наложений окулярной сетки, имеющей 100 тест-точек.

Количественные результаты измерений в сравниваемых группах пациентов

обрабатывали разностным методом вариационной статистики (Ойвин И.А., 1960) с использованием электронных таблиц «Microsoft® Office Excel 2010» на компьютере серии IBM PC. Определяли среднюю арифметическую (Mi и М2) для каждого вариационного ряда и сумму квадратов отклонений от средней арифметической -2 (х - Mi)2 и X (х - М2)2. Степень достоверности различий (р) находили по таблице Стьюдента. Достоверными считали различия при р < 0,05.

II. Результаты исследования и их обсуждение Установлено, что при ЭП в опытах на крысах наиболее значимое фармако-терапевтическое действие (после 12-дневного лечения), выявляемое по уменьшению КДЖ, оказывает комплекс цитофлавин + ТМТ, который по эффективности в 1,7 раза превосходит ТМТ (рис. 1).

животные ТМТ

Рис. 1. Сравнительная эффективность сочетания цитофлавин + ТМТ и ТМТ при ЭП (на 31-й день) у крыс.

*р < 0,05, **р < 0,001 по отношению к контролю при ЭП (на 31-й день).

Спустя 1 месяц после проведенного лечения сочетанием цитофлавин + ТМТ состояние пародонтальных тканей у крыс с ЭП практически не отличалось от такового у интактных животных, тогда как в третьей группе, где проводилось только ТМТ, отдельные признаки патологических симптомов (наличие участков гиперемии и скудное отделяемое десен) со стороны пародонта сохранялись.

При исследовании влияния цитофлавина на показатели энергетического метаболизма, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции в условиях ЭП у крыс установлено (табл. 1), что применение этого препарата вызывало повышение (на 17%) содержания АТФ в гомогенатах десны, снижение количества

пирувата и лактата до нормального уровня, однако достоверного сдвига в содержании цитохрома С не наблюдалось.

Соотношение лактат/пируват при ЭП существенно не изменялось, а под воздействием цитофлавина снижалось (на 29%). Под влиянием цитофлавина повышалась активность СДГ гомогенатов десны, тогда как при пародонтите отмечалось подавление активности СДГ, что может лежать в основе нарушения цикла трикарбоновых кислот при гипоксически-воспалительных поражениях пародонта. Следует отметить, что изменение активности СДГ может считаться чувствительным маркером гипоксически-воспалительного поражения ткани десны и тесно связано с нормализацией уровня рибофлавина. Таким образом, под воздействием цитофлавина в гомогенатах ткани пародонта происходит, по-видимому, активация аэробных гликолитических реакций, на что указывает сдвиг соотношения лактат/пируват в сторону пирувата при одновременном возрастании активности СДГ и отсутствии изменений в содержании цитохрома С (восстановлении дыхательной цепи митохондрий).

При анализе ЭПР-сигналов ткани пародонта интенсивность свободноради-кального сигнала возрастала (на 61%), а его полуширина уменьшалась (на 39%). Эти изменения в спектре ЭПР при ЭП на фоне снижения содержания цитохрома С и развития дефицита АТФ указывают на нарушения в дыхательной цепи митохондрий и гиперпродукцию активных метаболитов 02; целостности мембранных структур. В пользу последнего и инактивации стероидогенеза свидетельствует и установленное в работе возрастание ПОЛ (повышался уровень МДА на 15%), а также появление ЭПР-сигнала метгемоглобина (табл. 1).

Под воздействием курсового применения цитофлавина интенсивность сво-боднорадикального сигнала и его полуширина приближались к нормальным значениям (табл. 1). Возрастание интенсивности сигнала РеБ-центров НАДН дегидрогеназы при ЭП свидетельствует об увеличении доли убисемихинонов в суммарном свободнорадикальном сигнале, нарушении цепи электронного транспорта митохондрий на участке НАДН-убихинон-редуктазы, что совпадает с данными биохимических исследований. Под влиянием цитофлавина активность НАДН-убихинон-редуктазы возрастала (на 23%) по сравнению с контрольной группой, как и интенсивность сигнала РеБ-центров.

