Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Применение обогащенной тромбоцитами плазмы и струйной санации в комплексном лечении хронического остеомиелита

На правах рукописи

Микулич Елена Викторовна

ПРИМЕНЕНИЕ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЫ И СТРУЙНОЙ САНАЦИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ОСТЕОМИЕЛИТА (экспериментальное исследование)

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 ДП;П'С!3

005052261

Воронеж - 2013

005052261

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Глухов Александр Анатольевич Официальные оппоненты:

Гисак Станислав Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры детской хирургии;

Ходорковский Марк Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, Бюджетное учреждение здравоохранения Воронежской области «Воронежская областная клиническая больница № 1», заведующий отделением микрохирургии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «/3> О Л 2013 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.009.01 в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 394036, ул. Студенческая, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Глухов Александр Анатольевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема лечения больных хроническим остеомиелитом (ХО) продолжает оставаться одной из наиболее сложных и актуальных среди заболеваний костно-мышечной системы (В.К.Гостищев с соавт., 2007; Д.Г.Алексеев, 2005; А.Г.Сонис, 2008; И.В.Борисов, 2007; С.В.Радаев, 2009; С.Л.Васильев, 2011). Это связано с особенностями локализации остеомиелитических полостей, тяжестью клинического течения патологичесского процесса, высокой частотой рецидивов заболевания. Больные нередко многократно подвергаются малоуспешным оперативным вмешательствам (С.В.Горюнов с соавт., 2004; С.Ф.Усик с соавт., 2007; Bhavan К.Р., 2009). Злободневность данной проблемы усугубляется ростом травматизма, увеличением доли сочетанного характера повреждений (Н.В.Корнилов, К.И.Шапиро, 2002; Е.Д.Склянчук, 2009). Ряд авторов отмечают, что доля ХО в целом в структуре гнойно-септических заболеваний составляет 6,8-12% (Е.С.Малышев с соавт., 2001; Л.С.Страчунский, 2002; Д.Г.Алексеев, 2005). Следует отметить, что, несмотря на постоянное совершенствование методов лечения переломов костей конечностей, переход острого остеомиелита в хронический отмечается у 15-45% больных (А.А.Кутин, Н.И.Мосиенко, 2000; А.Л.Камека, 2012; Hambleton S., Berendt A.R., 2004; Malcius D. et al., 2009).

Лечение больных ХО является серьезной социальной проблемой, так как около 70% больных становятся нетрудоспособными; из них 78% - это лица трудоспособного возраста (В.И.Шевцов и соавт., 2002), а инвалидность достигает 55% и более (Ю.А.Амирасланов, В.А.Митиш, 1996; М.В.Казарезов, 2002; Kumar J. et al., 2010).

Остается актуальной разработка методов воздействия на репаративный остеогенез (Л.Ю.Орехова с соавт., 2001). В последнее время активно проводится ряд исследований, направленных на использование естественных, биологически активных агентов в различных областях медицины (И.Ю.Якобашвили, 2009; Suba Z. et al., 2004). Ведется поиск остеоиндуктивиых и остеокондуктивных материалов, которые отвечают современным требованиям. Во многих областях реконструктивной хирургии хорошо зарекомендовали себя различные аутоткани, к числу которых относится и аутогенная обогащенная тромбоцитами плазма /ОТП/ (В.В.Тачалов, 2009).

В целом, анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что многие вопросы лечения ХО, несмотря на множество предложенных методов, остаются

решенными не до конца, что является основанием для продолжения исследований в указанном направлении (В.К.Гостшцев с соавт., 2010; В.К.Носков, 2003; Н.Н.Гурин, 2004; А.В.Еремин, 2006; Б.ЮКуков с соавт., 2007; Ю.А.Амирасланов с соавт., 2008).

Целью исследования явилось повышение эффективности лечения экспериментального хронического остеомиелита путем применения ОТП и струйной санации гнойно-некротических очагов костных и мягких тканей.

Задачи исследования:

1. Модифицировать экспериментальную модель хронического остеомиелита и изучить ее эффективность.

2. Изучить эффективность селективного регионарного применения ОТП в лечении экспериментального хронического остеомиелита.

3. Разработать новый метод лечения экспериментального хронического остеомиелита, основанный на комбинированном применении ОТП и струйной санации.

4. Изучить в эксперименте эффективность комбинированного применения ОТП и струйной санации в лечении экспериментального хронического остеомиелита.

Научная новизна

Модифицирована модель экспериментального хронического остеомиелита, позволяющая получить воспроизведение патологического процесса в 100% случаев с минимальным риском гематогенного инфицирования и развития патологических переломов (рационализаторское предложение № 1302 от 30.01.2013 г.).

Отработаны методики и доказана эффективность селективного воздействия ОТП при лечении хронического остеомиелита в эксперименте.

Разработан новый метод комбинированного применения ОТП и струйной санации, предназначенный для использования в комплексе лечения хронического остеомиелита, позволяющий достоверно повысить эффективность удаления гнойно-некротических тканей и микробных тел в области остеомиелитических очагов и стимулировать процессы регенерации костной ткани.

Модифицировано микромоторное устройство, предназначенное для хирургической санации костной полости (положительное решение о получении патента РФ на полезную модель № 2012115068 от 04.12.2012 г).

Научная работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию молодежной науки У.М.Н.И.К. (государственный контракт №10493р/16870 от 08.06.2012 г).

Практическая значимость

Разработан новый метод лечения хронического остеомиелита, основанный на комбинированном применении ОТП и струйной санации гнойно-некротических очагов костных и мягких тканей. Предложенный метод позволяет повысить эффективность и ускорить сроки лечения лечения хронического остеомиелита.

