Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетически обоснованный метод стимуляции регенерации печеночной ткани при ССl#34#1-гепатите на основе модуляции функций эндогенных стволовых клеток

На правах рукописи

□ОЗОВ82ЭВ

Сотникова Наталья Владимировна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ ОБОСНОВАННЫЙ МЕТОД СТИМУЛЯЦИИ ГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ СС14 ^ ГЕПАТИТЕ НА ОСНОВЕ МОДУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ЭНДОГЕННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2007

003068298

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Гольдберг Евгений Данилович

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Шерстобоев Евгений Юрьевич кандидат медицинских наук Чернова Евгения Николаевна

Ведущая организация ГУ Научно-исследовательский институт физиологии СО РАМН

Защита состоится « »__2007 г. в_ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан « Ю »бЬИ^Осб.^ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость патологии печени различной этиологии определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний [Подымова С.Д., 1998; Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 2000].

Так, хорошо известно, что хронический гепатит различной этиологии может длиться многие годы, при этом его часто диагностируют на поздних стадиях развития болезни, когда резко возрастает вероятность развития цирроза печени и хронической печеночной недостаточности [Хазанов А.И., 2002]. В связи с вышесказанным, разработка методов, способных эффективно стимулировать регенерацию печени, остается весьма актуальной.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития нового направления в медицине - клеточной терапии [Сухих Г.Т., Малайцев В.В. и др., 2002; Owen M., Friedenstein A.J., 1988; In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. et al., 2003]. Клеточная терапия представляет собой совокупность методических подходов, направленных на стимуляцию восстановления функционально активной здоровой ткани на месте повреждения, преимущественно, за счет активации и использования регенераторного потенциала различных типов стволовых клеток организма.

К настоящему времени получены данные о наличии во многих тканях организма мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [Сухих Г.Т., Малайцев В.В. и др., 2002; Orlic D., Kajstura J.,Chimenti S. et al., 2001; In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. et al., 2003].

В недавних исследованиях была доказана способность стволовых клеток костного мозга мигрировать в область поврежденной печени [Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R. et al., 2000; Theise N.D., Nimmakayalu M., Gardner R. et al., 2000; Körbling M., Katz R.L., Khanna A. et al, 2002].

Поскольку в литературе описаны положительные результаты при трансплантации собственных стволовых клеток костного мозга больным с цир'розом печени, можно предположить, что мезенхимальные стволовые клегки в определенных условиях способны дифференцироваться в печеночные клетки [Miyazaki M., Akiyama I., Sakaguchi M. et al., 2002; Newsome P. N„ 2003; Ishikawa F., 2003; Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R., Watanabe M. et al., 2003; Hong S.H., Gang E.J., Jeong J.A. et al., 2005]. Одним из наиболее перспективных направлений развития метода клеточной терапии представляется мобилизация эндогенных стволовых клеток и их последующий хоминг в пораженные ткани с помощью фармакологических агентов. По данным литературы, наиболее мощным стимулятором мобилизации регенераторно-компетентных клеток считается гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) [Козлов В.А.,

Сенников C.B., 2004; Theocharis S.E., Margeli A.P., Kittas C.N., 1999; Di Campli C., Piscaglia A.C., Pierelli L. et al., 2004; Yannaki E., Athanasiou E., Xagorari A. et al., 2005].

В то же время известно, что сверхмалые дозы антител к эндогенным регуляторам физиологических функций способны оказывать эффект, аналогичный тому, который осуществляют данные биологически активные вещества in vivo [Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай A.M. и др., 2005].

С указанных позиций несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение возможности модуляции функций различных классов эндогенных стволовых клеток с помощью препаратов на основе Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ). Полученные в этом направлении данные позволили бы разработать принципиально новый патогенетически обоснованный способ стимуляции процессов регенерации в печени, в частности, при хронических гепатитах.

Цель исследования. Изучить состояние различных пулов стволовых клеток на модели СС14-гепатита. Разработать патогенетически обоснованный способ терапии хронического гепатита на основе модуляции функций стволовых клеток препаратами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние костномозгового и циркулирующего пулов мезенхимальных клеток-предшественников разной степени зрелости, а также регионарных стволовых клеток печени при экспериментальном хроническом гепатите.

2. Исследовать гепатопротекторную активность препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на модели хронического гепатита.

3. Исследовать гепатопротекторную активность препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору на модели хронического гепатита.

4. Изучить механизмы гепатопротекторного действия препаратов сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Научная новизна. В работе впервые всесторонне изучено состояние различных пулов мезенхимальных клеток-предшественников в костном мозге и периферической крови, а также динамика содержания регионарных клеток-предшественников в печени при экспериментальном хроническом гепатите. Выявлено участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в процессах регенерации печени при ее хроническом поражении. Полученные результаты свидетельствуют о недостаточности либо несостоятельности указанных механизмов для восстановления печеночной ткани.

В эксперименте на модели СС14-гепатита изучены гепатопротекторные свойства препаратов Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ. Показана

высокая противосклеротическая эффективность данных средств, а также противовоспалительная активность препарата анти-Г-КСФ. Установлено, что гепатопротекторное действие обоих препаратов связано со стимуляцией, мобилизацией, миграцией и детерминированным хомингом в пораженную печень мезенхимальных стволовых клеток.

