Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Повышение эффективности метода определения чувствительности рака матки и молочной железы к эстрогенам и антиэстрогенам

российская академия медицинских наук

онкологический научный центр

На правах рукописи

ДАТСКАЯ Валентина Александровна

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РАКА МАТКИ И ЙОЛОЧНОИ ЖЕЛЕЗЫ К ЭСТРОГЕНАМ И АНТИЭСТРОГЕНАМ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Носква - 1993

Работа выполнена о Онкологическом научном Центре РАШ.

Научные руководители: доктор медицннских наук, профессор Л.С. бассадык кандидат Окологических наук ИЗ. А. Красшшпшов •

официальные оппоненты: доктор иедииннских наук, профессор В.Я. Федотов доктор биологических наук Г.И. Потасооа

Ведущая организация: &осковскнп научно-нсследовательскип институт онкологии ин. П.А. Герцена.

Чяватг^ргтпит™ " 199 ^_ г.

в г— часок на заседании Специализированного совета по закцто кандидатских диссертации (К.001.17.01) при онкологической научной центре РАШ (Москва 515476, Каимрское косее. 24).

С диссертацией нохшо ознаконитьса о библиотеке Онкологического научного центра РЛШ11.

Диссертация разослана Ученый секретарь специализированного совета доктор иедццннских наук, профессор

U.C. Турусов

Актуальность проолемы.

В настоящее время эндокринная терапия широко используется для лечения вольных с опухолями матки и молочной железы. Используемые -сегодня критерии чувствительности опухолевых клеток к гормонотерапии ограничиваются, преимущественно, определением содержания рецепторов стероидных гормонов и их связывающей способности, в первую очередь рецепторов эстрогенов и прогестерона. Однако, используя эти показатели, далеко не всегда удается правильно оценить чувствительность клеток к гормонотерапии. Примерно 45-50% опухолей с высоким содержанием рецепторов эстрогенов (РЭ) нечувствительны к эндокринной терапии и 10Я РЭ-отрииательных опухолей чувствительны. В связи с этим остается актуальным вопрос о повииении надежности определения чувствительности опухоли к гормонотерапии.

Одним из наиоолее перспективных направлений в этой ооласти представляется определение пролиферативной активности опухолевых клеток, полученных либо путем биопсии, либо после операции при культивировании In vitro в присутствии гормона. Такой подход стал возможен после того, как в последние годы были подробно описаны события, происходящие на начальных этапах клеточного цикла ( в ранней UI-фазе) и предваряюдие собственно процесс репликации ДИК. Речь идет о взаимодействии ростовых факторов и гормонов с клеточной мембраной, активации скорости оборота инозитсодерхавшх фосфодипидов, стимуляции протеинкиназы С и тирозинкиназ, фосфорилировании белков, активации некоторых ранних протоонкогенов, сопряженных с активной пролиферацией tmyc, ros, sis ). Из перечисленных изменений наиболее простым в методическом плане и вместе с тем достаточно информативным представляется исследование процесса активации обмена фосфолипмдов - одного из ранних этапов пролиферативной реакции.

Цель и задачи исследования Целью настоявего исследования является изучение основных путей воздействия стероидных гормонов на ранние стадии пролиферативного никла опухолевых клеток матки и молочной железы и разработка на основе полученных данных новых критериев, повивающих надежность определения чувствительности опухолей молочной железы и матки к гормонотерапии.

Основные задачи исследования: I. Изучить влияние половых гормонов t17В -эстрадиола, протесте-

рона), и антиэстрогена тамоксифена на синтез фосфолипидов о клетках карциномы матки.и молочной хелезы. отличающихся по содержанию рецепторов гормонов.

2. Провести сравнительный анализ скорости синтеза различных фракций фосфолмпидов (фосфатидилинозитола, 'фосфатидилхолина и фосфатидилзтаноламина) в клетках рака молочной железы и рака тела матки>отличающихся по чувствительности к стероидным гормонам.

3. Провести сравнительный анализ действия стероидных гормонов и эпидермалыюго фактора роста (ЭФР) на синтез фосфолипидов клеток карциномы матки и-молочной хелезы.

4. На основании проведенных исследований „ разраОотать дополнительный метод, повывающий надежность оценки чувствительности опухоли к гормонотерапии.

Научная новизна работы.

В работе впервые на клинической материале исследовано влияние половых стероидов и таиоксифена на цикл обрасгния фосфолипидов о опухолевых клетках. Показано, что синтез фосфолипидов находится под противоположный контролен со стороны стероидных гормонов - активаторов пролиферации (зстрадиола) и ингибиторов пролиферации (прогестерона). Показано отсутствие корреляционной зависимости между содержанием цитоплазматических рецепторов гормонов и эффективностью деиствия стероидов на цикл обращения фосфолипидов. Установлено, что чувствительность опухолевых клеток к рост-регулирув-идему действию стероидных горионов определяется не только содержанием рецепторов гормонов, но и присутствием оелково-пептидных ростовых факторов (ЭФР), контролирующих процесс инициации клеточного деления.

Научно-практическая значимость.

На основании полученных данных предложен дополнительный иотод определения гормональной чувствительности опухолей, оснований «а анализе индуцированных гормоном изменении скорости обращения клеточных фосфолипидов.

Полученные в результате работы результаты позволяют аойысить точность и надежность предсказания гормоночувствительности злокачественных опухолей, таких как рак полочной халези и тела натки. Разработанный метод анализа цикла обращения фосфолипидов делает возможным определение степени гормональной чувствительности

опухолей с учетом экзогенных ростовых факторов, влиявших на пролиферативную активность опухолевых клеток, что позволит существенно увеличить эффективность эндокринной терапии злокачественных новообразовании.

