Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Применение аллогенного сухожильного трансплантата для стимуляции регенерации сухожилий

На правах рукописи

Аслямов Наиль Назипович

ПРИМЕНЕНИЕ АЛЛОГЕННОГО СУХОЖИЛЬНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ СУХОЖИЛИЙ (экспериментально-морфологическое исследование)

14.00.02. - анатомия человека

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Уфа-2005

Работа выполнена в ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Мулдашев Эрнст Рифгаювич

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель медицинских наук РФ,

доктор медицинских наук, профессор Каган Илья Иосифович доктор медицинских наук, профессор Краюшкин Александр Иванович

Ведущее учреждение: Государсч пенное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Защита диссертации состоится «_»_2005 г в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 006 02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» rio адресу 450000, г Уфа, ул Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государс!венный медицинский университет Федеральною агенства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Автореферат разослан «Z/? » . _2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Р Т Нигматуллин

¿ÖVß^L j/с/ ygw

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эффективное лечение повреждений сухожилий и полноценная реабилитация пациентов с данной патоло1ией является актуальной проблемой современной травматологии и ортопедии [Казарезов MB с со-авт , 2004] Важную роль в развитии восстановительной хирургии сухожилий сьнрали работы по их рспарашвной регенерации рада отечественных и зарубежных авторов (Лаирищева Н И, Оноприенко Н А 1996. Демичев НИ. 1968, 1970, Казарезов MB 1998 2004 Фалк И1 , 1966, Awad НА, Butler DI,, Boivin G P , Smith F N, 1999, 2001)

Одним из направлений современной реконструктивной хирургии мягкого остова является пересадка различных аллотрансплантатов Так, по мнению ПП Коваленко (1975) аллогенные с\хожилия при пересадках выполняют три назначения 1) обеспечиваю! непрерывистость поврежденных аналогичных тканей, 2) служат каркасом па ко юром формируемся peieHepa; из клеточных элементов псаневого ложа, 3) являются биологическими ешм) ляторами в развитии репаративной регенерации

Многочисленными исследователями доказано, что аллогенные сухожилия в организме реципиента разрушаются, а на их месте развивается плотная волокнистая соединительная ткань (Берингер ЮВ, 1966, Брянцева J1H, 1964, Доманов А Г, 1969, Дорохов с соавт , 1970 )

Дальнейшее развшис методов восстановиюльных операций на сухожилиях невозможно без адекватного экспериментально-морфологического обоснования В связи с тем, что при повреждении сухожилия нарушается ф}нкция мышцы и происходит ее дирадация и дистрофия Поэтом) восстановление сухожилия важно еще и с точки зрения сохранения структуры и функции мышечного органа, предотвращения обратимых и необратимых дистрофических процессов (Демичев Н П , 1979)

Кроме того до нашею времени не решен вопрос о характере гкапи. «мешающей дефект сухожилий, оставаясь предметом споров между морфологами и хирургами Основные разногласия возникают по вопросу о том, образуется ли при регенерации истинная ткань сухожилия со свойственной ей типичной структурой или

же дефект замещается новообразова] нбй^^^^^^^йй^г^льной тканью

СЛетсвйпг OV/il

OS SUJ«»

Ш

При этом одни исследователи исключают возможность трансформации со-единительнотканно! о регенерата в истинное сухожилие, другие отмечают образование волокнистых пучков при участии клеток повреждённого сухожилия

Учитывая расхождения существующие в литературе по вопросу о peí сне-рации сухожилий, нами предприняты эксперимент ал ьные исследования по моделированию дефекта пят очною сухожилия с последующей пластикой биоматериалами Для замещения дефекта мы вы брат и два вида биоматериала структурированный и диспергированный аллогенный трансплантат сухожилия, приготовленный по требованиям ТУ 42-2-537-2002 и ТУ 4431-001-27701282-2002 соответственно

Цель работы

Экспериментально обосновать возможность применения диспергированного и структурированного аллогенного трансплантата для восстановления анатомической целостности сухожилий

Для достижения данной цели были носчанлены следующие задачи:

1 Экспериментально исследовать реакцию тканевого ложа при имплантации двух видов аллогенных биомагериалов трансплаша! и диспергированной формы биоматериала «Стимулятор регенерации» производства лаборатории биоматериалов Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (ТУ 42-2-537-2002)

2 Изучить структурные особенности регенерата, формирующегося при пересадке указанных двух видов биоматериала

3 Выработать рекомендации по применению ал.кненпого трансплантата (нити ленты) и диспергированного биоматериала, а также комбинированного применения обеих форм биоматериала при лечении травм сухожилий

