Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Применение метода флуоресцирующих антител с эритроцитарным иммуносорбентом в клинических и эпидемиологических исследованиях при клещевом энцефалите

С"

э ¿л

V На правах рукописи

Душкин Евгений Аркадьевич

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ С ЭРИТРОЦИТАРНЫМ ИММУНОСОРБЕНТОМ В КЛИНИЧЕСКИХ И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ПРИ КЛЕЩЕВОМ ЭНЦЕФАЛИТЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь - 1998

Рчоон! выполнена 11а кафедре лшкрооио.н.ч ни в Пермский юцчдарс!-вениои медицинской академии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Р.З.Кузяев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук О.А.Тимашева. доктор медицинских наук, профессор В.ВЛОшков

Ведущая организация:

Уральская медицинская академия (г. Екатеринбург)

Защита диссертации состоится « » OlЫ^>^г^^uГ1998 г. на заседании диссертационного совета (К 200.46.01) Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (614081, г. Пермь, ул. Голева,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН.

13), /в№.О0.

Автореферат разослан <>.£ 9 » {1% 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что среди иейроинфекций наиболее значимое место но тяжести течения, инвалидизации и смертности занимает клещевой энцефалит (КЭ). Пермская область представляет собой крупнейший очаг этой инфекции, где заболеваемос ть, несмотря на систематическое проведение вакцинации, серопрофилактики и других противоэпидемических мероприятий, остается высокой, превышая в отдельные годы республиканский уровень в 4-7 раз.

Полиморфизм клинических симптомов клещевого энцефалита затрудняет его дифференциальную диагностику. Наиболее «рудны для клинического распознавания лихорадочные формы, которые составляют основное число случаев заболевания (А Н. Шаповал,1974). Эти особенности КЭ свидетельствуют о значимости лабораторной диагностики инфекции.

Серодиагностика является ретроспективным метолом и позволяет подтвердить диагноз не чаще чем в 40% случаев (A.B. Зотов, 1973; АН. Волкова, 1991; H.H. Воробьева, 1992). Ранний период заболевания, когда организм подвергается интенсивному антигенному воздействию возбудителя, исключен из серологического анализа. Наряду с тгим, серологическая диагностика затруднена целим рядом дополнительных факторов - естественной иммунизацией населения от 4.9 до 48,8% в различных климаго-географических подзонах области (Р.3. Кузяев, 1968), многолетней вакцинопрофилактикой и введением гамма-глобулина лицам, отмечавших присасывание вирофорных клещей.

Это обстоятельство требует внедрения в широкую практику лабора-торно-диагностических исследований новых методических приемов, ос-

исканных на обнаружении антигенов вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале.

Наиболее перспективным среди методов, позволяющих обнаруживать антиген вируса КЭ, является метод флуоресцирующих антител (МФА) с эритронитарным иммуиосорбситом (ЭИС). Этот метод успешно реализован при определении групповой зараженности клещей и выявлении вируса в крови экспериментально зараженных животных (Т.Г Пархоменко, Г. И. Стародубцева, Р.З. Кузяев. 1984).

Цель исследовании

Совершенствование лабораторной диагностики КЭ на основе применения МФА с ЭИС в клинико-лабораторных и эпидемиологических исследованиях.

Задачи исследования

1. Оценить результативность МФА с ЭИС при использовании в качестве индикаторной часта тест-системы новых флуоресцирующих конъюгатов: флуоресцирующих ГаЬ-фрагмеитов антител и флуоресцирующих моноклональных антител, а также при применении в опенке результатов метода, предложенного нами "индекса свечения"" (ИС).

2. Исследовать возможность применения МФА с ЭИС .для индикации антигена вируса в крови больных КЭ.

3. Изучить возможность использования метода для обнаружения антигена вируса КЭ в особях клещей, собранных в природе и снятых с людей после присасывания.