Практическая значимость. Выполненные исследования позволили разработать патогенетически обоснованные методы терапии хронического гепатита и восстановления функционально активной ткани печени, основанные на модуляции функций эндогенных пулов стволовых клеток гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и препаратом сверхмалых доз антител к Г-КСФ. По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности указанных препаратов для получения разрешения на клинические исследования. Получен патент (1Ш) №2295971 от 27 марта 2007 г. «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на конференции «Фармакологическая регуляция стволовой клетки» (Томск, 2005), на ежегодной Всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006) и на пленуме патофизиологов Сибири, приуроченном к 50-летию кафедры патофизиологии Алтайского государственного медицинского института (Барнаул, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 - в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 15 таблицами. Бибагиографический указатель включает 146 источников, в том числе 54 отечественных и 92 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 100 беспородных крысах и 540 мышах линии СВА/СаЬас обоего пола в возрасте 2-х месяцев. Мыши 1 категории, конвенциональные линейные мыши, получены из питомника ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Перед началом эксперимента и в период исследования животные находились в виварии при температуре воздуха 20-22°С на обычном пищевом рационе, в пластиковых клетках (по 10-15 особей). Для исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

В качестве экспериментальной модели патологии печени был выбран хронический СС14-гепатит. У крыс гепатит вызывали внутрижелудочным введением 50% раствора ССЦ на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали

внутрижелудочным введением СС14 в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 10 мл/кг по той же схеме. Исследуемыми препаратами являлись: сверхмалые дозы потенцированных антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (анти-Г-КСФ) в разведении С12+С30+С200 («Материа Медика Холдинг», г. Москва, совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) и препарат рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) «Нейтростим» («ГНЦ Вектор», г. Новосибирск, совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН). Препарат анти-Г-КСФ вводили крысам по 1 мл, мышам - по 0,3 мл per os (1 раз в день), начиная с 1-го введения ССЦ, в течение 40 дней. Контрольным животным (контрольная группа №1) по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду. Препарат Г-КСФ вводили 5 раз подкожно крысам в дозе 100 мкг/кг в объеме 0,5 мл физиологического раствора, мышам - в дозе 125 мкг/кг в объеме 0,2 мл физиологического раствора, 1 раз в день, начиная с 19-го дня эксперимента -следующего после последнего введения CCL». Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор (контрольная группа №2). Поскольку статистически значимых различий между контрольными группами 1 и 2 не было зарегистрировано, эти данные были объединены в одну группу - общий усредненный контроль.

Биохимические исследования сыворотки крови проводили на предмет содержания в ней аспартат-, аланин-аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 7, 14, 21, 28 и 40-е сут. Активность данных ферментов определяли по общепринятым методикам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Согшау и стандартные наборы фирм Согшау и «Витал Диагностик» (г.Санкт-Петербург).

Для морфологического исследования выделяли печень животных (также проводилось вычисление весового индекса печени - отношение массы печени в миллиграммах к массе животного в граммах). На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Г.Г.Автандилова [Автандилов Г.Г., 1990].

Площадь соединительной ткани определяли на препаратах, окрашенных пикрофуксином [Меркулов Г.А., 1969], с помощью средств компьютерной обработки графических данных.

Изучение показателей периферической крови и костного мозга осуществляли стандартными гематологическими методами [Кост Е.А., 1975; Меньшиков В.В., 1987; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Выделение фракции мононуклеаров из периферической крови мышей проводили в градиенте плотности с помощью Histopaque - 1077.

Структурно-функциональную организацию костного мозга опытных и контрольных животных изучали, определяя количественный и качественный состав гемопоэтических островков по модифицированной методике Crocker, Gordon [Crocker P.R., Gordon S., 1985].

Определение способности адгезирующих клеток костного мозга к связыванию стромальных предшественников (КОЕ-Ф) проводили путем инкубации клеткок прилипающей фракции костного мозга с клеточной взвесью от интактной мыши. Подсчитывали число колоний, образованных несвязавшимися клетками после совместного культивирования, и содержание КОЕ-Ф в исходной клеточной взвеси, полученной из костного мезга интактной мыши. По разности двух указанных показателей судили о способности адгезирующей фракции костного мозга опытных мышей к связыванию интактных КОЕ-Ф.

Для культивирования КОЕ-Ф конечную концентрацию клеточных элементов доводили до 5,0х105/мл полувязкой питательной средой Dulbecco's modified Eagle's medium и инкубировали в течение 7 сут в С02-иккубаторе. После инкубации под инвертированным микроскопом подсчитывали число колоний. Под колониями фибробластов подразумевали клеточные агрегаты, содержащие более 50 клеток.

Количество мезенхимальных столовых клеток в костном мозге определяли с помощью метода лимитирующих разведений [In't Anker P.C., Noort W.A., Scherjon S.A. et al., 2003]. Клеточный материал помещали в среду DMEM и доводили до различной концентрации в 8-ми вариантах, от максимальной 750 тыс. клеток/мл до минимальной 6 тыс. клеток/мл. После этого разведения клеточного материала инкубировали в течение 4 недель в С02-инкубаторе со сменой среды 2 раза в неделю. После инкубации подсчитывали количество фибробластоподобных клеток в каждой лунке. При этом если в лунке их число было >10 штук, то лунка оценивалась как «положительная», если же содержание фибробластов было менее 10 штук, то лунка считалась «отрицательной». Таким образом, получались ряды знаков, отражающие наличие или отсутствие родоначальник клеток в различных разведениях клеточного материала. Частоту встречаемости мезенхимальных стволовых клеток определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивали посредством линейной log-log регрессии. [Bonnefoix Т. et al., 2001; t'Anker P.S. et al., 2003] Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, углового преобразования Фишера, программы Statistica 6.0.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Токсическое действие тетрахлорметана, используемого в качестве повреждающего фактора для создания экспериментальной модели, приводило к закономерной гибели части животных, начавшейся во всех группах после третьего введения ССЬ4. Во всех случаях причиной смерти животных стала острая дистрофия печени, что было подтверждено при вс крытии. Однако если в контрольной группе к концу эксперимента погибло 20% крыс, то в группе животных, получавших препараты Г-КСФ и анти-Г-

КСФ, лишь 17% и 13% соответственно, что, по-видимому, связано с гепатопротекторным эффектом препаратов.