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Пересадка коллагенсодержащих биоматериалов при экспериментальном дефекте сухожилия приводит к активации репаративных процессов Однако динамика замещения аллотрансплантатбв зависит от их структурной opi анизации

2 Диспергированные формы биоматериалов («Стимулятор регенерации») после введения в область дефекта сухожилия приводят к стимуляции репара-тивных процессов с относительно быстрой сменой фаз воспалительной реакции Входящие в состав биоматериала гликозаминогликаны, являясь адекватным матриксом для миграции клеток, обеспечивают раннюю пролиферацию клеточных структур и синтез волокнистых компонентов Первоначально волокна не имеют преимущественной ориентации, и только пройдя этап ремоделиро-вания, приближаются к структуре сухожилия

3 Структурированный биоматериал для пластики сухожилий (в форме ленты или нити) в ранние сроки 'жеперимента служит каркасом для новообразованных волокон и выполняет моделирующую роль для формирующегося регенерата. В результате изначально достигается одноосная направленность новообразованных коллагеновых волокон и компактное расположение пучков волокон

Научная новизна:

1 Пересадка аллогенного сухожильного биоматериала в структурированной и диспергированной форме в 'женерименте приводит к формированию структурно адекватного регенерата в обеих сериях опытов

2 В контрольной серии (аллотрансплантация структурированного биоматериала) регенерация ид&т по каркасу трансплантата, и завершается направленной одноосной ориентацией пучков коллагеновых волокон в регенерате Органное сосудистое русло тканевого ложа сохраняет высокую плотность, обеспечивая рснаративные процессы

3. В опытной серии происходит быстрая дифференцировка фибробла-стов с последующим формированием ориентированных коллагеновых пучков Репаративные процессы в трансплантате завершаются формированием функционально полноценного органного сосудистого русла тканевого ложа и регенерата

Практическая ценное п> работы

1 Впервые экспериментально и клинически обосновано применение диспергированного биоматериала «Стимулятор регенерации» для лечения повреж-

дений сухожилий Разработана методика введения данного биоматериала для стимуляции регенерации сухожилий

2 Впервые экспериментально обосновано применение аллогенных трансплантатов в форме ленты или нити, обработанных по требованиям ТУ 42-2-5372002 и ТУ 9431-001-27701282-2002, для лечения повреждений сухожилий Разработана методика сухожильной пластики с применением данного биоматериала для восстановления дефектов сухожилий

3 Применение аллогенного биоматериала улучшает результаты комплексного лечения разрывов (различной степени) и других видов травм сухожилий Клинические испытания указывают на возможность комбинированного применения обоих видов представленных биоматериалов, сокращаются сроки иммобилизации в послеоперационном периоде

4 Проведённые клинические испытания полностью подтвердили данные экспериментальных исследований и позволяют рекомендовать данные ал-лотрансплантаты для использования в хирургической практике Биоматериалы отечественного производства доступен для лечебных учреждений его применение не требует специальной аппаратуры, условий и может бып, рекомендован для широкого применения в учреждениях травматологического профиля

Реализация результатов работы

Основные положения и результаты исследования внедрены в клиническую практику травматологического пункта и отделения реабилитации городской клинической больницы № 10, отделение травматологии и ортопедии городской клинической больницы № 13 города Уфы

Апробация работы и публикация

Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на заседаниях отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирурши и на кафедре анаюмии человека Башкирско! о государственного медицинского университета

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы Получена приоритетная справка на изобретение № 011313 от 04 04 2005 Изданы методические рекомендации

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 120 странице машинописного текста состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы

Диссертация иллюстрирована 42 рисунками, содержи) 8 таблиц

В работе приведены данные 165 отечественных и 83 зарубежных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на 'жспериментально-морфологических исследованиях Эксперименты по трансплантации структурированной (контрольная серия) и диспергированной (опытная серия) форм биоматериалов проводились целью доказательства возможности их применения в клинической практике. Для стимуляции регенерации сухожилий.