Апробация диссертации. Основные материалы диссертации представлени и обсуздены на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки " (Минск, 1990), II Всесоюзной симпозиуме "Метастаэированне злокачественных опухолей. Новые подходи" (Киев, 1991), Международном семинаре по раку молочной хелезы (Львов, 1992 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных раоот.

МАТЕРИАЛЫ И ¡ЖТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выполнения поставленных в раОоте задач было проведено комплексное клинико-лаОораторное обследование 60 первичных оольных раком молочных железы и 50 Оольных ракой тела матки, лечиввихся в ОНЦ.

У оольных злокачественными ооразованнями молочных желез были выполнены операции - радикальная мастэктомия, радикальная иастэк-тониа с сохранением грудных мышц. У всех Оольных злокачественными образованиями тела матки были выполнены операции - надвлагаликная ампутация натки с придатками.

Все удаленные во время операции опухоли подвергались гистологическому и цитологическому исследованию с целью установления гистологического типа опухоли и у 100 опухолей Оыла определена степень дифференцировки раковых клеток ведущим научный сотрудником Ермило-вой В.Д.

Оценка степени распространенности опухолевого процесса проводилась с применением классификации Международного противоракового союза, известно« как система ТЫМ (Классификация злокачественных опухолей по системе ТЫМ: Методические рекомендации, 1981 ).

При анализе распределения Оолышх раком молочных хелез в за-сисииости от гистологического типа опухоли установлено, что преобладавши гистологическим типом Оыла протоковая инфильтративная карцинома (83%), дольковая инфильтративная карцннома и медуллярный рак были выявлены у 122 и 52 Оолышх, соответственно. У 65% оольных была верифицирована II степень злокачественности опухолевых клеток, у 50Я было обнаружено поражение лимфатических узлов.

При анализе распределения Солышх ракой эндометрия в зависимости от гистологического типа опухоли установлено, что преобладающим гистологическим типом рака эндометрия была адепокарцшюма -02?, у 67,5» больных была верифицирована высокая и умеренная степень дифференцировки опухолевых клеток.

Получение материала:

Из злокачественно»! опухоли, удаленной во врекя операции, иссекали участок без некроза с кассой 500-1000 мг. Кусочки опухоли аа льду доставляли в лабораторию клинической биохимии, разделяли па две части, в одно« из которых исследовали цикл оОрашлшя фосфоли-пидов, вторую хранили па -70°С до определения рецепторов.

Определение рецелтороо стероидных rcpssoiioo о опухолях вольных раком молочних хелез и раком эндометрия. Освобожденная от игра и соединительной ткани опухоль измельчалась, замораживалась жидки»: азотом, дробилась до получения порошка и затеи экстрагировалась вестью ооьеиаям ТРИС-11С1 буфера (рН-7,<1) для получения гокогена-тов. Определение рецепторов производилось в цитозолях исследусних опухолей методом, предложенным Е.О.Е.Т.С. Breast Cáncer Cooperativo ггоир, 1У73 с небольшими модификациями. Ццтозолси считают супернатант, полученный на ультрацентрифуге К-32 при 105000 е. Цитозолк инкубировали 10-20 часов при 0°С-4°С с Í3IIJ -эстрадиолом (для определения рецепторов эстрогенов), синтетически« прогестином [3Ы JR-5020 (для определения рецепторов прогестерона).

Для разделения 13И1 горион-рецепторнмх комплексов и свободного lJH) - стероида использовали обработку цитозолеп углем, покрцтин декстраном.

Счет радиоактивности производился в сшштнлляшюшшх счетчиках Mark III м Intertechnlque.

Специфическое связывание гормонов с цитоплаззатичсскшш Оелкаии-рецепторами рассчитывали по разности мехау обеим к неспецифическим связыванием в присутствии 100-200-кратного избытка соответствующих немеченых стероидов и отражали в феятоыолях связанного с рецептором стероида на иг общего цитоэольного Оелка в пробе (фмоль/мг). Белок определялся методом Lowry O.fl.

Границей рецепторополохительности для РЭ и РП при раке молочних желез считали 10 фмоль/мг Оелка цитозоля, границей рецепторположи-телыюсти для злокачественных опухолей эндометрия - 10 фцоль/кг Оелка для РЭ и 20 фмоль/мг -для РП.

Оценка рецепторного статуса проводилась совместно с сотрудников

лаборатории клинической биохшшм к.О.и- Кузьиинол З.В.

Метол определения скорости обретения фзсфолипнлоо о опухолегшх клетках. Клетки опухоли молочних желез и аденокарциноин яатки гсен-иин выделяли из фрагиентов удаленных опухолей по методу (Ottestad L., o.a., 1988). Измельчали 1 г ткани, добавляли 0,5 ил снеси Ферментов (ix коллагеназа + 0,1" гиалуронидаза + 0,02% ДНКаза) в 5ил среди Игла. Инкубировали, пракая при коинатноп температуре, 10 час. Затеи гокогенат фильтровали и ценрифугнровалм через слои фи-кол-верографпиа (р = 1,077) при 100 g 30 мин. Сконцентрированные в интерфазе клетки отбиралш откипали и ресуспендировали в среде Игла.

Для определения включения ^Р п фосфолипидн Омл использован мо-

4 2

днфнцировашшл иетод анализа Р-фосфолипидоз, основании« на одновременном проведении -экстракции и тонкослойной хроматографии (ТСХ) лнпидоо из целнх клеток, предварительно иммобилизованных на силикагсле.. Клетки лреинкубнровалк в присутствии или отсутствии

исслсдуетшх агентов в течении 10 мин. Затем в кулътуралъную среду 32

добавляли Р-ортофосфат 120 мкКм/ил) и клетки инкубировали 20 иин при 37°С. Клетки пронывали н ресуспендировали в растворе Хэнкса, затея определяли количество клеток. Образцы, содержащие одинаковое количество клеток, наносили на ТСХ пластины (около 10 клеток на точку). Пластшш гшеуиивалн и проводили ТСХ в системе хлоро-фори/иетанол/7М накатирпип спирт (65:25:5). При низком включении

3->

Р п фосфолипиди (в экспериментах с медленно пролиферируюиикн клетками) лкпкди разделяли в системе хлороформ/иетанол/вода (65:25i4), что позволяло добиваться максимальной концентрации фосфолипидоз (в частности, фофоилозитлдов ) а зона прохождения. Для • идентификации фосфолипидов использовали стандарти липидов ("Signa"), После проведения ТСХ, пластшш высупивали, проявлял» d парах иода и радиоавтографировалн.