Указанные результаты согласуются с данными недавних исследований, в которых на модели токсического цирроза печени у мышей (поражение четыреххлористым углеродом) после мобилизации стволовых клеток костного мозга получили значительное увеличение выживаемости по сравнению с контролем [УаппаИ Е., АШапаБюи Е., Xagorari А. е1 а1., 2005].

Процент прироста массы тела животных и весовой индекс печени служат показателями интегрального действия токсического агента на организм, принятыми в экспериментальной токсикологии.

Процент прироста массы тела крыс был достоверно ниже по сравнению с фоном в контрольной группе и у животных, получавших анти-Г-КСФ (7, 14, 21, 28 и 40-е сут опыта). Однако у крыс, которым вводили анти-Г-КСФ, процент прироста массы тела превышал соответствующие значения в контрольной группе (7 и 14 сут). У животных, которых лечили Г-КСФ, процент прироста массы тела не отличался от значений, полученных у здоровых животных.

Весовой индекс печени крыс во всех группах также снижался по отношению к значению, полученному в фоновой группе к 40 сут эксперимента.

Поскольку данный параметр вычисляют с целью оценить не только общее состояние животных, но и действие яда на организм животного в целом, можно сделать предварительный вывод о том, что оба препарата снижали токсическое действие ССЬ4.

Биохимические исследования сыворотки крови экспериментальных животных показали повышение активности АлАТ (табл. 1) по отношению к фону во всех группах животных на 7 и 14-е сут опыта, а также на 21-е сут у контрольных животных и у крыс, получавших Г-КСФ. На 28-е сут опыта во всех группах активность АлАТ резко снижалась по сравнению с активностью данного фермента у здоровых животных, в то время как к 40-м сут опыта во всех случаях наблюдался подъем величины данного показателя до фоновых значений. В то же время, при назначении анти-Г-КСФ активность аланинаминотрансферазы в сыворотке крови на 14, 21-е и 28-е сут опыта была достоверно ниже, чем в группе крыс, которым вводили дистиллированную воду. В случае применения Г-КСФ снижение активности фермента по отношению к контролю наблюдалось лишь на 21 и 40 сут эксперимента.

Активность АсАТ во всех группах также была достоверно выше по сравнению с фоном (табл. 1) на 7, 14-е сут опыта, причем активность фермента у животных, которые получали препараты, была заметно ниже, чем в контроле. В дальнейшем у животных, которым вводили анти-Г-КСФ, уже с 21-х сут эксперимента имело место снижение энзиматической активности. В то же время, в остальных двух группах, в том числе, и контрольной, указанные изменения возникали лишь к 28-м суткам наблюдения, на 40 сут опыта активность АсАТ во всех группах животных не отличалась от фона.

Таблица 1.

Биохимические показатели крови крыс после введения препаратов на фоне моделирования СС14 гепатита, Х+ш_

Пока Сроки Группы

зател и исследо вания контроль анти-Г-КСФ Г-КСФ

фон 0,72±0,05 0,72±0,05 0,72±0,05

7 сутки 2,78±0,09* 2,67±0,07* -

СО ы а 14 сутки 2,8±0,07* 2,51±0,03*# -

2 Н С е? < 21 сутки 1,22±0,07* 0,86±0,03# 1,00±0,04*#

28 сутки 0,45±0,02* 0,37±0,01*# 0,48±0,02*

40 сутки 0,72±0,02 0,74±0,03 0,62±0,01#

фон 0,76±0,06 0,76±0,0б 0,76±0,06

7 сутки 3,10±0,35* 2,30±0,03*# -

5 X а 14 сутки 2,43±0,09* 1,91±0,06*# -

Н 21 сутки 0,71±0,08 0,54±0,02* 0,60±0,04

< о С 28 сутки 0,40±0,01* 0,33±0,01*# 0,43±0,04*

40 сутки 0,71±0,03 0,70±0,01 0,61±0,02#

фон 447,15±42,35 447,15±42,35 447,15±42,35

7 сутки 947,4±97,7* 707,0±39,2*# -

ш 14 сутки 1283,1±172,6* 702,9±33,0*# -

е гГ 21 сутки 1262,4±137,3* 842,4±39,3*# 1249,1±95,69*

28 сутки 407,7±8,45 392,9±18,2 293,8±15,5*#

40 сутки 554,2±65,3 596,1±44,2 465,0±28,1

Примечание: здесь и далее в таблицах и рисунках указаны сроки от начала эксперимента (первое введение СС14) на крысах и после последнего введения СС14 на мышах.