Экспериментальные исследования

Исследования проводились на половозрелых крысах породы «Вистар» На пяточное сухожилие наносилась насечка на Уг его ширины Затем в опытной группе дефект иерифсжально обкалывался ешмулятором распсрации, а в кон-фольной группе производилась аллотрансплантация сухожильной нити Ал-лотрансплантат «стимулятор регенерации» в количестве 50 мг разводился в 510 мл физиологического раствора и вводился перифокально в область дефекта в две точки по 0,02-0,04 мл. В качестве контроля использовали биоматериал Ал-лоплант для пластики сухожилий, в форме ленты (нити) При этом сухожильная нить с помощью иглы проводилась или через аналогичный с опытной серией дефект (нассчка на Уг ширины сухожилия) Для основной и контрольной ipyrin аллогенпые биоматериал!,i roi овились в тканевом банке ФГУ «Всероссийский центр пшзной и плаоичсской хирургии Федерального агешшва по здравоохранению и социальному развитию» (г Уфа) в соответствии с требованиями ТУ 42-2-537-2002 и ТУ 9431-001-27701282-2002 соответственно

Диспергированный биоматериал - продукт тонкого измельчения различных аллогенных сухожилий, обработанный также по ТУ 9431-001-277012822002 Дисперсность измельченных частиц биомагериала сос!аиляет 45-

120 мкм По данным РА Хасанова (1999) диспергированный биоматериал «Стимулятор регенерации» содержит 82% белка, 74,6% которого составляет коллаген и 7,4% - неколлагеновые белки Суммарное количество протеогли-канов и гликозаминогликанов составляет 3,46% В их составе преобладает гиалуроновая кислота

Установлено, что оптимальной дозой для инъекции концентрацией ДБМА, при которой образуется стабильная суспензия, является 40 мг/мл (Хасанов P.A., 1999)

Динамику структурных изменений изучали на 1, 3, 7, 14, 30, 60. 90 и 120-е сутки эксперимента Всего для проведения экспериментов использовано 86 лабораторных крыс Животных выводили из опыта путём передозировки эфира Для гистологических исследований производился забор трансплантата с окружающими тканями с последующей фиксацией в 10% растворе нейтрального формалина Серийные гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, а также по методу Ван-Гизона и Малори

На гистологических препаратах проводили подсчёт коэффициента дифференциации фибробластов. определение степени ориентации и толщины волокон коллагена, подсчет суммарной площади просвета капилляров (CI11IK) на единицу площади (27.8 тыс мкм2) в ложе биоматериала, измерение коэффициента анизотропии

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Далее приводятся результаты двух серий экспериментально-морфологических исследований

Морфологическая динамика биодеградации аллотрансплантата для пластики сухожилий (контрольная серия)

Эксперимент по аллотрансплантации сухожильной нити в область дефекта сухожилия, показал, что данный биоматериал подвергается поэтапной перестройке и замещению в соответствии с закономерностями заместительной регенерации при аллотрансплантации тканей

3-й сутки Структура трансплантата сохранена на всем его протяжении Уже в ранние сроки обнаруживается реакция тканевого ложа на аллотранс-плантат В краевых зонах он инфильтрирован сегментоядерными лейкоцитами, макрофагами и фибробластами, что свидетельствует о высокой степени обменных процессов в месте трансплантации и выраженной регенерационной способности ткани сухожилия Данная полиморфноклеточная инфильтрация направлена вдоль пучков волокон трансплантата и распространяется от периферии к центру В тканевом ложе аллотрансплантата выделяются три зоны реактивная, краевая и контактная Между тканевым ложем и аллотранспланта-юм произошла плотная адгезия В реактивной зоне тканевого ложа умеренная сосудистая реакция, выраженная в расширении путей оттока крови В реактивной зоне выявляются недифференцированные соединительнотканные клетки в количестве 7,0±0,74, макрофаги в количестве 5,4±0,71, юные фиб-робласты - 16,8±0,72

7-е сутки Размеры трансплантата в целом сохранены, толщина нити сохраняйся в пределах 3 мм Нин. находится в состоянии плотной адгезии с тканевым ложем на всем протяжении В зонах тканевой) ложа и нити произошли заметные структурные изменения В ложе трансплантата умеренная сосудистая реакция, выражающаяся в равномерном расширении капилляров, посткапилляров и венул Трансэндотелиальный выход клеток из расширенных звеньев мик-роциркуляторного русла создает инфильтрацию тканевого ложа сегментоядерными лейкоцитами, макрофагами, лимфоцитами и фибробластами Эти клетки обеспечивают посттравматическую регенерацию краевой зоны ложа и внедряются в трансплантат

Краевая зона трансплантата инфильтрирована клетками и новообразованными кровеносными капиллярами Клеточный состав инфильтрата представлен макрофагами и фибробластами Внедрение клеток в трансплантат идет быстрее вдоль волокон по межпучковым прослойкам рыхлой ткани, а также между отдельными волокнами Зона инфилырации нити имеет ширину 3(Х)-330 мкм Вместе с указанными клетками висдрякмся и новообразующиеся капилляры В данный срок в краевой зоне нитей обнаруживаются новообразованные коллагеновые фибриллы Вместе с указанными клетками внедряются и новообразующиеся капилляры