Научная новизна исследования 1. Показана принципиальная возможность индикации антигена вируса в крови больных КЭ и особях спонтанно зараженных клещей.

2. Предложен оригинальный способ количественной оценки содержания антигена вируса КЗ в исследуемом материале.

3. Впервые в качестве флуоресцирующего конъюгата применен принципиально новый иммуноглобулиновый реагент на основе меченых РаЬ-фрагментов антител, что позволило повысить чувствительность МФА с ЭИС, существенно ускорить и упростить метод.

Практическая значимость работы и внедрение

1. Показана возможность использования МФА с ЭИС с целью ранней экспресс-диагностики КЭ.

2. Предложенная модификация МФА с ЭИС »недрена в практику клиии-ко-лабораторной диагностики КЗ областного центра санэпиднадзора и городской инфекционной больнице №1.

3. Полученные материалы о возможности индикации антигена вируса в крови больных КЗ и особях спонтанно зараженных клещей используются при преподавании микробиологии в Пермской медицинской академии.

4. Получены удостоверения на рационализаторские предложения № 1981 от 14 апреля 1098 г. "Модифицированный метод постановки МФА с ЭИС при определении вирофорносги клещей'" и № 19X0 '' Методика количественного определения вирусного антигена » организме клетей-переносчиков" от 1998 г.

5."Индикация антигена вируса в особях спонтанно зараженных клетей н крови больных клетевым энцефалитом методом флуоресцирующих антител с применением эритроцитарного иммуносорбента".

6. Практическое внедрение полученных результатов.

Принцип ранней экспресс-диагностики КО внедрен в работу центра Госсанэпиднадзора (ГСЭН) г.Перми, вирусологической лаборатории Пермского областного центра ГСЭН

Результаты исследований включены в методические рекомендации "Клещевой энцефалит у де гей "(Диагностика, лечение и профилактика Пермь,] 9%).

Результаты диссертационной работы используются в преподавании микробиологии, эпидемиологии и детских инфекционных болезней студентам Пермской государственной медицинской академии, врачам на курсах повышения квалификации в процессе чтения лекций и проведения практических занятий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показана высокая чувствительность и специфичность метода флуоресцирующих антител с применением эритроцитарного иммуносор-бента в эпидемиологических и клинико-лабораторных исследованиях при КЭ.

2. Использование ИС в опенке результатов МФА с ЭИС существенно превышает эффективность метода.

3. Применение в качестве флуоресцирующего конмогата меченых ГаЬ-фрагментов антител повышает чувствительность метода.

4. Результаты проведенных исследований позволяют рассматривать МФА с ЭИС как метод ранней эксяресс-ди агностики клещевого энцефалита.

Апробация работы

Работа выполнена на кафедре микробиологии 1 Н МЛ и вирусологической лаборатории Пермского областного центра ГСЭ11 и является частью комплексной темы по изучению Ю на Западном Урале (№ госрегистрации темы 01970002265).

Основные положения диссертации доложены:

- на VII и IX иммунологической конференции Пермского государственного медицинского института Í Пермь, 1988,1994),

- на юбилейной научной сессии (с>0 лет) Пермского ордена трудового красного знамени научно-исследовательского института вакцин и сывороток НПО "Биомед^ (Пермь. 1988).

- на пленарных заседаниях Пермского отделения Всероссийского научного обшесжа микробиологов, эпидемиологов, паразитологов (Пермь, 1989,1993).

- на республиканской научной конференции "Актуальные вопросы медицинской вирусологии'' (Свердловск,1989),

- на научно-практической конференции "Природно-очаговые инфекции и инвазии" (Пермь, 1990).

- на республиканской научно-практической конференции "Актуальные вопросы изучения клещевого энцефалита и геморрагической лихорадки r их природных очагах (Ижевск, 1990),

- на научной конференции "Актуальные вопросы инфекционной патологии" (к 75-летию Пермского государственного медицинского института. Пермь, 1991),

- на научной сессии 1996 года Пермской государственной медицинской академии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страниц;« машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, заключения и выводов.