Исследование активности ЩФ выявило во многом схожую динамику у животных различных групп. Во всех случаях отмечалось возрастание показателя (табл. 1) на 7, 14, 21-е сут опыта, сменяющееся к 28-м сут снижением активности фермента у крыс, получавших Г-КСФ, и нормализацией данного параметра во всех остальных группах. При этом концентрация ЩФ в сыворотке крови у крыс, получавших препарат антител

к Г-КСФ, на 7, 14, 21-е сут эксперимента была существенно ниже соответствующих контрольных значений. К концу эксперимента во всех группах животных активность ЩФ не отличалась от фонового значения.

Таким образом, наблюдалось значительное снижение энзиматической активности сыворотки крови по отношению к контролю при курсовом введении Г-КСФ на фоне моделирования СС14-гепатита (АлАТ - на 40-е сут; АсАт - на 40-е сут и ЩФ - на 28-е сут опыта) и практически во все сроки исследования - при введении препарата сверхмалых доз антител к Г-КСФ (АлАТ - на 14,21, 28-е сут; АсАт - на 7, 14, 21, 28-е сут и ЩФ - на 7, 14,21-е сут опыта), что свидетельствует о наличии у данных веществ гепатопротекторного эффекта.

При морфологическом исследовании гистологических препаратов печени крыс, окрашенных гематоксилином и эозином, на 21-е сут опыта во всех группах были обнаружены жировая дистрофия, некроз гепатоцитов и развитие клеточной инфильтрации печеночной паренхимы (преимущественно макрофагами и лимфоцитами) разной степени выраженности.

В контрольной группе отмечалось выраженное нарушение долькового строения печени. На препаратах были видны поля грануляционной ткани, замещающей погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков. В большом количестве встречались тельца Каунсильмена, а в сохранившихся гепатоцитах -выраженная крупнокапельная жировая дистрофия, при этом, отдельные клетки сливались, образуя жировые кисты. Вместе с тем, имела место значительная регенерационная гипертрофия

печеночных клеток и обилие митозов гепатоцитов. Инфильтрация носила диффузный характер. В макрофагах можно было видеть зеленовато-желтые включения - желчные пигменты.

В то же время, при введении анти-Г-КСФ на фоне моделировании ССЦ-гепатита дольковое строение печени не нарушалось на 21 сут опыта, при этом выраженность признаков дистрофии гепатоцитов также заметно снижалась. Так, тельца Каунсильмена при этом встречались лишь в единичных случаях, а жировая дистрофия гепатоцитов была преимущественно мелкокапельная. Имела место регенерационная гипертрофия гепатоцитов. Вместе с тем, встречались макрофаги, содержащие желчные пигменты и отмечалась инфильтрация портальных трактов, хотя и менее значительная в сравнении с контрольной группой животных, но все же существенная, однако инфильтрат, как правило, не проникал внутрь долек. В целом, относительная площадь инфильтрации была достоверно ниже, чем в контрольной группе, что дает возможность говорить о противовоспалительном эффекте препарата анти-Г-КСФ (рис. 1) . У животных, которым вводили Г-КСФ, морфологические изменения в печени на 21 сут опыта не оценивались, поскольку к этому сроку крысам ввели Г-КСФ только 2 раза.

На 40-е сут эксперимента морфологические признаки гепатита в

печени крыс как контрольной, так и получавшей анги-Г-КСФ групп были выражены в Меньшей степени, чем на 21-е сут. Жировая дистрофия гепатоцитов сохранялась, но становилась мелкокапельной. Относительная площадь инфильтрации печеночной паренхимы (и, следовательно, воспалительный процесс) в данных группах уменьшалась. Однако у животных, которых лечили анти-Г-КСФ, инфильтрация оказалась значительно менее выраженной относительно контроля.

Морфологические изменения в печени крыс, получавших препарат Г-КСФ, на 40 сут эксперимента также были менее выражены по сравнению с таковыми в контрольной группе, при этом жировая дистрофия гепашцитов сохранялась, но становилась мелкокансльной, Признаки регенерационной гипертрофии печени оказались менее выраженными (поля грануляционной ткани и митозы гепатоцитов не выявлялись, а количество гипертрофированных гепатоцитов заметно снижалось). В то же время, относительная площадь инфильтрации печеночной паренхимы при этом не отличалась от таковой в контрольной группе.

зо -

фон 21 сутки 40 сушки

Рисунок I. Изменение относительной площади инфильтрата в печени крыс а контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования СС14-гепатита. По оси аб;цисс-сроки исследования (сут); по оси ординат - значения показателя в % от общей площади. # - отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

Моделирование хронического поражения печени закономерно приводит к развитию склеротических процессов в печеночной ткани. Понуждение гепатоцитов сопровождается возрастанием функциональной активности непаренхиматозиых клеток печени, которые согласно современным данным [Fausto N,, 2000; Kaplowitz M.D., 2002], вносят основной вклад в развитие острого поражения и последующую регенерацию

.1 _1 __ I _

органа. Если развитие воспалительного процесса становится неуправляемым, что наблюдается при длительном воздействий побеждающего фактора, перисинусои дальние звездчатые клетки трансформируются в фибробласты и миофибробласты и начинают вырабатывать коллаген, становящийся первичной молекулярной основой развития соединительной ткани и фиброза |Калинин A.B., 2005].