Реализация результатов работы

Разработанный метод лечения хронического остеомиелита внедрен в работу Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Материалы диссертации используются на лекциях и практических занятиях кафедры общей хирургии ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

По материалам диссертации опубликованы 14 статей, из них 3 - в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Основные положения результатов диссертационной работы были представлены на III Молодежном инновационном форуме (Воронеж, 2010); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ургентной хирургии» (Воронеж, 2010); VI Всероссийской научной-практической конференции молодых ученых-медиков (Казань, 2012); VI Молодежном инновационном форуме (Воронеж, 2012); V Всероссийской конференции молодых ученых "Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине" (Воронеж, 2012); II межрегиональной научно-практической конференции хирургов «Бурденковские чтения» (Воронеж, 2012); I Международной конференции «Морфоклинические аспекты безопасности жизнедеятельности» (Воронеж, 2012).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 180 странице машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования; двух глав собственных исследований; выводов; практических рекомендаций; списка литературы. Указатель литературы включает 270 источников, в том числе 166 отечественных и 104 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 92 рисунками.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложена модифицированная модель экспериментального хронического отстеомиелита, позволяющая воспроизводить патологический процесс в 100% случаев.

2. При селективном применении ОТП в лечении экспериментального хронического остеомиелита обеспечивается выраженный стимулирующий эффект на течение регенераторных процессов в области остеомиелитического очага.

3. Разработан новый метод лечения хронического остеомиелита, основанный на комбинированном региональном применении ОТП и струйной санации.

4. При лечении экспериментального хронического остеомиелита достоверно лучшие результаты достигаются при комбинированном воздействии струйной санации и ОТП.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований.

Исследования проведены на 175 белых крысах-самцах массой 300±20 г на базе НИИ Экспериментальной биологии и медицины ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н.Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Выделены две контрольные и три опытные группы животных (по 35 крыс). Во всех группах моделировали хронический остеомиелит. Для этого под наркозом («Золитил-100» в дозе 8 мк/кг) в асептических условиях на наружной поверхности нижней трети бедра производили линейный разрез длиной 1,5 см; обнажалась метаэпифизарная зона бедренной кости, где с помощью модифицированного микромоторного устройства создавали полость диаметром 3,5 мм. После этого в полость вводили турунду, смоченную 20% спиртовым раствором нитрата серебра, и фрагменты аутокости. На кожу накладывали наводящий шов шелковой нитью. На 7-е сутки иссекали рубец и в полученную полость вводили культуру золотистого стафилококка в 2% агаре. На 31-е сутки после внесения микробной культуры развивался хронический остеомиелит. В 100% случаев формировались свищи с отделением гнойного экссудата.

Во всех опытных и II контрольной группах лечение начинали (под наркозом /«Золитил-100» в дозе 8 мк/кг/) на 31-е сутки после внесения культуры ЗСарЬЛососсив аигеиэ. В опытных группах производили предварительную хирургическую санацию очага с помощью модифицированного микромоторного

устройства. В I опытной применяли однократную струйную санацию патологического очага 0,9% раствором №С1 с помощью оригинального устройства УГОР-ОШ. Во II опытной изучали влияние ОТП на течение хронического остеомиелита. В III опытной использовали однократное комбинированное воздействие ОТП и струйной санации 0,9% раствором хлорида натрия.

Метод получения ОТП заключался в следующем: из хвостовой вены каждого животного проводили забор 3 мл крови. ОТП получали с помощью лабораторной центрифуги при 6000 оборотах в мин. в течение 15 мин. Сразу после активации раствором тромбина ОТП вводили в костную полость.

В I контрольную группу вошли животные с хроническим остеомиелитом, не подвергающиеся лечению, во II контрольную - животные, которым проводили только однократную хирургическую санацию с помощью модифицированного микромоторного устройства.

Для оценки эффективности лечения во всех группах использовались клинические, гематологические, бактериологические, морфологические и рентгенологические методы исследования (на 7, 14, 28, 60 и 90-е сутки после моделирования хронического остеомиелита).

Учитывались следующие клинические проявления: общее состояние животных; наличие или отсутствие отека в н/3 бедра, свищей и гнойного отделяемого, опороспособность конечности.

Гематологические показатели включали общий анализ крови, определение уровня малонового диальдегида (МДА), динитрофинилгидразонов (ДНФГ), активности супероксиддисмутазы (СОД), уровня вН-групп.

Бактериологические методы включали посев материала на питательные среды, изучение морфологии колоний и количества колониеобразующих единиц (КОЕ). При появлении роста в жидких питательных средах готовили мазки с окраской по Грамму. Для изучения биохимических характеристик микроорганизмов /сахаролитические свойства (посев на среды Гисса), общая биохимическая активность (реакция Фогеса-Проскауэра и на среде Клиглера)/ использовали набор качественных тестов.

Обзорная рентгенография проводилась при помощи стационарного рентгеновского аппарата 12П5.

Морфологические исследования включали методики окраски гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону; окраску на ретикулиновые волокна путем импрегнации серебром по Футту; с помощью ШИК-реакции определяли

нейтральные гликопротеиды; для определения состояния матрикса костной ткани применяли реакцию на гиалуроновую кислоту по Мюллеру. Препараты изучали в световом микроскопе. Изображения получали с помощью системы анализа изображений Leica Qwin Standart V2.6 (Leica, Германия).

Статистическая обработка данных осуществилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 фирмы StatSoft. Первоначальная обработка выполнялась с помощью традиционных методов вариационного анализа: выполнялся расчет средних значений, медианы и моды, ошибки среднего, дисперсии и стандартного отклонения, доверительного интервала, квартилей и дентальных коридоров. При выявлении многомодового характера распределения, а также по данным ассимметрии и эксцесса осуществлялось определение характера распределения результатов исследования с помощью графического метода -построение гистограмм распределения, а также методы Колмогорова-Смирнова и Лилпиефорса.

Для сравнения результатов в различных группах применяли методы параметрической и непараметрической статистики (в зависимости от характера распределения): одно- и многомерный дисперсионный анализ, Н-критерий Краскала-Уоллеса; в качестве апостериорного критерия использовался критерий Шеффе. В качестве критериальных статистик использовалась верхняя область 5% F-распределения.

