Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Применение культуры аллофибробластов в лечении раневых дефектов кожного покрова (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Чаплыгип Сергей Сергеевич

ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУРЫ АЛЛОФИБРОБЛАСТОВ В ЛЕЧЕНИИ РАНЕВЫХ ДЕФЕКТОВ КОЖНОГО ПОКРОВА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.17-Хирургия

14.03.02 - Патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 8 НОЯ 2013

Самара - 2013 г.

005541054

005541054

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Колсанов Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

Сонис Александр Григорьевич, доктор медицинских наук, доцент, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей хирургии, заведующий.

Туманов Владимир Павлович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической и патологической анатомии №1 педиатрического факультета, профессор.

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится » ^¿шГр/С- 2013 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 208.0^5.01 при ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443079 г. Самара, пр. К. Маркса, 1656).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Самарского государственного медицинского университета (443001, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «Х^ » _2013 года

Ученый секретарь диссертационного сс

доктор медицинских наук, профессор

Общая характеристика работы Актуальность темы исследовании

Лечение ран является одной из важнейших проблем хирургии (Абаев Ю.К., Богданец Л.И., 2007; Condor R.E., 2011; Clare А., 2012). Это связано с увеличением количества пациентов с раневыми дефектами вследствие роста числа пожаров, случаев дорожного травматизма, трофических нарушений (Воробьев A.A., 2008; Жуков Б.Н., 2009). Кроме того, выполнение адекватных по масштабу хирургических вмешательств, приводит к образованию послеоперационных ран, что, в свою очередь, приводит к длительным срокам нетрудоспособности и существенным материальным затратам на последующее лечение и реабилитацию таких пациентов (Маслякова Г.Н., 2006; Гостищев В.К., 2009; Shukla S., 2009). За последние 5 лет не появилось радикально новых методов восстановления дефектов кожного покрова, сохраняются проблемы, связанные с дефицитом донорских тканей (Зиновьев Е.В., 2008; Колсанов A.B., 2010; Зорина А.И., 2011; Lin С.Н., 2011 ; Sosnowski T.R., 2013)

В современной хирургии ран наибольшее распространение получило местное применение лекарственных средств на раневую поверхность. В России разработаны и используются различные перевязочные материалы, которые по своей эффективности соответствуют, а по некоторым параметрам превосходят зарубежные (Новожилов A.A., 2008; Ермолов A.C., 2009; Сонис А.Г., 2011). Современным подходом в местном лечении дефектов кожи является применение раневых покрытий на основе биологически активных гидрогелей с антисептиками, ферментами и местными анестетиками, рассасывающимися пленочными покрытиями на основе полилакгидов (Адамян А А, 2001; Гусева A.C., 2007; Сычевский М.В., 2010; Keck M., 2009).

Другим перспективным направлением является применение культур клеток при лечении раневых дефектов (Зорин В.Л., 2009). К ним можно отнести использование алло- и аутокератиноцитов, фибробластов (Туманов В.П., 2008; Расулов М.Ф. 2008, Волова Л.Т., 2012; Bannasch H., 2010). Остается нерешенным вопрос о выборе оптимальных способов нанесения клеток: ряд исследователей придерживаются мнения о необходимости использования синтетических носителей (Goedkoop R., 2010; Böttcher-Haberzeth S., 2010), другие авторы предлагают использовать биологические носители (Алексеев A.A. 2006; Bannasch H., 2008). За последние три года рядом авторов высказывается возможность дистанционного нанесения культур клеток при помощи спреев (Gerlach J.C., 2011; Kirsner R.S., 2012).

Разработка и внедрение новых высокотехнологичных способов восстановления целостности кожного покрова с использованием клеточных культур фибробластов и кератиноцитов является актуальной (Смирнов С. В., 2009; Chang H.Y., 2002), т.к. позволяет оптимизировать течение репаративных процессов и снизить риск формирования грубых рубцов (Саркисов Д.С. с соавт., 1995; Шехтер А.Б., 2009; Harrison С.А., 2008). Научные исследования, направленные на разработку новых методов применения культуры фибробластов, являются актуальными и перспективными.

Цель исследования

Разработка и оценка эффективности нового способа аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов при лечении раневых дефектов кожного покрова в эксперименте.

Задачи исследования

1. Разработать устройство для аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов при лечении раневых дефектов кожного покрова.

2. Изучить жизнеспособность культуры аллогенных фибробластов при аэрозольном способе нанесения in vitro.

3. Усовершенствовать способ местного лечения раневых дефектов кож).

4. Оценить патоморфологические изменения при лечении поверхностных раневых дефектов кожного покрова с использованием культуры аллогенных фибробластов на покрытии «Фолидерм», аэрозольного способа нанесения культуры аллофибробластов, раневых покрытй «Активтекс Ф» и 3% раствора перманганата калия в эксперименте.

5. Изучить течение раневого процесса при глубоких дефектах кожного покрова при условии использования культуры аллофибробластов на покрытии «Фолидерм», аэрозольного способа нанесения культуры аллофибробластов, раневых покрытий «Активтекс Ф».

6. Обосновать с позиций доказательной медицины эффективность местного лечения поверхностных и глубоких дефектов кожного покрова с помощью культуры аллофибробластов.

Научпая новизна

Впервые разработано устройство для аэрозольного нанесения культуры клеток для лечения раневых дефектов кожного покрова (Патент РФ на полезную модель № 133734 от 26.04.2013).

Доказано отсутствие травматического воздействия аэрозольного способа нанесения на культуру аллофибробластов.

Усовершенствован способ местного лечения поверхностных и глубоких раневых дефектов кожного покрова за счет применения аэрозольного нанесения культуры аллогенных фибробластов.

Изучены патоморфологические особенности течения раневого процесса под влиянием различных способов местного лечения поверхностных ран кожи.