Таблица 1. Влияние цитофлавина на энергетический метаболизм, оксидативный стресс и эндотелиальную дисфункцию при ЭП у крыс (М ± т, п = 10)

Показатель Контроль Пародонтит

без лечения + цитофлавин

Содержание нитрозотиолов, мкмоль/г белка 16,6 ±0,5 23,1 ±0,8* 20,2 ± 0,8*

Скорость генерации 'Ог', мкмоль/мг белка • мин 2,65 ±0,21 7,59 ± 0,46" 5,08 ± 0,25"

Н202, мкмоль/л • мин 1,59 ±0,14 5,55 ±0.23" 3,73 ±0,21"

Интенсивность сигнала 24,0 + 0,9 15,4 ±0,7" 20,5 ± 1,0**

Полуширина сигнала 7.0 ± 0.3 4,3 ± 0,3" 5,0 + 0,1""*

Рев 36,1 ± 1,8 32,1 ± 1,4* 36,1 ± 1,6

Ре5-ЫО 5,3 ± 0,2 6,6 ± 0,4* 6,3 ± 0,3*

Окисленный церулоплазмин 21,1 ±0,4 23,7 ± 0,4* 20,6 ± 0,7"

МДА, мкмоль/г вл. ткани 39,5 ± 1,9 45,3 ± 1,7* 41,6 ± 1,6*

АТФ, мкмоль/г вл. ткани 1.56 ±0,09 1,28 ±0.04* 1.50 ±0,11*

Цитохром С, нмоль/г вл. ткани 8,7 ± 0,3 6,6 ± 0,3" 6,7 ± 0,2"

Лактат, ммоль/г вл. ткани 1,08 ±0,14 1,22 ±0,08 1,16 ±0,06

Пируват, ммоль/г вл. ткани 0,072 ± 0,008 0,065 ± 0,006 0,071 ±0,002

Лактат/пируват 20 ±4 22 + 3 14,0 ±1,0**

Рибофлавин, мкг/г вл. ткани 0,40 ± 0,03 0,34 ± 0,03 0,39 ± 0,04

НАДН-убихинон-редуктаза, мкмоль/(мг белка • мин) 24,0 ± 1,0 18,0+1,0* 22,0 ± 1,0*

Сукцинат-убихинон-редуктаза, мкмоль/(мг белка • мин) ' 1,24 + 0,06 0,89 ± 0.04* 1,23 ±0,09*

Сукцинатдегидрогеназа, нмоль /мг белка 61,0 + 2,0 52,0 ± 2,0* 62,0 ± 4,0*

Эндотелии-1, фг/мг белка 1,32 ±0.08 2,58 ± 0.27" 1,85 ±0,06**

Эндотелиальный фактор роста, мг/мг белка 81,0 ± 1,0 149 ±16** 131 ± 19*

Примечание. Сравнение различий средних: *- с контролем, # - с состоянием ХГП, один знак-р < 0,05, два —р< 0,01.

Оптимизация метаболических процессов при ЭП под влиянием цитофлавина приводила к снижению скорости образования Н202 и N0 (на 15 и 14% соответственно), однако скорость генерации *02 оставалась повышенной. Активация синтеза N0 рассматривается как адаптационная реакция, направленная на повышение энергопродукции в митохондриях. Отмечалось снижение интенсивности ЭПР-сигналов окисленного церулоплазмина (при ЭП увеличивалась на 12%) и возрастание (на 28%) интенсивности ЭПР-сигнала Ке1+-трансферрина, что является показателем торможения генерации СР, замедления процессов ПОЛ и повышения активности антиоксидантных ферментов (табл. 1).

Известно, что экспрессия трансферрина регулируется посредством взаимодействия HIF-la (hipoxia inducible factor), индуцированного IRP (iron responsive protein) и IRE (iron responsive element), обеспечивающего активацию экспрессии гена трансферрина по NO-зависимому механизму (Kendal Н.К. et al., 2001; Golub L.M. et al., 2006). Следовательно, стимулирующее действие цитофлавина на Fe3+-трансферрин обусловлено регуляцией этим препаратом окислительного гомеоста-за организма и активности NO. Нормализация окислительного гомеостаза под влиянием цитофлавина, по-видимому, лежит в основе улучшения функции эндотелиальной системы [содержание вазоконстрикторного эндотелина-1 уменьшалось (на 28%) при поддержании на высоком уровне СЭФ роста] (табл. 1).

Исследование влияния цитофлавина на пролиферативную активность остео- (теменной кости) и фибробластов (кожи) крыс показало, что этот препарат не оказывает на них токсического воздействия. При внесении в среду инкубации интактных клеток цитофлавина в разведениях 1:10, 1:20 и 1:100 отмечалась достоверная тенденция к повышению метаболической и пролифера-тивной активности клеток: остеобластов на 6,0 - 7,2 %, фибробластов на 11,7 — 16,1% соответственно (табл. 2 и 3).