42

Для количественного определения включения Р в фосфолипидц использовали денситомстрическое сканирование - радиоавтографов (Ultroscan XL, LKB). Предварительные исследования показали, что применение описанного дагода позволяет добиться эффективного разделения фосфолилидов на ТСХ пластинах, не уступаюиего по качеству разделению фосфолипндов, предварительно экстрагированных из клеток с использование*! традиционного метода Blich, Dayer, 1959 . Эффективность разделения фосфолнпидов контролировалась с помогли двумерной хроматографии по методу Kai buch!, Takal, 1933.

- 6 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ It ИХ ОБСУДЦЕШЕ Влияние стероидных гормонов и эпидермалыюго фактора роста на обмен (^осфолипидоо о клетках, аденмсаршшолв! матки

Влияние эстрадиола на обмен фосфолипидов в клетках аденокаршномы матки.

Известно, что 170 -эстрадиол стимулирует пролиферацию клеток, причем рост-стимулируюшмй эффект 17В~зстрадиола кокет быть сопряжен с увеличением скорости обмена фосфолипидов в клетках. Увеличен

ние скорости обмена .фосфолипидов и, соответственно, увеличение

12

включения Р в фосфолмпиди при стимуляции пролиферации клеток вызваны, в основном, активацией фосфолипазы С (Whitman М., 1988; Fain J.N.. 1990).

В наимх экспериментах исследовалось влияние 170-эстрадиола на синтез фосфолмпидов в клетках карцином эндометрия хешшн-

Клетки получали из фрагментов удаленных опухолей матки, как описано в "Материалах и методах исследования". Полученные опухолевые клетки инкубировали в среде Игла 19 мин в присутствии 10"» М 176-зстрад.иола и затем 20 мин в присутствии 32Р -ортофосфата. Тонкослойную хроматографию меченых фосфолипидов проводили на силикагеле Н с последующим радиоавтографированием.

Обнаружено, что инкубации опухолевых клеток матки с 176-эстра-диолом в течении 15 мин достаточно для заметно« стимуляции включения Р-ортофосфата в основные клеточные фосфолипиды: фосфоинози-тиды и фосфати"илхолин (рис.1). При этом оказалось, что степень активации обравения фосфолипидов сравнима с активацией, наблюдаемой при действии на клетки эпидермалыюго фактора роста (ЗФР). Было исследовано 40 Сольных с аденокарщшоноя матки и показано, что

в 37,58 случаев аденокарциноны катки 17В~эстраднол вызывает 1,5-2

32

кратное увеличение включение Р в фосфолипиды а в 62,5* случаев опухолевые клетки натки были не чувствительны к действию 170-зст-радиола.

В 33 (82,5%) опухолях матки содержание рецепторов эстрадиола (РЭ) пресыщало 10 фмоль/мг белка. Сравнение уровня изменения синтеза фосфолипидов в карциномах эндометрия с разной концентрацией рецепторов показало отсутствие корреляции между этими двумя параметрами (Е=-0,25.Р>0,05 ) (рис.2).

Среди 40 исследованных опухолей иаткн 45? опухолей характеризовались высокой степенью дифференцировки, в 202 и 35i были зафикси-

«¡¡1

1 - ковзроаз )

ч

2 - оогредкоа (--)

8ФР (...!..)

Рис.1 Влняние 176-эстрадиола и ЭФР на включение 32Р в фосфолипндм клеток аденокарцинош натки.

Клетки преинкуоировали о среде Игла 15 мин оез добавок (1), в' присутствии 10-3М эстрадиола (2) и о присутствии 10~° И ЭФР <3 1. Затеи во все образин добавляли 32Р-ортоеюсфорную кислоту на 20 мин. фосфолипиды анализировали методом ТСХ. Справа от радиоавтографа представлены результаты' денситонетрического сканирования фракция фосфатидилхолина IФХ) и фосфоинозитидоо (ФИ).

фракция ФХ

12 3

- о -

Еклттге 32-Р U от ксятролй

350

зоо

250 200 150 100 50 0

О 100 200 300 400

РЭ (fiiOAb/MT Сзллс)

Рис. 2 Влияние 176-эстрадиола на оОйоп фосфолипндов d

клетках аденокарцинои иатки. Представлены результат«

12

определения включения Р в фосфолиаиды каоток с различав содержанием РЭ.

0

0 0

о> 0

"о* ♦ к 0 0 0 0

8 ООО 0 0.0 : 0 0 0 о* с ♦ о о 1 ...........1-------- - , ,1. 0

ровани умеренная и низкая степени дкфферениировки. Оказалось, что эстрадиол с одинаковой эффективностью действует на опухоли с различно!! степенью дифференцировкн и глуонноп инвазии. Не било обнаружено корреляции и между чувствительностью опухолей натки к эстрадиолу и такнин показателями как стадия заболевания и состояние менструальной функции.

Олиянно прогестерона но ос кем фвсфшшлпдсп о клетках аденскершнски мэтки.

Как известно, инвены» для действия прогестерона являются ткани половой сферы. Наем эксперинепты проводились на клетках карциномы катил человека, пролиферация которой, как правило, находится под взаишго противоположит контролен со стороны эстрогенов - стинуля-TopoD пролиферации и прогестинор - ингибиторов пролиферации.