Результаты исследований

При изучении общего состояния животных были получены следующие данные. У животных всех групп на 7-е сутки отмечалось истощение, снижение аппетита, угнетение общего состояния. В I контрольной у животных функционировали свищи с умеренным количеством гнойного экссудата. Во П контрольной наблюдалась зона интенсивной гиперемии в области патологического процесса, скудное серозно-гнойное отделяемое. На дне раны отмечался рост зернистых грануляций. В I и П опытных группах определялась умеренная гиперемия вокруг раны, отделяемого не было. В Ш опытной у 71,4% животных отмечалась незначительная гиперемия, заживление проходило под струпом, у 28,6% животных клиническая картина не отличалась от таковой в других опытных группах. На 14-е сутки у животных контрольных групп сохранялись угнетение общего состояния, слабая двигательная активность. В опытных группах общее состояние достоверно улучшилось. В I контрольной продолжали функционировать свищи с умеренным количеством гнойного экссудата. Во II контрольной группе 8

визуализировались раны с умеренной зоной гиперемии и скудным серозным отделяемым. Продолжался рост розовых, зернистых грануляций. В I опытной заживление ран первичным натяжением отмечено в 42,86% случаев, вторичным - в 57,14%, во II опытной - в 28,6 и 71,4%, в 1П опытной - в 71,4 и 28,6%, соответственно. К 28-м суткам клинические показатели животных I контрольной группы не претерпели существенных изменений. Во II контрольной группе улучшилось общее состояние, но продолжала сохраняться слабая двигательная активность. Во всех опытных группах отмечено полное восстановление опороспособности оперированной конечности. При оценке пораженной конечности I контрольной группы выявлено наличие свищевых ходов с умеренным гнойным экссудатом; во II контрольной у всех животных произошло заживление ран вторичным натяжением. К 60-м суткам в I контрольной группе клиническая картина не претерпела достоверных изменений. Во II контрольной происходило дальнейшее улучшение общего состояния животных, двигательная активность увеличилась, но была ниже, чем у животных опытных групп. В опытных группах животные по внешнему виду не отличались от интактных.

При изучении показателей общего анализа крови, уровня окислительного стресса и антиоксидантной защиты были отмечены следующие тенденции. На 7-е сутки в I контрольной группе уровень лейкоцитов соответствовал 13,00±0,24х109/л, во П контрольной - 12,66±0,26x10%. В опытных группах данный показатель был ниже, чем в контрольных и составил в I опытной группе 12,00±0,04х10%, во II опытной - 11,25±0,13х109/л, в 1П опытной - 10,23±0,22x10%. На 14-е сутки в I контрольной группе сохранялся гнойный процесс, что объясняло наличие лейкоцитоза (12,41±0,30x10%). Во II контрольной уровень лейкоцитов также продолжал оставаться высоким (12,29±0,23х 109/л), что свидетельствовало о неэффективности одной только хирургической санации. Проводимое лечение в опытных группах позволило умеренно снизить данный показатель. В I опытной он составил 10,89±0,06хЮ9/л., во II опытной - 9,27±0,05х109/л, в Ш опытной -8,26±0,44х109/л. На 28-е сутки в I контрольной группе уровень лейкоцитов составил 12,07±0,27х109/л, во II контрольной - 11,40±0,26 х109/л; в I и II опытных группах - 9,02±0,04х109/л и 7,89±0,04х109/л. В III опытной группе количество лейкоцитов приблизилось к норме (6,46±0,39х109/л). На 60-е сутки в I контрольной группе лейкоцитоз составил 11,91 ±0,20x10%, во П контрольной -10,93±0,22х109/л, в I и II опытных - 10,93±0,22x10% и 10,93±0,22x10%,

соответственно. У животных III опытной группы данный показатель соответствовал физиологической норме (6,06±0,12х10'/л).

Показатели окислительного стресса

В ходе проведенных исследований было установлено, что на 7-е сутки в I контрольной группе уровень МДА в 2,9 раза превысил данный показатель у интактных животных. Во II контрольной группе значения МДА превышали норму более чем в 2 раза. В опытных группах данный показатель был ниже и составил в I опытной группе 33,92±2,90 нмоль/л, во II опытной - 33,25±2,20 нмоль/л, в 1П опытной - 27,27±3,15 нмоль/л. Констатировали увеличение уровня ДНФГ во всех экспериментальных группах. Наиболее высокие показатели наблюдались в контрольных группах. В I и П контрольных группах уровень ДНФГ составил 80,36±3,22 и 76,33±2,53 нм/мг белка, соответственно. В опытных группах выявлена положительная динамика с достоверным снижением уровня ОМБ по сравнению с контрольными группами (р<0,05). Уровень ДНФГ в I и II опытных группах составил 65,44±3,24 и 63,65±2,55 нм/мг белка, соответственно. В III опытной группе данный показатель был достоверно ниже (р<0,05) по сравнению с I и II контрольными группами (57,64±3,48 нм/мг белка).

На 14-е сутки уровень МДА в I и П контрольных группах достоверно не изменился в сравнении с 7-ми сутками (40,07±3,06 и 39,60±5,32 нмоль/л, соответственно). При использовании струйной обработки отмечено достоверное снижение (р<0,05) уровня МДА (27,08±3,13 нмоль/л). Во II опытной группе содержание МДА составило 25,22±2,64 нмоль/л, в Ш опытной - 18,83±1,77 нмоль/л (р<0,05). При оценке уровня ДНФГ наблюдалась такая же тенденция, как при определении содержания МДА. Наиболее выраженная положительная динамика отмечалась при комбинированном применении ОТП и струйной санации, уровень ДНФГ составил 52,63±2,37 нм/мг белка.