Согласно данным нашего исследования, препарат анти-Г-КСФ обладал выраженным антисклеротическим эффектом. Так, на фоне его введения имело место снижение количества соединительной ткани в печени животные в 3 раза по сравнению с контролем. Относительная площадь соединительной ткани н печени животных, которым вводили Г-КСФ, также оказалась значительно ниже описанной в контроле и не отличалась от таковой при применении антител к Г-КСФ, что свидетельствует о наличии у обоих изученных препаратов антисклеротического действия. Сокращение почти в 2 раза относительной площади соединительной ткани в контрольной группе по сравнению с предыдущим сроком исследования, вероятно, было связано с

созреванием грануляционной ткани (рис. 2).

%

11 ю

t

Рисунок 2. Изменение относительной площади соединительной ткани в печени крыс в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования ССЬ гепатита. По оси абсцисс-сроки исследования (сут); по оси ордина!' - значения показателя в % от общей площади, # - отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о наличии у препаратов Г-КСФ и анти-Г-КСО гепатопротекторной активности.

С целью определения возможных механизмов гепатопрогекторного действия препаратов проведены эксперименты на мышах, в которых на изучено состояния пулов костномозговых, циркулирующих и регионарных стволовых клеток.

Отражением функционального состояния стволовых клеток костного мозга в какой-то мере служат изменения клеточности периферической крови. При этом самыми ранними чаще всего являются сдвиги количественного и качественного состава лейкоцитов, представляющих собой наиболее мобильные клеточные элементы системы крови [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999]. Проведенные эксперименты показали, что курсовое введение CCL4 на протяжении практически всего периода наблюдения сопровождалось достоверным снижением общего количества лейкоцитов за счет уменьшения числа палочкоядерных и сегментоядерных форм нейтрофилов в периферической крови. Содержание моноцитов при этом также снижалось (3, 7, 10 сут опыта), а количество лимфоцитов, напротив, возрастало. Введение препарата сверхмалых доз антител к Г-КСФ на фоне моделирования гепатита приводило к еще более выраженному падению общего числа лейкоцитов, при этом, в периферической крови уменьшалось как содержание полиморфноядерных клеток (на протяжении практически всего эксперимента), так и количество мононуклеаров: моноцитов (во все сроки опыта) и лимфоцитов - на 14-е сут наблюдения. При введении мышам Г-КСФ динамика содержания отдельных форм лейкоцитов напоминала таковую в контроле. Снижение OKJ1 в данном случае было более выраженым, чем в остальных группах, при этом содержание различных форм нейтрофилов, как и количество моноцитов, снижалось на протяжении практически всего эксперимента. Число же лимфоцитов в периферической крови, напротив, увеличивалось в ранние сроки опыта (3 и 7 сут).

Описанная динамика содержания различных форм лейкоцитов, как в контрольной группе, так и у мышей, которым вводили исследуемые препараты, вероятно, была обусловлена токсическим влиянием самого CCL4 на кроветворную ткань и активизацией (особенно выраженной при применении препаратов) перераспределительных реакций в системе крови, касающихся, в первую очередь, процессов миграции мононуклеаров (фракции клеточных элементов, в состав которой входят стволовые клетки) [Pittenger M.F., Mackay А М., Beck S.C., 1999].

При изучении состояния различных пулов CK у животных контрольной группы было обнаружено увеличение количества в костномозговой ткани КОЕ-Ф на 7, 10-е сут исследования (рис. 3), в состав которых, как известно, входят как как предшественники стромальных элементов, так и истинные CK [Owen М., Friedenstein A.J., 1988], что подтверждалось возрастанием и числа мезенхимальных стволовых клеток (рис. 4) (МСК) в гемопоэтической ткани в те же сроки наблюдения (до 279,1% и 291,7% от фона на 7, 10-е суткисоответственно) (табл. 10, 12). Указанные изменения состояния пула CK, очевидно, являлись неспецифическими и были связаны с активацией стресс-реализующих систем при формировании патологии печени с помощью токсического агента. Кроме того, отмечалось увеличение содержания клеток-предшественников фибробластов в периферической крови на 7, 10, 14-е сут (рис. 5), и возрастание числа МСК на 3-е сут,

И фон

Рисунок 3. Динамика содержания КОЕ-О в костном мозге мышей линии СВА/СаЬа£ в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования ССЬ, гепатита. По оси абсциес-сроки исследования (сут); по оси ординат -значения показателя на 250 тыс. мислокариоцитов, # - отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

130

тео

МО 120 | 100 ■ яо 60 40 20 0 -Н

□

фон

□ фон Е Контроль О анти-Г-КСФ О Г-КСФ

3 сутки 7 сутки 10 сутки 14 сутки

Рисунок 4. Динамика содержания мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге мышей линии С В А/С аЬ ас в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования ССЦ гепатита. По оси абсцисс-сроки исследования (сут); по оси ординат - значения показателя на I О6 миелокариоцитов. # -отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

Рисунок 5. Динамика содержания КОЕ-Ф в периферической крови мышей линии CBA/CaLac в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (антиТ-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования ССЬ гепатита. По оси абсцисс-сроки исследования (сут); по оси ординат -значения показателя на 250 тыс. м и ел о ка р но ц ито в. # - отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