В зоне инфильтрации трансплантата клетки распределились следующим образом макрофаги - 2,3±0,72, недифференцированные соединительнотканные клетки - 7,8±0,71 Клеточная и сосудистая инфильтрация сопровождается разрушением и размыванием межклеточного матрикса

14-е сутки В тканевом ложе артериолы и венулы с расширенным просветом, а зона новообразования сосудов сместилась в глубь трансплантата В периферической зоне трансплантата происходит замещение его структур тканями реципиента Зона замещения по периметру трансплантата расширяется В тканевом ложе признаки воспаления Заметно уменьшились В краевой зоне ложа уменьшилась выраженность клеточной инфильтрации, уменьшилась выраженность реакции кровеносных сосудов на воспаление (локальное расширение просвета капиллярного и посткапиллярно-венулярного звеньев, краевое стояние и трансэндотелиальный переход лейкоцитов) Уменьшение воспаления тканевого ложа в данный срок является признаком обусловленности его, в основном, операционной травмой, а не антигенными свойствами пересаженного материала, то есть это признак слабой антигенности трансплан 1ата На месте бывшей контактной зоны сформировались дифференцированные на аргериолы и венулы сосуды как пути доставки и оттока крови в зону замещения трансплантата Сама контактная зона заросла новообразованными тканями

В зоне замещения трансплантата выявляется большое количество макрофагов, фиброкластов и фибробластов Макрофаги - 3,5±0,71, недифференцированные соединительнотканные клетки - 3,7±0,36, фибробласты - 2,0±0,5 Очевидно значительное количество коллагеновых волокон перерабатывается фиб-рокластами В этот срок и под световым микроскопом выявляются ориентированные предсуществующими волокнами новообразованные ко.хдагеновые фибриллы.

В стенке некоторых сосудов появляются единичные гладкомышечные и адвентициальные клетки В месте появления гладкомьппечных клеток диаметр сосуда несколько уменьшается Микроциркуляторное русло дифференцируется на отдельные звенья

30-е сутки В тканевом ложе признаки воспаления заметно уменьшились Область трансплантации нити инфильтрирована полностью Идёт образование

пучков коллагеновых волокон Постепенно нарастают процессы замещения трансплантата' по его окружности по межпучковым пространствам и между отдельными волокнами в направлении центра продвигаются макрофаги, фиброб-ласпл и фиброкласты В периферической зоне относи/елыю крупные артерио-лы и венулы ориентированы но ходу формирующихся пучков Кровеносные сосуды регенерата дифференцированы на отдельные звенья и напоминают сосуды сухожилий Фибробласты контактной зоны активно синтезируют коллагеновые волокна и с периферии поэтапно замещают аллотрансплантат За ними тянутся новообразованные капилляры, напоминая капиллярные петли по периферии бессосудистых зон На периферии нити обнаруживается достаточно плотный регенерат, который хорошо выявляется при окраске по Малори

Коллагеновые волокна разрушаются не одновременно, а избирательно, с определенной очередностью Сначала разрушаются волокна несколько большего диаметра с нечеткими контурами, расщепленные или с признаками фрагментации (по-видимому, это более старые волокна) Сохранившиеся волокна играют ведущую роль в ориентации новообразованных фибрилл и в обеспечении биомеханических параметров замещающегося трансплантата

Клеточный состав зоны инфилырации следующий макрофаги - 5±0.71, клетки фибробластического дифферона соедини гель потканные - 2,7±0,35, юные фибробласты 3,0±0,88 Показатель двойного лучепреломления для пучков коллагеновых волокон аллогенной сухожильной нити составили 0,15, что указывает на сохранение внутренней структуры нити в данный срок

В промежуточной зоне замещения волокна располагаются более свободно, но преимущественная ориентация их соответствует направлению волокон граненлашага Представляется очень важным, что новообразование коллагеновых фибрилл идет не сплошным фронтом с резкой границей раздела, а рядом с сохранившимися волокнами, постепенно

90-е сутки Трансплантат замещён тканями реципиента Сформировавшийся регенерат представляет собой плотную оформленную соединительную ткань с незначительными отклонениями от нормальной ткани сухожилия Клеточный состав представлен макрофа1ами - 3 2±1,5. недифференцированными соединительнотканными клетками - 9.2±1 08 юными фиброблас!ами - 11,8±0,72, зрелыми фиб-

робластами - 26,3±1,59 По площади регенерат соответствует нанесенному ранее дефекту Вновь синтезированные коллагеновые волокна обладают достаточно высоким показателем двойного лучепреломления в пределах 0,1-0,08