Выявлено различие в скорости репаративных процессов при лечении глубоких ран кожи культурой аллофибробластов на покрытии «Фолидерм» и при их аэрозольном способе нанесения по сравнению с применением раневых покрытий «Активтекс Ф».

Практическая значимость

Разработано новое устройство для аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов, которое позволяет избежать травматизации и гибели клеток при их распылении.

Разработан и апробирован новый способ местного лечения ран за счет аэрозольного нанесения культур фибробластов, позволяющий сократить сроки лечения поверхностных и глубоких раневых дефектов кожи в 1,3-2 раза в сравнении с использованием традиционных способов местного лечения.

Использование культур аллогенных фибробластов при лечении поверхностных : и глубоких ран кожного покрова позволяет оптимизировать репаративные процессы в сравнении с традиционной терапией.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные в процессе исследования выводы и практические рекомендации внедрены в работу Института экспериментальной медицины и биотехнологий ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и применяются в процессе выполнения экспериментальных исследований.

Результаты работы используются в учебном процессе на кафедрах оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий, общей хирургии, общей и клинической патологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Полученные экспериментальные результаты и практические рекомендации

могут быть основой для проведения клинических испытаний нового способа лечения ожоговых ран и трофических язв за счет аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов у пациентов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 65-й юбилейной научно-практической конференции студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые- здравоохранению региона» (Саратов, 2004); на VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2006); на Всероссийской итоговой научной конференции «Человек и медицина XXI века» (Самара, 2007, 2008); на 61 международной научно-практической конференции молодых ученых УГМА 2006 год; на III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009); на 10-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2011); на межрегиональной научной конференции с международным участием «Новые технологии в экспериментальной и клинической хирургии» (Саратов, 2011); на Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011); на XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикшщи материалов докторских и кандидатских диссертаций. Получен 1 Патент РФ на полезную модель и 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель включает 234 источника, в том числе 135 отечественных и 99 иностранных. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 71 рисунком.

Положения, выносимые на защиту: 1. Устройство для аэрозольного распыления культуры аллофибробластов не снижает жизнеспособность клеток при его применении.

2. Использование усовершенствованного способа лечения клеточной культурой аллофибробластов методом аэрозольного нанесения целесообразно при поверхностных и глубоких ранах.

3. При применении метода аэрозольного нанесения клеточных культур аллофибробластов репаративные процессы характеризуются пролиферацией базальных эпидермоцитов с краев раны (при поверхностных дефектах) и быстрым созреванием грануляционной ткани с последующим формированием эпителизированного рубца (при глубоких дефектах).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Экспериментальный раздел работы выполнен на базе Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ (директор - профессор, д.м.н. JI.T. Волова).

В рамках выполнения диссертационного исследования были проведены эксперименты на 136 лабораторных животных, направленные на изучение заживления ран кожного покрова под воздействием различных способов местного лечения.

В своем исследовании придерживались наиболее распространенной классификации течения раневого процесса, предложенной коллективом авторов Института хирургии РАМН им. A.B. Вишневского: 1-я фаза - воспаление (сосудистые изменения, очищение), 2-я фаза - регенерация и пролиферация, 3-я фаза -реорганизация рубца и эпителизация (Кузин М.И. с соавт., 1990).

Характеристика серий экспериментов при местном лечении поверхностных дефектов кожи (1-5 серия)

Для получения модели поверхностного дефекта использовали прибор для микродермабразии «Crystal» (Италия). Прибором создавали дефект в межлопаточной области крысы площадью 4 см2. Действие прибора основано на выбрасывании на кожу потока инертных микрокристаллов с высокоабразивными свойствами, контролируемого посредством градуируемого вакуума. На конце наконечника прибора имеется эллиптическое отверстие, при контакте которого с кожей возникает вакуум, направляющий поток микрокристаллов на кожу.

В эксперименте на лабораторных животных, после полного выстригания шерсти и обработки 70% раствором этилового спирта, проводили глубокое

воздействие со шлифовкой на уровне сосочкового слоя. Манипуляция проводилась под общим комбинированным наркозом препаратами Золетил в дозировке 0,2 мкг/кг и Рометар в дозировке 0,3 мкг/кг.

После получения модели плоскостной поверхностной раны кожи лабораторные животные были разделены на 5 серий. Распределение животных по сериям экспериментов проводилось при помощи рандомизации. В первой (основной) серии (15 крыс) лечение проводили при помощи аэрозольного распыления культуры аллогенных фибробластов по разработанной методике. Во второй серии (15 крыс) лечение поверхностных ран проводили культурой аллофибробластов на культуралыюй подложке (Фолидерм), в третьей серии (15 крыс) - раневые дефекты лечили при помощи раневых покрытий «Активтекс Ф», в четвертой серии (15 крыс) для лечения применяли 3% раствор перманганата калия, в пятой (контрольной) серии (10 крыс) - поверхностные раны заживали самостоятельно «под струпом».

В первой серии экспериментов на раневой дефект производили распыление культуры аллогенных фибробластов по разработанной методике при помощи распылителя (Патент РФ на полезную модель № 133734 от 26.04.2013). После чего к дефекту подшивали рамку и фиксировали стерильным перевязочным материалом. На 3-й сутки проводили повторное аэрозольное распыление культуры клеток на раневой дефект.

Во второй серии на дефект помещали культуру клеток аллофибробластов на подложке клеточным слоем вниз, после чего к ране фиксировали рамку и закрывали стерильным перевязочным материалом. Культуру аллофибробластов на подложке для лечения раневых дефектов применяли на 1-е сутки и в ходе перевязки на 3-й сутки.

В третьей серии экспериментов применяли раневое покрытие «Активтекс Ф», которое помещали на рану после нанесения дефекта и фиксировали к рамке. Покрытие закрывали стерильным перевязочным материалом. Перевязки проводили на 3, 5 и 7 сутки.