К 28-м суткам в I контрольной группе сохранялась высокая активность перекисного окисления (39,48±3,42 нмоль/л). У животных II контрольной группы не отмечалось достоверных отличий содержания МДА по отношению к I контрольной (37,48±1,59 нмоль/л). У животных всех опытных групп отмечено статистически достоверное (р<0,05) снижение содержания МДА по отношению к контрольным группам. Наиболее выраженная положительная динамика имела место в III опытной группе - 15,41±1,75 нмоль/л. В I контрольной группе процессы окислительной модификации белков (ОМБ) не имели достоверных различий по сравнению с 14-ми сутками, содержание ДНФГ составило 77,24±2,65 нм/мг белка. Во II контрольной

группе так же сохранялся высокий уровень ДНФГ (64,21 ±2,91 нм/мг белка). У лабораторных животных опытных групп уровень карбонильной модификации белков был достоверно ниже, чем в контрольных (р<0,05). Среди опытных групп наиболее высокий уровень ДНФГ отмечался в I опытной (55,04±2,63 нм/мг белка). Во II и III опытных группах уровень ДНФГ составил 52,57±2,17 и 50,24±2,44 нм/мг белка.

На 60-е сутки исследования в I контрольной группе уровень МДА не претерпел существенной динамики. Во II контрольной группе данный показатель превышал норму на 148,96% (35,85±3,04 нмоль/л). В I и II опытных группах уровень МДА достоверно отличался от 28-х суток исследования (р<0,05) и составил, соответственно, 17,46±1,46 и 16,97±0,92 нмоль/л. В III опытной группе данный показатель соответствовал параметру интактных животных (14,54±1,97 нмоль/л). В I контрольной группе сохранялся высокий уровень ДНФГ (77,07±1,93 нм/мг белка). У лабораторных животных II контрольной группы произошло снижение уровня ОМБ, но показатель ДНФГ продолжал статистически достоверно (р<0,05) превышать значения интактных животных (59,61±2,04 нм/мг белка). В опытных группах отмечалась выраженная положительная динамика. Уровень ДНФГ в I и II опытных группах составил 50,64±2,18 и 50,07±1,66 нм/мг белка. В III опытной группе данный показатель приблизился к уровню интактных животных и составил 48,59±1,99 нм/мг белка.

К 90-м суткам исследования в I контрольной группе уровень МДА составил 38,30^4,20 нмоль/л, что превысило показатель у интактных животных на 165,97 %. У лабораторных животных II контрольной группы содержание МДА претерпело положительную динамику и достоверно отличалось (р<0,05) от I контрольной группы (35,30±2,74 нмоль/л). В I и II опытных группах, несмотря на выраженную положительную динамику, уровень МДА остался выше нормальных значений и составил 16,18±0,82 и 15,98±1,50 нмоль/л. Уровень МДА в группе животных с комплексным применением струйной санации и обогащенной тромбоцитами плазмы не выходил за пределы физиологической нормы (14,40±1,67 нмоль/л). Сохранялась высокая активность процессов ОМБ у лабораторных животных I и II контрольных групп, содержание ДНФГ составило 76,95±1,73 и 56,99±1,69 нм/мг белка соответственно. В I и II опытных группах, аналогично уровню МДА, снизилось содержание ДНФГ, но не достигло значений интактных животных. В III опытной группе процессы ОМБ пришел в соответствие с физиологической нормой (46,26±2,10 нм/мг белка).

В ходе проведенных исследований было установлено, что на 7-е сутки в контрольных группах отмечалось повышение уровня SH-групп. Однако данная активация неферментативного звена антиоксидантной системы (АОС) была недостаточной для ингибирования свободнорадикальных процессов. В опытных группах происходило адекватное повышение неферментативного звена антиоксидантной системы защиты. В I опытной труппе уровень SH-групп составил 117,11±6,81 мг%, во II и III - достоверно отличался от контрольных групп и составил 118,51±3,21 и 124,15±2,53 мг%, соответственно. При изучении ферментативного звена АОС было установлено, что содержание СОД в I контрольной группе составило 0,40±0,03 усл.ед., во П контрольной - 0,50±0,07 усл.ед. Происходил дисбаланс физиологического оксидант-антиоксидантного равновесия. Анализ динамики изменений активности СОД показал, что в опытных группах произошло достоверное повышение данного показателя по сравнению с контрольными группами, а во II и III опытных группах - по сравнению с интактными животными. Уровень СОД в I опытной группе составил 1,52±0,04 усл.ед., во П опытной -1,60±0,03 усл.ед., в III опытной - 1,96±0,02 усл.ед.

К 14-м суткам в контрольных группах происходило снижение содержания SH-групп. В опытных группах констатировали снижение уровня неферментативного звена АОС, коррелирующее с нормализацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Содержание SH-групп составило в опытных группах 107,82±6,13, 109,22±3,76 и 115,29±5,71 мг%, соответственно. В контрольных группах на 14-е сутки происходила достоверная инактивация СОД, уровень которой составил 0,35±0,03 и 0,43±0,04 усл.ед., соответственно. В опытных группах в отношении СОД наблюдалась тенденция, свидетельствующая о сбалансированном функционировании ферментативного и неферментативного звеньев АОС.

На 28-е сутки дальнейшее снижение уровня SH-групп в контрольных группах ассоциировалось с сохраняющимся повышением уровня ПОЛ и окислительной модификации белков, что свидетельствовало об истощении резервно-адаптационных возможностей организма. Содержание SH-групп составило в I контрольной группе 68,25±4,62 мг%, во П контрольной - 70,09±4,50 мг%. В опытных группах происходило снижение уровня SH-групп, однако данный показатель был достоверно выше, чем в контрольных группах. Сохранялась корреляция между снижением уровня свободно-радикального окисления и показателем неферментативного звена антиоксидантной системы. В I опытной группе уровень SH-групп составил 73,97±5,14 мг%, во П опытной - 74,60±7,26 мг%, в III опытной - 78,59± 11,24 мг%. К

28-м суткам, аналогично вН-группам, снижалась активность СОД в контрольных группах. Ингибирование антиоксидантной системы защиты при высокой активности свободнорадикальных процессов приводило к развитию окислительного стресса. В опытных группах уровень СОД был достоверно выше по сравнению с контрольными группами (р<0,05) на фоне снижения активности ПОЛ.