Библиографический указатель включает ссылки на работы 154 отечественных и 51 зарубежных авторов.

Работа иллюстрирована 15 шашками и 2 рисунками.

Основное содержание работы Материалы н методы.

В опытах использованы следующие материалы: Клещевые взвеси на среде 199.

Плазма больных КЗ, здоровых доноров и больных другими заболеваниями.

Антиген вируса Ю (коммерческий препарат 7 омского НИИВС для РТГА и РСК с титром 1:640).

Эршроцитарный иммуносорбент (ЭИС) - стандартизованный препарат Пермского НПО "Биомед". Формалинизированные эритроциты барана.

Эритроцитарный диагностнкум коксаки В. (коммерческий препарат производства Свердловского НИИВИ).

Флуоресцирующие антитела к вирусу КЭ производства Свердловского НИИВИ и Томскою НИИВС с красящим титром 1:4 - 1:8.

Флуоресцирующие КаЬ-фрагмеитм антител к вирусу Ю, меченые ФИТЦ (экспериментальная серия Пермского 11ИИВС НПО 'Т>иоме;Г\

В исследованиях использованы методы:

- реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (J. Casals, L Broun, 1953);

- метод флуоресцирующих антител (МФА) (Г.И. Стародубцева, Т.Г. Пархоменко, 1974);

- реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) (Р.Д. Марголин, З.Н. Кои-драшова, 1966);

- реакция непрямого иммунного розсткообразования (РНИР) (Л.П. Быкова,! 986);

- иммуноферментный анализ (ИФА) (О.В. Наволокин, JLC. Субботи-на,1986);

Статистический анализ результатов исследований проводили с помощью метода вариационной статистики (И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев.! 962: М.К. Ворошилова и др. 1964; П.Ф. Рокицкий,1967). Для обработки цифровою материала использовали микрокомпьютер МК" - 85.

Работа выполнена в комплексе с учреждениями ГСЭН и больницами г. Перми.

Резулы а 1 ы обсуждении Совершенствование МФА с >ИС.

Целью любого иммунологического исследования является получение достоверного (положительного или отрицательного) результата, суждение о наличии или отсутствии искомого антигена в исследуемом материале.

in

Естественно, что такое суждение может быть сделано лишь на основе определенного способа учета и оценки результатов в опыте и контроле. Общепринятая в МФА четырех крест пая шкала оценки специфического свечения, в том числе и г, варианте с применением ЭИС, выглядит следующим образом:

Яркость и цвет специфической флуоресценции

- очень яркая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета но периферии клетки (эритроцита), контрастирующая с ее телом;

Шкала оценки флуоресценции

— менее яркая флуоресценция

зеленого цвега по периферии -+-

клет ки (эритроцита);

— флуоресценция зеленого цвета

по периферии клетки с разрывами; -н-

— флуоресценция зеленого цвета но периферии клетки в виде "шапочки";

С общепринятых позиций флуоресценция считается специфической, если интенсивность свечения эритроцита оценивается на 2 плюса и более,

а результаты считаются положительными при наличии 5 эритронишв в поле зрения, светящихся не ниже чем на 2- при просмотре не менее 15-20 полей зрения и соответствующих контролях.

Описанный метод контроля учета и оценки результатов, на наш взгляд, не лишен существенных недостатков, поскольку не учитывает условий протекания реакции и сорбционных возможностей сенсибилизированных эритроцитов, а сам результат носит преимущественно качественный характер. Существование четырех вариантов специфического свечения мы объясняем неодинаковостью условий взаимодействия вирусного антигена с сенсибилизированными эритроцитами, а также разной нагрузкой эритроцитов противоклещевым гамма-глобулином Последнее, возможно, связано с изначальной гетерогенностью сорбционных свойств бараньих эритроцитов в отношении сенситииа.

