Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Препараты на основе иммуноактивного дипептида и его координационных соединений с ионом цинка

Бобиев

Гуломкодир Муккамолович

ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОАКТИВНОГО ДИПЕПТИДА И ЕГО КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИОНОМ ЦИНКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

-1 т

тг

Москва, 2012 г.

005010942

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России и в Таджикском государственном педагогическом университете имени С. Айни Республики Таджикистан

Научные консультанты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук

доктор фармацевтических наук доктор фармацевтических наук

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «__»___________2012 г. в ___часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49

Автореферат разослан «_____»____________2012 г.

Бунятян Наталья Дмитриевна

Меркулов Вадим Анатольевич

Боковикова Татьяна Николаевна Чистяков Виктор Владимирович Каленикова Елена Игоревна

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Н.П. Садчикова

Актуальность проблемы. В настоящее время установлено, что нарушение функции иммунной системы организма зачастую приводит к возникновению широкого круга заболеваний. С целью профилактики таких патологий успешно используются иммуномодулирующие препараты, нередко полученные синтетическим путем. Однако, являясь чужеродными для живого организма, они могут провоцировать возникновение неблагоприятных побочных реакций (НПР). Альтернативой синтетическим средствам могут стать препараты, созданные на основе эндогенных иммуномодулирующих пептидов. В 70-х годах XX века из тимуса были получены экстракты, обладающие иммуномодулирующими свойствами (В .Г. Морозов и соавт., 2000). На основе этих экстрактов разработано несколько препаратов - тималин, тактивин и др., представляющих собой смесь большого количества пептидов, из которых были выделены индивидуальные пептиды и изучены их биологические свойства. При этом установлено, что некоторые триптофансодержащие дипептиды обладают иммуномодулирующими свойствами, в том числе Н-Ие-Тгр-ОН и Н-С1и-Тгр-ОН, на основе которого создан препарат тимоген (Яковлев Г.М. и соавт., 1990). В отличие от тимогена, дипептид Н-11е-Тгр-ОН оказывал влияние как на Т-хелперные (С04+), так и на Т-супрессорные (С08) клетки, что позволило сделать предположение о том, что лекарственные средства, изготовленные на его основе должны обладать более широким спектром иммунологической активности.

Преимущество таких препаратов состоит в том, что они не являются чужеродными организму, вследствие чего не обладают токсичностью и не оказывают НПР. Опыт применения тимогена, вилона, иммунофана и других препаратов, являющихся синтетическими пептидами, соответствующими по аминокислотной последовательности природным, подтвердил справедливость данного утверждения. Все вышеизложенное показывает актуальность разработки новых

иммуномодулирующих препаратов на основе синтетических пептидов эндогенного происхождения, обладающих

иммунотропной активностью.

Малое содержание этих пептидов в организме и сложность выделения их из тимуса в чистом виде обуславливает особую актуальность разработки оптимальных методов их химического синтеза.

Известно, что в функционировании иммунной системы важную роль играют некоторые микроэлементы, наиболее значимым из которых с этой точки зрения является цинк. Роль его в клеточном и гуморальном иммунитете уже ни у кого не вызывает сомнений (Кудрин А.В. и соавт., 2000, 2007; ТакаЬаэЫ К., 1999; Тгап СШ., 1999; Бевига^ М., 1999).

Установлено, что при комплексообразовании ионов различных металлов с биологически активными соединениями, в том числе иммуноактивными, происходит увеличение специфической и расширение спектра биологической активности последних. Однако до настоящего времени не был разработан ни один лекарственный препарат на основе биокоординационных соединений иммунологически активных микроэлементов и низкомолекулярных пептидов. В связи с этим, представляется актуальным изучение путей комплексообразования низкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионами биологически активных металлов, таких как цинк; создание на их основе иммуномодулирующих препаратов; разработка методов стандартизации и технологических схем производства.

Цель и задачи исследования: разработка методов

получения иммуноактивных дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка и создание на их основе новых иммуномодулирующих препаратов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить технологичность и безопасность различных путей получения триптофансодержащих дипептидов с использованием различных активированных эфиров и методов их получения.

2. Определить параметры стандартизации и методики

анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием методов спектрофотометрии, тонкослойной и

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Изучить взаимодействие триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка с использованием методов рН-метрического и окс-редметрического титрования.

4. Изучить влияние соле- и комплексообразования на хроматографическую подвижность триптофансодержащих дипептидов.

5. Разработать условия хроматографирования методом ВЭЖХ дипептида изолейцил-триптофан и его координационных соединений с ионом цинка.

6. Разработать технологические схемы производства препаратов тимогар и тимоцин, а также методы их стандартизации.

7. Изучить стабильность препаратов тимогар и тимоцин в условиях длительного хранения.

8. Разработать нормативную документацию на препараты тимогар и тимоцин.

9. Провести доклинические и клинические исследования препаратов тимогар и тимоцин.

Научная новизна работы. На основе дипептида Н-Ие-Тгр-ОН и его координационных соединений с ионом цинка впервые разработаны технологические схемы производства и методы стандартизации иммуномодулирующих препаратов тимогар -

0,01% водный раствор дипептида и тимоцин - 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка; исходных фармацевтических субстанций и их стандартных образцов.

Впервые изучена возможность использования ПСА-метода для синтеза аналогов тимопентина и Ы-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Экспериментально подтверждено преимущество использования активированных (пептафторфениловых) эфиров при получении низкомолекулярных тимусных пептидов.

Получены координационные соединения дипептидов Н-С1у-Тгр-ОН и Н-11е-Тгр-ОН с ионом Ъп1*. Использование окислительной функции позволило установить состав координационных соединений Ъп ' и дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Разработаны методы стандартизации триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка,

основанные на использовании современных физико-химических методов анализа.

Установлено увеличение специфической и расширение спектра биологической активности исследуемых комплексных соединений триптофансодержащих дипептидов с биологически активным микроэлементом - цинком.

Отмечено сокращение срока и увеличение эффективности лечения заболеваний человека и животных, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний при совместном применении разработанных препаратов с химиотерапевтическими лекарственными средствами.

Показано значительное повышение уровня iy морального иммунного ответа у иммунизированных животных и птиц при совместном применении вакцин и иммуномодулирующих препаратов на основе триптофансодержащих дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны схемы синтеза лекарственных препаратов на основе триптофансодержащих дипептидов и их координационных соединений с ионом цинка, использующиеся при производстве новых иммуномодулирующих препаратов тимогар, тимоцин. Разработаны методы их стандартизации, включенные в 5 Фармакопейных статей (ФСП 42 Tj-00001-08, 42 Tj-00002-08, ФСП 42-Tj-0001-08, ФС 42-Tj-0002-08, 42-Tj-0003-08),

утвержденных Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан, а также технические условия, наставления по изготовлению и контролю, наставления по применению, утвержденные Главным Управлением ветеринарии МСХ Республики Таджикистан. Разработанные препараты тимогар и тимоцин зарегистрированы в Республике Таджикистан (per. № 000084Т и 000085Т). Препараты тимогар и тимоцин внедрены в медицинскую и ветеринарную практику.

Связь задач исследований с проблемным планом.

Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора по теме: «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов» и

планами исследований кафедры органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета имени С. Айни Республики Таджикистан по теме: «Исследование низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с биометаллами».

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на: научно-практической конференции

«Теоретические и практические исследования в медицине» (Душанбе, 1999), VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), третьей республиканской научной конференции биохимиков РТ «Вклад биохимиков в развитие биологической науки» (Душанбе, 2003), научно-практической конференции с международным участием «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» (Душанбе, 2006), научно-практической конференции «Аналитик кимё ва экологиянинг долзарб муаммолари» (Самарканд, 2006), научной конференции «Проблемы клинической онкологии» (Душанбе, 2008), совместной республиканской научно-практической конференции «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане и 56-ой годичной конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане» (Душанбе, 2008), международной конференции «Вакцинология-2008» (Москва, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009), VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 2010), республиканской конференции «Проблемы современной координационной химии» (Душанбе, 2011), на совместном заседании секции №1 и секции №2 Ученого совета Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.

Личный вклад автора. Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи

исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложена схема синтеза изучаемых дипептидов, разработана технологическая схема их производства. Автором разработана технологическая схема производства препаратов тимогар и тимоцин, методы контроля качества препаратов, изучена стабильность тимогара и тимоцина в процессе длительного хранения и установлен срок его годности. При личном участии автора проведены производственные испытания тимоцина и тимогара, подтвердившие его высокую эффективность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 научных работ, в том числе одна монография и 5 патентов Республики Таджикистан. 29 статей опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальные методы синтеза аналогов тимопентина, триптофансодержащих пептидов, бурсина и его гибридного аналога.

2. Результаты исследований по разработке рациональной технологии получения триптофансодержащих дипептидов и координационных соединений дипептида Н-11е-Тгр-ОН с ионом цинка.

3. Результаты разработки методик анализа и стандартизация стандартных образцов, субстанций и лекарственных форм на основе дипептида Н-11е-Тгр-ОН и его координационного соединения с ионом цинка.

4. Результаты фармакологических и клинических испытаний синтезированных соединений и выбор наиболее перспективных из них для применения в медицине и ветеринарии (препараты тимогар и тимоцин).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 391 странице компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, списка литературы, включающего 236 источников, в том числе 75 на

иностранных языках, приложения. Работа включает 39 рисунков и 38 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В работе использовали аминокислоты Ь-ряда и производные аминокислот («11еапа1», Венгрия) или производные аминокислот, полученные по стандартным методикам (Гершкович А.А. и соавт., 1992). Индивидуальность и степень чистоты полученных соединений проверяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «БИиМ иУ-254» («СЬетароЬ, Чехия) и «Мегск» (Германия») в следующих системах растворителей: СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 18:2:1 (А), н-бутанол-пиридин-СН3СООН-Н20, 5:5:1:4 (Б), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 60:45:20 (В),

этилацетат-С6Н6, 3:2 (Г), СНС13-этилацетат-СН3ОН-СН3СООН, 9:3:1:0,3 (Д), СНС13-СН3ОН-СН3СООН, 32:2:1 (Е), н-бутанол-СН3С00Н-Н20, 3:1:1 (Ж), н-бутан0л-пиридин-СН3СООН-Н2О, 30:20:6:24 (3), СН3СООН-Н20-СН3ОН-СНС13, 7:3:1:1 (И).