В четвертой серии раневой дефект обрабатывали 3% раствором перманганата калия, после чего подшивали рамку и закрывали стерильным перевязочным материалом. Перевязки осуществляли через день до 7 суток. При каждой перевязке производили повторную обработку дефекта 3% р-ром перманганата калия и замену перевязочного материала.

Животных во всех сериях экспериментов с поверхностными дефектами выводили из эксперимента внутрисердечным введением тиопентала натрия на 3, 5, 7, 14, 21 сутки.

Характеристика серий экспериментов при местном лечении глубоких дефектов

кожи (6-9 серии)

Под комбинированным наркозом препаратами Золетил в дозировке 0,2 мкг/кг и Рометар в дозировке 0,3 мкг/кг, создавалась модель глубокого дефекта путем иссечения кожи в межлопаточной области до собственной фасции прямоугольной формы площадью 400 мм2. К краям раны (для предотвращения контракции) подшивали прямоугольную рамку из индифферентного синтетического материала площадью 400 мм2.

После получения модели глубокой раны лабораторные животные были разделены на 4 серии. В шестой (основной) серии (18 крыс) лечение проводили при помощи аэрозольного распыления культуры аллогенных фибробластов по разработанной методике. В седьмой серии (18 крыс) лечение поверхностных ран проводили культурой аллофибробластов на культуралыюм покрытии (Фолидерм), в восьмой серии (18 крыс) — раневые дефекты лечили при помощи раневых покрытий «Активтекс Ф», в девятой (контрольной) серии (12 крыс) - поверхностные раны заживали самостоятельно (без лечения).

В шестой серии на раневой дефект производили распыление культуры аллогенных фибробластов по разработанной методике при помощи аэрозольного распылителя. Распыление проводили на 3-й, 7-е и 11-е сутки. Раневой дефект укрывался стерильным перевязочным материалом для предотвращения инфицирования.

В седьмой серии лечение проводили при помощи трансплантации культуры аллогенных фибробластов, пассированных на подложку «Фолидерм». Перевязки проводили так же как и в шестой серии на 3-й, 7-е, 11-е сутки. Перед нанесением выполнялось моделирование носителя под размер и форму дефекта. После 14-х суток производилась только замена стерильного перевязочного материала для предотвращения инфицирования раны.

В восьмой серии использовали раневые покрытия «Активтекс Ф». После нанесения дефекта моделировали повязка под форму и размер раны, после чего, согласно инструкции, помещали в стерильный физиологический раствор, а затем укладывали на рану. Сверху повязка закрывалась стерильным перевязочным

материалом. Перевязки проводили через день: на 3-й, 5-е, 7-е, 9-е сутки. После 9-х суток перевязку проводили один раз в 3 дня.

Девятая серия (контроль) велась без лечения. Животным в данной серии подшивали рамку, раневой дефект закрывали стерильным перевязочным материалом.

Животных во всех сериях с глубокими дефектами выводили из эксперимента внутрисердечным введением тиопентала натрия на 3, 7,14,21,30 и 60 сутки.

Морфологические методы исследования

В работе были использованы общеморфологические и морфометрические методы. Кусочки кожи пограничной области раневого дефекта и прилежащей интактной кожи изучали микроскопически. Для гистологического исследования вышеназванные объекты фиксировали в 12% растворе формалина, проводили в спиртах и заливали в целлоидин-парафин. Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, азур-эозином по Романовскому. Гистологические препараты толщиной 5 мкм изучали светооптически с помощью светового микроскопа Nicon ALPHAPHOT-2 YS2-H (Japan) и телеметрически с помощью видеокамеры CCDKOC0MKCC-31OPD и системы визуализации с программным обеспечением ВидеоТест Морфология 5.2 (Россия, С. Петербург).

Раневая планиметрия проводилась по оригинальной методике. После получения фотографических изображений производилась компьютерная обработка полученных данных при помощи разработанной программы для ЭВМ. Суть программы заключается в автоматическом распознавании краев раны по градиентному изменению цвета. После чего происходит сравнивание коэффициентов деформации геометрических фигур на измерительной шкале. Затем программа автоматически заполняет дефект квадратами, размером 0,1x0,1 мм. Общее количество квадратов, разделенное на 10 позволяет получить площадь раневого дефекта.

При изучении материалов, применяемых для изготовления аэрозольного распылителя, проводили работы по определению их цитотоксичности на культуре фибробластов. Для реализации данного блока работ было выполнено тестирование на культуре дермальных фибробластов 4-7 пассажей, полученных в лаборатории культуры клеток ИЭМБ СамГМУ.

Цифровые показатели, полученные в работе, оценены с позиций доказательной ' медицины и подвергнуты статистической обработке с учетом рекомендаций,'

изложенных в монографий «Доказательная медицина» (Котельников Г.П., Шпигель А.С.,2000).

Статистическая обработка полученных в ходе работы числовые данных выполнена при помощи компьютерной программы Statistica 10 (StatSoft) для ОС Windows 7 (Microsoft). Отдельные показатели оценены в процентном отношении, к другим применены непараметрические статистические методы - критерий Пирсона (X2) и двусторонний точный критерий Фишера (Лакин Г.Ф., 1990; Гланц СЛ., 1999). В основу статистических сравнений результатов было положено отвержение нулевой гипотезы, то есть предположения об отсутствии различий в сравниваемых группах. Различия считались статистически значимыми, если нулевая гипотеза была отвергнута. Выявленные закономерности и связи изучаемых параметров между группами и признаками считались статистически значимыми при вероятности безошибочного прогноза 95% и более (р<0,05) (Бююль А., Цефель П., 2001).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты разработки аэрозольного распылителя.

В ходе работы был разработан, сконструирован и изготовлен аэрозольный распылитель клеточных культур (Патент РФ на полезную модель № 133734 от 26.04.2013) совместно с кафедрой медицинского приборостроения Самарского государственного аэрокосмического университета (проф. Калакутский Л.И.)