Изучение вариантов свечения разных серий иммуносорбента при исследовании одних и тех же вируссодержащих материалов показало нецелесообразность исключения из оценки эритроцитов с интенсивностью свечения на 1 -г. Это свечение в используемом варианте МФА носило специфический характер и зачастую не зависело от количества вирусног о антигена в материале.

Поэтому в качестве показателя, интегрирующею количественные и качественные параметры реакции, нами был предложен так называемый "'индекс свечения" (ИС), применение которого давало возможность количественной оценки антигена в условных единицах, что значительно повышало чувствительность метода.

Практически '"ИС" вычисляется по формуле:

г де "ИС" - индекс свечения

а, Ь, с, (3 количество эритроцитов в поле зрения, светящихся соответственно на 4,3,2,1 плюс;

N - обтее число эритроцитов в поле зрения.

Обоснованность данного подхода к опенке результатов МФА с ЭИС была подтверждена в серии опытов с суспензиями вирофоркых и нениро-форных клещей по результатам ИФА.

Изучая препараты из невирофорных клещей с использованием различных флуоресцирующих когплогапж мм нашли, что "ИС" в них за редким исключением не превышал двух. В контрольных препаратах специфическое свечение практически отсутствовало и "ИС" был равен 0. Средние "ИС" при исследовании невирофорных клешей составили с поликлональ-ными антителами 1,7, с НаЬ-фрагметами антител 0,7. По лому величина 2, взятая с запасом в 2 раза, послужила основанием для принятия пороговое '"ИС" равного 4.

В целом результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица I

Определение порогового значения "ИС" и оценка специфичности МФА

с ЭИС при изучении вирофориосги клешей

Варианты Средний "ИС" Отношение средних

МФА при исследовании невирофорных клещей При исследовании виро-форных клещей "ИС" Р

С поликло- 1,9 1 1,7 6.1 <0,001

налышми

антителами

С монокли- 1,7 10,7 <0,001

нальными

антителами

С гаЬ- 0,7 10,2 14,6 <0,001

фрагмснтами

антител

п

Из таблицы видка большая разница между средними "ИС" при исследовании невирофорных и вирофориых клешей, что говорит в пользу объективности полученных результатов, равно как л отношение средних "ИС" при положительном результате к отрицательному 6.1, 6.3, 14.6. Более высокая кратность отношении в случае использования в качестве флуоресцирующего конъюгата Fab-фрагментов антител демонстрирует более высокую чувствительность МФ Fab-фрагментов перед МФА.

Таким образом, на основании проведенных исследований, нами был предложен иктегратнинын показатель "ИС", позволяющий судить не только о наличии или отсутствии искомого антигена, но и более точно, чем при общепринятой системе оценки, выразить его присутствие к условных единицах.

Для изучения возможное!'ей индикации антигена вируса с диагностической целью МФА с ЭИС нами было исследовано 105 проб плазмы крови больных с подозрением на КЭ. Параллельные контрольные опыты проводились вирусологическим методом с использованием культуры клеток линии СПЭВ, серологическим методом с им-муноферментной тест-системой для определения IgM и !g(¡ и п реакции торможения геммаглютинации при исследовании парных сывороток.

Таким образом, опираясь на вирусологический и серологический методы исследования, оценивалась объективность полученных МФА результатов. Результаты исследования представлены в табл.2.

Таблица 2

Сравнительная оценка реилыамш исследовании плазм больных МФА с ЭИС и в * 1 ру сол отческим методом

Методы Исследования Исследовано проб плазмы Положительный Результат Р

Абс. М±га%

МФА с ЭИС 105 28 26,6±4,3 <0,05

Вирусологический метод 15 14,3±3,4

Как следует из таблицы, при исследовании 105 проб плазмы крови МФА с ЭИС положительный результат наблюдался в 26,6% случаев. При обследовании ¡ой же группы больных вирусологическим методом антиген вируса в культуральной жидкости обнаружен в 14,3% проб материала. Следует также отметить, что 11 положительных результант, полученных вирусологическим методом, вошли в группу положительных результатов, полученных МФА.