Как на 60-е, так и на 90-е сутки в контрольных группах сохранялся окислительный стресс, снижающий резервные возможности антиоксидантной системы и усугубляющий эндогенную интоксикацию. Происходило снижение показателей неферментативного и ферментативного звеньев АОС. На 60-е сутки исследования уровень БН-групп и СОД составил в I контрольной группе 6б,78±4,58 мг% и 0,29±0,04 усл. ед., во II контрольной группе - 69,29±5,36 мг%. и 0,39±0,03 усл. ед. соответственно. К 90-м суткам показатели БН-групп и СОД составили в I контрольной группе 65,85±3,09 и 0,26±0,03 усл. ед., во II контрольной группе -69,69±4,19 мг% и 0,38±0,03 усл. ед. соответственно. На данные экспериментальные сроки в опытных группах на фоне проводимой терапии отмечалась сбалансированность процессов в системе свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты. Значения показателей антиоксидантной системы защиты были адекватны содержанию продуктов ПОЛ и ОМБ. На 60-е сутки уровень БН-групп в I опытной группе составил 73,40±4,62 мг%, во II опытной группе -73,78±4,67 мг%. Содержание СОД соответствовало 1,46±0,03 усл. ед. в I опытной группе, 1,46±0,03 усл. ед. во II опытной группе. На 90-е сутки исследоавания уровень вН-групп и СОД составил в I опытной группе 72,03±3,31 мг% и 1,42±0,05 усл. ед., во П опытной группе - 72,25±5,85 мг%. и 1,44±0,03 усл. ед. соответственно. Наиболее выраженная положительная динамика отмечалась на фоне комбинированного применения струйной санации и ОТП, где все показатели соответствовали интактным животным.

Оценка данных микробиологических исследований

Микробный спектр остеомиелитических очагов на 7-е сутки исследования во всех группах включал как Гр (+), так и Гр (-) флору. При наличии в патологическом очаге несколькох возбудителей возникали различные их комбинации.

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что выделенные З.аигеиэ и З^ёеггшШз обладали выраженными гемолитическими, протеолитическими и сахаролитическими свойствами, а также факторами патогенности. Е.соН активно разлагали все сахара короткого ряда Гисса,

образовывали индол, обладали каталазной активностью, но были цитохромоксидазоотрицательными, образовывали зону гемолиза на кровяном агаре.

Таблица 1

Биохимическая характеристика выделенных микроорганизмов из остеомиелитического очага на 7-е сутки наблюдения (п=35)

Исследование Вид микроорганизма

S.aureus S.epidermidis E.coli

о л <L> С и- 5 сахароза + + +

s 3 глюкоза + + +

§ Е Q, К ff а лактоза + + +

& « <3 О и маннит + + +

Гемолитическая активность + + а

Амилолитическая активность - - -

Уреазная активность + + -

Каталазная активность - - +

Редукция нитратов + + +

Цитохромоксидаза + + -

Реакция Фогеса Проскауэра + + -

Индол + + +

Сероводород + + -

Гидролиз желатины + + -

Биохимическая активность на слабая слабая высокая

среде Клиглера

Лидирующее место занимал S.aureus (71,4%), на долю E.coli пришлось 28,6%. Количественные характеристики микрофлоры выделенной от животных I контрольной группы соответствовали 106 -108 КОЕ в мл. Во II контрольной частота высевания S.aureus умеренно снизилась, по сравнению с I контрольной, а удельный вес E.coli остался на прежнем уровне. В данной группе, помимо S.aureus и E.coli, был выделен S.epidermidis (14,3%). Исследование биохимической активности и факторов патогенности показало, что возбудители оставались биохимически активными и сохраняли патогенные свойства. Количественные показатели микрофлоры составили 104-105 КОЕ в мл.

Из выделенных штаммов в I опытной группе на 7-е сутки монокультуру представляли S. aureus, E.coli и S.epidermidis. Ассоциированная микрофлора была 14

представлена S.aureus и S.epidermidis. Золотистый стафилококк утратил способность выделять лецитовителлазу и плазмокоагулазу, все штаммы слабо разжижали питательную желатину. Отмечали снижение микробной обсеменности по сравнению с контрольными группами. Количественные характеристики микрофлоры соответствовали 102-103 КОЕ в мл. У животных II опытной группы отмечено наличие как монокультур, так и микробных ассоциаций, состоящих из штаммов S.aureus и E.coli. Показатель микробной обсемененности в этой группе соответствовал 102-104 КОЕ в мл. У животных III опытной группы в 71,4% микроорганизмов обнаружено не было, а в оставшемся проценте случаев идентифицировали E.coli. При этом показатель микробной обсемененности в ране составил 10-Ю2 КОЕ в мл.

К 14-м суткам в I контрольной группе была выделена монокультура (S.aureus /42,9%/, E.coli /28,6%/) и ассоциация данных микроорганизмов в 28,6%, во II монокультуру представляли S.aureus (57,1%) и E.coli (14,3%), ассоциированная микрофлора, состоящая из S.aureus/E.coli /14,29%/ и S.aureus/S.epidermidis /14,29%/ составила 28,6%. Микробная обсемененность ран во II контрольной группе - 103-104 КОЕ в мл, I контрольной варьировал - 106-107 КОЕ в мл.

На 28-е сутки в I контрольной группе S.aureus выделялся в 42,9% случаев, E.coli и ассоциация данных микроорганизмов составили по 28,6%. Количественные характеристики микрофлоры соответствовали 10е -107 КОЕ в мл. К 28-м суткам произошло заживление ран во II контрольной группе.

К 60-м суткам у животных I контрольной группы биохимически активный S.aureus был идентифицирован в 42,9%, E.coli - в 14,9% и ассоциация данных микроорганизмов - в 42,9%. Количественные показатели микрофлоры незначительно снизились и соответствовали 105 -106 КОЕ в мл. На 90-е сутки было отмечено, что все штаммы сохраняли высокую биохимическую активность. Микробный спектр биоматернала животных I контрольной группы изменений не претерпел.