Из удаленной опухоли матки человека выделяли клетки как описано в"К'дтериалах и яетодах исследования". Клетки суспендировали в среде Нгла НО7 клеток d 1 ил среди). Для выяснения пряного влияния гордона на клетки эндометриально« карцикоии опухолевые клетки инкубировали In vitro 15 пин в присутствии прогестерона в концентрации 10"7 JJ.

Било обнаружено, что п отличие от эстрадиола прогестерон виэи-

42

вает заметное ториожвние включения ""р-ортофосфата в фосфолипиды, а добавление ЗФР снимает действие прогестерона на обмен фосфолипидов (рис.3).

Анализ 45 опухолей матки показал, что в 42,2% случаев прогесте-рои зиз'нвал 1,5-2 кратное торяожеиие включения ""Р-ортофосфата в фосфолипиды,. а в 57.7% случаев опухолевые клетки матки оили нечувствительны к действии прогестерона. Всего из 40 исследованных рецзптор-положительних опухолей натки мы обнаружили 23 образца, синтез основных фосфолипидов в которых не контролировался прогестеронов. Следует отметить, что эффективность действия прогестерона не зависела от базальной скорости обращения фосфолипидов и в клетках с различным уровней обмена прогестерон вызывал сходные изменения синтеза фосфолипидов.

В 35 аденокарцмноиах матки содержание рецепторов прогестерона (РП) превышало 100 фмоль/иг белка, s остальных 10 концентрация рецепторов была ниже 100 фмоль/мг. Анализ действия прогестерона на синтез основных фосфолипидов в клетках адекарциномы иатки первичных больных показал, что добавление прогестерона вызывает снижение

1 - КОИЕРОШ» (——}

2 - арогвоеароа <---)

$ - В®ЗР ■* прогеовероя (•••••)

32

Рис.3 Влияние прогестерона и ЭФР на включение р о фосфолипиды клеток аденокарциноны натки.

Клетки преинкубнровали 15 иин о среде Игла без добавок (1), в присутствии 10~7М прогестерона (21 и в присутствии 10~7М прогестерона * Ю"еЫ ЗФР 13 1. Затеи во всо образцы образцы добавляли а2Р-ортофосфорную кислоту на 20 шш. Фосфолипнды анализировали иетодон ТСХ. Справа от радиоавтографа представлены результаты денсмтонетрвческого сканирования фракция фосфатидилхолина 1ФХ1 и оосфоииозитидов (ФИ).

- И -

включения "^Р-ортофосфат в основные фракции фосфолипидов (фосфатидилхолин, фосфоиноэитиды) в 15 из 35 опухолей с высоким содержанием РП, в 4 из 10 образцов с низким содержанием РП. Сравнение уровня изменений синтеза фофолипидов и концентрации рецепторов прогестерона в карциномах эндометрия показало отсутствие корреляции между этими ■ параметрами (Е=-0,233, Р>0,2 ) {рис.4). Среди 45 исследованных опухолей матки 45? опухолей характеризовалась высокой степенью дифференцировки, в 22% и 33% били зафиксированы, соответственно, умеренная и низкая степень дифференцировки. Оказалось, что прогестерон с одинаковой эффективностью действует на опухоли с различной степенью дифференцировки и глубиной инвазии. Процент опухолей, чувствительных к действию прогестерона, не изменялся и в зависимости от стадии заболевания, состояния менструальной функции.

Представленные результаты позволили предположить, что в клетках некоторых аденокаршшом матки один из начальных этапов И-фазы клеточного цикла - распад фосфолипидов - находится под контролен стероидных гормонов.

Влкпняе эпидериалъного фактора роста и прогестерона на ссрааоияо фосфолшшдоз в клетках апенскарцкнсгаги матки.

Выше ми показали , что стероидные гормоны - стимуляторы пролиферации (эстрогены) вызывают активацию , а гормоны-ци-тостатикн ( прогестерон) - торможение цикла обрааения основных клеточннх фосфолипидов: фосфатидилхолина и фосфоииозитидоз. На слйдуюавя этапе экспериментов мы исследовали роль ЭФР в реализации обнаруженных эффектов стероидных гормонов.

К клеткам опухолей матки, предобработанним 15 мин 10~в И ЭФР, -7 32

добавляли на 15 мнн 10 И прогестерона, затем на 20 мин Р-ор-

тофосфат. Меченные 32Р фосфолипиды анализировали методой ТСХ.

Было обнаружено, что 15-минутной инкубации клеток с ЭФР достаточно для заметной стимуляции включения 31!Р-ортофосфата в основные клеточные фосфолипиды (см. рис.1), сравнимой с действием 17В -эстрадиола. Анализ 31 опухоли матки показал, что в 35,52 случаев

то

ЭФР внзывал 1,5-2 кратную стимуляцию включения Р-ортофосфата в фосфолипиды; а в Ь4,52 случаев опухолевые клетки матки были нечувствительны к действию ЭФР.

В Табл.1 суммированы данные по влиянию прогестерона и ЭФР на

- и -

32-Р 8 от кситрвля

200 400 600 всю 1000

РП (^моль/иг Сза!СО)

Рис.4 Влияние прогестерона на оОисн фосфолипидов в клетках аденокарцшюм катки. Представлены результаты

42

определения включения Р в фосфолипиди клеток с различии« содерхаииек РП.