Проявление хроматограмм проводили последовательной обработкой С1г и насыщенным раствором бензидина в 2% СНзСООН.

При каталитическом гидрировании использовали 10% палладий на активированном угле фирмы «Р1ика» (Германия).

Удельное оптическое вращение определяли в СН3ОН на автоматическом цифровом поляриметре «Регкт-Е1тег-241» (США), длина кюветы 1 дм.

рН-метрические и потенциометрические исследования проводили на рН-иономере МБ-20 (Чехия),

Температуру плавления (не скорректирована) определяли на нагревательном столике «Вое1шз» (Германия).

Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 мм.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили: 1) на приборе «АЬех-334» (США) с использованием колонки 250x16 мм, заполненной обращенно-фазовым силикагелем Силасорб С18 в градиенте этанол ацетатаммонийного буфера при скорости потока 11,2 мл/мин,

детекция при 220 нм, время выхода определяли с помощью интегратора «Shimadzu C-RIB) (Япония);

2) на приборе Shimadzu LC-20 (Япония); элюирование проводили на колонке Discovery Cl8 (250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм), в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буфера с pH 7,4 (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирования 30 мин.

Для колоночной хроматографии использовали силикагель L-100/160 («Chemapol», Чехия) и сефадекс G-25 («Merck», Германия).

Аминокислотный анализ свободных пептидов (после 24часового гидролиза в 6 н НС1 при 105°С в запаянных под вакуумом ампулах) проводили на аминокислотном анализаторе «JLC-GAN» («JEOL», Япония).

Гидролиз триптофансодержащих пептидов осуществляли 3 М раствором п-толуолсульфокислоты в течение 48 ч при 110°С. Растворы веществ упаривали под вакуумом при температуре не выше 40°С.

При стандартизации препаратов использовали методы и методики, включенные в соответствующие статьи Государственной фармакопеи РФ XI и XII изданий.

Биологические свойства полученных соединений и разработанных препаратов изучали на белых мышах, кроликах, овцах, телятах 2-6-месячного возраста и взрослом крупном рогатом скоте. ;

Токсические свойства препаратов изучали на белых мышах и кроликах в сравнении с 0,9% физиологическим раствором согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.)

Препараты тимоген, тимогар, тимоцин вводили внутримышечно или подкожно в зависимости от поставленного опыта.

Активность пептидов в тесте Е-розеткообразования клетки определяли согласно Abiko Т. et al. (1980). В опытах использовали ассоциированную вакцину против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза телят, изготовленную Всероссийским НИИ экспериментальной

ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), в дозе 5 мл на голову, живую культуральную противотейлериозную вакцину ВИЭВ в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток). Для обнаружения антител к рота-, коронавирусу и Е.соН применяли, соответственно, иммуноферментный анализ (ИФА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и агглютинации (РА) (Соколова Н.Л. и соавт., 1987), противотейлерийных антител - реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) и ИФА.

Бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови животных определяли согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под редакцией Р.У. Хабриева. М., 2005 г.), биохимические показатели крови - «Методическим указаниям по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях» (Москва, 1991).

Получение низкомолекулярных тимусных пептидов

Методом активированных эфиров, путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, получали тимопентин Н-Аг§-ЬуБ-Азр-Уа1-Туг-ОН и его аналоги Н-Ьуз-Азр-Уа1-Туг-ОН, Н-А^-Ьуз-С1и-Уа1-Туг-ОН, Н-А^-Ьуэ-Азр-УаЬТгр-ОН, Н-Ащ-Ьуэ-Азр-Vа1-Туг-Ащ-ОН, Н-Ащ-Ьуз-01и-Уа1-Тф-0Н, Н-Ьуз-С1и-Уа1-Тгр-ОН. Использование ПСА-метода, при встречном синтезе, показало его неприменимость в случае С-концевого остатка аргинина и преимущество при синтезе тимопентина.

Активность синтезированных пептидов в тесте Е-розеткообразования составляла, соответственно, 100,0%, 0%, 92,3%, 64,0%, 100,0%, 44,2%, 0% активности тимопентина.

Для модификации пептида Н-01и-Тгр-0Н и повышения его иммунологической активности были синтезированы аналоги: Н-01и-Тгр-0Н, Н-Агё-С1и-Тгр-ОН, Н-Ьуз-С1и-Тф-ОН, Н-Шз-Ии-Тгр-ОН, Н-Агё-С1и-Тгр-Ш2, Н-аи-Тф-Туг-ОН, Н-С1и-Тф-Аг§-ОН, Н-Ои-вЫ-Тф-Тгр-ОН, Н-Ащ-Ьуз-С1и-Тф-ОН, Н-Агв-С1и-С1и-Тф-Тф-ОН, Н-01и-Тф-01и-Азр-А1а-0Н. И-

карбоксиангидридным методом была получена натриевая соль дипептида Н-Ие-Тф-ОН.

Трипептидный гормон бурсы Фабрициуса бурсин Н-Ьуз-1Ш-01у-МН2, избирательно дифференцирующий В-клетки, был

синтезирован наращиванием пептидной цепи от И-конца к С-концу методами активированных эфиров и смешанных ангидридов. Для модификации дипептида Н-С1и-Тгр-ОН был получен его гибридный аналог с бурсином: Н-Ьу5-Шз-С1у-ЫН-МН-'Ггр-Ои-Н комбинацией ступенчатого наращивания пептидной цепи и блочной конденсации.

Наибольшей активностью в тесте Е-розеткообразования обладали Н-11е-Тгр-ОН, Н-С1и-Тгр-ОН и бурсин. Поэтому для разработки новых иммуномодулирующих препаратов в качестве основы были выбраны триптофансодержащие дипептиды.

Разработка технологии получения триптофансодержащих дипептидов

Поиск оптимальной схемы синтеза триптофансодержащих дипептидов

На примере некоторых дипептидов, содержащих С-концевой остаток триптофана, был проведен поиск наиболее простой схемы их синтеза и разработка на ее основе технологической схемы их производства.

Первоначально дипептид Н-Уа!-Тгр-ОН получали

конденсацией М-оксисукцинимидного эфира

карбобензоксивалина (г-УаЮБи) и метилового эфира

триптофана (Н-Тгр-ОМе) согласно реакциям:

1. г-Уа1-ОН + БСС + НОви -> г-УаЬОБи + ОСНЩ

2. г-УаЮБи + НС1-Н-Тгр-ОМе + ИММ -» г-Уа1-Тгр-ОМе + НС1-КММ| + НОБи

3. г-Уа1-Тгр-ОМе -не-* Н-Уа1-Тгр-ОМе + С6Н5СН2ОН + С02Т

4. Н-Уа1-Тгр-ОМе _зйе5-> Н-Уа1-Тгр-ОИа + МеОН

5. Н-Уа1-Тф-0№ + НС1 -*• Н-Уа1-Тгр-ОН + ИаС1

Деблокирование защищенного дипептида осуществляли каталитическим гидрированием и обработкой 1 н раствором ЫаОН с последующей очисткой с помощью ВЭЖХ. Общий выход свободного дипептида - 56,2%.

С технологической точки зрения синтез дипептидов, без получения карбобензоксивалина (г-Уа1-ОН) и хлоргидрата метилового эфира триптофана (НС1-Н-Тф-ОМе), имеющихся в продаже, включает 5 стадий, требующих проведения следующих технологических операций:

Синтез 1Ч-оксисукцинимндного эфира

карбобензоксивалнна: 1) получение раствора 2-Уа1-ОН в этилацетате, 2) охлаждение раствора, 3) добавление дициклогексилкарбодиимида (ОСС), 4) перемешивание в течение 30 мин, 5) приготовление раствора К-гидроксисукцинимида (НСКЗи) в этилацетате, 6) добавление раствора НОБи к реакционной смеси, 7) перемешивание в течение 4 часов (получение активированного эфира), 8) удаление дициклогексилмочевины (БСНи) фильтрованием, 9) упаривание этилацетата, 10) растворение остатка в этилацетате, 11) выдерживание полученного раствора при 0°С для осаждения остатков ОСНи, 12) удаление оставшейся ОСНи фильтрованием, 13) упаривание этилацетата.

Получение защищенного дипептида - проведение реакции конденсации: 1) получение раствора 2-Уа1-0Би в диметилфорамиде (ОМР), 2) получение раствора НС1-Н-Тгр-ОМе в ОМР, 3) добавление к раствору НС1-Н-Тгр-ОМе рассчитанного количества Ы-метилморфолина (ИММ), 4) смешивание растворов, 5) перемешивание при комнатной температуре в течение 15 часов (реакция конденсации), 6) упаривание ОМР, 7) растворение остатка в этилацетате, 8) обработка этилацетатного раствора 2% раствором Н28С>4, 9) обработка этилацетатного раствора 5% раствором N3^03, 10) обработка этилацетатного раствора водой до нейтральной реакции промывных вод, 11) высушивание этилацетатного раствора над безводным №2804, 12) упаривание этилацетата, 13) перекристаллизация продукта из эфира, 14) отфильтровывание продукта, 15) высушивание продукта под вакуумом.

Удаление г-группы с а-ГШ2-группы защищенного дипептида каталитическим гидрированием: 1) растворение защищенного дипептида в метаноле, 2) добавление 10% Рс1/С катализатора, 3) проведение гидрирования, 4) удаление катализатора фильтрованием:

Удаление сложноэфирной мстильной группы с карбоксильной группы триптофана защищенного дипептида:

1) добавление рассчитанного количества N3011, 2)

перемешивание при комнатной температуре до полного омыления.