свидетельствующее о мобилизации стволовых клеток различной степени зрелости при данном виде патологии, представляющем, по своей сути, экстремальное воздействие. Причем их выход в кровь наблюдался, несмотря на усиление способности клеточных компонентов микроокружения костного мозга связывать С К (рис. 6), что позволяет говорить об участии иных механизмов мобилизации мезенхимальных прекурсоров в условиях интоксикации ССЦ. В костном мозге имело место увеличение количества как макрофаглозитивных (7, 10 сут), так и макрофагнегативных (7 сут) гемопоэтических островков. Вместе с тем, исследование динамики содержания регионарных клеток-предшественников в печени выявило снижение числа КОЕ-Печ, достигающее статистической значимости на 10-е сут опыта, сменяющееся достоверным возрастанием их количества лишь к концу эксперимента (14-е сут), когда токсические эффекты яда, очевидно, были уже устранены (рис. 7). В целом, полученные результаты свидетельствуют об активации «глубокого резерва» механизмов компенсации - костномозговых стволовых клеток - при хронической интоксикации ССЦ, которые в данном случае оказываются недостаточными и/или несостоятельными для репарации печеночной ткани. Исследование возможности стимуляции данных компенсаторно-приспособительных механизмов при патологии печени с помощью введения сверх малых доз антител к Г-КСФ показало, что изученный препарат приводил к накоплению в костном мозге большего по сравнению с контролем количества комм итир о ванных и истинных (мезенхимальных) СК на 3, 7-е сут

наблюдения, с дальнейшим более выраженным, чем в контроле, выходом в периферическую кровь МСК (до 203,2%от фона 3-есут) и КОЕ-Ф (14-е сут).

Рисунок 6. Способность клеток прилипающей фракции костного мозга мышей линии СВЛ/СаЬас к связыванию интактных КОЕ-Ф в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г -КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования СС)а гепатита. По оси абсцисс-сроки исследования (сут); по оси ординат - значения показателя в условных единицах. # - отмечена достоверность различий (р<0,05) от контрольных Значений. Доверительные интервалы при р=0,05

Так же, как и у нелеченых животных, данные изменения не зависели от связывающей способности стромальных элементов костного мозга и его структурно-функциональной организации.

Тем не менее, указанные сдвиги в состоянии пулов стволовых клеток костного мозга и периферической крови, свидетельствующие о мобилизации и миграции МСК, сопровождались их хомингом в печеночную ткань, о чем мы судим по выраженному увеличению количества клеток-предшественников в печени на 10-е и ?4-е сут опыта (до 228,9% я ¡31,4% соответственно относительно животных, получавших растворитель). Указанные изменения в конечном счете и приводили, по всей видимости, к усилению регенераторных процессов, что лежало в основе выявленного в экспериментах на крысах выраженного гепатопротекторного эффекта данного препарата.

фон 3 сутки 7 сутки 10 сутки 14 сутки

Рисунок 7. Динамика содержания печеночных клеток* предшественников в печени (КОЕ-Печ) мышей линии СВА/СаЬас в контроле и при курсовом введении препаратов антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ) и Г-КСФ (Г-КСФ) на фоне моделирования ССЦ-гепатита. По оси абсцисс-сроки исследования (сут); по оси ординат - значения показателя на Ю5 нуклеаров. # - отмечена достоверность отличий (р<0,05) от контрольных значений. Доверительные интервалы при р=0,05

Препарат Г-КСФ оказывал во многом схожее, однако не столь выраженное, как анти-Г-КСФ, влияние на динамику содержания мезенхимальных предшественников в костном мозге. При его назначении отмечалось увеличение числа КОЕ-Ф в костном мозге на 7 сут (рис. 3) эксперимента относительно контрольных значений. В то же время, возрастание количества длительно репопулирующйх клеток (МСК) по отношению как к фону, так и к контролю наблюдалось во все сроки эксперимента (рис.4). Однако содержание МСК в периферической крови, напротив, оказалось снижено на 3-й сут опыта по сравнению с контрольной ГРУППОЙ, что, тем не менее, не было связано с возрастанием связывающей способности стромальных клеток костного мозга (рис. 6) и возможно зависело от режима введения препарата.

В периферической крови животных количество КОЕ-Ф с начала наблюдений превысило контрольные значения (3 сут опыта), а затем, напротив, снизилось (10 сут) (рис. 5), Данные изменения не зависели от состояния структурно-функциональной организации костного мозга. Вместе с тем, в этой группе животных в печеночной ткани отмечалось повышение количества регионарных клеток-предшественников на 3 и 14 сут по сравнению со здоровыми животными и на 10 сут - по сравнению с контрольной группой (рис. 7). Итак, препарат Г-КСФ вызывал мобилизацию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, миграцию их. в периферическую кровь и хоминг в печень, что и являлось основой развития в ней процессов регенерации.

В целом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что оба препарата оказывали стимулирующее влияние на стволовые клетки костного мозга. При этом анти-Г-КСФ вызывал более значительные, направленные на стимуляцию процессов восстановления поврежденной печени изменения функционального состояния мезенхимальных стволовых клеток.

Таким образом, оба изученных препарата на модели ССЦ-гепатита проявили выраженные гепатопротекторные свойства. При этом более эффективным, обладающим высокой противовоспалительной и антисклеротической активностью, явился препарат сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору, оказывающий свое гепатопротекторное действие за счет стимуляции, мобилизации, миграции и детерминированного хоминга в печень мезенхимальных стволовых клеток с их дальнейшей дифференцировкой в зрелые гепатоциты [Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R. et al., 2000; Theise N.D., Nimmakayalu M., Gardner R. et al., 2000]. В основе фармакологических эффектов анти-Г-КСФ, вероятно, лежит возрастание эндогенной продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай A.M. и др., 2005].