В случаях введения в инкубационную среду блокатора дыхательной цепи NaCN и разобщителя процессов фосфорилирования ДНФ приводило к снижению степени адгезии к субстрату, которая оценивалась по уменьшению площади клеточных элементов и увеличению расстояния между ними; рост остеобластов повышался на 36,3 и 44,5%, а фибробластов - на 35,9 и 45,2% соответственно (табл. 2 и 3).

Введение в инкубационную среду цитофлавина в разведениях 1:10, 1 : 20 и 1 : 100 индуцировало в условиях гипоксии, вызванной NaCN и ДНФ, достоверное восстановление жизнеспособности клеточных культур, что проявлялось в нормализации адгезии и количества остео- и фибробластов. При этом прирост их численности составлял для остеобластов в 46,0 и 51,0%, а для фибробластов — 43,0 и 51,0% соответственно (табл. 2 и 3).

Учитывая, что ДНФ вызывает усиление окислительных процессов и уменьшение образования макроэргических соединений, можно предполагать участие свободнорадикальных механизмов в осуществлении его цитотоксического дейст-

Таблица 2. Влияние цитофлавина на количество остеобластов (крыс, п = 16) и их метаболизм в присутствии КаСИ и ДНФ, оцениваемое по оптической плотности красителя формазана (5 образцов на 1 точку), образующегося в МТТ-тесте (М+ш)

Воздействующие Концентрация цитофла- Оптическая плотность,

вещества вина, мг/мл усл. ед.

Контроль - 1301±173

100,0 1380,0 ± 123,0

Цитофлавин 50,0 1395,0 ± 115,0

10,0 1386,0 ±87,0

0,2 мМ - 829,0 ±51,0*

100,0 1289,0 ±98,0+

Цитофлавин + 0,2 мМ 50,0 1257,0 ± 131,0+

10,0 1140,0 ± 146,0+

ДНФ 0,5 мМ - 722,0 ± 43,0*

100,0 1102,0 ± 124,0°

Цитофлавин + ДНФ 0,5 мМ 50,0 1141,0 ± 139,0°

10,0 1094,0 ± 156.0°°

Примечание: Здесь и в табл. 3: *р < 0,001, **р < 0,01 - эффекты цитофлавина, ЫаСЫ и ДНФ достоверно отличаются от контроля; *р<0,02, ггр<0,05 - эффекты цитофлавина достоверно отличаются от данных действия №СЫ; °р<0,02, °°р<0,05 - эффекты цитофлавина достоверно отличаются от данных действия ДНФ.

Таблица 3. Влияние цитофлавина на количество фибробластов (крыс, п = 16) и их метаболизм в присутствии ЫаСЫ и ДНФ, оцениваемое по оптической плотности красителя формазана (5 образцов на 1 точку), образующегося в МТТ-тесте (М±ш)

Воздействующие Концентрация цитофла- Оптическая плотность,

вещества вина, мг/мл усл. ед.

Контроль - 1423,0 ±138,0

100,0 1589,0 ± 151,0

Цитофлавин 50,0 1652,0 ± 147,0

10,0 1609,0 ±92,0

ЫаСЫ 0,2 мМ - 912,0 ±91,0*

100,0 1311,0 ± 119,0+

Цитофлавин + №СЫ 0,2 мМ 50,0 1298,0 ± 105,0+

10,0 1301,0+ 141,0+"

ДНФ 0,5 мМ 779,0 ±55,0**

100,0 1117,0 ± 121,0°°

Цитофлавин + ДНФ 0,5 мМ 50,0 1234,0 ± 158,0°

10,0 1189.0 ± 111,0°

вия. Цитофлавин оказывал выраженное протекторное действие на модели гипоксии, вызванной ДНФ, индуцируя повышение жизнеспособности клеточных культур и способствуя поддержанию мембранного потенциала митохондрий.

Полученные данные подтверждают наличие у цитофлавина антиоксидантных, антигипоксических и цитопротекторных свойств.

ЫаСЫ, блокируя дыхательную цепь, вызывал накопление продуктов цикла трикарбоновых кислот. Цитофлавин проявлял нормализующее действием на метаболические процессы в условиях гипоксии, вызванной ЫаСЫ.