Превращение натриевой соли дипептнда в свободный дипептид: 1) добавление раствора НС1 до pH 5,0, 2) обработка н-бутанолом, 3) упаривание водного слоя, 4) очистка свободного пептида с помощью ВЭЖХ, 5) упаривание элюента, 6)

переосаждение из метанола эфиром, 7) лиофилизация.

Таким образом, общее количество технологических операций равно 41, что существенно затрудняет его промышленное производство.

Применение при синтезе дипептида Н-Не-Тгр-ОН

пентахлорфениловых (-ОРср) эфиров, как более

реакционноспособных, позволило повысить общий выход

пептида на 10,6% по сравнению с предыдущим случаем.

Для снижения количества стадий синтеза разработана схема с использованием в качестве исходного продукта остатка триптофана со свободной карбоксильной группой, защищаемой на стадии конденсации с помощью солеобразования:

1.г-Уа1-ОН + БСС + Н-Тгр-ОНСЖзМ г-Уа1-Тгр-

ОН-СЖзЫ + БСНи|

2. г-Уа!-Тгр-ОН ОЕ%К Н-Уа1-Тф-ОН-<Ж3К + С6Н5СН2ОН + С02|

3. Н-Уа1-Тф-ОН ОЕ13К + НС1 -♦ Н-Уа1-Тф-ОН + На-Е^Ы

При разработке этой схемы, в предыдущую были внесены следующие изменения: в качестве активированных были использованы 1-гидроксибензотриазоловые эфиры (-ОВ^, которые не выделяли из реакционной смеси; соль триптофана вводили непосредственно в реактор, в котором получали активированные эфиры; триптофан использовался в виде триэтиламмониевой (Е1з1Ч) соли.

Проведенные изменения позволили сократить количество стадий синтеза с пяти до трех:

1. Синтез натриевой соли защищенного дипептида;

2. Удаление 2-группы с а-МН2-группы защищенного дипептида каталитическим гидрированием;

3. Превращение натриевой соли дипептида в свободный дипептид.

Таким образом, разработанная схема заключается в синтезе дипептидов путем взаимодействия свободных аминокислот с 1-гидрокси-бензотриазоловыми эфирами №-

карбобензоксиаминокислот, получаемыми в ОМЕ

взаимодействием Ы-защищенных аминокислот с НОВ! карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего агента БСС и вводимыми в реакцию конденсации с аминокомпонентом без выделения из реакционной смеси (образующейся при получении 1-гидроксибензотриазоловых эфиров) путем добавления аминокомпонента к реакционной смеси.

Предложенная схема апробирована при синтезе Н-С1и(ОН)-Тгр-ОН, Н-Уа1-Тгр-ОН, Н-Тгр-01и-0Н, Н-Азр-Тгр-ОН, Н-Тгр-Бег-ОН, Н-С1и-Тгр-Ш2, Н-8ег-Тф-ОН, Н-С1и(Тф-ОН)-ОН, Н-№в-Тгр-ОН, Н-Тгр-Аг§-ОН, Н-11е-Тф-ОН, Н-С1п-Тф-ОН, Н-Ьеи-Тф-ОН, Н-Иу-Тф-ОН, Н-Ьу$-Тф-ОН.

Для защиты боковых функциональных групп аминокислот использовали Ъ- и -ОВг1 группы. СООН группу триптофана защищали путем солеобразования с Е13К Очистку защищенных дипептидов осуществляли промыванием их этилацетатпых

растворов 2% раствором Н2804 и водой, г-группу с защищенных дипептидов удаляли каталитическим гидрированием без

выделения защищенных пептидов.

Предварительную очистку свободных дипептидов осуществляли путем экстракции их из водных растворов н-бутанолом. Окончательную очистку при необходимости

проводили с использованием ВЭЖХ.

Результаты изучения иммунологической активности полученных дипептидов в тесте Е-розеткообразования клетки показали, что их активность относительно активности тимозина а! (100%) составляла для Н-01и-Тф-0Н и Н-11е-Тф-ОН - 100%, Н-С1и(Тф-ОН)-ОН - 50%), Н-Авр-Тф-ОН - 30%, остальные дипептиды оказались неактивными в этом тесте.

Несмотря на сокращение стадий синтеза, к недостаткам данной схемы можно отнести использование токсичного БСС и достаточно дорогого Е13М В связи с указанным была разработана новая схема синтеза с применением наиболее реакционноспособных пентафторфениловых эфиров и относительно дешевого и доступного солеобразующего реагента

- №ОН. Активированные эфиры получали с помощью дипентафторфенилкарбоната, что позволило исключить применение токсичного ВСС. Схема иллюстрируется реакциями:

г-ие-он + (с6р5)2с=о г-ие-ос6р5 + едой + со2т

г-Пе-ОС^ + Н-Тф-СЖа -> г-Пе-Тгр-СЖа + С6Р5ОН 2-11е-Тгр-ОЫа — ~с-> Н-Пе-Тгр-ОНа Н-11е-Тф-(Жа + НС1 -» Н-11е-Тф-ОН + ИаС1 В этом случае активированные эфиры вводили в реакцию конденсации без выделения из реакционной смеси. Защищенный дипептид очищали обработкой раствором бисульфата натрия и с помощью колоночной хроматографией на силикагеле Ь-100/160 при элюировании хлороформом и смесью этилацетат-бензол (3:2). Свободный дипептид очищали экстракцией н-бутанолом и переосаждением из метанола эфиром. Применение колоночной хроматографии исключило использование ВЭЖХ. Количество стадий синтеза, как и в предыдущем случае, равно трем, но в последнем варианте не используется токсичный БСС.

Таким образом, установлено, что наиболее технологичным способом получения иммуноактивных триптофансодержащих дипептидов является использование активированных (пентафторфениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната и вводимых в реакцию конденсации без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки, а также применение при очистке защищенного дипептида колоночной хроматографии на силикагеле.

Разработка технологической схемы получения триптофансодержащих дипептидов

Процесс получения триптофансодержащих дипептидов включает три основные стадии, разбитые на следующие технологические операции:

Синтез натриевой соли защищенного дипептида: 1) растворение карбобензоксиаминокислоты в этилацетате, 2) добавление дипентафторфенилкарбоната, 3) получение раствора пентафторфенилового эфира карбобензоксиаминокислоты (перемешивание в течение 30 мин), 4) упаривание этилацетата и растворение остатка в ЭМР, 5) получение раствора натриевой соли триптофана, 6) проведение реакции конденсации, 7) упаривание растворителя, 8) растворение остатка в этилацетате, 9) приготовление 3% раствора бисульфата натрия, 10) перемешивание в течение 5 мин, 11) отделение этилацетатного слоя и высушивание его над безводным На28 04, 12) упаривание этилацетата, 13) растворение остатка в хлороформе, 14)

приготовление смеси этилацетат-бензол (3:2), 15) приготовление колонки с силикагелем Ь-100/160, 16) очистка защищенного пептида на колонке, 17) упаривание элюеита.

Удаление 3£-групны с а-1ЧН2-группы защищенного дипептида: 1) растворение защищенного дипептида в метаноле,

2) добавление 10% Рс1/С катализатора, 3) проведение гидрирования, 4) удаление катализатора фильтрованием.

Превращение натриевой соли днпептида в свободный дипентид: 1) добавление НС1 для удаления натриевой соли, 2) упаривание растворителя, 3) растворение остатка в смеси н-бутанол-вода и обработка свободного дипептида н-бутанолом, 4) отделение водного слоя, 5) упаривание воды, 6) переосаждение из метанола эфиром, 7) лиофилизация.

Предложенная схема синтеза включает 28 технологических операций. На всех стадиях получения дипептида осуществляется контроль методом тонкослойной хроматографии.

Стандартизация стандартного образца и субстанции дни сити да Н-Ис-Тгр-ОН

Выбраны параметры стандартизации и методики анализа стандартного образца и фармацевтической субстанции дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Общие параметры стандартизации приведены в таблице 1.

Отличительными параметрами для стандартного образца были такие как подлинность и удельный показатель поглощения.

Подлинность стандартного образца дипептида предложено устанавливать по УФ-спектру 0,01%-ного раствора в воде, имеющего в области 220-350 нм максимум поглощения при 280+2 нм и плечо при 286±2 нм (рис.1). Удельный показатель поглощения при 280+2 нм должен быть в пределах 96-104.

Для подтверждения подлинности дипеитида изолейцил-триптофан как фармацевтической субстанции использовали УФ-спектрофотометрию, тонкослойную и высокоэффективную жидкостную хроматографию.

УФ-спектры поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца изолейцил-триптофана, приготовленные для количественного определения, в области длин волн от 220 до 350 нм должны совпадать и иметь максимумы при одной и той же длине волны (рис. 1).

Таблица 1

Общие параметры стандартизации стандартного образца и фармацевтической субстанции днпептпда _____________изолейцил-триптофана______________

Параметр Требования по ИД

Описание Порошок белого, желтоватого или кремового цвета без запаха

Растворимость (ГФ XII, ОФС 42-0049-07) Растворим в воде, очень мало растворим в, спирте 95%, практически нерастворим в хлороформе

Прозрачность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0051-07) 0,01%-ный раствор препарата должен быть прозрачным

Цветность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0048-07) 0,01%-ный раствор препарата должен быть бесцветным

pH (ГФ XII, ОФС 42-0048-07) 5,0-6,8 для 0,01%-ного раствора

Посторонние примеси (ВЭЖХ) Содержание любой единичной примеси не более 0,9%, суммарное содержание примесей не более 2,0%

Потеря в массе при высушивании (ГФ XI, вып. 1, с. 176) Не более 6,0%

Для установления подлинности субстанции дипептида Н-Ие-Тгр-ОН методом ТСХ (при сравнении со стандартным образцом) были изучены две хроматографические системы, в которых пептид обладает хорошей хроматографической подвижностью: А - н-бутан0Л-пиридин-СН3С00Н-Н20

(30:20:6:24) и Б - СН3С00Н-Н20-СН30Н-СНС13 (7:3:1:1). На хроматограмме пятно субстанции должно соответствовать пятну стандартного образца.