ВЫВОДЫ

1. В процессе развития ССЦ-гепатита у мышей линии CBA/CaLac наблюдается повышение функциональной активности эндогенных стволовых клеток, о чем свидетельствует увеличение содержания в костном мозге и периферической крови примитивных мезенхимальных стволовых клеток и более зрелых стромальных предшественников (КОЕ-Ф).

2. При ССЦ-гепатите у мышей происходит снижение количества регионарных клеток-предшественников в печени (КОЕ-Печ), что указывает на несостоятельность или недостаточность механизмов компенсации, связанных со стволовыми клетками, при данной патологии.

3. Гранул оцитарный колониестимулируюий фактор (Г-КСФ) обладает выраженным гепатопротекторным действием. Его введение приводит к нормализации активности цитолитических ферментов в периферической крови, а также к регрессии соединительной ткани в печени у крыс с хроническим ССЦ-гепатитом.

4. В основе регенерации печеночной ткани под действием Г-КСФ лежит стимуляция функциональной активности различных пулов стволовых клеток. При его введении мышам с хроническим ССЦ-гепатитом происходит увеличение содержания мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, колониеобразующих единиц фибробластов в периферической крови и регионарных клеток-предшественников в печени.

5. Препарат сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (анти-Г-КСФ) проявляет выраженное гепатопротекторное и противовоспалительное действие, о чем свидетельствует нормализация активности цитолитических ферментов в сыворотке крови и существенное снижение относительной площади

инфильтрата и соединительной ткани в печени крыс при хроническом ССЦ-гепатите.

6. Гепатопротекторные свойства препарата анти-Г-КСФ реализуются за счет стимуляции функциональной активности различных пулов стволовых клеток. Анти-Г-КСФ в условиях ССЦ-гепатита вызывает увеличение содержания мезенхимальных стволовых клеток и КОЕ-Ф в костном мозге и периферической крови, а также значительное повышение содержания регионарных клеток-предшественников в печени мышей.

7. Введение препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и сверхмалых доз антител к нему мышам с ССЦ-гепатитом не вызывает существенных изменений способности адгезирующих клеток костного мозга связывать стромальные предшественники, а также в структурно-функциональной организации костного мозга (гемопоэтические островки).

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Механизмы влияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на восстановление поврежденной ткани при хроническом поражении печени ССЦ // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2005. - №4,- С. 13-18 (соавт. Ставрова JI.A., Гурьянцева Л.А., Хричкова Т.Ю. и др.).

2. Механизмы влияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на восстановление поврежденной ткани при введении крысам с хроническим поражением печени ССЦ // Материалы конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии». -Томск, 2005.- С. 28.

3. Механизмы гепатопротекторного эффекта препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4,- С. 46-50 (соавт. Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н., Ставрова JI.A. и др.).

4. Создание экспериментальных моделей и изучение на их основе регенераторных возможностей стволовых клеток // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2007. - Приложение № 1. - С. 5-13. (соавт. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др.).

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АлАт - аланиниаминотрансфераза

Анти-Г-КСФ - препарат сверхмалых доз антител к гнанулоцитаному колониестимулирующему фактору

АсАт - аспартатаминотрансфераза

Г-КСФ - гранулоцитаный колониестимулирующий фактор

КОЕ-Печ - клетки-предшественники печени

КОЕ-Ф - фибробластные колониеобразуюшие единицы

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

ЩФ - щелочная фосфатаза

Отпечатано в ООО "Вайар" г Томск, Московский тракт, 2г Тел/факс 52-98-11 Тираж 100 Заказ N«194 от 7 апреля 2007г.

Актуальность проблемы. Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость патологии печени различной этиологии определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний [Подымова С.Д., 1998; Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 2000].

Так, хорошо известно, что хронический гепатит различной этиологии может длиться многие годы, при этом его часто диагностируют на поздних стадиях развития болезни, когда резко возрастает вероятность развития цирроза печени и хронической печеночной недостаточности [Хазанов А.И., 2002]. В связи с вышесказанным, разработка методов, способных эффективно стимулировать регенерацию печени, остается весьма актуальной.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития нового направления в медицине - клеточной терапии [Сухих Г.Т., Малайцев В.В. и др., 2002; Owen М., Friedenstein A.J., 1988; In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. et al., 2003]. Клеточная терапия представляет собой совокупность методических подходов, направленных на стимуляцию восстановления функционально активной здоровой ткани на месте повреждения, преимущественно, за счет активации и использования регенераторного потенциала различных типов стволовых клеток организма.

К настоящему времени получены данные о наличии во многих тканях организма мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [Сухих Г.Т., Малайцев В.В. и др., 2002; Orlic D., Kajstura J.,Chimenti S. et al., 2001; In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. et al., 2003].

В недавних исследованиях была доказана способность стволовых клеток костного мозга мигрировать в область поврежденной печени [Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R. et al., 2000; Theise N.D., Nimmakayalu M., Gardner R. et al., 2000; Körbling M., Katz R.L., Khanna A. et al., 2002].

Поскольку в литературе описаны положительные результаты при трансплантации собственных стволовых клеток костного мозга больным с циррозом печени, можно предположить, что мезенхимальные стволовые клетки в определенных условиях способны дифференцироваться в печеночные клетки [Miyazaki M., Akiyama I., Sakaguchi M. et al., 2002; Newsome P. N., 2003; Ishikawa F., 2003; Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R., Watanabe M. et al., 2003; Hong S.H., Gang E.J., Jeong J.A. et al., 2005]. Одним из наиболее перспективных направлений развития метода клеточной терапии представляется мобилизация эндогенных стволовых клеток и их последующий хоминг в пораженные ткани с помощью фармакологических агентов. По данным литературы, наиболее мощным стимулятором мобилизации регенераторно-компетентных клеток считается гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) [Козлов В.А., Сенников C.B., 2004; Theocharis S.E., Margeli А.Р., Kittas C.N., 1999; Di Campli С., Piscaglia A.C., Pierelli L. et al., 2004; Yannaki E., Athanasiou E., Xagorari A. et al., 2005].