Устройство состоит из емкости для культуры клеток, камеры для создания давления, и сопла распылителя. Вся конструкция распылителя создана по принципу максимальной совместимости и набором максимальных регулировок. Так изменение объема камеры позволяет регулировать площадь орошения, а изменение расстояния до сопла - объем распыляемой жидкости. Распылитель состоит из двух разборных частей, которые позволяют легко обрабатывать внутренние пространства изделия. Внутри распылителя впрессовано первичное сопло, которое подает взвесь клеток в распылительную камеру. Камера распылителя имеет специальные карманы, которые создают обратный ток жидкости вдоль стенок, что позволяет минимизировать травматизацию клеток о стенки камеры.

В нижней части распылителя, закрывающейся при помощи крышки, имеется выходное сопло распылителя. Благодаря резьбовому соединению, которым крепятся эти элементы, возможно регулировать расстояния между первичным и выходным соплами распылителя, что в свою очередь позволяет регулировать объем камеры распылителя. Таким образом, при максимально закрытой крышке в камере создается

более высокое давление, что приводит к увеличению угла распыления при более низком объеме распыляемого состава. С другой стороны, при максимально открытой крышке мы получаем больший объем распыляемого препарата при более низкой площади орошения (рис. 1).

Рис. 1. Схема распылителя. Условные обозначения: 1- камера с культурой клеток; 2- механизм фиксации камеры в теле распылителя; 3- форсунка для подачи воздуха; 4- первичное сопло распылителя; 5- камера для создания давления; 6-выходное сопло распылителя.

В ходе экспериментальной работы были подобраны оптимальные комбинации положения заслонки для более эффективного распыления. Подбор положения проводили следующим образом. В стандартный 2 мл шприц набирали жидкость, плотностью 1,030 г/мл. Далее проводили распыление с различных расстояний на лист бумаги низкой плотности. После чего оценивали диаметр смоченного пятна. Таким образом оптимальным расстоянием для распыления при объеме камеры 0,45 мл составляет 10 см от поверхности раны.

В ходе разработки распылителя были проведены работы по подбору оптимального материалы для изготовления устройства. С точки зрения1 механической обработки, целесообразнее всего использовать сталь и сплавы меди, так как oira более легко подвергаются механической обработке, однако в ходе исследований токсичности на клетках дермальных фибробластов была получена высокая токсическая реакция по отношению к данным материалам. Для изготовления был выбран титан марки ВТ-01, который разрешен к применению в изделиях медицинского назначения и показал наименьшую токсичность к клеткам. Данные выводы подтверждены исследованиями на культурах дермальных фибробластов in vitro.

В серии с использованием сплавов меди количество поврежденных клеток на 7-е сутки составило 48,5 ± 1,5%, при плотности монослоя клеток 580,6 ± 24,3 кл/мм2, в серии с использованием нержавеющей стали количество поврежденных клеток на 7-е сутки составило 45,5 ± 2,5%, при плотности монослоя клеток 756,9 ± 31,5 кл/мм2, тогда как в серии с использованием титана ВТ-01 количество поврежденных клеток не превышало 5,4 ± 1,8% с плотностью монослоя клеток 1230,5± 45,6 кл/мм2. В контрольной серии поврежденные клетки составили 5,4 ± 2,1 %, плотность монослоя равнялась 1250,5 ±55,2 кл/мм2.

Исследование травматизации клеток при распылении проводились по следующей методике. 3 стандартный 5 мл шприц набиралась взвесь культуры фибробластов в физиологическом растворе с содержанием клеток в количестве 20х104 клеток на 1 мл. С расстояния 10 см в положении заслонки 3 производили распыление клеток в культуральную чашку Петри со средой MEM. После чего производили культивацию клеток по стандартной методике. Контролем служили клетки, помещенные в культуралыше чашки непосредственно со среды, а так же нанесенные при помощи шприца без распыления. Оценку результатов производили при помощи микроскопии на 1,2,3,5,7 сутки.

В серии с использованием аэрозольного распылителя клеточных культур на 1-е сутки количество поврежденных клеток не превышало 5, 8 ± 1,7% Плотность монослоя на 7-е сутки составила 1344,6±29,4 кл/мм2. В серии с использованием распыления культуры аллогенных фибробластов при помощи стандартного пульверизатора количество поврежденных клеток на первые сутки- 23,8 ± 4,5 %, а плотность монослоя на 7-е сутки 769,4±24,6 кл/мм2. В контрольной серии поврежденные клетки на 1-е сутки составили 3,7 ± 1,1%, плотность монослоя на 7-е сутки 1523,2± 47,8 кл/мм2.

Таким образом, было выяснено, что оптимальным материалом для изготовления является титан ВТ-01, обладающий доказанной нетоксичностью по отношению к культуре клеток дермальных фибробластов. Несмотря на достаточно высокую сложность и трудоемкость обработки данного материала, Титан является оптимальным для изготовления внутренних частей аэрозольного распылителя. Подобранные нами режимы распыления позволяют обеспечить наилучшую площадь орошения культурами клеток при их минимальном расходе. Проведенные нами опыты позволяют утверждать, что распыление с расстояния 10 см от раневого дефекта позволяет создать нужную концентрацию клеток дермальных фибробластов,

которая составляет 0,5х105 клеток/см2. Проведешше исследования также доказали, что конструкция распылителя подобрана таким образом, что позволяет избежать травматизации клеток в процессе распыления.

Результаты экспериментальных исследований в сериях при лечении поверхностных раневых дефектов кожного покрова

Заживление раневых дефектов в сравниваемых сериях экспериментов имело сходный качественный характер, но отличалось сроками эпителизации.