обращение фосфолипидов в 31 исследованной опухоли матки. Оказалось, что в 35,38 опухолеп ЭФР вызывает увеличение включения 12

Р-ортофосфата в фосфолипиди. Анализ измоиешш скорости обращения фосфолнпидов посла действия на опухоли прогестерона показал, что в клетках нечувствителышх к ЭФР. гормон не визивает заметних нз-вонения в Оазальнои уровне обмена фосфолнпидов в 70% случаев. В то хз время из 11 опухолеп, положительно реагирующих на ЭФР, в 82Я случаев прогестерон приводил к выраженному торможению ЭФР-зависи-моП активации обрацения оосфолипидов. Сравнение уровня изменения синтеза фосфолипидов о карциномах эндометрия с ЭФР-завмсимым и ноэависинии циклоп обраиения фосфолипидов показало'наличие поло-Я1Т0ЛЫ10Л корреляции между зависимость» цикла обраиения фосфолипидов от ЗФР и чувствительностью клеток к прогестерону (г= 0,5, р< 0,01).

Табл. 1.

Влияние прогестерона на обмен фосфолипидов в клетках адепокаршшоии катки

Ответ на прогестерон 32

Всего (включение Р в фосфолипиди)

Снижение Отсутствие

включения изменении

Опухоли с ЭФР-эависииим

Никлом обращения - И 9 (322) 2 (10S)

фосфолипидов

Опухоли с ЗФР-иезависияым

циклом обращения 20 б (30») H (70% )

фосфолипидов

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что процесс ЗФР-зависимоп активации обращения фосфолипидов может являться одной из первых мишенеп при действии прогестерона на клетки горионочувствителышх опухолеп матки.

Влияние 17В-эстрши»ола, тамоксифена и эпндермального фактора роста на включение в фосфолипидн клеток первичного рака люлочной нелезы.

Действие 176-эстрадиола на обмен фосфоднпндоа о' клетках

опухолей молочцоя хелезы.

Обнаружено, что инкубации опухолевых клеток нолочноя хелезы с

17В~эстрадиолон в течение 15 мин достаточно для стинуляшш вклвча-«2

ния Р-ортофосфата в основные клеточные фосфолипиди: фосфошюзи-тиды и фосфатидилхолин (рис.5).

Было исследовано 43 Сольных первичный раком иолочноп железы и

показано, что в 30,2» случаев 17В-эстрадиол вызывает 1.5-2 кратное

32

увеличение включения Р-ортофосфата в фосфолипидн, а в 66,82 случаев опухолевые клетки нолочноя хелезы оказались не чувствительны к действию 176-эстрадиола.

Из 43 исследованных опухолей нолочноя железы п 24 155,85) оОразцах содержание рецепторов эстрогенов' превыиало 10 фноль/нг и в 19 (44,2%) оОразцах содержание эстрогенов Оило ниже 10 ф»голь/иг. В 10 РЭ+ опухолях и 3 РЭ- пухолях добавление 17В-эстрадиола

32

вызывало увеличение включения Р-ортофосфата в основные клеточные фосфолипидн. Сравнение концентрации рецепторов эстрогенов (РЭ) и уровня эстрогеи-нндуцировашшх изиеиения синтеза клеточных фосфолипидов (фосфатидилхолина и фосфоинозитидов) в первичной раке молочной железы показало отсутствие корреляции {гв0,0228, Р>0.031 (рис.6).

Среди больных ракой молочной хелезы у 012 Сил диагносцнрован протоковыя инфильтративныя рак, 11,5% случаев - дольковыя инфаль-тратнвния и 7,5? - иедуллярныя рак. Оказалось, что все перечисленные разновидности рака молочной железы обладают примерно одинаковой чувствительностью к действию 17В-эстрадмола на фосфолипиди. 12а било обнаружено существенных изменения в эффективности действия 17р-эстрадиола и в зависииости от стадии заболевания и состояния менструальной функции.

Леостоне антиэстрогена тамоксифена на оокеи фосСолмяидсз о клетках опухолей молочной железы.

' В представленных экспериментах аи исследовали действие на оиу-холевие клетки молочноя железы тамоксифена - соединения из груипы антиэстрогенов, активно используемого а клинической практике паря-

ш

03-

/ »

Фрикции ФА

фрикция ФЯ

I - козздигэ (-*—) а - оаград?"М (—)

42

Рис. 5 Влияние 178-эстрадиола на включение Р в

фосфолияшш клеток опухоли молочной зелезы.

Клетки прешнсубировалн 13 мин в среде Игла без добавок

II) и в присутствии ю"вМ 17В-эстрадиола (2). Затем во все 12

образцы добавляли " Р-ортофосфорну» кислоту на 20 мин. фосфолиошш анализировали методом ТСХ. Справа от радиоавтографа представлены результаты денситоиетрического сканирования фракции фосфатиднлхолина (ФХ) и фосфоинозитидов (ФИ).

Вклктша 32-Р U от кснгпрсАй

250 200 150

100 50 0

о 20 40 60 60

рз (^иоль/иг &5л1со)

Ркс.е Влияние 17В-эстрадмола па оОкен фосфолипидов в

клетках рака молочной делезы. Представлены результаты 42

определения включения Р в фосфолиандн клеток для опухолеп с различным содержанием РЭ. .

О О О О О О

Ч О о о

<> о о

-4-U

- IT -

t с 17Ц-зстрадиолои и арогесткиаии.

Оказалось, что после инкубации клеток и течении 15 мни с та-жсифемон о концентрации Ю-6 И включение 32Р-ортофос<рач л в

¡сфатидилхолин снижается, в то врейя как включение >

'Р-ортофосфата d фосфоинозитидц, наоборот, существенно возрастает гноситолыю контрольного уровня. Можно било предположить, что шенения в обмене фосфолипидов, отиечаеине после обработки клеток шокснфенои, связаны с его способность» воздействовать на пути ¡реноса митогенцого сигиала в клетках и, в частности, с известным юпствои таиоксифена подавлять активность протеишсиназы С )• Brian С.Л., о.а., 1930).