Возможными причинами большей выявляемое™ вирусного антигена МФА по отношению к вирусологическому методу могут быть следующие:

1. Эритроцитарный иммуносорбент, сорбируя на поверхности сенсибилизированного эритроцита и вирус и антиген, обеспечивает локальную концентрацию, что, в конечном итоге, и определяет более высокую чувствительность МФА с ЭИС по сравнению с вирусологическим методом.

Последнее можно подтвердить словами основоположника метода флуоресцирующих антител А.Кукса (1958): "Этим методом можно обнаружить очень маленькие количества антигена при условии, что он сконцентрирован в одном месте... Однако, если антиген не сконцентрирован, ею не удается обнаружить даже в тех случаях, когда он содержится в больших количествах."

2. Существованием штаммов вирусов ICI со сниженной репродуктивной способностью.

3. Контаминацией использованных культур клеток линии СПЭВ вирусами, оказывающими интерферирующий эффект.

Серологическое исследование в подтверждение объективности полученных МФА результатов проведено иммунофермеитпым методом и в РТГА. В плазме больных выявлены lgM, -свидетели свежего инфицирования вирусом КЭ, и диагностическое нарастание титров антител при исследовании парных сывороток.

Обобщенные данные исследования представлены на рис 1.

Рис. 1. Оценка объективности результатов МФА с ЭИС при индикации антигена вируса в плазме больных КЭ с помощью традиционных методов исследования.

Таким образом, из 28 положительных результатов, полученных МФА с ЭИС, при исследовании 105 проб плазмы крови больных с подозрением на КЭ 23 результата были подтверждены контрольными исследованиями, что составило 80,2%

Высокий уровень совпадения результатов апробируемого метода и комплекса рутинных исследований подтверждает специфичность МФА с ЭИС и, следовательно, объективность полученных данных.

Важным, на наш взгляд, приемом обоснования объективности полученных МФА результатов может послужить и повторное исследование

плазмы крови больных с подтвержденным клиническим диагнозом КЭ и положительным результатом МФА. Проведено повторное исследование двадцати проб плазмы крови больных КЭ и двадцати проб плазмы больных с другими заболеваниями и отрицательным результатом МФА.

Результаты проведения исследований представлены в табл.3

Таблица 3

Результаты повторного исследования плазмы крови больных КЭ и лиц контрольной группы МФА с ЭИС

Исследованный материал Кол-во исследованных проб Первичное исследование Средний "ИС" Повторное исследование Средний "ИС" Кратность снижения среднего "ИС" Р

Плазма больных КЭ МФА (-) 20 9,4± 1,3 2,9±0,7 3,2 <0,05

Плазма больных контрольной группы МФА (-) 20 1.8+0,4 1,7±0,4 0,02 ....... .. . >0,05

Как видно из таблицы, при повторном исследовании положительных проб плазмы крови больных КЭ наблюдалось более чем 3-х кратное снижение среднего "ИС. В контрольной группе средний "ИС" практически не изменился. Полученные результаты можно объяснить лишь тем, что антиген вируса КЭ в плазме больных был сорбирован (иммунная сорбция) эритроцитарным иммуносорбентом при первичном исследовании. Следовательно, оц не должен выявляться при повторном исследовании.

В действительности же средний "ИС" при повторном исследовании составил 2,9 — несколько больший, чем в контрольной труппе, где он не превышал двух. По-видимому, это обстоятельство объясняется неполнотой

сорбции вирусного антигена при первичном исследовании. В ряде случаев емкость иммуносорбента оказывалась недостаточной и часть вируса оставалась в свободном состоянии.