На месте трансплантата сформировался регенерат, идентичный окружающей ткани сухожилия Однако в данный срок могут обнаруживаться очаговые остатки трансплантата Тем не менее, регенерат имеет присущую сухожилию толщину и однонаправленную ориентацию пучков коллагеновых волокон

Изучение процесса замещения соединительнотканных трансплантатов, как нам представляется, целесообразно выделить отдельные зоны контактную зону (между трансплантатом и тканевым ложем), реактивную зону тканевого ложа и зону инфильтрации в трансплантате

Морфологическая динамика биодеградации диспергированного биоматериала - «Стимулятор регенерации» (в опытной серии)

Проведение эксперимента на лабораторных крысах с нанесением насечки на сухожилие и дальнейшим перифокальным обкалыванием диспергированной формой аллотрансплантата показало, что данный вид биоматериала является адекватным модулятором регенерации плотной оформленной волокнистой соедини! ель-ной ткани и уже в ранние сроки активирует процессы репаративной регенерации

3-е сутки. В ранние сроки эксперимента наблюдалась полиморфноклеточ-ная инфильтрация диспергированного биоматериала В инфильтрате представлены сегментоядерные лейкоциты, макрофаги и в меньшем количестве лимфоциты и фибробласты Недифференцированные фибробласты образовали тяжи клейме вдоль волокон трансплантата В эти же сроки наблюдалась характерная инфильтрация трансплантата макрофагами Это свидетельствует о начале резорбции биоматериала

Клеточный состав зоны инфильтрации следующий макрофаги - 10±0,8. недифференцированные соединительнотканные клетки - 9±1,2, юные фибробласты - 20,1 ±0,8

Наблюдалась активная сосудистая реакция окружающей ткани на введение диспергированного биоматериала Место введения биоматериала обильно кро-воснабжалось, на что указывает увеличение суммарного просвета капилляров

тканевого ложа Это свидетельствует об активной реакции тканевого ложа диспергированных форм биоматериала В данной серии элементы микроциркуля-торного русла, такие как артериолы и венулы реагируют на аллотранспланта-цию раньше, чем в контрольной серии В эти же сроки обнаруживались набухание и гомо1 списания коллагеновых волокон диспергированного биоматериала, свидетельствующие о начинающейся деградации введённых частиц

1-е сутки. Деградация коллагеновых волокон диспергированного биоматериала и фагоцитоз лизированных фрагментов макрофагами приобретают более интенсивный характер Наибольшая концентрация макрофагов наблюдалась в зоне контакта частиц диспергированного биоматериала с окружающими тканями Здесь, по-видимому, происходит активная резорбция биоматериала макрофагами

Клеточный инфильтрат области введения представлен макрофагами -15±2,1. недифференцированными соединительнотканными клетками - 10±2,1, юными фибробластами 19,8±0,71 При окраске по Ван - Гизону можно выделить тонкие розоватые тяжи идущие от фибробластов - признак активного синтеза коллагеновых волокон Реакция сосудистого русла в ток срок оставалась практически неизменной' тканевое ложе обеспечивала трансплантат обильным кровоснабжением Поэтому суммарная площадь просвета капилляров регистрируется именно в этот срок Данный показатель является пиком активности микроциркуляторного русла на данной стадии воспаления

Сосуды из окружающих тканей беспрепятственно (в сравнение с контрольной серией) прорастают в область трансплантации, это объясняется не только мелкодисперигрованной структурой биоматериала, введённого в данную область, но и стимулирующим эффектом биоматериала, который он оказывает на все элементы ренаративных процессов

14-е сутки. Идёт формирование зрелых волокон коллагена, окрашивающиеся в красный цвет по Ван-Гизот Полиморфноклеточная инфильтрация на месте введения диспергированного биоматериала менее выражена, чем в ранние сроки, сохраняется макрофагальная реакция Их активация вызвана присутствием гликозаминогликанов в составе диспергированного биоматериала, которые захватываются макрофагами, перерабатываются и активируют синтезирующую функцию фибробластов На ж> указывает большое количество вновь

синтезированных волокон коллагена В зоне инфильтрации выявляются макрофаги - 10,2±1,7, недифференцированные соединительнотканные клетки -10,1±2,1, юные фибробласты 23,2±2,2 В периферической зоне относительно крупные артериолы и венулы ориет ировапы по ход}' формирующихся пучков В реактивной зоне выявляются функционирующие терминальные микрососуды и единичные недифференцированные соединительнотканные клетки