Клинические наблюдения показали, что цитофлавин оказывает благоприятное влияние на ткани пародонтального комплекса больных с ХГП. У пациентов всех групп к 26 дню наблюдения уменьшились отечность и кровоточивость слизистой оболочки десен, количество экссудата из пародонтальных карманов и патологическая подвижность зубов. В основной группе больных в 2 раза быстрее купировались воспалительные процессы (в случаях ХГП средней степени на 2 - 3-е посещение против 5 - 7-го - у пациентов группы сравнения; при ХГП тяжелой степени на 3 — 4-е посещение против 7 — 9-го — у больных группы сравнения). ИГ, ПИ и ПМА на 26 день лечения отражали имеющуюся клиническую ситуацию. Существенные изменения этих показателей имели место у больных основной группы. Так, для пациентов с ХГП средней степени эти показатели составляли: 0,85 ± 0,06, 0,78 ± 0,08 и 3,31 ± 0,51%, тогда как до лечения они были равны 2,40 ± 0,12, 3,42 ± 0,14 и 41,43 ± 2,64% (р < 0,001 во всех случаях). При этом проба Шиллера-Писарева была отрицательна. Индекс КЫг.чсЬе составлял 3,16 ± 0,07 против 35,94 ± 2,01% (р < 0,001) до лечения.

Для больных с ХГП тяжелой степени ИГ, ПИ и ПМА составляли: 1,50 ± 0,05, 1,39 ±0,31 и 4,96 ± 0,23% тогда как до лечения они были равны 2,85 ± 0,29 (р > 0,05), 5,88 ± 0,19 и 61,26 ± 2,11% (р < 0,001 в обоих случаях). При этом проба Шиллера-Писарева была отрицательна у 98% пациентов. Индекс КЫязсЬс уменьшался, составляя 14,07 ± 1,37 против 62,18 ± 2,44% (р < 0,001) до лечения.

У больных с ХГП средней и тяжелой степени, представляющих группу сравнения, показатели ИГ, ПИ и ПМА были менее значимы (по сравнению с основной группой). Так, у пациентов с XI11 средней степени отмеченные индексы составили: 1,21 ± 0,05, 1,27 ± 0,07, 6,31 ± 1,02%, тогда как до лечения они были равны 2,44 ± 0,12, 3,25 0,26 (р < 0,01 в обоих случаях) и 42,90 ± 2,22% (р < 0,001). При этом проба Шиллера-Писарева была слабо положительна у 6 больных, что составило 10,3%. Индекс Ко178сЬе снизился имея значение 6,96 ±1,03 против

37.93 ± 1,84% (р < 0,001) до лечения.

Для пациентов с ХГП тяжелой степени ИГ, ПИ и ПМА составили: 1,67 ± 0,30, 1,76 ± 0,21, 12,99 ± 1,28%, тогда как до лечения они были равны 2,86 ± 0,36 (р < 0,02), 5,79 ± 0,21 и 61,32 ± 2,06% (р < 0,001 в обоих случаях). При этом проба Шиллера-Писарева была слабо положительна у 6 больных, что составило 21,4%. Индекс Ю^гБсЬе уменьшился, составляя 23,28 ± 2,15 против 61,65 ± 2,21% (р < 0,001) до лечения. Подобная клиническая картина имело место спустя 6 и 12 месяцев после завершения комплексной фармакотерапии пациентов с ХГП всех групп.

Рентгенологические исследования показали, что спустя 6 и 12 месяцев после завершения комплексного лечения у пациентов обеих групп имела место позитивная тенденция к стабилизации деструктивных изменений в челюстных костях и альвеолярных отростках, прерывалось формирование новых очагов деструктивных процессов и образование костных карманов. Однако у пациентов основной группы наблюдалась более выраженная активация репаративных процессов в костных структурах, чем это имело место в контрольной группе. Границы межзубных альвеолярных перегородок имели более выраженный контурный рисунок. Существенно уменьшалась периодонтальная щель. Губчатая ткань альвеолярных костей перестраивалась, костные балочки приобретали вид переплетенных светлых полосок, при этом отмечалось исчезновение очагов остеопороза, наблюдалась тенденция к остеоинтегральной перестройке.