Било обнаружено, что действие на клетки хлорпроиазмна - известно ингибитора протеинкинази С сопровождается изменениями в обме-| фосфолипидов, аналогичными изменения«, вызванным тамоксифенои шс. 7). Также mi исследовали действие активатора протеинкинази С

12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФЛ). Оказалось, что ТФА шшает нзпенения и -обращении фосфолипидов, обратные теи, что 1бл!здаютсп при действии таноксифена. На рмс.8 видно, что обра-<тка клеток ТФА в концентащш 2х10~' М приводит к активации обие-i фосфатидилхолина и некоторому снижению синтеза фосфоинозитидов. давление к клеткам ТФА вместе с таяоксифенои практически пол-

1СТЫ0 блокирует депстзне последнего на обмен фосфолипидов.

32

Такии образом, анализ распределения Р-ортофосфата «ежду от-мыш??и фракциями фосфолипидов: фосфоинозитидаии и фосфатидилхо-:яоя иожйт служить косвенный показателем эффективности действия :>!оксиреиа на опухолевые клетки.

Было исследовано 56 больных ракоя молочной железы. В 29 (52?) следованных опухолях молочной железы содержание рецепторов зет-генов t РЭ) было Оольие 10 фиоль/иг белка. Яри анализе влияния яоксифена на опухолевые клетки ии сравнивали включение 32Р-ор-фосфата в основные клеточные фосфолипиди: фосфатидилхолии и сфоииозитиды.. Результаты показали, что в 482 случаев тамоксифен вепял соотноиепие между фосфомнозмтидаии и фосфатидилхолином и зпзал 2-кратное увеличение ФИ/ФХ индекса, а в 52S случаев опухо-вие клетки молочной железы били нечувствительны к действию та-ксифена. Яри этом не било обнаружено корреляции между ФИ/ФХ ин-ксои и концентрацией рецепторов эстрогенов в опухолях молочной лезы (г= -0,075, Р>0,05 1.

1-К0ЬЕр0ДЬ( -)

¿-авыокоифйиС"»«4"") 3-.хдорпроиягйн(• • • •)

Рис. т Влияние хлорпромазина м таиоксифена на включение

32Р в фосфолипиди клеток опухолеп молочной яелезы.

Клетки йреиикубировали 15 иин в среде Игла без добавок

(1), в присутствии 1о"6М таиоксифена ,12) и хлорпроиазина -5

2x10 м (3). Затеи ко веек образен добавляли 42

Р-ортофосфорную кислоту на 20 иин. Фосфолипиди анализировали методом ТСХ. Справа от радиоавтографа представлены результаты денситометричзского сканирования фракции фосфатидилхолина (ФХ) и фосфоикозитидов С ФИ).

О

сэ сэ

а

А - комуоль I-—)

2 - свиокоодая (-----}

3 - гвиокои^н + Ш С....)

Фракция «Л

Фракция СМ

Рис. в Влияние таноксифена и ТФЛ на включение 32Р в

)Сфолипияи клеток опухоли полочной гелези.

Клетки преинкубировали 13 мин в среде Игла без добавок

II. в присутствии 10"ьй такоксифена (2) и в присутствии

шоксифена 10~6М * ТФА 2х10~7М (3 1. Затем ко всем образцам 32

»бавляли Р-ортофосфорную кислоту иа 20 мин. фосфолипиди ¡ализировали яетодоя ТСХ. Справа от радиоавтографа »едставлени результати денситоиетрического сканирования »акций фоссфатидилхолина (ФХ) и фосфоинозмтидов (ФИ).

Влияние эпидермального фактора роста и такоксифеиа на обращение фосфолипидов о клетках опухолей молочной келези.

Целью этих экспериментов было изучение роли ЭФР в реализации действия тамоксифена на цикл обращения фосфолипидов. К клеткан, предобработаннин 15 мин 10_в И ЭФР или 10~в М 17В~эстрадиолои, добавляли на 15 мин Ю-6 И таиоксифена, затеи на 20 вин Р-ортофосфат.

Било обнаружено, что 15-шшутной инкубации клеток с ЭФР доста-

32

точно для стимуляции включения Р-ортофосфата в основные клеточные фосфолипмды: фосфоинозитиды и фосфатидилхолин.

Оказалось, что и добавление таиоксифена к клеткам, стимулированным Ю"в М ЭФР, не снимает действие этого соединения на обмен

внутриклеточных фосфолипидов. Так, на рис.Я видно, что тамоксифеп

32

ослабляет индуцированное ЭФР увеличение включения Р в фосфатм-

32

дилхолин, в то время как включение Р в фосфоинозитиды возрастает относительно контрольного уровня.

Анализ 27 случаев первичны«: ракой иолочноп гелезн показал, что в 40? образцов ЭФР вызывал 1,5-2 кратную стимуляцию включения 32Р-ортофосфата в фосфолипидн, а в 60% опухолевые кЛеткя колочиоя железы были нечувствительны к деяствию ЭФР.

Сравнительный анализ эффективности действия таиоксифена и ЭФР на ооиен фосфолипидов в опухолях молочной железы продемонстрировал отсутствие достоверных различий в действии тамоксифена на опухоли, отличавшиеся по чувствительности к ЭФР (табл. 2).

Таким образом, из приведенных данных следует, что депстоие на клетки-мишенк антиэстрогена таиоксифена, в отличие от действия стероидных гормонов-цитостатиков (прогестннов), не связано с торможением ЭФР-зависммои активации обращения фосфолипидов, а реализуется, возможно, через изменение протеннкиназа С-зависиких путей переноса митогенного сигнала.

я Я

О

X

9'.

¿

ю ;0

О

о

ЛМ»

4

А V

1- коазрога (*—) г - '5

• Ч ч

? - гавово&^зп С-®-»-) * - «аю&оодвя * В«?

Одшвцм ОХ

Фракция «11

Рис. 9 Влияние ЗФР и таноксифена на оонеи фосфолипмдов в

клетках опухолей иолочноп галези.