Использованный в работе эритроиитарный иммуносорбент в виде 0,5% концентрации обеспечивал оптимальное для подсчета количество эритроцитов в поле зрения и достаточно высокую удельную нагрузку антигена на эритроцит. Если предположить, что сорбция вирусного антигена носила неспецифическин характер, то средние "ИС" в обследуемых группах были бы практически одинаковыми, чего в действительности не наблюдалось. Следовательно, эритроиитарный иммуносорбент способен специфически взаимодействовать с зныгеном вируса в плазме полыни о Ю, результат которого четко выявляется методом флуоресцирующих антител.

Таким образом, полученные данные (более чем трехкратное снижение среднего "ИС" при повторном исследовании плазмы) позволяют считать, что МФА с ЭИС являются специфическим диагностическим гестом, способным обнаруживать антиген в плазме больных КЭ.

Оценка специфичности МФА с ЭИС в условиях практической вирусологической лаборатории

Для оценки специфичности МФА с ЭИС было проведено обследование больных КЭ и лиц контрольной группы. Контрольную группу составили больные с другими инфекционными заболеваниями, а также здоровые доноры. В общей сложности обследовано 232 больных с подозрением на КЭ и 40 человек контрольной группы. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты МФЛ с ЭПС при обследовании больных КЭ с разными данными серологического исследовашш

Обследуемые Исследовано Из них положитель и ы х

группы проб МФА в МФА

Абс. М±т%

Нарастание титров 44 19 43.2+7,5

Стабильные титры 56 17 30,3+6,1

Отсутствие анти- 132 27 20,4+3,2

тел

Всего обследовано 232 63 27,2±3,0

Контрольная груп- 40 0 0

па

Примечание: Первичный анализ обследуемой группы больных проведен по результатам исследования первых двух проб крови в РТГА.

Как следует из таблицы, при исследовании МФА с ЗИС 232 больных с подозрением на КЭ положительный результат наблюдался у 63 обследуемых (27,2%).

С целыо обоснования специфичности апробируемого метода все обследуемые больные были разделены на 3 группы:

Первая группа: больные с нарастанием титров антител в РТГА - 44 человека. 11оложительная реакция в этой группе наблюдалась у 19 больных (43,2%).

Вторая группа со стабильными титрами составила 56 человек . Положительный результат отмечен у 17 обследуемых (30,3%).

Третья группа больные с отсутствием антител - 132 человека, положительный результат получен у 27 обследуемых (20,4%). В данной группе иммуноглобулины класса М в РИГА с редуцентом обнаружены у 33 человек, из них реакция положительна у 55 больных (15,1%).

Г)

Из таблицы видно, что частота выявления вирусного am hi сна н группах закономерно снижается. Гак, выявляемость вирусного антигена в группе больных с нарастанием титров антител составила 43,2%, в то время как у больных со стабильными титрами и отсутствием антител выявляемость составила 30,3% и 20,4% соответственно. Разница частоты выявляемое™ антигена между первой и третьей фуппами оказалась статистически достоверной (Р<0,05). Различная выявляемость вирусного антигена в обследуемых группах косвенно подтверждает объе!сгивносгь полученных результатов.

Однако, как видно из таблицы, антиген вируса [О довольно часто выявляется и у больных с неподтвержденным серологическим диагнозом. Обнаружение вирусного антигена у больных с отрицательными результатами серологического анализа можно объяснить существованием при Ю серонегативных форм этой инфекции. Рядом авторов наличие существования таких форм болезни объясняется возможной диссоциацией гуморального и клеточного звеньев иммунитета, а вирусемия при этом, по-видимому, носит транзиторный характер (150,! 51). Известно также, что при КЭ, как и при других вирусных инфекциях, образование антител, их уровень, далеко не всегда отражают степень специфической защиты организма от инфекции. Для обеспечения зашиты мобилизуются и другие механизмы иммунитета (67,169).

Таким образом, на основании проведенных исследований, можно заключить, что МФА с ЭИС является самостоятельным методом экспресс-диагностики КЭ.