Результаты рентгенологического исследования

На 7-е сутки в I контрольной группе кость утолщена за счет периостальных наслоений. На фоне зоны остеопороза со склеротическим ободком визуализировались секвестры в секвестральной коробке. Во II контрольной так же выявлены очаги деструкции костной ткани, утолщение кости за счет периостальных наслоений. Наблюдались очаги остеопороза и остеосклероза, секвестры не выявлены. Во всех опытных группах кость утолщена за счет периостальных

наслоений. Теней, подозрительных на секвестры, не обнаружено. Умеренно выражен остеопороз. В рентгенологической картине животных всех опытных групп достоверных различий не наблюдалось.

На 14-е сутки на рентгенограммах животных I контрольной группы выявлены участки деструкции костной ткани. Как по латеральному, так и по медиальному контуру визуализировались секвестры до 3 мм в диаметре. Кость утолщена. Костномозговой канал склерозирован в средней трети бедренной кости. Во П контрольной группе сохранялось утолщение кости. Наблюдалось чередование участков остеосклероза и остеопороза. Секвестры не визуализировались. У животных I опытной группы отмечалось значительное утолщение нижней трети диафиза за счет периостальных наслоений. Наблюдался остеопороз нижней трети диафиза, на фоне которого визуализировались немногочисленные очага деструкции. Во П опытной рентгенологическая картина характеризовалась наличием утолщения бедренной кости. Отмечалось сочетание участков остеопороза и остеосклероза. Наблюдались небольшие очаги деструкции. В III опытной кость по-прежнему была утолщена, имел место остеопороз краев дефекта костной ткани. Очаги остеосклероза небольшого диаметра. Во всех опытных группах теней, подозрительных на секвестры не выявлено.

На 28-е сутки в I контрольной группе определялись очаги деструкции костной ткани, утолщение кости, визуализировались мелкие секвестры. Во П контрольной группе сохранялась зона деструкции, при этом появлялись первые признаки регенерации костной ткани. Отмечались зоны остеосклероза и остеопороза.

В I и II опытных группах отмечено уменьшение очагов деструкции, сочетание очагов остесклероза с остеопорозом. Во II опытной группе наблюдались более выраженные, по сравнению с I опытной группой, признаки регенерации в виде теней регенерата, расположенного по краям костного дефекта. В III опытной группе произошло значительное уменьшение полости деструкции, появилась полоса новообразованной костной ткани с наличием со стороны внутреннего кортикального слоя периостальных наслоений.

На 60-е сутки в I контрольной группе, наряду со склерозом кости, обнаруживались участки ее истончения. На месте кортикального слоя образовывались новые линейные многослойные периостальные наслоения. Сохранялись очаги деструкции с мелкими секвестрами.

Во II контрольной группе произошло уменьшение очагов деструкции. Участки остеосклероза были более выражены. Отмечались слабые тени регенерата по краю очагов деструкции, утолщение кости за счет периостальных наслоений.

У животных I и II опытных групп сохранялись явления остеосклероза. Отмечались незначительные участки остеопороза. Новообразованная костная ткань практически полиостью заполняла дефект. У животных III опытной группы сохранялось утолщение кортикального слоя со стороны костномозгового канала. Сужение костномозгового канала свидетельствовали об остеосклерозе. Восстанавливался структурный рисунок кости.

На 90-е сутки в I контрольной группе рентгенологическая картина не отличалась от 60-х суток. У животных II опытной группы структурный рисунок кости был нарушен. Сохранялся дефект костной ткани 0,15-0,2 см. У животных I и II опытных групп отмечалась нечёткость границ кортикального слоя, дифференцировки на кортикальный слой и костномозговое пространство не происходило. В III опытной группе бедренная кость имела чёткий рисунок и хорошо выраженные границы кортикального слоя. Костный дефект был полностью заполнен гомогенными тенями новообразованной костной ткани.

Оценка результатов морфологических исследований.

В I контрольной группе на 7-е сутки отмечалось наличие секвестров в окружении полости с гнойно-некротическим содержимым. От данной полости шли свищевые ходы, достигая надкостницы. Нарушение целостности надкостницы вызывало формирование абсцессов в окружающих мягких тканях. При лечении традиционным способом в области остеомиелитического очага имелся дефект кости, заполненный ретикулофиброзной костной тканью и гнойно-некротическим содержимым. Грануляционная ткань содержала большое количество сегментоядерных лейкоцитов, сосуды с элементами стаза и тромбоза. Зона деструкции характеризовалась наличием секвестров, погруженных в рыхлую неоформленную соединительную ткань. В препаратах I опытной группы отмечалась морфологическая картина репаративного процесса в зоне деструкции. На фоне сформировавшейся грануляционной ткани определялись секвестры, окруженные скоплением нейтрофильных лейкоцитов. Структурно-функциональные изменения кости на 7-е сутки после применения ОТП характеризовались выраженной воспалительной реакцией, которая проявлялась интенсивной лейкоцитарной инфильтрацией, поднадкостничными абсцессами. Очаги грануляционной ткани с признаками фиброза заполняли пространства между секвестрами. Сосуды

расширены, со стазом эритроцитов. Края эндоста зазубрены. В III опытной группе в области дефекта кости обнаруживались признаю! гнойно-некротической реакции. Костная ткань секвестрирована, между отдельными фрагментами определялась ретикулофиброзная ткань различной степени зрелости, выраженный воспалительный клеточный компонент, сосуды расширены с признаками стаза эритроцитов. Надкостница утолщена.