На месте бывшей контактной зоны сформировались дифференцированные на артериолы и венулы сосуды как пути доставки и оттока крови в зон}7 замещения трансплантата Сама контактная зона прорастает новообразованными тканями Формирующийся регенерат повергается поэтапном}' ремоделированию В целом •

формир} емый регенерат соот вегствует новообразованной т кани сухожилия

30-е сутки В последующие сроки происходит полная резорбция чаешц диспергированного биоматериала, и они уже гистологически не обнаруживаются Большая часть резорбированного диспергированного биоматериала замещена новообразованной плотной соединительной тканью, по структуре мало отличающейся от окружающей Происходила дальнейшая дифференцировка фиб-робластов, о чем можно судить по форме их ядер Выраженной инфильтрации макрофагами области введения диспергированною биоматериала не наблюдается, так как их функция в основном завершается Клеточный состав макрофаги - 4,3±1,1, недифференцированные соединительнотканные клетки 3,0±0,85, зрелые фибробласты - 28,2±2,2

Скорость резорбции биоматериала в опытной серии сбалансирована со скоростью фибриллогенеза Одним из подтверждений этой гипотезы является обнаружение новообразованных волокон коллатепа окружающих фибробласты в месте введения диспергированного биома!сриала, которые выявляются микроскопически при окраске по Ван - I иадну и при поляризационной микроскопии Вновь синтезированные волокна коллагена имеют высокий показатель двойного лучепреломления 0,1 -0,08

90-е сутки Трансплантат замещается тканями реципиента На месте травмы сформировался адекватный регенерат, представляющий собой плотную оформлению волокнистую ткань с относительно большим, чем в сухожилии количеством клеточных элементов и сосудов 11ри этом в регенерате менее выражена изви-

листость коллагеновых волокон и плотность их упаковки Об этом свидетельствует ряд морфологических признаков Коллагеновые волокна имеют высокий показатель двойного лучепреломления 0,1-0,15 При поляризационной микроскоиии выявляются пучки коллагеновых волокон I и II порядков, ориентированные параллельно продольной оси сухожилия Также обнаруживаются дифференцированные фибробласты, расположенные между этими пучками, имеющие базофиль-ные продольно вытянутые ядра (признак их высокой степени дифференциации) Встречаются также и дефинитивные формы фибробластов фиброциты или тено-циты, расположенные также перифибриллярно 5» Клеточный состав на данный срок следующий макрофаги - 2,3±0,71, не-

дифференцированные соединительнотканные клетки - 2,2±0,5, зрелые фибробласты (фиброциты) - 32,2±2,3.

Новообразованные капилляры растут по межпучковым прослойкам и поэтому ориентированы вдоль коллагеновых волокон Относительно крупные ар-териолы и венулы в тканевом ложе трансплантата ориентированы по ходу формирующихся пучков

I Гри поляризационной микроскопии регенерата обнаруживаются преимущественно пучки II порядка, их толщина меньше в сравнении с нормой

Таким образом, постепенно на месте трансплантата в опытной серии происходит формирование адекватного ткани сухожилия регенерата, при этом увеличивается толщина пучков волокон коллагена II порядка в регенерате с 8,4±0,2 (0,2) мкм на 3 сутки до 20,0±0,6 (1,1) и достигает наибольшего значения- 29,1^0,7 (0,4) мкм на 67 сутки Раннее формирование пучков второго порядка объясняется тем, что при резорбции данного вида биоматериала происходит активация макрофагов с выделением цитокинов (Муслимов С А , 2000) В результате происходит стиму-* ляция фиброклазии, и фибробласты формируют однонаправленные фибриллы, за

счет чего уплотняются пучки волокон коллагена в регенерате

В контрольной серии эксперимента динамика увеличения толщины волокон коллагена отличается от таковой в опыте На 3 сутки этот показатель составляет 7,3±0,2 (0,2) мкм, затем на 30 сутки он составляет 16,6±0,5 (0,3), и лишь на 90 сутки достигает значения близкого к норме - 28,8±0,7 (0.4) мкм В данной серии формирование регенерата происходит по каркасу пересаженного

трансплантата - биоматериала для пластики сл хожилий На рис 1 представлена динамика изменения юлщины коллагеновых волокон в формирующемся регенерате в основной и контрольной серии эксперимента

Разработанный нами на основании данных В В Серова (1995) метод определения коэффициента дифференциации фибробластов показал следующие результаты В опытной сери эксперимента в трансплантате на 7-е сутки коэффициент был равен 0,75±0,03 (0,05) и достигает миним} ма на 90 сутки 0,26±0,03 (0,05), тогда как в норме эгот показатель равен 0,23±0,03 (0,06) Ранняя диффе-ренцировка фибробластов 1акже объясняется влиянием цюокинов образующихся при резорбции диспер1ированного биоматериала