Предложенный для оценки результатов метод "ИС" позволяет точнее, чем традиционный метод оценить содержание вирусного антигена в исследуемом материале.

Присасывание вирофорнсно клеща создае! в организме состояние ¡ш-фицированности, которое в зависимости от иммунного статуса организма может перейти в заболевание.

Современная рациональная серопрофилактика КЭ основывается на введении гомологическою гамма-глобулина в случае присасывания виро-форного клеща. Представляло интерес проанализировать, как влияет превентивное введение гамма-глобулина на выявляемоегь вирусного антигена.

Для изучения этого вопроса нами была рассмотрена группа больных из 75 человек с подтвержденным клиническим диагнозом КЭ. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Частота выявления антигена вируса КЭ в зависимости о» серопрофилактики для больных с п одтве рждемп ым клиническим

диагнозом

Серопрофилак- | Количество тика | наблюдений Частота обнаружения | Р вирусного антигена !

Лбе. М±т% ;

Проводилась 20 3 | 15,0±7.9 1

Не проводилась 1 55 Всего | 75 26 1 47,3+6,7 ; <0,05 29 | 38,7±0,9 ! : 1

Исследование показало, что превентивное введение гамма-глобулина самым существенным образом влияет на выявляемоегь вирусного антигена. Как видно из таблицы 5, процент выявляемое™ в случае проведения серопрофилактики составил 15; в случае если гамма-глобулин не вводился, выявляемость возрастала более чем в 3 раза (47,3%).

")\я реп'дьтаты вполне объяснимы с попиши способности антител блокировать антигенные детерминанты вируса и его антигенов с образованием "ИК'\ которые не могут быть выявлены примененным вариантом МФДс ЭИС.

С другой стороны, эти же результаты исследования показывают, что введение гамма-глобулина в 1/3 случаев не препятствует индикации вируса, что, по-видимому, связано с количеством, специфической активностью (авидностыо), титром и сроками введения препарата.

ВЫВОДЫ.

1. Показана возможность индикации антигена вируса методом флуоресцирующих антител с применением зри фоцитарного иммуно-сорбента в кропи больных клещевым энцефалитом и особях спонтанно зараженных клещей, снятых с людей после присасывания.

2. Предложен оригинальный способ количественного учета антигена вируса клетевого энцефалита в исследуемом материале посредством "'индекса свечения", применение которого в оценке результатов при исследовании плазмы кроки и изучении вирофорлости клещей позволяет выявлять людей, подверженных наибольшему риску заболевания.

3. Применение в качестве флуоресцирующего конъюгата принципиально нового иммуноглобулинового реагента на основе меченых ГаЬ-фрагментОБ антител позволило увеличить чувствительность МФА с эритроцитарным иммуносорбентом, существенно повысить его оксирессность.

4. Вероятность индикации антигена вируса в крови больных клеше-вым энцефалитом зависит от превентивного введения противозн-нефалитного гамма-глобулина. В крови больных, взятой доя не-

следования после введения препарата в тигре не ниже !: 160, частота обнаружения антигена снижалась в среднем в три раза.

5. Результаты комплексных исследований позволяют рассматривать МФА с эритроци гарным иммуносорбентом не только как дополнение к совокупности методов, используемых в диагностике клещевого энцефалита, но и как самостоятельный высокочувствительный и специфичный тест, который может быть применен для ранней экспресс-диагностики заболевания, а также в процессе организации эпиднадзора за клешевым энцефалитом.

Список работ, опубликованных но теме диссертации.

1. Выявление вирусемии у больных клещевым энцефалитом в реакции иммунофлуоресценции с использованием эритроцитарного иммуносорбента/Душкин Е.А., Минаева В.М., Кузяев Р.З. и др. // Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов: Тез, докл. науч. конф. Пермского НИИВС. - Пермь, 1988. - С.87-88.