В сериях с использованием клеточных культур, независимо от способа нанесения, раневой дефект был чистым, без каких либо признаков воспаления, что подтверждалось и гистологическими исследованиями. Отличие в этих сериях наблюдалось только в более интенсивном закрытии дефекта в серии с использованием аэрозольного способа нанесения культуры аллофибробластов. К 3-м суткам в серии с культурой клеток на покрытии «Фолидерм» наблюдалась только краевая эпителизация, тогда как в серии с использованием аэрозольного распылителя выявлялась и островковая эпителизация. При исследовании гистологических препаратов в первой серии наблюдали выраженные очаги островковой эпителизации, локализованные в области дериватов кожи. В обеих сериях были ярко выраженные регенераторные изменения, при этом выявлен достоверно менее выраженный отек дермы, чем в сериях сравнения. В серии с использованием раневых покрытий «Активтекс Ф», равно как и в серии с использованием 3% р-ра перманганата калия визуально наблюдались признаки воспаления, что подтверждалось гистологическими данными. К 3-им суткам в этих сериях наблюдалось закрытие 40,4 ± 2,1% от первоначального дефекта, тогда как в основных сериях этот процент достигал 65,7±1,6%.

Визуально полная эпителизация в сериях поверхностных дефектов наступала в серии с использованием аэрозольного распыления к 5,2±0,3 суткам, во второй серии-к 6,4 ¡0,4 суткам.

В сериях при использовании раневых покрытий «Активтекс Ф» эпителизация достигалась к 9,3 ± 0,4 суткам, а при использовании 3% раствор перманганата калия лишь к 10,2 ± 0,5 суткам (рис. 2).

На 5-е сутки в серии с использованием аэрозольного распылителя отмечали: макроскопически - полное заживление. К 7-м суткам при гистологическом исследовании - формирование многослойного плоского эпителия на всей поверхности раны с верификацией всех его слоев и базалыюй мембраны.

сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут.

Рис. 2. Динамика изменения площади поверхностного раневого дефекта кожи при различных способах местного лечения.

В серии с использованием культуры аллофибробластов на покрытии «Фолидерм» на 5-е сутки определялся дефект размером 30,2± 4,5 мм2. На 7-е сутки при микроскопии- формирование многослойного плоского эпителия на всей поверхности раны с верификацией всех его слоев и базальной мембраны.

Аналогичную картину в других сериях сравнения (раневые покрытия «Активтекс Ф» и 3% раствор перманганата калия) наблюдали лишь на 7-е и 14-е сутки соответственно. В последующие сроки при морфологическом исследовании процесс регенерации в сериях с использованием культуры аллофибробластов проходил интенсивнее, чем в других сериях, и опережал серии сравнения - на 7 дней. Эпителизация ран у лабораторных животных происходила за счет стимуляции пролиферации эпидермиса в придатках кожи и с краев раны.

Таким образом установлено статистически значимое уменьшение сроков восстановления толщины эпидермиса на 4,4±0,5 суток (р <0,05) в серии с использованием культуры аллогенных фибробластов по сравнению с серией с использованием покрытой «Активтекс Ф» и на 5,2±0,4 (р <0,05) суток по сравнению с серией с использованием 3% раствора перманганата калия.

Дальнейшее наблюдение показало, что в серии с аэрозольным распылением толщина эпидермиса в 35,5 ±3,2 мкм достигалась к 14 суткам, так же как и в серии с использованием культуры аллофибробластов на покрытии «Фолидерм» на 14-е сутки толщина эпидермиса составила 35,1 ±2,7 мкм. В серии с использованием покрытия «Активтекс Ф» толщина эпидермиса составила 23,8±2,1 мкм, а в серии с 3 % раствором перманганата калия только 19,3±1,9 мкм. Нормальная толщина эпидермиса достигалась в сериях сравнения к 21-м суткам и составила в 3-ей серии 34,1 ±2,7 мкм, а в 4 серии 31,2 ±2,1 мкм.

Результаты экспериментального исследования в сериях глубоких дефектов

кожного покрова

Результаты исследований регенерации глубоких раневых дефектов кожного покрова отличали в зависимости от способа лечения.

На 3-й сутки в серии с использованием аэрозольного способа нанесения культуры аллофибробластов макроскопически наблюдали закрытие раневого дефекта на 4,5± 0,9% от первоначального размера дефекта. Микроскопически наблюдали появление репаративных процессов в виде активизации макрофагальной реакции, образования грануляционной ткани на периферии и из дна раны в виде небольших тяжей пролиферирующих фибробластов веретенообразной формы. Участки грануляционной ткани характеризовались интенсивным новообразованием капилляров. Признаков воспаления не определялось.

К 7-м суткам в 6-й серии по данным планиметрии размер дефекта составил 77,8±2,3% от первоначального за счет краевой эпителизации. Микроскопически грануляционная ткань была представлена зрелыми фибробластами, формирующими тяжи. Наблюдались вновь образованные сосудистые петли. К 14-м суткам площадь раневого дефекта составила 40,4±3,5 % от первоначального за счет контракции раны и «наползания» эпидермиса на грануляционную ткань. При гистологическом исследовании в области краев раны определялся незрелый эпителий. Так же присутствовало большое количество зрелых фибробластов, формирующих соединительно-тканные тяжи.

На 21-е сутки в серии аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов у всех животных процесс закрытия раневого дефекта завершился. Кожный покров в месте дефекта визуально не был покрыт шерстью, кожа в этой области была розового цвета, в центре- рубец. При гистологическом исследовании рубец представлял собой соединительную ткань с преобладанием коллагеновых волокон. Количество элементов микроциркуляторного русла сокращалось до нормального уровня. Количество волосяных фолликулов составило 4,2 ±0,4%. Толщина эпидермиса -28,3±2,1 мкм что ниже нормы, толщина дермы увеличена за счет отека и составила 954,2±43,2 мкм. К 30-м суткам макроскопически рубец розового цвета, не покрыт шерстью, находится на уровне здоровой кожи. Площадь рубца составила 0,15±0,03 см2. Микроскопически наблюдается сглаживание сосочков дермы и уплощение эпидермиса. В эпидермисе определяются все четыре слоя. Однако толщина эпидермиса меньше нормы из-за уменьшения количества слоев клеток в каждом слое

и составляет 32,6 ±2,1 мкм. В дерме наблюдалось активное формирование кожных дериватов: количество волосяных фолликулов составило 5,2 ±0,3%. К 60 суткам макроскопически наблюдалось появление шерстяного покрова в зоне рубца. Микроскопически выявляется восстановление толщины всех слоев эпидермиса и возрастание его общей толщины до нормы 39,2 ± 2,7 мкм. Толщина дермы снижается по сравнению с 30-ми сутками за счет исчезновения явлений посттравматического отёка и составляет 735,2±63,5 мкм. Архитектоника сосочков дермы не отличается от нормы. Во всех слоях дермы большое количество новообразованных кожных дериватов на разных стадиях развития. Их плотность составила 8,2 ± 1,2%.