Морфологическая картина на 14-е сутки при спонтанном заживлении не имела значительных различий по сравнению с предыдущим сроком. Во П контрольной группе зона остеомиелитического поражения кости содержала значительное количество ретикулофиброзной ткани. Встречались очаговые скопления нейтрофильных лейкоцитов в периваскулярных пространствах в области репарации дефекта. На фоне восстановительных процессов сохранялись значительные участки некротизированной костной ткани, окруженные грануляционной тканью. Отмечалось образование как эндостальной, так и периостальной костной мозоли. В I опытной группе образовывались участки новых костных структур; отмечалась частичная резорбция хрящевого вещества. Воспалительная инфильтрация и интерстициальный отек в зоне очага были выражены меньше, чем в предыдущих группах. Во II опытной группе отмечалась пролиферация грануляционной ткани с признаками гнойного воспаления. В качестве фиксирующего вещества для секвестрированной костной ткани выступала ретикулофиброзная ткань. В области уплощенного периоста среди пучков коллагеновых и ретикулиновых волокон обнаруживались очаги новообразований хрящевой ткани. В препаратах П1 опытной группы обнаруживалась ретикулофиброзная ткань между некротизированными участками кости. Определялась костно-хрящевая мозоль в области периоста, где на фоне усиления метаболических процессов потенцировалась пролиферация хряща с последующей оссификацией.

На 28-е сутки в I контрольной группе определялись гнойные фокусы, продолжающиеся в свищевые ходы. Периост в области свищевого канала утолщался и склерозировался. Имелись единичные участки, выполненные ретикулофиброзной тканью, соединяющей между собой новообразованную костную ткань с явлениями не только синтеза, но и резорбции, что проявлялось в наличии скоплений остеокластов. Результаты, полученные во II контрольной группе отличались от I контрольной наличием большого количества зон остеогенеза, процесс ремоделирования сопровождался остеобластической реакцией, но ретикулофиброзная ткань между микросеквестрами и между новообразованной костной

тканью характеризовалась полиморфизмом клеточного компонента с преобладанием клеток воспалительного ряда. Определялись участки склерозированной костной ткани с измененной структурой. Применение струйной санации оказывало положительное воздействие на репаративный остеогенез, что проявлялось морфологической картиной купирования воспалительной реакции. В зоне очага определялись участки остеогенеза различной степени дифференцировки, был характерен полиморфизм дифферонов костных клеток. Экстрацеллюлярный матрикс представлен ретикулиновыми и коллагеновыми волокнами. Сохранялись зоны с преобладанием воспалительной реакции на фоне ретикуло-фиброзной ткани, но выраженность таких участков была меньше, чем в контрольных группах.

Во II опытной группе определялась грануляционная ткань различной степени зрелости и с наличием остеобластической реакции. Костные трабекулы были окружены пролиферирующими остеобластам, имелись участки резорбции за счет деятельности остеокластов. Грануляционная ткань с выраженными проявлениями ангиогенеза содержала хаотично расположенные волокна, клеточный компонент был представлен макрофагами, лимфоцитами и фибробластическими клетками. Периостальная реакция характеризовалась пролиферацией хондроцитов с участками остеогенеза, что выражалось в утолщении надкостницы.

В III опытной группе после комбинированного применения струйной санации и ОТП гнойный процесс в грануляционной ткани характеризовался очаговостью. В участках с преобладанием зрелых грануляций увеличивалось количество фибробластических элементов с выраженным коллагеногенезом. На фоне фиброзных изменений определялись зоны остеогенеза. Отдельные балки подвергались резорбции с преобладанием остеокластов, определялись участки склерозированной костной ткани. В области периоста имелись участки хрящевой ткани с преобладанием зрелых форм.

На 60-е сутки в препаратах I контрольной группы дефект костной ткани замещался пластинчатой костной тканью, но обнаруживалось нарушение морфоархитектоники базофильных линий склеивания, что указывало на компенсаторно-приспособительные процессы костного органа.

Во II контрольной группе на фоне воспалительных изменений в местах новообразованной костной ткани преобладали остеокласты, осуществляющие резорбцию старых фрагментов. В костно-хрящевой мозоли сохранялись единичные воспалительные инфильтраты. Воспалительная реакция стихала к 90-м суткам. В I опытной группе завершалось моделирование костной ткани. Среди полноценных

структур определялось нарушение цитоархитектоники, что указывало на процессы перестройки в кости. Базофильные линии склеивания были ориентированы преимущественно упорядочение с равномерными промежутками, что отражало направленность в соответствии с механическими нагрузками. Аналогичная картина наблюдалась к 90-м суткам.

Во II опытной группе отмечались процессы оссификации хрящевых элементов, клеточные элементы характеризовались полиморфизмом с преобладанием зрелых клеточных форм. Костные трабекулы были утолщены. Края эндоста зазубрены, что свидетельствовало о процессах воспалительного характера с вовлечением данного отдела кости. По периферии очага определялись немногочисленные участки фиброзной ткани. Надкостница утолщена с признаками перихондрального и периостального окостенения. Данная динамика сохранялась на 90-е сутки, цитоархитектоника пластинчатой костной ткани в зоне остеомиелитического очага отличалась от интактной хаотичным расположением базофильных линий. К 60-м суткам после комбинированного применения струйной санации и ОТП на месте дефекта определялась костная ткань губчатого строения с явлениями дистрофических изменений. Разнонаправленность расположения базофильных линий склеивания, утолщение надкостницы, клеточный полиморфизм с преобладанием остеоцитов свидетельствовали о завершении репаративного процесса. Динамика данных структурно-функциональных изменений сохранялась и к 90-м суткам.

Таким образом, как показали проведенные исследования, применение струйной санации в комплексе лечения хронического экспериментального остеомиелита способствует повышению эффективности купирования воспалительной реакции, а дополнительное использование ОТП потенцирует процессы ангиогенеза, что, в свою очередь, усиливает остеогенез.

ВЫВОДЫ

1. Модифицированная экспериментальная модель в 100% случаев вызывает хронический остеомиелит у белых крыс, существенно снижает вероятность гематогенного инфицирования, развития патологических переломов, удобна для разработки новых способов лечения.

2. Изучена эффективность селективного применения ОТП в лечении экспериментального хронического остеомиелита, позволяющая достоверно ускорить в патологическом очаге процессы репаративного остеогенеза.