2. Некоторые аспекты ранней диагностики клещевого энцефалита /Кузяев Р.З., Минаева В.М., Ярошенко Л.К.. Душкин Е.А. и др.//Актуал. вопр. мед. вирусол.: Респуб. сб. науч. тр. - Свердловск, 1989. - С. 161-166.

3. Выявление вирусемии у больных клещевым энцефалитом методом флуоресцирующих антител с использованием эритроцитарного иммуносорбента /Душкин Е.А., Кузяев Р.З., Минаева В.М. и др.// Актуал. вопр изучения клещевого энцефалита и геморрагической лихорадки в их природных очагах: Тез. докл. респуб. науч-практич. конф. Ижевск, 1990. - С.40-41.

4. Определение индивидуальной зараженности клетей вирусом клещевого энцефалита в реакции иммуиофлуоресиеннии /Душкин

E.А.. Кузяев Р.З., Минаепа В.М. и др. // Г]риродно-очаговые инфекции и инвазии; Материалы науч-практич. конф. Пермского гос. мед инс-та. Пермь, 1990. - С.10-11.

5. Методические аспекты диспансеризации при субклиническом течении клещевого энцефалита ' Кузяев Р.З., Ярошенко JI.K., Душкин Е.А., Быкова Л.П.// Профилакт. медицина. Состояние и перспективы: Матер, конф. - JL, 1991. - С. 157-158.

6. Изучение индивидуальной зараженности клешей вирусом клещевого энцефалита методом флуоресцирующих РаЬ-фрагментов антител с использованием эритроцитарного нммуносорбента / Душкин H.A., Кузяев Р.З.. Минаева В.М. и др./'1 Эпидемиол., клиника и профил. вирус, инфекций: Сб. науч. тр. Екатеринбургского НИИВИ Екатеринбург. 1992. - С. 141-144.

7. Использование эригроцитарного иммуносорбента при изучении клещевого энцефалита / Пархоменко Т.Г., Душкин Е.А.. Васильев Н.В. и др.// Актуал пробл. теор. и приклад, иммунол.: Материал, докл. науч-практич. конф. Пермского НПО "Биомед" Пермь, 1994.

С. 41-42.

8. Определение индивидуальной зараженности клешей вирусом клещевого энцефалита в реакции иммунофлуоресцешши с помощью эритроцитарного иммуносорбента / Минаева В.М., Душкин

F.A., Кузяев Р.З. и др.// Иммунол. реакции в диагн., профил. и эиидемиол. надзоре за иифек. болезнями: Сб. науч. тр. - Пермь. 1995. - С.23-27.

9. Душкин Е.А., Кузяев Р.З., Кудреватых Е В. Реакция эрифоиммунофлуоресценции в ранней диагностике клещевого

энцефалита /У Науч. сессия 19% года Пермской гос. мед. академии: Тез. докл.- Пермь, 1996. - С.70-71.

10. Антигенепецнфические методы исследования в ранней диагностике и эпидемиологическом надзоре за клетевым энцефалитом / Кузяев Р.З.. Ярошенко Л.К., Быкова Л.II., Душкин Е.А. и др./7

Инфор бюл. Госкомсанэпиднадзора РФ "Здоровье населения и среда обитания". М. 1996, - №12. - С. 13-14.

11. Совершенствование ранней иммунодиагностики клещевого энцефалита / Кузяев Р.З., Ярошенко Л.К., Быкова Л.П., Душкин Н А, и др./У Факторы клеточ. и гумор. иммунитета при различных физиологии. и патологи ч. состояниях. Тез. докл. XII Российской науч. конф. - Челябинск, 1997 - С.82.

Издательская лицензия ЯП № 020930 от 26.10.94

Подписано в печать 23.09.98. Формат 60х84'/|6. Усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 45.

Техническая редакция "Пермскою медицинского журнала" 614000, Пермь, ул. Большевистская. 85