В серии с использованием культуры аллогенных фибробластов на покрытии «Фолидерм» на 3-й сутки макроскопически незначительное уменьшение площади раневого дефекта на 5,5±1,7 % от первоначального. Признаков воспаления не выявлено. Микроскопически наблюдали репаративные процессы, активизацию макрофагальной реакции, образование грануляционной ткани, представленной тяжами пролиферирующих фибробластов. Грануляционная ткань с вновь образованными капиллярами. Периферические сосуды расширены и полнокровны.

К 7-м суткам в серии с культурой клеток на покрытии «Фолидерм» при визуальном осмотре под покрытием определялась грануляционная ткань без признаков отделяемого. Площадь дефекта уменьшилась на 25,4±3,7% от первоначальной. По краям раны наблюдались признаки краевой эпителизации с наползанием на грануляционную ткань. Эпителизация была равномерной по всему периметру дефекта. При гистологическом исследовании: грануляционная ткань представляет собой плотно прилегающие друг к другу фибробластоподобные клетки и однонаправленные молодые коллагеновые волокна, пронизанные вновь образованными сосудами микроциркуляторного русла. Грануляционная ткань наиболее четко визуализировалась у края дефекта. К 14-м суткам раневой дефект был закрыт на 73,6±4,9% от начального за счет «наползания» эпидермиса на грануляционную ткань и контракции краев раны. При гистологическом исследовании в области краев раны определялся эпителий, с начальной дифференцировкой слоев. Наблюдались клетки в фазе деления, значительное количество вновь образованных сосудистых петель.

К 21-м суткам макроскопически определяли полную эпителизацию раневого дефекта. Кожа в месте дефекта визуально тоньше чем окружающая, в центре рубец площадью 0,16±0,03 см2. Волосяной покров отсутствует. При микроскопии в зоне

дефекта- соединительная ткань со значительным количеством коллагеновых волокон. Количество волосяных фолликулов в составило 4,8 ±0,4%. Толщина эпидермиса -29,1±2,5 мкм что ниже нормы, но статистически значимо не отличается от серии с аэрозольным применением культуры аллофибробластов.

К 30-м суткам визуально картина соответствует предыдущей серии. Микроскопически так же наблюдалось сглаживание сосочкового слоя дермы. Дифференцировка слоев эпидермиса завершена, но количество слоев клеток в каждом слое снижена, что подтверждается уменьшением его толщины 33,3 ±2,5 мкм. В дерме при морфометрии выявлено увеличение количества кожных дериватов 6,7 ±1,1%. К 60-м суткам макроскопически определялось наличие редкого шерстяного покрова в области рубца. Микроскопически сосочковый слой имел неровную структуру. Толщина дермы в пределах нормы и составила 720,4±59,0 мкм. Эпидермис имел нормальное строение с верификацией всех слоев и восстановлением количества клеток в каждом слое, что подтверждается морфометрическими данными- 39,4 ± 1,8 мкм. В дерме увеличенное количество волосяных фолликулов и желез. Плотность составила 10,5 ± 2,3%.

В серии с лечением глубоких дефектов кожного покрова с использованием раневых покрытий «Активтекс Ф» на 3-й сутки макроскопически уменьшение дефекта на 5,5± 1,8% от первоначального, что подтверждает правильность рандомизированного распределения серий наблюдения. Признаков острого воспаления не выявлено. Микроскопически наблюдали признаки репаративных процессов, образование грануляционной ткани. К 7-м суткам закрытие раневого дефекта 16,2±1,7 % от первоначального, что ниже чем в 6 и 7-ой серии. Микроскопически грануляционная ткань была представлена молодыми хаотично расположенными коллагеновыми волокнами. Формирующиеся элементы микроциркуляторного русла были представлены расширенными сосудами. На 14-е сутки площадь дефекта уменьшилась на 47,5±3,9% (р<0,05) от первоначальной, что статистически ниже чем в других сериях. Грануляционная ткань покрывает всю площадь дефекта. С краев раны визуализируются признаки краевой эпителизации. При гистологическом исследовании коллагеновые волокна, представляющие грануляционную ткань расположены упорядочение. Сосуды микроциркуляторного русла частично расширены.

На 21-е сутки в серии с применением «Активтекс-Ф» раневой дефект значительно меньшей площади, чем на 14-е сутки, но в отличие от основных серий,