3. Разработан новый метод лечения экспериментального хронического остеомиелита, основанный на комбинированном применении ОТП и струйной санации гнойно-некротических очагов костных и мягких тканей.

4. В эксперименте доказана достоверно более высокая эффективность лечения хронического остеомиелита при использовании разработанного метода. Применение струйной санации позволяет добиться значительного снижения микробной обсемененности костной полости и мягких тканей, а последующее введение ОТП в предварительно санированную костную полость оказывает выраженное стимулирующее влияние на регенерацию костной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью воспроизведения хронического остеомиелита в лабораторных условиях целесообразно использовать предложенную модификацию модели экспериментального хронического остеомиелита.

2. С целью проведения адекватной обработки гнойно-некротического остеомиелитического очага и снижения бактериальной обсемененности рекомендуется использовать струйную санацию.

3. Ускорение процессов регенерации тканей в области предварительно санированного остеомиелитического очага может быть достигнуто региональным применением ОТП.

4. При лечении хронического остеомиелита наибольшая эффективность лечебных мероприятий достигается при комбинированном использовании струйной санации и ОТП, при этом на первом этапе лечения осуществляется качественная очистка патологического очага от гнойно-некротических тканей и микробных тел посредством струйной санации, а на втором - согласно отработанным методикам наносится ОТП.

Список опубликованных работ

1. Глухов A.A. Морфологические изменения в костной ткани при хроническом остеомиелите на фоне применения тромбоцитарного концентрата / А.А.Глухов, Н.Т.Алексеева, Е.В.Микулич // Успехи современного естествознания. - 2011. - № 12 -С. 36-38.

2. Глухов A.A. Оценка морфологической реакции костной ткани при лечении экспериментального хронического остеомиелита обогащенной тромбоцитами плазмы / А.А.Глухов, Е.В.Микулич, А.П.Остроушко // Материалы XII

международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва, 2011. -С. 483.

3. Микулич Е.В. К вопросу о пломбировке костных полостей в комплексном лечении хронического остеомиелита / Е.В.Микулич // Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий (материалы П Международной научно-практической конференции). - Екатеринбург, 2011. - С. 92-93.

4. Микулич Е.В. Пластика костных полостей в лечении хронического остеомиелита (обзор литературы) / Е.В.Микулич // Современные тенденции в науке: новый взгляд (часть 9). - Тамбов, 2011. - С. 94 - 97.

5. Глухов A.A. Экспериментальное обоснование применения струйной санации и тромбоцитариого концентрата в лечении хронического остеомиелита длинных трубчатых костей / А.А.Глухов, Н.Т.Алексеева, Е.В.Микулич // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2012. - T.V, № 1. - С. 131 -136.

6. Микулич Е.В. Клинико-морфологические изменения при хроническом остеомиелите на фоне применения обогащенной тромбоцитами плазмы / Е.В.Микулич, Н.А.Малкина, И.А.Луев // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых-медиков. - Казань, 2012. - С.91-93.

7. Глухов A.A. Изучение регенерации костной ткани на фоне применения тромбоцитарного концентрата при лечении хронического остеомиелита в эксперименте / А.А.Глухов, Н.Т.Алексеева, Е.В.Микулич // Международный журнал экспериментального образования. - 2012. - №7. - С. 115-117.

8. Глухов A.A. Оценка эффективности применения струйной санации и обогащенной тромбоцитами плазмы в лечении хронического экспериментального остеомиелита / А.А.Глухов, Н.Т.Алексеева, Е.В.Микулич // Перспективы науки. - 2012. - № 5 (32). - С. 368 - 371.

9. Глухов A.A. Клинико-лабораторное обоснование применения струйной санации и обогащенной тромбоцитами плазмы в лечении хронического экспериментального остеомиелита / А.А.Глухов, Е.В.Микулич, А.П.Остроушко // Международный журнал экспериментального образования. - 2012. - №7. - С. 45-47.

10. Микулич Е.В. Технология лечения хронического остеомиелита / Е.В.Микулич // Сборник докладов «Инновационные разработки молодых ученых Воронежской области на службу региона». - Воронеж, 2012. - С. 99 - 100.

11. Мнкулич E.B. Современные принципы лечения хронического остеомиелита / Е.В.Микулич // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. XIX, № 2. - С. 180 - 184.

12. Глухов A.A. Оценка показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при хроническом остеомиелите на фоне применения обогащенной тромбоцитами плазмы и струйной санации / А.А.Глухов, Е.В.Микулич // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012. -№ 12.-С. 68-69.

13. Микулич Е.В. Результаты применения обогащенной тромбоцитами плазмы и струйной санации в комплексном лечении хронического остеомиелита / Е.В. Микулич, А.П. Остроушко // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии», посвященной 80-летшо со дня рождения проф. В.И.Булынина. - Воронеж, 2012. - С. 55-57.

14. Оценка эффективности применения тромбоцитарного концентрата и струйной санации в лечении экспериментального хронического остеомиелита / Е.В. Микулич, A.A. Глухов, Н.Т. Алексеева, А.П. Остроушко // Материалы 1-го международного конгресса «Раны и раневые инфекции», посвященного 90-летию проф. Б.М. Костюченка. - Москва, 2012. - С.227-229.

Рационализаторские предложения

1. Удостоверение на рационализаторское предложение № 1302 от 30.01.2013 г. "Способ моделирования хронического остеомиелита" / Микулич Е.В., Глухов A.A., Остроушко А.П.

2. Удостоверение на рационализаторское предложение № 1303 от 30.01.2013 г. "Метод применения обогащенной тромбоцитами плазмы и струйной санации в комплексном лечении хронического остеомиелита"/ Микулич Е.В., Глухов A.A., Остроушко А.П.

Подписано в печать 06.02.2013. Формат 60 х 84 1/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 47.

Отпечатано в типографии ООО ИПЦ «Научная книга». 394030, г. Воронеж, Московский пр-т, д. 11Б.

тел. (473) 220-57-15, 238-02-38 http://www.n-kniga.ru. E-mail: zakaz@n-kniga.ru