Еще одним методом установления подлинности дипептида Н-11е-Тгр-ОН выбрана обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонках С18 при сравнении времен удерживания дипептида и стандартного образца (должны соответствовать друг другу). Элюирование проводили смесью ацетонитрил - фосфатный буфер в соотношении 40:60. ВЭЖХ-хроматограмма дипептида Н-Пе-Тгр-ОН приведена на рис.2.

Рис.1. УФ-спектр дипептида Н-Ие-Тгр-ОН (0,01% раствор в воде)

mV_______________________

- Detector A Ch1:280nm

200-

№

100-

50-

0.0 2.5 5!o 7.5 10.0 12.5

Рис.2. ВЭЖХ-хроматограмма дипептида Н-11е-Тгр-ОН (колонка Discovery С18 (250 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), подвижная фаза - смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (40:60), скорость потока - 1 мл/мин, детектирование - при 254 и 280 нм, время элюирования - 30 минут.

10.0

15.0min

Параметры пирогенность, микробиологическая чистота и количественное содержание дипептида характеризуют качество фармацевтической субстанции.

Пирогенность (ГФ XII, ОФС 42-0061-07). Препарат должен быть апирогенным.

Микробиологическая чистота (ГФ XII, ОФС 42-0067-07). В 1 г препарата допускается наличие не более 100 аэробных бактерий и грибов суммарно, не допускается наличие энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Количественное содержание дипептида изолейцил-

триптофан (C17H22N3O3): не менее 98% и не более 102% в пересчете на сухое вещество.

Количественное содержание дипептида определяли

спектрофотометрически по величине оптической плотности

0,01% раствора при длине волны 280 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению со стандартным образцом дипептида (растворитель-Н20).

Разработка препарата на основе дипептида Н-11е-Тгр-ОН

Физико-химические свойства лекарственной формы, стабильность, токсичность, специфическая активность

На основе дипептида Н-11е-Тгр-ОН разработан

иммуномодулирующий препарат тимогар, представляющий собой 0,01 % водный раствор дипептида.

Для определения срока годности препарат хранили при 4 и 35°С в течение 2 лет. Через определенные промежутки времени проверяли внешний вид и цвет (бесцветный прозрачный раствор), механические примеси (не должно быть), pH водного раствора (5,0-6,8), содержание действующего вещества (0,09-0,11 мг/мл), стерильность (должен быть стерильным), пирогенность (должен быть апирогенным), токсичность (должен быть нетоксичным), хроматографическую подвижность (Rf) в системах растворителей: А - СНС13-СН3ОН-СН3СООН (18:2:1), Б - н-бутан0л-СНзС00Н-Н20 (4:1:1), В - н-бутанол-пиридин-СН3С00Н-Н20 (30:20:6:24).

Полученные результаты приведены в таблице 2, из которой видно, что концентрация дипептида за это время снизилась на 2% от начальной, но находится в пределах, допускаемых

Государственной фармакопеей для препаратов с такой

концентрацией действующего вещества, остальные показатели также находились в пределах нормы. Исходя из этого, срок годности тимогара был установлен равным 2 годам.

Острую и хроническую токсичность тимогара изучали при однократном и при повторном длительном введении, продолжительность которого определялась предполагаемым курсом клинического применения.

Разовая терапевтическая доза тимогара аналогично

тимогену составляла для человека 50-100 мкг (0,5-1,0 мл) при введении один раз в сутки. На I этапе однократная

терапевтическая доза препарата была увеличена в 100000 раз. Контролем служили животные, не получившие тимогар.

Клиническое наблюдение в течение 8 дней показало, что у опытных и контрольных животных не отмечалось отклонений от физиологической нормы.

При изучении хронической токсичности тимогара, вводимого в количестве 776-1250 терапевтических доз в течение 14 дней, были получены аналогичные результаты.

Эти результаты позволяют заключить, что тимогар является практически нетоксичным.

Для проверки специфической (иммуностимулирующей) активности тимогара, его применяли при вакцинации цыплят ассоциированной вакциной против колибактериоза и стафилококкоза. Активность препарата оценивали по его влиянию на титр специфических антител в сравнении с таковым, вырабатываемым только вакциной.

После вакцинации и ревакцинации у цыплят, которым иммуностимуляторы не применяли, титр

противоколибактериозных и противостафилококкозных антител составлял 1:16 и 1:64, соответственно. При использовании тимогена титр антител после вакцинации составил 1:32 и 1:64, соответственно, после ревакцинации - 1:32 и 1:128. У цыплят, которым совместно с вакциной применяли тимогар, эти показатели составили, соответственно, 1:64 и 1:256, после ревакцинации - 1:128 и 1:512. Следовательно, применение тимогара способствовало 2-4-кратному увеличению титра специфических антител по сравнению с тимогеном.

Таблица 2

Результаты исследований стабильности препарата тимогар _____________в условиях длительного хранения______________

Время (меся- - цы) Характеристика исследуемого параметра и норма

Внешний вид и цвет: Механичес кие примеси: pH водного раствора 5,5-6,8 Содержание дипептида 0,09-0,1 мг/мл Стериль- ность Пироген- ность Токсич- ность Хроматографическая подвижность (Яг)

А ОДЗ Б 0,44 В 0,71

4°С 35°С 4°С 35°С 4*С 35°С 4 °С 35°С 4°С 35°С 4° С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С

1 + + + 4- + + 0,1 од + + + + + 4- + + + •+ 4- 4-

2 + + + + 4- 0,1 од 4- + 4- 4- 4* 4- 4- + + + + +

3 + + + + 4- + 0,1 од + + + 4- + 4- + 4- 4- 4 + +

4 + + + + + + 0,1 од + + + 4- + + + 4- 4- 4- 4- 4-

5 + 4* + + + + 0,1 од + + + 4- 4- + 4- + 4- + + 4-

6 + + + + + + 0,1 од + + + 4- 4- + 4- + + 4- 4- 4-

9 + + + 4- + 0,1 од + + 4- 4- + 4* 4- 4- 4- + 4- +

12 + + + + + + од од + + 4- - - + - - 4- - +

15 + 4- + + 4- + 0,1 0,099 + + 4- - + -Ь - + + - 4- -

18 + + + 4- + + од 0,099 - - - + - + +■ - - 4- - 4-

21 + 4- + + + + од 0,098 + + 4- - 4- 4- - 4- 4- 4- 4- -

24 + 4- + 4- + од 0,098 + + + 4- 4- 4- 4* 4- 4- + 4- 4*

Примечание: «+» - отклонения в значениях параметра соответствует требованиям Государственной фармакопеи, «-» - данный параметр не определяли.

Применение тимогара и тимогена при лечении тейлериоза и бронхопневмонии КРС совместно с традиционными препаратами положительно влияет на общее состояние животных, увеличивает прирост их массы, повышает эффективность лечения, нормализует биохимические показатели крови, причем тимогар проявляет более высокую активность по сравнению с тимогеном.

Технологическая схема производства лекарственной формы - тимогар

На основании результатов исследований синтеза и физикохимических свойств дипептида Н-11е-Тгр-ОН разработана технологическая схема производства тимогара, включающая следующие стадии (рис.З):

I. Синтез дипептида Н-11е-Тгр-ОН (осуществляется в специальной лаборатории).

II. Приготовление 0,01%-го водного раствора дипептида Н-Ие-Тгр-ОН.

III. Контроль препарата тимогар.

I. Синтез дипептида толейцил-триптофап

осуществляется методом активированных (пентафторфениловых) эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, взаимодействием пентафторфе-нилового эфира г-Не-ОН и натриевой соли триптофана. Защищенный пептид очищают обработкой бисульфатом натрия и колоночной хроматографией на силикагеле Ь-100/160, деблокируют каталитическим гидрированием. Свободный дипептид предварительно очищают экстракцией н-бутанолом, окончательно - переосаждением из метанола эфиром. Высушивают.

II. Приготовление 0,01%-го водного раствора дипептида Н-Пе-Тгр-ОН. Готовят 0,01% водный раствор дипептида Н-Ие-Тгр-ОН в воде для инъекций, фасуют в ампулы по 1 мл или в пенициллиновые флаконы по 5 мл и укупоривают. Стерилизуют. Этикетируют и упаковывают.

Рис. 3. Технологическая схема производства препарата тимогар.

III. Контроль производства препарата тимогар. Контроль в процессе производства (операционный контроль). При получении дипептида методом ТСХ контролируется содержание промежуточных продуктов и степень очистки конечного. Перед ампулированием продукт проверяется по показателям: описание, прозрачность, цветность, pH раствора, содержание дипептида должно составлять 90-110 мкг/мл (90110% от номинального значения).

На основании проведенных исследований разработаны схема синтеза дипептида Н-11е-Тгр-ОН и новый

иммуномодулирующий препарат на его основе - «Тимогар». Выбраны условия стандартизации, показатели качества, требования и методики анализа, включенные в ФСП 42 Т]-0001-08 «Изолейцил-триптофан. Субстанция» и ФСП 42 ^-00001-08 «Тимогар».

Разработка препаратов на основе координационных соединений Н-Пе-Тгр-ОН с ионом гп2+

Изучение взаимодействия Н-Пе-Тгр-ОН с ионом гп2+

Методом рН-метрического титрования на примере модельного дипептида Н-Иу-Тгр-ОН установлено, что при его взаимодействии с Zn2l образуются координационные соединения с составом комплексных ионов |^пЬ]+, ^пЬ2]° и [?,п(НЬ)2]2\ Десятичные логарифмы констант устойчивости равны: =

7,353, - 13,908, = 30,256.

Из диаграммы распределения (рис.4) Н-Пе-Тгр-ОН, построенной после определения его констант кислотной диссоциации [К1 = 7,4-10'6 (рК, - 5,13), К2 = 1,45-10-11 (рК2 -10,84)] видно, что при физиологических значениях pH в водном растворе дипептид присутствует в катионной, анионной и цвиттер-ионной формах.