заживление не завершилось. Площадь дефекта составляет 15,2±2,9 % от первоначальной. Ярко выраженные признаки краевой эпителизации при отсутствии контракции краев раны. Имеющийся дефект выполнен зрелой грануляционной тканью. Края раны без признаков воспаления. Эпителиальный слой не имеет четкой дифференциации слоев. К 30-м суткам в данной серии завершен процесс эпителизации, площадь рубца составила 0,28±0,07 см2. На гистологических препаратах в области рубца эпидермис по-прежнему сглажен и значительно истончен по сравнению с нормой: 20,8 ± 1,8 мкм. В нем удается четко дифференцировать только базальный и роговой слои. Между ними располагаются 1-2 слоя клеток, по форме и размерам похожих на клетки зернистого слоя, но лишенных базофильных гранул. При окраске орсеином наблюдаем нечетко контурирующую базальную мембрану, резкую сглаженность и уплощение сосочков дермы. К 60-м суткам макроскопически рубец широкий, лежит на уровне здоровой кожи, цвет выделяется по сравнению со здоровой кожей. Волосяной покров отсутствует. Микроскопически сосочки дермы сглажены, но более выражены, чем на ранних сроках с момента операции. Толщина дермы составила 940,4±59,0 мкм. Коллагеновые волокна имеют нормальную толщину и форму, в прилежащих к регенерату участках расположены параллельно поверхности кожи, в зоне регенерата - неупорядоченно, хаотично. Новообразование кожных дериватов снижено 2,1 ± 0,3%. Эпидермис представлен всеми слоями, но толщина ниже нормы и составляет 32,4±3,0 мкм (рис. 3). Подкожно-жировая клетчатка выражена слабо, атрофична, представлена единичными жировыми клетками, сутки^ 60 сутки

30 сутки 21 сутки

I

40,83

т

40,83

р 40,83

10

20

30

40

50

0

В Норма

555 Контрольная серия К Раневое покрытие "Активтекс Ф" ^ Культура аллофибробластов на покрытии "Фолидерм" н Аэрозольный способ нанесения культуры аллофибробластов

Рис. 3 Динамика изменения толщины эпидермиса в сериях с лечением глубоких дефектов кожного покрова.

Проведя анализ полученных данных, можно сделать вывод о том, что применение культуры аллогенных фибробластов позволяют ускорить сроки регенерации раневых дефектов кожного покрова. Это достигается за счет стимуляции собственных фибробластов кожи, что в свою очередь и ускоряет процессы регенерации. При этом эпителизация раневого дефекта проходит по тем же стадиям, что и при использовании раневых покрытий. Однако нами не выявлено статистически достоверных различий в скорости эпителизации в сериях с аэрозольным нанесением культуры аллофибробластов и их пересадке на покрытии «Фолидерм» (рис. 4).

а Культура аллофибробластов на покрытии "Фолидерм" ШАэрозольный способ нанесения культуры аллофибробластов ^ Раневое покрытие "Активтекс Ф" III Контрольная серия

Рис. 4 Динамика изменения площади раневого дефекта в сериях глубоких раневых дефектов кожного покрова.

Таким образом, способы лечения раневых дефектов с использованием культуры клеток на покрытии «Фолидерм» и аэрозольном распылении культуры аллофибробластов более эффективны, чем применение раневых покрытий «Активтекс Ф», и позволяют ускорить сроки эпителизации на 32,4± 3,1%. Применение культуры аллофиброластов на покрытии «Фолидерм» и при использовании аэрозольного способа нанесения культуры клеток не показывает статистически достоверно значимых различий в сроках эпителизации.

ВЫВОДЫ

1. Разработано устройство, позволяющее наносить культуру аллогенных фибробластов при помощи аэрозольного распыления на раневой дефект. Оптимальным расстоянием до раневой поверхности при распылении культуры клеток является 10 см, при объеме камеры распылителя 0,45 ем3.

2. Выживаемость культуры аллофибробластов после использования аэрозольного способа нанесения составила 94,2±1,2% in vitro при плотности монослоя 1344,6±29,4 кл/мм2.

3. Усовершенствованный способ хирургического лечения поверхностных и глубоких раневых дефектов кожи заключается в аэрозольном нанесении культуры аллофибробластов в количестве 1x105 клеток/мл на 2 см2 поверхности, 2-3-кратно с интервалом в 3 дня.

4. Реэпителизадия поверхностных ран кожного покрова при использовании аэрозольного нанесения культуры аллофибробластов происходит с образованием полноценного слоя эпидермиса за счет пролиферации базальных эпидермоцитов с краев раны и придатков кожи. Верификация всех слоев эпидермиса и дермы при поверхностных ранах достигается быстрее (к 7-м суткам) по сравнению с раневым покрытием «Акгивтекс Ф» и 3% раствором перманганата калия (к 14-м суткам).

5. Раневой процесс при глубоких дефектах колеи при применении культуры аллофибробластов (на покрытии Фолидерм и аэрозольном способе нанесения) характеризуется более быстрым формированием и созреванием грануляционной ткани, усилением процессов коллагеногенеза с последующим формированием эпителизированного рубца (к 21-м суткам) по сравнению с раневыми покрытиями «Активтекс Ф» (к 30-м суткам).

6. Эффективность местного лечения поверхностных и глубоких дефектов кожного покрова, изученная с позиций доказательной медицины, свидетельствует о преимуществах аэрозольного способа нанесения культуры аллофибробластов. Отмечено ускорение заживления поверхностных рай кожи в 1,5-2 раза, а глубоких ран - на 32% по сравнению с традиционным лечением.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения площади раневого дефекта и оценки динамики его изменения целесообразно применение раневой планиметрии с помощью компьютерной программы обработки изображения.

2. Разработанный способ моделирования раневого дефекта при помощи микрокристаллической дермабразии может быть рекомендован в дальнейших экспериментальных исследованиях.

3. Нанесение культуры аллофибробластов на рану можно производить с помощью разработанного аэрозольного распылителя.

4. Распыление культуры клеток необходимо проводить с расстояния 8-12 см до орошаемой поверхности, что позволит получить максимальное покрытие площади при сохранении нужной концентрации клеток на единицу площади.

5. Культуру аллофибробластов целесообразно наносить на поверхностный дефект кожи в 1-е сутки и на 3-й сутки от момента образования раны, а при глубоких дефектах - на 3-й, 7-е и 11-е сутки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Чаплыгин, С.С. Новые технологии в местном лечении экспериментальных ран кожных покровов / С.С. Чаплыгин // Сборник тезисов докладов 72 итоговой конференции СНО СамГМУ,- Самара, 2004 г.- С 209-210.

2. Чаплыгин, С.С. Экспериментальное обоснование новых подходов в лечении ран кожного покрова / С.С. Чаплыгин // Материалы 65-й юбилейной научно-практической конференции студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые- здравоохранению региона»,- Саратов, 2004. - С. 297.

3. Чаплыгин, С.С. Новые технологии в местном лечении экспериментальных ран кожных покровов/ С.С. Чаплыгин // Сборник тезисов докладов 73 итоговой конференции СНО СамГМУ.- Самара, 2005 г.- С 290

4. Дорожкина, Е.В; Оценка эффективности применения кулыуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи после операции дермабразии в эксперименте / Е.В. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Наука о человеке». - Томск, 2006. - С. 68-69.

5. Дорожкина, Е.В. Клеточные культуры фибробластов в лечении раневых дефектов кожи / Е.В. Дорожкина, С.С. Чаплыгин // Материалы 61-й межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки в здравоохранении»,- Екатеринбург, 2006.-С. 339-340.

6. Колсанов, A.B. Экспериментальное обоснование эффективности раневых повязок Акгивтекс БТ в лечении pan кожи и мягких тканей / A.B. Колсанов, С.С. Чаплыгин, A.B. Хачатрян, P.P. Юнусов// Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов (в составе ВНОАГЭ) Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия - Оренбург 2008. - Выпуск № 8 - С. 12-18.

7. Колсанов, A.B. Результаты клинического применения клеточных культур фибробластов в лечении ран и рубцовых деформаций кожи / A.B. Колсанов, В.Д. Иванова, С.С. Чаплыгин, Л.Т. Волова, Е.В. Орлов/Материалы всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы оперативной хирургии и топографической анатомии».-Москва, 2009 Г.-С.43-46.

8. Колсанов, A.B. Культуры фибробластов в лечении нормо-атрофических рубцов кожи /A.B. Колсанов, Е.В. Орлов, Л.Т. Волова, H.H. Золотовицкая, С.С. Чаплыгин// Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии».-Самара, 2009 г. - С. 248-250.

9. Колсанов, A.B. Обоснование эффективности раневых повязок в местном лечении ран кожного покрова в эксперименте / A.B. Колсанов, A.B. Хачатрян, С.С. Чаплыгин// Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии».-Самара, 2009 г. - С. 166-169.

10. Экспериментально-клиническое обоснование применения клеточных культур фибробластов в лечении рубцовых деформаций кожи / A.B. Колсапов, В.Д. Иванова, С.С. Чаплыгин, A.B. Толстое, P.P. Юнусов, Е.С.

Петров, A.A. Миронов, Б.И. Яремин, JI.T. Волова//Морфологическне ведомости № 3. 2009 Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов "Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия" Оренбург 2009. -Выпуск № 9 - С. 199-200.

11. Колсанов, A.B. Применение культуры аллофибробластов в местном лечении ран кожи после операции дермабразии / A.B. Колсанов, С.С. Чаплыгин, В.Д. Иванова // Морфология.- 2009.- № 4 (Том 136). - С. 78.

12. Колсанов, A.B. Оценка эффективности применения раневых покрытий при лечении ран и раневой инфекции кожи и мягких тканей / A.B. Колсанов, С.С. Чаплыгин, A.C. Воронин, A.B. Толстов, A.A. Миронов, Б.И. Яремин // Морфологические ведомости.- 2011.- № 2 (33)- С. 44-49.

13. Колсанов, A.B. Современные технологии местного лечения ран и раневой инфекции кожи и мягких тканей / A.B. Колсанов, С.С. Чаплыгин, A.C. Воронин, A.B. Толстов, A.A. Миронов, P.P. Юнусов //Материалы межрегиональной научной конференции с международным участием. Новые технологии в экспериментальной и клинической хирургии,- Саратов, 2011 г. - С. 84-85.

14. Колсанов, A.B. Современные способы профилактики и лечения ожоговой инфекции / A.B. Колсанов, С.С. Чаплыгин, A.B. Толстов, P.P. Юнусов //Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов (в составе ВНОАГЭ) Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия - Оренбург 2011. - Выпуск №11 -С. 8-10.

15. Чаплыгин, С.С. Сравнительный анализ различных способов нанесения культуры аллофибробластов при лечении раневых дефектов кожи у лабораторных животных / С.С. Чаплыгин, A.B. Колсанов, В.В. Болтовскап, М.С. Рубинская// Морфологические ведомости.- 2013.- №3 - С. 108-113.

АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА, ПАТЕНТЫ

1. Устройство для распыления суспензии клеточных культур. Патент РФ на полезную модель № 133734 от 26.04.2013/ A.B. Колсанов, J1.T. Волова, С.С. Чаплыгин, В.В. Болтовская; ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ. Заявка № 2013119762/14; Приоритет от 26.04.2013 (Россия). Зарегистрировано 27.10.2013. Опубликовано 27.10.2013. Бюллетень № 30.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Способ лечения раневых дефектов кожного покрова с использованием культуры фибробластов после микрокристаллической дермабразии. Удостоверение на рационализаторское предложение № 555, выданное Самарским государственным медицинским университетом 20.04.2007 / A.B. Колсанов, Е.В. Дорожкина, С.С. Чаплыгин.

2. Способ моделирования раневого дефекта кожного покрова путем применения микрокристаллической дермабразии. Удостоверение на рационализаторское предложение № 556, выданное Самарским государственным медицинским университетом 20.04.2007 / A.B. Колсанов, Е.В. Дорожкина, С.С. Чаплыгин.

Подписано в печать 25.10.2013 г. Формат 60x80/16. Объем 1 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ № 1542

Отпечатано с готового оригинал-макета в Центре Оперативной Полиграфии ООО «Стройхомплект». г. Самара, 443010, ул. Молодогвардейская, 104, тел.: (846) 333-33-32