В результате патоморфологических и гистохимических исследований выявлено, что включение цитофлавина в комплекс лечебных мероприятий улучшает качественные показатели тканей десны. Так, на 26 день исследования под влиянием сочетания цитофлавин + ТМТ толщина эпителиального покрова (314,0 мкм против 594,0 и 421,0 мкм соответственно) и общая площадь воспалительно-клеточных инфильтратов в структуре десны (30,0% против 86,2 и 45,4% соответственно) статистически достоверно уменьшались как по сравнению с контролем (до лечения), так и ТМТ (табл. 4).

Что же касается суммарной площади склеротически измененных тканей в десне, то оказалось, что этот показатель при использовании сочетания цитофлавин + ТМТ по сравнению с контролем статистически значимо увеличивалась (34,7

Таблица 4. Сравнительное исследование влияния сочетания цитофлавин + ТМТ и ТМТ на патоморфологические показатели биоптатов десны при лечении больных с ХГП в стадии обострения (М ± т)

Группы пациентов Средняя толщина эпителиального покрова десны, мкм Суммарная площадь клеточных инфильтратов в соединительнотканной основе десны, % Суммарная площадь склеротически измененных тканей в десне, % Суммарная площадь соеденительноткан-ной основы десны, восстановленной по типу реституции, %

Контроль[п = 86] (до лечения)(1) 594 ± 22 86,2 ± 8,5 9,3 ± 1,6 -

ТМТ (2) [п = 42] 421 ± 18 р,.2< 0,001 45,4 ±3,1 Рк2< 0,001 45,6 ± 2,6 Рі.2 < 0,001 4,9 ±0,9

Цитофлавин + ТМТ (3) [и = 44] 314 ± 15 Риг< 0,001 Рм< 0,001 30,0 ± 3,6 р,.з< 0,001 р2.ъ< 0,001 34,7 ± 3,4 Рі.}< 0,001 р2-з< 0,001 30,1 ±3,0 р2-г< 0,001

Примечание. В скобках: круглых - номер группы, квадратных - количество пациентов.

против 9,3%), а по отношению к ТМТ - уменьшалась (34,7 против 45,6%). Следует подчеркнуть, что общая площадь соединительнотканной основы слизистой оболочки десны, регенерированной по типу реституции, в случаях применения сочетания цитофлавин + ТМТ больше (30,1%) таковой при применении только ТМТ (4,9%) (табл. 4).

Таким образом, согласно проведенным патоморфологическим и гистохимическим исследованиям, цитофлавин в сочетании с ТМТ способствует нормализации структуры собственной оболочки десны на гораздо большей территории, чем это имеет место при использовании только ТМТ. Под воздействием ТМТ регенерация характеризуется, главным образом, развитием в десне фиброзно-склеротических изменений.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального пародонтитау крыс наиболее выраженный фармакотерапевтический эффект проявляет сочетание цитофлавин + «традиционная» медикаментозная терапия, значительно превосходя в этом отношении «традиционную» медикаментозную терапию.

2. При экспериментальном пародонтите у крыс цитофлавин повышает энер-

гетический потенциал клеток и стимулирует клеточное дыхание, нормализует свободнорадикальные процессы, уменьшает генерацию свободных радикалов, активирует процессы окислительного гомеостаза и улучшает функцию эндотели-альной системы в тканях пародонта.

3. Цитофлавин в условиях нормоксии не оказывает цитотоксического действия на остео- и фибробласты (крыс), повышает их пролиферативную активность; на фоне гипоксии, вызванной натрия цианидом и 2,4-динитрофенолом, увеличивает жизнеспособность клеточных культур, способствуя нормализации их адгезии и сохранению количественного состава.

4. Применение цитофлавина в сочетании с «традиционной» медикаментозной терапией существенно повышает эффективность лечения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени, проявляющуюся более быстрым купированием острых воспалительных процессов и повышением репаративной регенерации тканей пародонтального комплекса.

5. При лечении больных с хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения применение цитофлавина в дополнение к «традиционной» медикаментозной терапии способствует более выраженному восстановлению структуры собственной оболочки десны.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для более эффективного лечения больных с хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени рекомендуется включать в схему «традиционной» медикаментозной терапии цитофлавин: местно в виде орошений и аппликаций на слизистую оболочку десны (30 минут) в течение 25 дней, а также назначать его в таблетированной форме по 2 таблетки 2 раза в сутки курсом 25 дней.