— ХН2Ь+-------ХШ.+-------ХЬ рц

Рис.4. Диаграммы распределения дипептида Н-11е-Тгр-ОН

Координационные соединения получали непосредственным взаимодействием Н-Пе-Тгр-ОН и 2п(СНзСОО)2 в водном растворе с выдерживанием при 60°С в течение 30 минут.

Кривая рН-метрического титрования координационных соединений дипептида Н-Пе-Тгр-ОН с ионом цинка приведена на рис. 5.

• H-I)e-Trp-OH H-De-Trp-OH + Zn

Рис.5. Кривая титрования дипептида Н-11е-Тгр-ОН с ионом Zn2+

Как видно из рисунка 5, кривые титрования дипептида и его смеси с ацетатом цинка отличаются друг от друга, что свидетельствует об образовании координационных соединений. Определение их состава с использованием окислительной функции (Юсупов З.Н., 2001) показало, что при взаимодействии дипептида и иона цинка в. области pH 3,5-5,0, наряду с моноядерными комплексными формами, образуется и димерная со следующими десятичными логарифмами констант образования комплексных форм: [ZnHL]2+ - 3,71, [ZnL(HL)]+ -6,6, [Zn(HL)2]2+ - 0,279, [Zn2(HL)2]4+ - 18,8, [Zn(OH)HL]+ - 0,256. Изучение влияния комплексообразовапия на иммунологическую активность Н-Пе-Тгр-ОН

Иммунологическую активность полученных

координационных соединений изучали in vivo по увеличению титра антител у животных, иммунизированных противотейлериозной вакциной. Результаты исследования показали, что применение только дипептида увеличивало титр антител в 2 раза, координационных соединений - в 2-8 раз по сравнению с титром антител, вырабатываемых только вакциной.

Полученные результаты показывают, что после координации с ионом цинка происходит увеличение иммунологической активности по сравнению с исходным дипентидом.

Разработка препарата на основе координационных соединении Н-11е-Тгр-ОН с Zn2+

Разработка и стандартизация лекарственной формы

Повышенная иммуностимулирующая активность координационных соединений Н-11е-Тгр-ОН с гп2+ позволила приступить к разработке на их основе лекарственных препаратов.

Для лекарственной формы выбрано эквимолярное соотношение дипептида и иона металла при концентрации дипептида, как и в случае тимогена и тимогара, 100 мкг/мл.

На основе координационных соединений дипептида Н-Не-Тгр-ОН и иона цинка был разработан иммуностимулирующий препарат тимоцин, представляющий собой 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка.

В связи с тем, что координационные соединения образуются в водном растворе (в процессе получения тимоцина) и не выделяются в свободном виде, для разработки стандартного образца тимоцина и методов его стандартизации, было изучено влияние комплексообразования на интенсивность поглощения дипептида и на хроматографическую подвижность координационных соединений по сравнению с дипептидом.

Результаты спектрофотометрических исследований показали, что взаимодействие дипептида с ионом цинка не влияет на интенсивность поглощения дипептида при длине волны 280±2 нм, используемой для его количественного определения.

Сложность выбора оптимальных условий хроматографирования пептидов обусловлена тем, что в растворе они могут находиться в катионной, цвиггер-ионной и анионной формах, имеющих свое время удерживания - в результате хроматографический пик соединения уширяется, что неприемлемо при анализе препарата. Тимоцин представляет собой координационные соединения дипептида Н-11е-Тгр-ОН с которые в растворе также могут присутствовать одновременно. в нескольких комплексных формах, обусловленных ступенчатой диссоциацией дипептида.

Данных о влиянии солеобразования и комплексообразования на хроматографическое поведение пептидов в научной литературе практически не имеется. Только

В.С.Смирнов (2003) сообщал, что мононатриевая соль Ь-глутамил-Ь-триптофана по данным ТСХ и ВЭЖХ идентична дипептиду в выбранных условиях хроматографирования.

Первоначально методом ТСХ было изучено влияние солеобразования на хроматографическое поведение Н-Не-Тгр-ОН. Для хроматографирования были использованы свободный дипептид Н-Ие-Тгр-ОН, хлоргидрат, ацетат, трифторацетат, натриевая соль дипептида и его координационные соединения с цинком.

Для смещения ионного равновесия дипептида в сторону образования одной ионной формы использованы системы растворителей, содержащие как основные (пиридин), так и кислые реагенты (уксусная кислота). В качестве основной хроматографической системы использовали систему н-бутанол-пиридин-СНзС00Н-Н20 (30:20:6:24) (А), в качестве кислой -СН3СООН-Н2О-СН3ОН-СНСІ3 (7:3:1:1) (Б).

Значения вышеуказанных соединений в выбранных системах были одинаковы и равны 0,55 (А) и 0,88 (Б), свидетельствуя о смещении ионного равновесия в сторону образования либо анионной (система А), либо катионной (система Б) формы дипептида.

При хроматографировании методом ВЭЖХ, для смещения равновесия в сторону одной ионной формы использовали элюент следующего состава: ацетонитрил - фосфатный буфер с pH 7,4 (40:60). Фосфатный буфер должен был обеспечить присутствие пептида в растворе в одной ионной форме. Для проверки этого предположения хроматографировали свободный дипептид и его солянокислую, ацетатную и натриевую соли, а также координационные соединения его с ионом цинка. Результаты исследования показали, что в этих условиях все три ионные формы пептида имели одинаковое время выхода - 5,21±0,15 минуты. Для примера на рис.6 приведены ВЭЖХ хроматограммы дипептида Н-Ие-Тгр-ОН и его координационных соединений с цинком.

Таким образом, применение кислых и основных систем при хроматографировании пептидов, их солей и координационных соединений методом ТСХ, а также применение фосфатного буфера (pH 7,4) при определении методом ВЭЖХ позволяет

получать хроматограммы исследуемых соединении в одной ионной форме.

mV

Detector A ChpSOnm

200-

150

100--

50-

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0 min

200-

.mV

150

100-'

Detector A Cht:260nro

4 Л ! i I I * V

I

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min

Рис.6. ВЭЖХ хроматограммы дипептида изолейцил-триптофан (а) и его координационных соединений с цинком (б). Колонка Discovery Cl 8 (25 см х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), подвижная фаза: смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (pH 7,4) (40:60), скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование проводили при длинах волн 254 и 280 нм и времени элюирования 30 минут

Проведенные исследования позволили разработать фармакопейные статьи на стандартный образец тимоцина и его лекарственную форму. Параметры стандартизации стандартного образца и препарата приведены в таблице 3.

I

5.0

I

7.5

Таблица 3

Параметры стандартизации стандартного образца и лекарственной формы - тимоцин

Стандартный образен Лекарственная форма

Параметр Метод определения и характеристика Параметр Метод определения и характеристика

Описание Белый или слегка желтоватый кристаллический порошок без запаха Описание Прозрачный бесцветный водный раствор бет запаха

Растворимость (ГФ XII, ОФС 42-0049-07) Растворим в воде» очень мало растворим в спирте 95%, практически нерастворим в хлороформе Подлинность Спектр поглощения препарата в области 220-350 нм имеет максимум поглощения при 278+2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288±2 нм

Подлинность Тимоции Ацетат-ион (ГФ XI, вып.1, стр. 159) Цинк (ГФ XI, вып.1, стр. 165) Спектр поглощения в области 220-350 нм имеет максимум поглощения при 278±2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288±2 нм Раствор дает качественную реакцию на ацетат-ион с раствором хлорида окисного железа Раствор препарата дает качественную реакцию на ион цинка с раствором калия ферроцианида Прозрачность (ГФ XI, вып.1, стр.198) Препарат должен бьггь прозрачным

pH (потенциометрически, ГФ XII, ОФС 42-0048-07) От 5,5 до 6,8 для 0,016924%-ного раствора Цветность (ГФ XI, вып.1, стр.194) Препарат должен быть бесцветным

Прозрачность раствора (ГФ XII, ОФС 42-0051-07) Раствор должен быть прозрачным Посторонние примеси (ТСХ) На хроматографических пластинках должны появиться только два темно синих пятна с совпадающими Яг

Цветность раствора (ГФХИ, ОФС 42-0050-07) Раствордолжен быть бесцветным Механические включения не должно быть

Посторонние примеси (ВЭЖХ) Содержание любой единичной примеси не более 0,9%, суммарное содержание примесей не более Стерильность (ГФ ХЗ, вып.2, стр. 187-193) Препарат должен быть стерильным

2,0%

Потеря в массе при высушивании (ГФ XI, вып. 1, с. 176) Не более 6% Пирогеиность (ГФ XI, вып.2, стр.183-185) Препарат должен апирогенным быть

Удельный показатель поглощения 163,1-176,7 Токсичность (ГФ XI, вып.2, стр. 182-183) Препарат должен нетоксичным быть

Количественное содержание: Тимоцин (спектрофотометрия) Цинк (спектрофотометрия) от 90 до 110% от 90 до 110%

Для определения количественного содержания цинка в тимоцине (после его экстракции из препарата) был разработан метод, основанный на образовании окрашенного соединения цинка с дитизоном, интенсивность окраски которого зависит от содержания цинка. Фотометрирование в этом случае проводили при 538 нм. Содержание цинка определяли по калибровочной кривой.

Стабильность тимоцина

Для определения срока годности образцы препарата тимоцин хранили в течение 2 лет в разном температурном режиме при 4 и 35°С и через определенные промежутки времени проводили проверку на соответствие требованиям ФСП 42 Т]-00002-08 по следующим параметрам: внешний вид и цвет (бесцветный прозрачный раствор), механические примеси (не должно быть), pH водного раствора (5,06,8), содержание действующего вещества (141,3-172,7 мкг/мл), стерильность (должен быть стерильным), пирогенность (должен быть апирогенным), токсичность (должен быть нетоксичным), хроматографическая подвижность (Л*) в следующих системах растворителей: А - н-бутанол-пиридин-СНзСООН-НгО (30:20:6:24); Б

- СН3СООН-Н2О-СН3ОН-СНС13 (7:3:1:1); значение Яг в системе А равно 0,55, в системе Б - 0,88.