Клетки преинкуОировали в среде Игла без дооавок (1,3) и в

присутствии 10~°М ЭФР (2,4). Затеи к пробам 3,4 добавляли

10~бМ такоксифена и через 15 кип во осе образин добавляли 32

Р-ортофосфорную кислоту на 20 мин. Фосфолипиды анализировали катодом ТСХ. Справа от радиоавтографа представлены результаты денситоаетрического сканирования фракция фосфатидилхолииа (ФХ) и фосфоинозитидов 1Ф11).

Таблица 2.

Влияние тамоксифена на оомеи фосфолипидов в клетках опухоле молочной железы.

Ответ на таноксифен (включение 32-Р в фосфоинозитнды

Всего Стимуляция Отсутствие

включения изменения

Опухоли с ЭФР-зависимым циклом обращения

фосфолипидов 14 11 (76.SS) 3 <21,58 ]

Опухоли с ЭФР-независимын циклом обращения

фосфолипидов 13 5 17,5Х) N 0 («J2.5S)

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведеншше' в последние годы исследования кеханизыа действи стероидных гормонов показали, что присутствие рецепторов стероид них гормонов является важным критерием гормональной чувствитоль ности опухолей и рассматривается в качестве одного из основных по казаний к назначению эндокринной терапии при лечении ряда злока чественних новообразования. Вместе с те», многие экспериментальны наблюдения указывают на возможность снижения чувствительности кле ток к гормонам без сколько-нибудь значительных ионепакии рецептор ного аппарата; (Maki H.S., е.а., 1969, Kleine Vi., o.a., 1890 Bchlwartz L.II.,). При этом вногиии автораки отмечается, что присутствие белково-пяптиднмх ростескх факторов суивственн снижает чувствительность клетей к стероидам, несмотря на ссхранс ние гормон-связывавюх рецептаров в клетках (Murphy L.C., е.а. 1988). Как известно, гаицаацип клеточного роста под действие оелково-пептидных факторов роста и .некоторых стероидных горкоио

( 1713-эстрадиол, эргостерол) сопровождается стимуляцией цикла обращения клеточных фосфолипидов (Freier С.F.,а.а., 1988; Whitman M., o.a., 1968). D настоящей работе ми исследовали влияние стероидных гормонов - стимуляторов пролиферации (17В-эстрадиол) и ингибиторов пролиферации (прогестерон ) на обмен фосфолипидов в опухолевых клетках молочноп железы и матки . На первом этапе экспериментов было показано, что прогестерон снижает, а 17В-эстрадиол увеличивает в 1,5-2 раза включение Р в основные клеточные фосфолипиди: фосфатидилхолин и фосфомнозитиды. Эффект прогестерона был обнаружен в 43Я реиепторположительных (РП>100 фмоль/мг белка) аденокарциномах матки и в 33% опухолей с РП< 100 фмоль/мг белка. Анализ действия 17В-эстрадиола на опухоли молочноп железы показал, что гормон увеличивает скорость обращения фосфолипидов d i.0% рецептор-положительных опухолей <РЭ>10 фмоль/мг белка) и в 28,5? рецептор-отрицательных опухолей (РЭ<10 фиоль/мг белка ). При этой не было обнаружено корреляции между концентрацией цитоп-лазаматических рецепторов и уровнем индуцированных гормонами изменении цикла обращения фосфолипидов, также не было обнаружено корреляции с гистологическим типом и степенью дифференцировки опухолей.

Хорошо известно, что активация цикла обращения фосфолипидов относится к одним из ключевых событий клеточного цикла, определяющих эффективность витогенного сигнала в клетках. Задачей следующего этапа экспериментов было изучение влияния стероидных гормонов на

процесс ЭФР-зависииоп активации обравдния фосфолипидов. Было обна-

32

pyxeito, что увеличение включения Р в фосфолипиды клеток адено-карциномы матки, стимулированных ЭФР, практически полностью блокируется через 15 мин после добавления к клеткам прогестерона. В то же время в клетках аденокарцинокы матки, нечувствительных к ЭФР, прогестерон не вызывал существенных изменений в базалыюм уровне обмена фосфолипидов. Таким образои, полученные данные свидетельствуют о том, что процесс ЭФР-зависимоя активации обращения внутриклеточных фосфолипидов моаоет существенно тормозиться под действием прогестерона.

Действие на клетки препарата из группы антиэстрогенов тамокси-фена вызывает сложную картину изменения в обмене фосфолипидов, которую не удается ооьяснить, исходя только из антиэстрогенной активности этого соединения. Оказалось, что в большинстве случаев ответ на тамоксиоен клеток опухолей молочноп железы заключается в

некотором снижении скорости обращения фосфатидилхолина и одновременном увеличении скорости обращения фосфоинозитидов. При этой эффект таиоксифена, в отличие от действия прогестерона, не снимается добавлением к клеткам экзогенного ЭФР и не зависит от чувствительности опухолевых клеток к ЭФР. Добавление к клеткам 17В-эстрадиола также не сникает эффекта тамокенфеиа, во всяком случае в топ его части, которая относится к действию тамокенфеиа на обмен фосфоинозитидов. Следовательно, если эффект прогестерона реализуется, скорее всего, через торможение процесса ЗФР-заоисимоя активации обращения фосфолипидов, то действие таиоксифена развивается по пиону механизму. Представленные данные об ослаблении действия тамокенфеиа в присутствии активатора протеинкипазы С ТФА позволяют предположить, что индуцированные тамоксифеном изменения в обрамшпп фосфолипидов когут бить связаны с известным свойство« таиоксифена подавлять активность протеинкипазы С (O'Brlan С.А., е.а.,1980). В пользу такого предположения свидетельствует и обнаруженная радом

исследователей зависимость цикла обращения фосфатидилхолнна от протеиикиназы С (Irving U.E., е.а., 1987 ).