2. Для предотвращения рецидива у больных с хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени следует проводить курс фармако-терапевтического лечения в случаях использования «традиционной» медикаментозной терапии спустя 5 и 11 месяцев после ее окончания, а при применении цитофлавина в сочетании с «традиционной» медикаментозной терапией - через 36 месяцев после ее завершения.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ордян Л.Л., Попков B.JI., Галенко-Ярошевский П.А. Влияние цитофлавина на течение экспериментального пародонтита у крыс // Инновационные направления в теории и практике стоматологии: сборник научных трудов. - Краснодар: Советская Кубань, 2009. - С. 98 - 104.

2. Ордян JLJL, Попков В.Л., Галенко-Ярошевский П.А. Влияние цитофлавина на метаболическую активность остеобластов и фибробластов крыс // Кубанский научный медицинский вестник. — 2009. — № 9 (114). — С. 101 — 104.

3. Ордян Л.Л., Попков В.Л., Галенко-Ярошевский П.А. Сравнительная характеристика дерматопротекторных свойств цитофлавина, эмоксипина и а-токоферола // Современные вопросы стоматологии: сборник научных трудов. — Краснодар: Советская Кубань, 2010. - С. 141 - 145.

4. Ордян Л.Л., Попков В.Л., Сукоян Г.В., Галенко-Ярошевский П.А. Коррекция метаболических нарушений, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции цитофлавином при генерализованном пародонтите в эксперименте // Новые технологии. — 2010. — № 1.-С. 143 - 147.

5. Ордян Л.Л., Попков В.Л. Клиническая эффективность препарата цитофла-фин в комплексном лечении больных с хроническим генерализованным пародон-титом // Труды X Всерос. научно-практич. конференции «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов, 2010. — С. 276 — 281.

6. Ордян Л.Л., Фаустов Л.А., Сычева H.A., Попков В.Л. Эффективность воздействия цитофлавина на регенераторный процесс в десне при обострении хронического генерализованного пародонтита // Труды X Всерос. научно-практич. конференции «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». Саратов, 2010. - С. 281 - 285.

7. Ордян Л.Л., Попков В.Л., Сычева Н.Л., Фаустов Л.А., Галенко-Ярошевский П.А. Патоморфологическая характеристика лечебного эффекта цитофлавина при лечении больных с хроническим генерализованным пародонтитом // Пародонто-логия.-2010.-№3 (56).-С. 14-21.

8. Леонтьев В.К., Фаустов Л.А., Галенко-Ярошевский П.А., Попков В.Л., Сычева Н.Л., Попкова Л.В., Ордян Л.Л. Хронический генерализованный пародонтит: клиническая и экспериментальная фармакотерапия метаболическими корректора-

ми. - Краснодар: Просвещение-Юг, 2012. — 403 с.

9. Леонтьев В.К., Галенко-Ярошевский ПЛ., Чекман И.С., Тахчиди Х.П., Сахнов С.Н., Гаевый М.Д., Горчакова H.A., Ордян Л.Л. и др. Фармакология. Руководство к практическим занятиям (учебное пособие для студентов медицинских вузов). - Краснодар: «Просвещение-Юг», 2012. - 782 с.

10. Леонтьев В.К., Фаустов Л.А., Галенко-Ярошевский П.А., Попков В.Л., Сычева Н.Л., Попкова Л.В., Ордян Л.Л. Явление активизации репаративной регенерации тканей десны организма человека И Диплом на открытие № 396 (заявление № А-496 от 15.01.2010 г.; регистрационный № 496).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота

ДНФ — 2,4-динитрофенол

ДПР - дентальная прицельная рентгенограмма

иг — индекс гигиены

кдж — количество десневой жидкости

МДА — малоновый диальдегид

ОПТГ — ортопантомограмма

пи — пародонтальный индекс

1ІМЛ — папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс

пмтд — препарат метаболического типа действия

пол — перекисное окисление липидов

сдг — сукцинатдегидрогеназа

сод — супероксиддисмутаза

СР - свободный радикал

СРО — свободнорадикальное окисление

СЭФ — сосудистый эндотелиальный фактор

тмт — «традиционная» медикаментозная терапия

ХГП - хронический генерализованный пародонтит

эп — экспериментальный пародонтит

ЭПР — электронный парамагнитный резонанс

Ol — супероксидный анион-радикал

NaCN — натрия цианид

NO — оксид азота

Подписано в печать 21.02.2013г. Тираж 100 экз.. Усл. п.л. 1,0. Заказ №329 Отпечатано в типографии «ДІД «Каретный Двор»» 101000, Москва, Лубянский пр., д.21, стр.5-5а Тел.: (495)621-70-09 www.allaprint.ru