В контроле коэффициент дифференциации на 3 сутки равен 0,821 ±0.03 (0,06), далее он изменяется до 0,6±0,03 (0,05) к 30 суткам, а на 90 сутки имеет значение 0,32±0,03 (0,05) Следовательно, в данной серии эксперимента в те же сроки фибробласты менее зрелые, чем в опыте На рис 2 показана динамика изменения величины коэффициента дифференциации фибробластов в формирующемся регенерате ош.п ной и контрольной серии эксперимента

Толщина 35 ■ коллагеновых волокон мкм

30

25

20

—•—Опытная серия --»--Контрольная серия

15Н

Юл

..К

7 14 21 30 44 67 77 90 Сроки эксперимента сутки

Рис 1 Динамика изменения толщины коллагеновых волокон в формирующемся регенерате

Коэффициент дифференциации

фибробластов 0 8

Опытная серия -*- Контрольная серия

0,2 -

0,1 -

о

Сроки эксперимента сутки

7

14

21

30

90

норма

Рис 2 Динамика изменеиия коэффициента дифференциации фибробластов в формирующемся регенерате

В ранние сроки в тканевом ложе аллотрансплантатов определяются признаки воспалительной реакции на операционную травму, заключающуюся в расширении дренажно-депонирующего звена микроциркуляторного русла Однако тканевое ложе по-разному реагирует на различные виды биоматериала и приводит к формированию несколько отличного регенерата Например, о зрелое! и и качестве регенерат можно судить по состоянию васкуляризации трансплантата.

Чтобы доказать выше сказанное мы выбрали метод подсчёта суммарной площади просвета капилляров в тканевом ложе трансплантата на единицу площади (27,8 тыс мкм2)

В опытной серии эксперимента выбранный показатель изменяется от 408,5±16,1 (18,0) на 7 сутки до 234,2±12,8 (23.2) на 90-е сутки, в норме суммарная площадь просвет а капилляров данной об. 1аа и равна 143,8±10,2 (18.9)

В контроле суммарная площадь просвета капилляров в тканевом ложе изменялась по такому же принцип}' В ранние сроки (7-е сутки) данный показатель составил 455,5±11,2 (17,9), затем на 30-е сутки происходил спад этой величины до 217,6±10,1 (16,8), на 90-е сутки до 172,9±8,0 (10,0) На рис 3 пока-

зана динамика изменения суммарной площади просвета капилляров тканевого ложа трансплантата в контрольной и опытной сериях эксперимента

Суммарная 500 площадь просвета капилляров, ^

-■»--Опытная серия -»-Контрольная серия

норма 7 21 30 90 Сроки эксперимента сутки

Рис 3 Динамика изменения суммарной площади просвета капилляров тканевого ложа трансплантата в контрольной и опытной сериях эксперимента

Показателем, отражающим зрелость регенерата, также является степень ориентации п\ чков коллагеновых волокон Данный показатель необходим ещё и с точки зрения оценки насколько адекватным является сформированный регенерат, так как плотная оформленная соединительная 'I кань сухожилия имеет строго однонаправленные волокна коллагена в своём составе

Полученные в финале опытной и контрольной серий результаты практически не отличаются (81±4% (19) и 85±5% (23) соответственно) Это связано с тем, что в контрольной серии формирование регенерата проходит изначально по каркасу фансплантата, а в основной - за счет поэтапного ремоделирования регенерат а

Таким образом, из результатов эксперимсша вытекает, чго структурные изменения в тканевом ложе и в области трансплантации в опытной и контрольной сериях происходят не однотипно с точки зрения различных показателей, но в итоге образуется регенерат адекватный ткани сухожилия Проведенный эксперимент показал, что выбор биоматериала для восстановительной операции

при повреждении сухожилий должен проводиться в соответствии с учётом описанной динамики репаративных процессов

ВЫВОДЫ

1 Аллогенные сухожильные биоматериалы, подвергну 1 ые 1ехнологиче-ской препаровке и мембраполизу удовлетворяют требованиям, про, и,являемым к биоматериалам, используемым при пластике повреждённых сухожилий

2 Два вида аллогенного сухожильного биоматериала (структурированный и диспергированный) отличаются низкой иммуногенностью, и после трансплантации в эксперименте замещаются плотной оформленной волокнистой соединительной тканыо в соответствии с общими закономерностями заместительной регенерации Однако, несмотря на одношпный финал репаративных процессов динамика процесса замещения структурированного и диспергированного форм аллотрансплантатов имеют специфические особенности