Вероятно, торможение протеинкинаэа С-зависикнх путей переноса митогённого сигнала следует расценивать как одно из проявлений ци~ тостатического действия таиоксифена на клетки-мишени. К такому заключению приходят многие авторы, эанииаюеиеся исследованиями механизма действия тамокенфеиа. Ряд авторов отводит особое место спо-собностн таиоксифсыа мзиенять проницаемость плазматических мембран и стимулировать обмен фосфоинозитидов (Trltton Т.К., o.a., 1990).

Полученные результаты позволили пая оценить эффективность

' действия тамокенфеиа на клетки опухолей молочной железы, используя

42

для этого анализ распределения р между отдельными фракциями фосфолипидов в клетках исследуемых опухолей. Било обнаружено, что тамоксифен вызывает специфическую картину изменений синтеза фосфолипидов, характерную для действия ингибиторов протеинкиназы С, не только в РЗ+ 152% >, но и в значительная части PS- (46~S опухолей молочных желез.

В заключение следует огкитг.ть, что обнаруженная у стсрондппх гормонов н антизстрогенов спосоОность изменять скорость обрадашя внутриклеточных фосфолипидог лежоу быть использована определишь; эффективности"действия этих препаратов на опухоль. Применение такого показателя d клинической практике позволит уточнить степень

гормональная чувствительности опухолей и оценить перспективность использования гормональных препаратов в терапии конкретного заболевания.

ШВОДЫ

1. В экспериментах на опухолях матки м молочной желеэи хеншдш исследовано влияние стероидных гормонов 17&-эстрадмола и прогестерона па один из ключевых процессов инициации клеточного деления -цикл обращения фосфолипидов. Обнаружено, что 17В-эстрадиол стимулирует скорость обращения фосфолипидов в 37% опухолен матки u п 30,22 опухолей молочной зклезя. Прогестерон обладает противояолохг ник эффектом и подавляет обмен фосфолипидов в 42,2" опухолея натки.

2. При исследовании действия антиэстрогеиа тамоксифена на

опухоли полочной хелезя установлено, что тамоксифен вызывает

32

относительное • увеличение включения Р-ортофосфата в

фосфошгоэитиди а снмтвимс скорости обраюмшя фосфатмдилхолина, причем этн изменения иодуяируются соединениями, влияющими на активность протоиикннази С.

3. Уровень индуцмрованних гормонами изменении обмена фосфолипидов достоверно не отличается в опухолях с разной концентрацией внутриклеточных гормон-связиваюадх рецепторов.

4. Обнаружено. что эффективность тормозяюсго действия прогестерона на обмен фосфолипидов в аденокарциномах матки зависит от чувствительности опухоли к ЗФР: прогестерон подавляет обмен фосфолипидов в 02? ЗФР-эависммых опухолей яатки я только в 305! ЭФР-не-завист.шх опухолея. Полученные данные указывают на воэмозпюсть изменения гормональной чувствительности опухолея в присутствии ЭФР.

5. Разработан дополнительный метод анализа гормональной чувствительности опухолей, основанный на определении индуцированных гормонами изменении цикла обращения фосфолипидов.

Список работ,опуоликспашшх по теме диссертации:

1. Влияние lTfi-эстрадпола u эмбриональной сыворотки на синтез фосфолипидов в клетках карциномы матки. // В кн.: Тезисн докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки". Минск, 1У30, с. 157, (соавторы St.А. Красилышков, Л.С. Бассалик).

2. Effect of steroid hormones on the rate oi phospholipid synthesis and protein Kinase С activity In tumor cells. // Metastatic spreading or malignant tumors. New approaches, Kiev, 1991, p.205, (соавтор M.A. Крлсильниковj.

a

3. Рост-ингибирующее действие глюкокортикоидов й арогестмнов на опухолевые клетки In vitro: влияние на скорость обращения фосфолипидов. // Биохимия, 1991, Т.56, вып.7, с.1272-80, (соавтор И. А. Красилышков).

4. Регуляция скорости обращения фосфолипидов и активности протеиикинаэы С как необходимый этап в реализации рост-ингибирукщего действия дексаметазона на клетки гепатоиы 22. // Биохимия, 1992, т.57, вып.4, С. 637-46, (соавторы М.А. Красилышков, D.M. Безруков).

5. Glucocorticoid regulation of phospholipid turnover and protoln kinase С activity In mouse hepatoma 22 cells. // BlochlMica et Blophysica Acta, 1992, 1135, 91-96, (соавтор« М.А. Красилышков, ß.M. Безруков).

6. Effect of 17ß-estradlol and tamoxifen on phospholipid turnover in breast cancer colls /1 Proc. Second. Europ. Seminar on Surgical Oncology, Lvov, 1992. In: Acta Chlrurgia Austrica, Suppl., 1992. (соавтор И.А. Красилышков).

7. Влияние стероидных гормонов и таноксифена на скорость оОрашэиия фосфолипидов в клетках опухолей натки и молочной желези. // Вестник РАМН, 1993, N3, с. 43-46, (соавторы М.А. Красилышков, З.В. Кузьмина, В.В. Баринов, В.П. Летягмн, Л.С. Бассалык).

8. Regulation of phospholipid turnover by steroid hortoonos In endometrial carcinoma and breast cancer cells. // Acta Endocrlnologlca, 1993, 128, 543-546, (соавторы М.А. Красильников, З.В. Кузькина, B.B. Баринов, В.Р. Летягмн, Л.С. Бассалик).

9. Влияние прогестерона к тамоксифена на ЭФР-завиашую активацию обращения фосфолипидов в клетках опухолей матки и молочной жалезн. // Биохимия, 1993, вип.б, с. 967-974 (соавторы М.А. Красилышков, Л.С. Бассалык).

10. Effect of steroid hormones on phospholipid turnover In endometrial colls. U International Meeting of Gynaecological Oncology, Barcelona, 1993. (соавторы З.В. Кузьмина, B.B. Баринов, М.А. Красилышков).