В то же время известно, что сверхмалые дозы антител к эндогенным регуляторам физиологических функций способны оказывать эффект, аналогичный тому, который осуществляют данные биологически активные вещества in vivo [Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай A.M. и др., 2005].

С указанных позиций несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение возможности модуляции функций различных классов эндогенных стволовых клеток с помощью препаратов на основе Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ (анти-Г-КСФ). Полученные в этом направлении данные позволили бы разработать принципиально новый патогенетически обоснованный способ стимуляции процессов регенерации в печени, в частности, при хронических гепатитах.

Цель исследования. Изучить состояние различных пулов стволовых клеток на модели ССЦ-гепатита. Разработать патогенетически обоснованный способ терапии хронического гепатита на основе модуляции функций стволовых клеток препаратами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние костномозгового и циркулирующего пулов мезенхимальных клеток-предшественников разной степени зрелости, а также регионарных стволовых клеток печени при экспериментальном хроническом гепатите.

2. Исследовать гепатопротекторную активность препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на модели хронического гепатита.

3. Исследовать гепатопротекторную активность препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору на модели хронического гепатита.

4. Изучить механизмы гепатопротекторного действия препаратов сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Научная новизна. В работе впервые всесторонне изучено состояние различных пулов мезенхимальных клеток-предшественников в костном мозге и периферической крови, а также динамика содержания регионарных клеток-предшественников в печени при экспериментальном хроническом гепатите. Выявлено участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в процессах регенерации печени при ее хроническом поражении. Полученные результаты свидетельствуют о недостаточности либо несостоятельности указанных механизмов для восстановления печеночной ткани.

В эксперименте на модели СС14-гепатита изучены гепатопротекторные свойства препаратов Г-КСФ и сверхмалых доз антител к Г-КСФ. Показана высокая противосклеротическая эффективность данных средств, а также противовоспалительная активность препарата анти-Г-КСФ. Установлено, что гепатопротекторное действие обоих препаратов связано со стимуляцией, мобилизацией, миграцией и детерминированным хомингом в пораженную печень мезенхимальных стволовых клеток.

Практическая значимость. Выполненные исследования позволили разработать патогенетически обоснованные методы терапии хронического гепатита и восстановления функционально активной ткани печени, основанные на модуляции функций эндогенных пулов стволовых клеток гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и препаратом сверхмалых доз антител к Г-КСФ. По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности указанных препаратов для получения разрешения на клинические исследования. Получен патент (1Ш) №2295971 от 27 марта 2007 г. «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на конференции «Фармакологическая регуляция стволовой клетки» (Томск, 2005), на ежегодной Всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006) и на пленуме патофизиологов Сибири, приуроченном к 50-летию кафедры патофизиологии Алтайского государственного медицинского института (Барнаул, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 - в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 146 источников, в том числе 54 отечественных и 92 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. В процессе развития СС14-гепатита у мышей линии СВА/СаЬас наблюдается повышение функциональной активности эндогенных стволовых клеток, о чем свидетельствует увеличение содержания в костном мозге и периферической крови примитивных мезенхимальных стволовых клеток и более зрелых стромальных предшественников (КОЕ-Ф).

2. При СС14-гепатите у мышей происходит снижение количества регионарных клеток-предшественников в печени (КОЕ-Печ), что указывает на несостоятельность или недостаточность механизмов компенсации, связанных со стволовыми клетками, при данной патологии.

3. Гранулоцитарный колониестимулируюий фактор (Г-КСФ) обладает выраженным гепатопротекторным действием. Его введение приводит к нормализации активности цитолитических ферментов в периферической крови, а также к регрессии соединительной ткани в печени у крыс с хроническим СС14-гепатитом.

4. В основе регенерации печеночной ткани под действием Г-КСФ лежит стимуляция функциональной активности различных пулов стволовых клеток. При его введении мышам с хроническим СС14 гепатитом происходит увеличение содержания мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, колониеобразующих единиц фибробластов в периферической крови и регионарных клеток-предшественников в печени.

5. Препарат сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (анти-Г-КСФ) проявляет выраженное гепатопротекторное и противовоспалительное действие, о чем свидетельствует нормализация активности цитолитических ферментов в сыворотке крови и существенное снижение относительной площади инфильтрата и соединительной ткани в печени крыс при хроническом СС14-гепатите.

6. Гепатопротекторные свойства препарата анти-Г-КСФ реализуются за счет стимуляции функциональной активности различных пулов стволовых клеток. Анти-Г-КСФ в условиях ССЦ-гепатита вызывает увеличение содержания мезенхимальных стволовых клеток и КОЕ-Ф в костном мозге и периферической крови, а также значительное повышение содержания регионарных клеток-предшественников в печени мышей.

7. Введение препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и сверхмалых доз антител к нему мышам с СС14-гепатитом не вызывает существенных изменений способности адгезирующих клеток костного мозга связывать стромальные предшественники, а также в структурно-функциональной организации костного мозга (гемопоэтические островки).