3 Пересадка структурированного биоматериала в форме ленты (нити) характеризуется относительно меньшей реакцией тканевого ложа, включая состояние органного сосудистого русла, изначально высокой степенью ориентации пучков коллагеновых волокон сформированного регенерата 85±22,4 (5,1)%, что указывает на высокие прочностные свойства сформированного регенерата

4 При трансплантации диспергированной формы биоматериала происходит ранняя пролиферация и дифференцировка фибробластов, а также активный синтез новообразованных коллагеновых волокон Данные пучки волокон, в отличие от контрольной серии, проходят этап ремоделирования, и лишь в последующем формируют однонаправленные структуры В тканевом ложе трансплантата происходит значительное увеличение суммарной площади просвета капилляров на 3-7-е сутки и последующее снижение этою показателя

5 Представленные экспериментальные данные по типу замещения трансплантатов могут быть использованы в клинической практике для разработки хирургической тактики при повреждениях сухожилий, а также для выработки показаний и противопоказаний для использования предложенных аллотрансплантатов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При лечении дефектов сухожилий различной степени тяжести возможно применение дв\ х видов биоматериалов - биоматериала для пластики сухожилий и диспергированного биоматериала в зависимости от тяжести поражения Данные виды биома1сриала зарегистрированы Министерством здравоохранения и социального развития Российской федерации и производная на базе специализированной лаборатории Всероссийский центр глазной и пластической хирургии (г Уфа) в соответствии с требованиями ТУ 42-2-537-2002 (диспергированный биоматериал) и ТУ 9431-001-27701282-2002 (биоматериал для пластики сухожилий) Б)дучи препаратом отечественного производства, данный биоматериал доступен для лечебных учреждений

2 Комбинированное применение данных форм биоматериалов показано при лечении разрывов сухожилий, сочетанных с выраженными ;ici оперативными изменениями сухожилий, а также для стимуляции репаративных процессов в области дефекта.

3 Возможно повторное применение диспергированного аллогенного биоматериала для усиления терапевтического эффекта

4 Методика транплантации биоматериалов при лечении повреждений сухожилий не требует специальных условий и оборудования Диспер1 ированные формы биоматериала Moiyr использоваться в общехир)<ргичсских оационарах

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Восстановление структуры сухожилий с применением биоматериалов / Аслямов H.II, Мулдашев Э Р , Нигматуллин Р.Т [и др ] // www Reg Surgery ru 2005 - № 1.

2 Применение биомагериалов для стимуляции регенерации с}хожилий / Аслямов Н Н, М> лдашев Э Р , Нигматуллин Р Т [и др ] // Актуальные вопросы правовой охраны и коммерциализации результатов ишеллектуальной деятельности тезисы межрегиональной научно-практической конференции - Уфа, 2005 - С 34

3 Способ стимуляции реиаративной регенерации сухожилий и связок с применением биоматериала «Аллоплант» Mei одические рекомендации для

врачей / Аслямов НИ Мулдашев Э Р . Нигматуллин Р Т [и др ] - Уфа Издательский отдел Всероссийского центра глазной и пластической хир\ргии, 2005

4 Аслямов, Н Н Применение биоматериалов для стимуляции репаратив-ной регенерации при фавмах мягкого остова // Практическая медицина ¡1 фар-мако-жоиомика Спец вып -М 2005 -№1 -С 53

Изобретения

1 Способ стимуляции репаративной регенерации сухожилий и связок Заявка на патентование № 011313 / Аслямов НН, Мулдашев 1Р. Пигмат\л-лин Р Т [и др ] - Приоритетная справка № 2005109596 от 04 04 2005

Аслямов Наиль Назипович

ПРИМЕНЕНИЕ АЛЛОГЕННОГО СУХОЖИЛЬНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ СУХОЖИЛИЙ (экспериментально-морфологическое исследование)

Авторефера! диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Издательская тацензия № 06788 от 01 11 2001 г ООО «Издательсшо «Здравоохранение Башкортостана» 450077, Pb,i Уфа, >л Ленина, 3, тел (3472) 22-73-50, факс 22-37-51

Подписано в печать 23 05 2005 г Формат 60x84/16 Гарнитура i unes New Roman Бумага офсетная Отпечатано на ризотрафе Уел печ л 1,4 У ч -изд л 1,5 Тираж 100 Заказ №191

№117 19

РНБ Русский фонд

2006-4 6890