Полученные результаты приведены в таблице 4. Из таблицы видно, что концентрация дипептида за 2 года снизилась на 1,27%, но находится в пределах, допускаемых ФСП 42 Т]-00002-08; другие параметры находились в пределах нормы. На основании результатов исследований установлен срок годности тимоцина - 2 годам.

Разработка технологической схемы производства тимоцина

Технологический процесс получения тимоцина включает следующие стадии (рис.7).

1. Синтез дипептида.

2. Получение препарата

3. Контроль препарата.

Синтез дипептида.

Технологический процесс синтеза дипептида был приведен выше.

Таблица 4.

Показатели качества тнмоцина в условиях длительного хранения________________

Вре- мя (мес яцы) Характеристика исследуемого параметра и норма

Внешний вид и цвет: бесцветный прозрачный раствор Механические примеси: не должно быть PH водного раствора 6,0-6,5 Содержание действующего вещества 157±Ю% мкг/мл Стериль- ность: должен быть стериль- ным Пироген- ность: должен быть апнрогенн ым Токсич- ность: должен быть нетоксич- ным Хроматографическая подвижность (ЯО

А 0,55 Б 0,88

4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4° С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С 4°С 35°С

I 4- +. + + 4 4- 157 157 + 4- 4- 4- + 4- 4* 4- 4- 4-

2 -г 4- + 4* + + 157 157 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- + 4-

3 4- 4~ 4- + 4- 4- 157 157 4- 4- 4- + 4- 4- 4- 4- 4- +

4 + + + 4- 4* + 157 156,8 4- + 4- 4- + 4- 4- 4- 4* +

5 4- + 4- 4- + 4- 157 156,8 4* + 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4-

6 + 4* 4- 4* 4- + 157 156,5 4- + 4- 4- 4- + 4- 4- 4- 4-

9 4* + 4- + 4- + 157 156 4- 4- 4- 4* 4- 4- 4- 4* 4- 4

12 + 4- 4- 4- + 4- 157 156 4- 4- 4- - - 4- - - 4-

15 4- 4- 4- + 4- + 157 155,4 4- 4- 4- - ч- 4- - 4- 4- -

18 4- + 4- + 4- 4- 157 155,2 - - - 4- - 4- 4- - - 4-

21 + 4- 4* + 4- 4- 157 155 4- 4- 4- - 4- 4- - 4- 4- 4-

24 4- 4- -Н 4- + + 157 155 4- 4- + 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4-

Примечание: «+» - параметр соответствует требованиям Государственной фармакопеи, «-» - данный параметр не

определяли.

Приготовление растворителей Приготовление аминокислотных

производных______________________

Конденсация аминокислотных

производных______________________

Очистка защищенного дипептида Деблокирование защищенного

дипегггида_______________________

Очистка свободного дипептида Контроль свободного дипептида

Приготовление

бидистиллированной воды__________

Контроль бидистиллированной

воды_____________________________

Приготовление и контроль водного

раствора дипептида_______________

Приготовление и контроль водного

раствора соли металла____________

Смешивание растворов динептида

и соли металла___________________

Получение препарата Контроль препарата

Ампулирование препарата

Маркировка, упаковка ампул

Рис.7. Технологическая схема производства тимоцина.

Получение тимоцина

Получение тимоцина основано на реакции Н-Ие-Тгр-ОН и 2п(СНзСОО)2 при смешивании эквимолярных количеств дипептида и соли металла в концентрации по дипептиду 100 мкг/мл; затем прибавляют воду для инъекций в количестве равном 1/10 необходимого объема, нагревают до 70°С, выдерживают 30 мин,

Вспомогательные работы:

Подготовка помещений и оборудования к работе Подготовка воздуха Мойка и стерилизация ампул Подготовка персоната и технологической одежды Настройка оборудования

Фильтрация_________________

Ампулирование______________

Стерилизация Контроль препарата

Получение тимоцина

Синтез дипептида

охлаждают и доводят водой для инъекций до необходимого объема. Раствор фасуют, стерилизуют и этикетируют.

Контроль тимоцина осуществляют в соответствии с требованиями ФСП 42 Т]-00002-08.

Контроль в процессе производства (операционный контроль)

Контроль при синтезе триптофансодержащего дипентида описан выше. На дальнейших стадиях технологического процесса контролируются промежуточные и конечный продукты.

Дипептид контролируется по показателям: описание,

подлинность, прозрачность, цветность и pH раствора, посторонние примеси, количественное содержание дипептида, цинка ацетат - по ГОСТ 5823.

Перед ампулированием препарата контролируются показатели: описание, прозрачность, цветность, pH раствора, содержание дипептида и цинка.

Токсические свойства тимоцина

При изучении острой и хронической токсичности тимоцина разовую терапевтическую дозу рассчитывали по пептиду. При этом в качестве прототипа был выбран тимоген, разовая доза которого для человека составляет 50-100 мкг (0,5-1,0 мл) при введении один раз в сутки. Аналогичная доза была выбрана и для разработанного препарата. Полученные результаты (таблица 5) показали, что тимоцин является практически нетоксичным.

Таблица 5

Токсические свойства тимоцина___________________

Вид животных Определение токсичности

Острая Хроническая

Количество разовых доз Признаки интоксикации Количество разовых доз Признаки интоксикации

белые мыши 7000 отсутствуют 1785 отсутствуют

кролики 1428 отсутствуют 714 отсутствуют

Биологические свойства тимоцина

Иммуностимулирующую активность тимоцина определяли по увеличению титра антител у телят, иммунизированных противотейлериозной вакциной и ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза телят.

Применение тимоцина способствовало 2-8-кратному увеличению титра противотейлерийных антител.

Проведен выбор оптимальной схемы применения тимоцина. Отмечено, что наибольшее увеличение титра антител к каждому вакцинному антигену отмечалось при применении его в дозах 0,02 и 0,03 мл/кг в течение 3-5 дней. Применение тимоцина способствовало увеличению титра антител к рота-, коронавирусу и эшерихии коли в 2,8, 3,6 и 2 раза соответственно.

При изучении влияния тимоцина на эффективность лечения пневмоэнтерита телят при совместном применении с химиотерапевтическими препаратами и определении оптимальной схемы их применения было обнаружено, что наибольшая эффективность лечения была достигнута при применении препаратов в дозах 0,02-0,05 мл/кг в течение 6 дней. Применение тимоцина увеличивало эффективность лечения на 20%, срок лечения животных сокращался с 10-14 до 6-7 дней.

Таким образом, применение тимоцина в комплексе с химиотерапевтическими препаратами повышает эффективность лечения различных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Производственные испытания совместного применения тимоцина с противотейлериозной вакциной показали, что тимоцин способствует усилению гуморального иммунного ответа в 4-8 раз.

В аналогичных условиях тимоцин способствовал увеличению титра специфических антител к рота-, коронавирусу и Е.соН в 3,2, 3,0 и 2 раза. '

Тимоцин положительно влиял и на ход лечения пнэвмоэнтеритов телят. Показано, что при совместном применении с ПВЭНТИ и регидропектатом, эффективность лечения увеличивается до 94,2%, сокращается его срок до 7 дней.

На основании вышеизложенного разработана нормативнотехническая документация на тимоцин, утвержденная Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан.

Результаты клинических испытаний тимогара и тимоцина

На основании решения Фармакологического Комитета Республики Таджикистан от 06.09.1994 года, протокол №2, были проведены клинические испытания тимогара в клинике кожновенерических болезней Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино.

Применение тимогара в комплексе с традиционными препаратами при лечении больных псориазом приводит к повышению эффективности лечения: клиническая ремиссия

достигнута у 81,2%, значительное улучшение - у 18,8%, против 66,3 и 33,7% соответственно больных в группе, в которой проводили традиционное лечение. Выраженное положительное влияние оказывает тимогар и на иммунологические показатели, его применение приводит к клинической ремиссии у 60% и значительному улучшению состояния здоровья у 40% больных.

В группе больных нейродермитом, которых лечили традиционными методами, из 13 исследованных показателей иммунной системы (содержание лимфоцитов (абсолютное и относительное), Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров, В-лимфоцитов, ]^А, 1{*М, 1цЕ, ЦИК, СЗ и С4 фракций

комплемента) до лечения 7 были изменены достоверно, после -нормализовалось только содержание ^А и СЗ фракции

комплемента. Остальные показатели имели тенденцию к

нормализации.

В группе, получавшей тимогар, к концу курса комбинированного лечения из 9 измененных показателей нормализовались 8, при этом уровень 1{>Е оставался повышенным при выраженной тенденции к нормализации.

Применение тимогара в комплексном лечении нефрологических (гломерулонефриты), ревматологических (ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева и др.),

пульманологических (бронхиальная астма, хронический бронхит, ринофарингит и СКВ) заболеваний, осложненной сердечнососудистой патологии, сопровождающейся иммунозависимыми воспалительными заболеваниями, сердечно-сосудистой патологии, осложненной вторичными иммунодефицитными состояниями, способствовало ярко выраженной положительной динамике всех данных исследования крови и мочи, особенно лейкоцитов, уровня СОЭ, иммуноглобулинов, белковых фракций и общего анализа

мочи. Назначение препарата тимогар намного сокращает курс лечения больных по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, тимогар хорошо зарекомендовал себя в качестве стимулятора и модулятора большинства иммунологических процессов, о чем свидетельствует его положительное влияние на лечение различных по своей этиологии иммунозависимых нефрологических, ревматологических, кожных, пульмонологических заболеваний, а также повышение уровня гуморального иммунного ответа при иммунизации различными вакцинами.

Решением Фармакологического Комитета Республики Таджикистан за № 3 от 4.09.2007 года были разрешены клинические испытания тимоцина в семи клиниках г.Душанбе.

Эффективность препарата изучалась при лечении хронических диффузных вирусных заболеваний печени (вирусные гепатиты В, С, В+С, В+Э, В+С+Э, фиброз печени, абдоминальный туберкулез), злокачественных новообразований (рак молочной железы, пищевода, носоглотки, шейки матки, вульвы, гортани, верхней челюсти, почечно-клеточный рак, опухоль яичников, мезателиома плевры, лимфосаркома периферических лимфоузлов, лейомисаркома правой почки), псориаза, нейродермита, аллергических состояний (бронхиальная астма, бронхиты, аллергические риносинусит и фарингит). При лечении всех заболеваний применение тимоцина приводило к положительной динамике клинических показателей.

При лечении диффузных заболеваний печени: отмечено увеличение концентрации эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, моноцитов, общего белка и холестерина, содержания Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, рецепторов к трансферрину, снижение количества палочкоядерных лейкоцитов, повышение концентрации общего билирубина, АсАТ, АлАТ, щелочной фосфатазы.

При лечении псориаза и нейродермита: повышается эффективность лечения - увеличение количества больных с клиническим выздоровлением и значительным улучшением, сокращается срока лечения, увеличивается количество Т-лимфоцитов, снижается количество В-лимфоцитов, IgA, ^Е, ЦИК, нормализуется 8 из 9 измененных показателей иммунологического статуса. Отсутствие клинического эффекта наблюдается в 10% случаев при лечении наследственно-обусловленных форм псориаза.

При лечении онкологических заболеваний: наблюдается стабилизирующее влияние на гсмопоэз, нивелируется действие химиопрепаратов, оказывается гепатозащитное действие, что не дает химиопрепаратам повышать концентрации АлАТ, АсАТ, мочевины, креатинина, удерживая их в пределах нормы, увеличивается количество Т-хелперов, снижается количество В-лимфоцитов и ЦИК.

Нормативные документы на препараты тимогар и тимоции

Утвержденные Министерством здравоохранения Республики Таджикистан:

1. Тимогар. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 Tj-

00001-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

2. Тимоцин. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 Tj-

00002-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

3. Изолейцил-триптофан образец стандартный. Фармакопейная статья ФС 42-Tj-0002-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

4. Тимоцин образец стандартный. Фармакопейная статья ФС 42-Tj-0003-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

5. Изолейцил-триптофан субстанция. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42-Tj-0001-08. Срок действия установлен с 2008 по 2013 гг.

Утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан:

1. Инструкция по изготовлению и контролю препарата тимоцин.

2. Препарат тимоцин. Технические условия.

3. Наставление по применению препарата тимоцин.

4. Инструкция по изготовлению и контролю препарата Тимогар (Thymogarum).

5. Препарат Тимогар (Thymogarum). Технические условия.

6. Наставление по применению препарата Тимогар (Thymogarum).

Выводы

1. Изучена технологичность и безопасность различных путей получения триптофансодержащих дипептидов, выбрана оптимальная схема (исключающая применение токсичного ОСС и дорогостоящего Е^зК), на основе которой разработаны технологические схемы производства субстанции.

2. Экспериментально доказано, что наиболее технологичным является использование активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении низкомолекулярных тимусных пептидов.

3. Установлено, что применение колоночной хроматографии на силикагеле при очистке защищенного дипептида позволяет исключить использование дорогостоящего метода ВЭЖХ на стадии очистки свободного дипептида.

4. Определены параметры стандартизации, разработаны методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием методов спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5. Методами рН-метрического и окс-редметрического титрования показано, что при взаимодействии триптофансодержащих дипептидов и ионов цинка образуются координационные соединения, иммуностимулирующая активность которых превышает активность исходных дипептидов. Установлен состав координационных соединений.

6. Установлено, что хроматографирование методом ТСХ в кислых и основных хроматографических системах пептидов, их солей и координационных соединений позволяет избежать влияния соле- и комплексообраз'ования на их хроматографическую подвижность.

7. Разработаны технологические схемы производства созданных на основе дипептида Н-11е-Тгр-ОН и его координационных соединений с ионом цинка препаратов тимогар и тимоцин, выбраны параметры и методы стандартизации. Разработанные методики стандартизации триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка основаны на использовании спектрофотометрического метода и

методов тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

8. Установлено, что новые лекарственные препараты тимогар и тимоцин не изменяют своих физико-химических свойств и не теряют иммунологической активности в течение 2 лет. Срок годности препаратов составляет 2 года.

9. На основании проведенных исследований разработано 5

Фармакопейных статей на новые иммуномодулирующие препараты тимогар и тимоцин, их субстанции и стандартные образцы,

утвержденные Министерством здравоохранения Республики Таджикистан и 6 нормативных документов, утвержденных Министерством сельского хозяйства Республики Таджикистан.

10. Показано, что препараты на основе дипептида Н-Ие-Тгр-ОН и его координационных соединений с ионом цинка являются практически нетоксичными.

11. Проведены клинические исследования препаратов

тимогар и тимоцин, показана их эффективность при лечении нефрологических, ревматологических, пульманологических, сердечно-сосудистых, кожных, почечных, онкологических заболеваний, сопровождающихся вторичными

иммунодефицитными состояниями. Доказана высокая иммуномодулирующая активность полученных препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бобиев Г.М., Сатторов И.Т., Хайдаров К.Х. Эффективность нового иммуностимулирующего препарата тимоцина при вакцинации телят против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактериоза // Докл. Российской академии сельскохозяйственных наук.-1998.-№ 6.-С. 37-39.

2. Бобиев Г.М., Бобиев Х.А. Модификация метода

активированных эфиров для еннтеза дипептида валил-триптофан // Докл. АН Республики Таджикнстан.-1998.-Т.40.-№ 1-2.-С. 30-33. .

3. Бобиев Г.М. Влияние синтетических иммуностимуляторов на клинические и гематологические показатели крупного рогатого скота, больного тейлериозом // Докл. АН Республики Таджи киста н.-1998..-Т.ХЫ1.-№ 5-6.-С. 58-62.

4. Бобиев Г.М., Зоиров П.Т., Хусайнов А.А., Бадалов Э.Т.

Клинико-экспериментальное изучение нового

биостимулирующего и иммуномодулирующего препарата тимогар // Здравоохранение Таджикистана.-1998.-№ 2.-С. 29-33.

5. Бобиев Г.М., Расулов У.Р., Хайдаров К.Х. Эффективность применения тимогара при лечении некоторых нефрологических и ревматических заболеваний // Здравоохранение Таджикистана.-1998.-№ 2.-С. 33-36.

6. Бобиев Г.М., Зоиров П.Т., Хусайнов А.А. Применение нового иммуномодулирующего препарата тимогар при лечении псориаза и нейродермита // Иммуиология.-1999.-№ 2.-С. 46-49.

7. Гиесов А.Ш., Исупов С.Д., Бобиев Г.М., Шахматов А.Н.

Изучение стабильности иммуностимулирующего препарата

тимогар // Сб.статей V научн.-практ. конф. «Теоретические и практические исследования в медицине».-Душанбе, 1999.-С. 98100.

8. Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х., Бадалов Э.Т. Повышение эффективности лечения тейлериоза с помощью иммуномодулирующих препаратов // Докл. Российской академии сельскохозяйственных наук.-1999.-№ 5.-С. 40-41.

9. Бобиев Г.М. Фармакологические свойства цинксодержащего соединения пептида ряда тимусных гормонов // Изв. АН Республики Таджикистан.-1999.-№ 3-4 (141).-С. 80-85.

10. Бобиев Г.М. Изучение биологической активности природного и синтетических иммуностимуляторов // Изв. АН Республики Таджикистан.-1999.-№ 1-2 (140).-С. 72-77.

11. Бобиев Г.М., Исупов С.Д., Шахматов А.Н., Хайдаров К.Х.

Синтез и иммуностимулирующая активность

координационных соединений некоторых

триптофансодержащих дипептидов с ионами металлов // Химико-фармацевтический журиал.-2000.-Т. 34.-№ 5.-С. 24-25.

12. Исупов С.Д., Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Хайдаров К.Х., Юсупов З.Н. Влияние взаимодействия с ионами металлов на иммуностимулирующую активность триптофансодержащих дипептидов // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тез. докл. -Москва, -2001.-С. 270.

13. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Исупов С.Д., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Повышение иммуностимулирующей активности

триптофансодержащих дипептидов комплексообразованием с ионами металлов // Кимиё и фармацня.-2002.-№ 6.-С. 53-56.

14. Гулов А.Х., Нораев Р.Х., Бобиев Г.М. Способ стимуляции пост вакцинального нротивотейлериозного иммунитета у крупного рогатого скота с помощью иммуностимулятора тимофера // Вестник ветеринарии.-2002 - Т.24 - № 3. - С. 49.

15. Бобиев Г.М., Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бандаев С.Г. Синтез дипептидного тимомиметика и его гистидинсодержащего аналога // Мат. межд. научн.-практ. конф., поев. 60-летию ТаджНИВИ «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях».-Душанбе, 2003.- С. 64-67.

16. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Хайдаров К.Х. О механизме действия тимогара // Вклад биохимиков в развитие биологической науки. Тр. третьей респ. научн. конф. биохимиков РТ.-Душанбе.-2003.-С. 84-86.

17. Садыков Д., Али Фрджани Хамис, Шахматов А.Н., Юсупов Т.Ю., Бобнев Г.М. Определение констант ионизации некоторых биологически активных аминокислот в водных растворах // Вестник Таджикского государственного национального университета. Серия естственных наук.-2004.-№

4.-С. 153-156.

18. Зоирова Н.П., Бобиев Г.М., Хусайнов А.А., Расулов М.М., Файзуллоева М.М. Лечение гнездной алопеции 1-(хлорметил)-сплатраном и тимогаром // Здравоохранение Таджикистапа.-2005.-№ 4.-С. 125-130.

19. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Токсические свойства натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан // Вестник педагогического университета.-2005.-№ 4.-.-С.71-73.

20. Исупов С.Д., Шахматов А.Н., Холназаров Б.М., Суфиев Т., Кадамов И., Наботов М., Файзуллоева М., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Перспектива разработки новых терапевтических агентов на основе биокоординациопных соединений аминокислот и низкомолекулярных пептидов с биометаллами // Вестннк Авиценны. Паёми Сино (Мат. научн.-практ. конф. «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» с межд. участием, поев. 25-летию фармацевтического факультета ТГМУ им.Абуали ибни Сино, 29 мая 2006 г.).-Душанбе, 2006.-№ 1-2.-. С. 491-503.

21. Салимов Д.М., Хакимов Ф.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Перспективы применения иммуномодулятора тимогара и его натриевой соли при лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Мат. научн.-практ. конф. «Аналитик кимиё ва экологиянинг долзарб муаммолари».-Самарканд,-2006.-.-С. 276-279.

22. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. О комплексообразовашш иона цинка с дипептидом глицил-триптофан // Докл. АН Республики Таджикнстан.-2006.-Т.49,-№2.-С.154-157.

23. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Расчет равновесий комплексообразовапия в системе цинк(П)-дипептид глицил-триптофан-вода // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-2006.-№ 2.-С .110-115.

24. Чориева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Юсупов З.Н., Хайдаров К.Х. Комплексообразование цинка в растворах глицил-триптофана // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-Душапбе.-2006.-№ 2.-.-

С. 121-126.

25. Джаборов К.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Экспериментальное изучепие фармакодинамики тимоцина // Вестник Таджикского государственного национального уииверситета.-Душапбе.-2007.-№ З.-С. 193-198.

26. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Некоторые вопросы синтеза триптофапсодержащих иммуноактивных дипептидов // Вестник Таджикского государственного национального университета.-Душанбе.-2007.-№ З.-.-С. 221-226.

27. Джаборов К.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х. Экспериментальное изучение токсических свойств тимоцина // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физ-мат., хим. и геол. наук.-2007,-№ 1(126)- С. 90-93.

28. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Антиаллергизирующис свойства натриевой соли нзолейцил-триптофана (тимогара) // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физ-мат., хим. и геол. наук.-2007,-№ 1(126)- С. 94-97.

29. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Изучение иммуностимулирующей активности натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан (тимогара) // Кишоварз, 2007.-№2.-С. 14-15.

30. Салимов Д.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Эффективность применения натриевой соли дипептида изолсйцин-триптофан (тимогара) при иеспецефическнх заболеваниях легких // Доклады Академии сельхознаук РТ, № 4 (14), 2007, С.52-55

31. Закиряходжаев Д.З., Мирзоева Д.С., Бобиев Г.М., Хусейнов

З.Х., Хамидов А.К., Ашурова М.Д., Бакиев С.А. Применение тимоцина при лечении злокачественных новообразований различной локализации // Проблемы клинической онкологии. Сборник статей, посвященный 75-летию профессора Ахмедова Б.П. Т. 1 .-Душанбе, 2008 - С. 71 -77.

32. Шахматов А.Н., Лангариева Дж.С., Талбов Ф.Щ.. Бобиев Г.М. О возможной прпчпне повышения иммунологической активности триптофансодержащих дппептидов при образовании солей и комплексообразовании // Вестник Авиценны. Паемп Сиио. -2008.-№ 3.- С. 119-121.

33. Валиев А.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Влияние солеобразования на хроматографическую подвижность дипептида изолейцил-триптофан // Сб. научн. тезисов совместной респ. научн.-прак. конф. «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане» и 56-ой годичной научнопрактической конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане».-Душанбе, 2008.-С. 24-25.

34. Валиев А.Х., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Оптимизация условий определения дипептида изолейцил-триптофан методом ВЭЖХ // Там же. -С. 25-26.

35. Бобиев Г.М. Результаты клинических испытаний нового иммуномодулирующего препарата тимоцин // Вакцинология-2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. -М., 2008.- С.

25.

36. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Мансурова Ф.Х., Лангариева Г. Иммуномодулирующее действие нового препарата тимоцин // Там же.-С.26

37. Джаборов К., Бобиев Г.М., Зоирова Н.П., Касымов О.И., Шахматов А.Н., Хайдаров К.Х. Результаты применения тимоцина при лечении псориаза // Там же - С. 48.

38. Лангариева Д., Шахматов А.Н., Талбов Ф.Ш., Бобиев Г.М.

Результаты клинических исследований нового

иммуномодулирующего препарата тимогар // Там же - С. 70.

39. Валиев А.Х., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Разработка условий определения иммуномодулирующего препарата тимоцин методом ВЭЖХ // Вестник педагогического университета.-2008.-№ 3(31).-С. 57-62.

40. Салимов Д.М., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Бобиев

Г.М., Хайдаров К.Х. Опыт применения тимогара при лечении осложненной сердечно-сосудистой патологии,

сопровождающейся иммунозависимыми воспалительными заболеваниями // Изв. АН Республики Таджикистан. Отд. физмат., хим., геол. и техн. паук -2008.-№4(133).-С. 57-61.

41. Шокиров М.Н., Холназаров Б.М., Шокиров М.М., Хушвактов Д.И., Ходжаева А.М., Мирзоев М.Ш., Акбаров М.М., Латипов С.Д. Применение отечественного иммуномодулятора тимогар при проведении дентальной имплантации у больных сахарным диабетом // Известия АН Республики Таджикистан.-2009.-№ 1(134).-С. 72-77.

42. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н. Изучение состава координационных соединений цинка и дипептида изолейцил-триптофан методом окислительного потенциала // Мат. межд. конф. «Состояние и перспективы развития биохимии а Таджикистане».-Душанбе, 2009.-С.38-44

43. Бобиев Г.М. Бунятяи Н.Д., Саядян Х.С., Саповский М.М. Иммуноактпвные пептиды и их координационные соединения в медиципе.-М.: Издательский дом «Русский врач», 2009.-228 с.

44. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Валиев А.Х. Разработка условий хроматографического определения дипептида изоленцил-триптофан и его координационных соединений // Фармация.-2009.-№ 7.-С. 17-18.

45. Холназаров Б.М., Саидов С.С., Чариева С.А., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Применение тактики максимальной защиты для сиитеза тирозинсодержащих тетрапептидов Н Вестник Таджикского государственного национального университета.-20Ю.-№ 3(59).-С. 228-231.

46. Мансуров Х.Х., Мироджов Г.К., Мансурова Ф.Х., Бобиев Г.М., Холназаров Б.М. Тимоцин в терапии хронических

диффузных заболеваний печени // Проблемы гастроэнтерологни.-2010.-№ 1-2.- С. 40-49

47. Холназаров Б.М., Джаборов К.М., Шахматов А.Н., Бобнев Г.М., Хайдаров К.Х. Механизм действия тимоцнна // Здравоохранение Таджикистана.-2010.-№ 3.- С. 23-27.

48. Мирзоева Д.С., Бобиев Г.М., Анохина И.В. Применение тимоцина при лечении рака молочной железы // VI съезд онкологов и радиологов стран СНГ. Материалы съезда: Душанбе, 1-4 октября 2010 г. -Душанбе, 2010,- С. 150.

49. Бобиев Г.М., Холназаров Б.М., Шахматов А.Н., Рахимова Т.П. Иммуноактивные пептиды и их координационные соединения в медицине // Материалы респ. научн. конф. «Проблемы современной координационной химии», поев. 60-летшо чл.-корр. АН РТ, д.х.н., проф. Аминджанова А.А. (13-14 января 2011 г.).-Душанбе, 2011.-С. 144-145.

50. Бобиев Г.М., Бунятян Н.Д., Шахматов А.Н., Юсупов З.Н., Рахимова Т.П. Изучение состава координационных соединений цинка и дипептида изолейцил-триптофан методом окислительного потенциала // Материалы респ. научн. конф. «Проблемы современной координационной химии», поев. 60-летию чл.-корр. АН РТ, д.х.н., проф. Аминджанова А.А. (13-14 января 2011 г.).-Душанбе, 2011.- С.149-150.

Список патентов по теме диссертации

1. Бобиев Г.М. Способ получения иммуностимулирующего

препарата тимоцин. Патент Республики Таджикистан № TJ 282, приоритет 08.05.1998.

2. Бобиев Г.М. Способ получения иммуностимулирующего

препарата тимогар и его состав. Патент Республики Таджикистан № TJ 283, приоритет 23.10.1998.

3. Бобиев Г.М., Салимов Т.М., Мурватуллоев С. Способ

вакцинации птицы против колибактериоза и стафилококкоза. Патент Республики Таджикистан № TJ 304, приоритет 16.01.1999.

4. Зоиров П.Т., Бобиев Г.М., Хусайнов А. Способ лечения псориаза. Патент Республики Таджикистан № TJ 382, приоритет 27.01.1999.

5. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Касирова А.Н. Способ

получения тимопентина. Патент Республики Таджикистан № TJ 453, приоритет от 19.10.2006 г.

Список использованных сокращений

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГФ - Государственная фармакопея ИФА - иммуноферментный анализ КРС - крупный рогатый скот МСХ - Министерство сельского хозяйств ПСА - вариант метода смешанных ангидридов РА - реакция агглютинации РТГА - реакция торможения гемагглютинации ФСП - Фармакопейная статья предприятия ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы БСС - дициклогексилкарбодиимид ОСНи - дициклогексилмочевина ЭМБ - диметилфорамид

- триэтиламин НОЕЛ- 1-гидроксибензотриазол НОБи - Ы-гидроксисукцшшмид КММ - К-метилморфолин -ОВг1 - сложноэфирная бензильная группа -ОМе - сложноэфирная метальная группа -ОРср - сложноэфирная пентахлорфенильная группа Ъ- - карбобензоксигруппа

Заказ № 6602 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru