Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы RH в следах крови реакцией абсорбции-элюции с применением высокоактивных протеаз

На правах рукописи

КОНДРАТОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ ЯН В СЛЕДАХ КРОВИ РЕАКЦИЕЙ АБСОРБЦИИ-ЭЛЮЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ВЫСОКОАКТИВНЫХ ПРОТЕАЗ

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.24 - судебная медицина

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА -2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор P.C. САХАРОВ Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор С. И. ДОНСКОВ доктор медицинских наук, профессор Л.О. БАРСЕГЯНЦ Ведущее упреждение:

Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

/О/г /У ^

Защита диссертации состоится ' » <У 2006 г в » часов на заседании

Диссертационного совета Д 001. 042 02. в Гематологическом научном центре РАМН по адресу 125167, Москва, Ново-Зыковский проезд, 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра

РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е Е. Зыбунова

ззеу

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Из всех известных и наиболее значимых эритроцитарных антигенных систем - ABO, Rh, MNS, Kell, Duffy, Kidd, система Резус (Rh) обладает наиболее выраженным антигенным полиморфизмом и высокой информативностью Это делает исключительно актуальным ее использование в судебно-медицинских целях, в частности, при разграничении следов крови на вещественных доказательствах. Например, определение в следах крови шести резус-антигенов- D, С, С", с, Е, е, рутинно выявляемых в жидкой крови, позволяет на треть повысить дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы следов крови.

Анализ данных литературы показывает, что методами выявления Rh-антигенов в следах крови чаще всего являются ферментные тесты (Гальцева Е.Е., 1973; Martin P.D., 1977; Gaensslen et al., 1985).

Недавно отечественными исследователями (Сахаров Р С, Федулова М.В, 1998, 1999) была разработана техника с использованием фиксирующих средств для обработки крови пятен, высокоактивных микробных и растительных протеаз для обработки не только стандартных тест-эритроцитов, но и исследуемых следов крови. Эта техника, названная авторами модифицированной РАЭ, значительно повышает чувствительность реакции антиген-антитело в системе ABO, позволяя тем самым выявлять указанные антигены в микроследах крови и выделений.

Поэтому, нами был выполнен большой объем исследований с целью изучения возможности повышения чувствительности и специфичности выявления в следах крови с помощью модифицированной РАЭ также и Rh-антигенов.

Подобные исследования выполнены впервые и для судебной медицины являются актуальными.

Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы КЬ в следах крови путем использования на различных этапах РАЭ высокоактивных протеаз микробного или растительного происхождения.

1) Адаптация модифицированной РАЭ к выявлению Rh-aнтигeнoв в следах крови.

2) Выяснение сущности неспецифичности РАЭ при выявлении в следах крови резус-антигена О.

3) Разработка способа модификации иммуноглобулинов 1дв анти-0 с целью устранения неспецифичности РАЭ.

МЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

4) Разработка чувствительного и специфичного способа определении резус-принадлежности следов крови с применением пептидов анти-О.

5) Разработка чувствительной и специфичной техники определения в следах крови минорных резус-антигенов С, С", с, Е, е .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые установлено наличие феномена абсорбции антител анти-Р энзимированным материалом резус-отрицательных ( сйе ) лиц. Серологически этот феномен проявляется й-подобный антиген Экспериментально установлено значение этого О- подобного резус-антигена как причины неспецифичности РАЭ при определении резус-принадпежности следов крови Разработан оригинальный способ устранения указанной неспецифичности (патент N8 2209434 от 27 07 2003). Установлены также оптимальные сроки давности образования пятен крови для специфического выявления в них РИ-антигенов

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Разработана чувствительная, простая и надежная техника определения антигенов РЬ-Нг в следах крови, что существенно повышает дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Материалы диссертации доложены на научной конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ в декабре 2002 г., апробация работы состоялась 21 февраля 2006 г. на расширенной конференции отдела судебно-медицинского исследования вещественных доказательств ФГУ «РЦ СМЭ Росздрава», на апробации диссертации присутствовали специалисты из отдела судебно-медицинской идентификации личности и танатологического отдела ФГУ «РЦ СМЭ», приглашенные специалисты из ГНЦ РАМН по специальности 14 00 29 - гематология и переливание крови В Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию России представлена на утверждение подготовленная Сахаровым Р С и Кондратовой И В усовершенствованная медицинская технология «Выявление антигенов системы ЯИ в следах крови», М , 2005 г

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, из них 5 - в центральной печати Получен патент № 2209434 от 27 07.2003 г.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 142 страницах компьютерной печати и состоит из введения, в глав, заключения, выводов, списка литературы. Текст иллюстрирован 38 таблицами и 3 рисунками Список литературы содержит 159 источников, из которых на русском -61 и 98-на английском и других языках

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1 Впервые серологическими методами на внутренней (цитоплазматической) поверхности энзимированных резус-отрицательных (сс)е) эритроцитов установлено наличие 0-подобного резус-антигена В силу своей хорошей изолированности от внешней среды (плазмы крови), этот антиген не принимает участия в обычных иммуносерологических реакциях и потому не имеет трансфузионного значения и не должен приниматься в расчет при типировании эритроцитов в случаях, когда они сохраняют свою морфологическую целостность

2. Для судебно-медицинской серологии наличие О-подобного антигена в резус-отрицательных эритроцитах создает серьезные трудности при определении резус-принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательства, поскольку в полностью гемолизированных эритроцитах сухих пятен крови для действия различных биологически активных веществ, а том числе и для антител анти-О, становится доступной и внутренняя (цитоплазматическая) сторона мембраны эритроцитов.

3 Разработан способ получения из аллоиммунных антител 1дв актн-0 пептидов анти-О, не реагирующих с О-подобрым антигеном резус-отрицательных эритроцитов и позволяющих специфически определять реакцией абсорбции-элюции (РАЗ) резус-принадлежность следов крови.

4. Установлены оптимальные сроки давности образования пятен крови для исследования в них резус-антигенов Это позволяет производить чувствительное и специфичное определение антигенов №-Нг в следах крови разработанной техникой МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалами исследования являлись: Стандартные тест-эритроциты группы 0(1) (и других групп крови) с резус-фенотипами СсОее, ССйее, СсОее, СсОиее, СсйЕе, ссйЕе, ссОЕЕ,, сссМее, применявшиеся для исследования активности и специфичности стандартных поли- и моноклональных сывороток антирезус, для исследования активности и специфичности получаемых элюатов; использовались эритроциты микродоноров РЦ СМЭ МЗ РФ (13 образцов) и ГНЦ РАМН (31 образец);

Высушенные на марле образцы крови живых лиц разных групп и с резус-фенотипами СсОее, ССОее, СсОее, СсОиее, СсРЕе, ссОЕе, ссОЕЕ, , ссбдее с давностью образования от 7 дней

до 14 лет, сохранявшиеся в комнатных условиях без воздействия прямого солнечного света (в закрытых конвертах), из них 57 пятен крови взятой из пальца (коллекция РЦ СМЭ) и 87 пятен, полученных путем нанесения цельной венозной крови на стерильную марлю (ГНЦ РАМН)'

Высушенные на марле 7 образцов незагнившей трупной крови, взятой через 1-3 суток после наступления смерти (морг Московской медицинской академии им И М Сеченова),

Экспертные пятна крови (32 пятна из 7 экспертиз, имевших место в биологическом отделении Московского городского бюро СМЭ ГУЗМ)

В указанных 183 пятнах крови выявлялись Rh-антигены D, С, С" , с, Е (мы не располагали аллоиммунной сывороткой анти-е для выявления антигена е (hr")

Поликлональные аллоимунные сыворотки анти-D (32 серия), анти-С, -С", -с, -Е; содержавшие соответствующие антитела как в полной (IgM), так и, преимущественно, в неполной (IgG) форме, к каждому минорному Rh-антигену имелось по 2-3 серии стандартных сывороток Поликлональные антирезусные сыворотки получали на Станции переливания крови г Дзержинска и в ООО «Гемостандарт» при ГНЦ РАМН (г. Москва).

Моноклональные Rh-антитела анти-D, -С, -с, -Е, -е как в неполной (IgG), так и, преимущественно, в полной (IgM) форме по 1-3 серии антител каждой специфичности Все моноклональные антитела были производства ООО «Гематолог» при ГНЦ РАМН,

Протеаза-С-субстанция (комплекс протеаз, продуцируемый микрокультурой Acremonium chrysogenum) производства АО «Антибиотики», г Москва, с активностью не ниже 3,5 пЕ/г, применялось 6 серий препарата; ВФС 4221124 (96)

Папаин фирмы Merk, Германия, катал № 107144 (1996), в работе использовалась 1 серия фермента

Трипсин кристаллический, производства фирмы «Spofa», Чехия, per Ni 72736/119, использовалась 1 серия Ферментные препараты применялись для обработки (энзимирования) тест-эритроцитов, исследуемых пятен крови и получения пептидов из антирезусных сывороток

Гликозидазьг №№ 1, 2 - комплекс гликозидаэ Cenavalia gladiata производства АО "Биотехнология", гликозидаза № 3 - комплекс гликозидаз люпина того же производства, гликозидаза (коллагеназа) № 4 производства МГП "Био-90" Препараты гликозидаз применялись при поиске методов устранения или снижения неспецифичности РАЭ. Метанол (спирт метиловый синтетический) ВТУ МХП 2220-50; Глютаровый альдегид 25% (ОНС-(СН2)3-СНО) фирмы «Serva», Германия

Метиловый спирт (неразведенный) и глютаровый альдегид, (1% на физиологическом растворе хлорида натрия) использовались для фиксирования пятен крови Фиксация осуществлялась при комнатной температуре - метиловым спиртом - 20-30 минут, глютаровым

альдегидом - 20, 30 мин. и в течение 1 часа.

Методы

Метод прямой (солевой) гемагглютинации стандартных энзимированных эритроцитов (Сахаров Р С., 1968; 1988, Сахаров Р С , Перепечина И О , Крестьянова И Н , 1986)

Реакция абсорбции-элюции (РАЭ), выполнявшаяся в двух вариантах- обычная (классическая) РАЭ (Томилин В В , Барсегянц Л О , Гладких А С , 1989) и модифицированная РАЭ, в которой перед выполнением этапа абсорбции производилась по описанной методике (Сахаров Р С, Федулова М В 1998) фиксирование, а затем обработка исследуемого материала пятна крови рабочим раствором используемой протеазы При выполнении этапа абсорбции готовились кратные разведения (обычно до титра 1*32) используемой стандартной сыворотки, в каждое разведение которой помещали по 1-2 ниточки исследуемого материала Абсорбция проводилась в температурном интервале 4-37° С Активность и специфичность элюатов каждого разведения сыворотки исследовались путем добавления к 1 к элюата 1 к 0,2% соответствующих стандартных эритроцитов В ряде опытов элюаты исследовались антиглобулиновым (А.Г Башлай, С И Донское, 1998) и поликатионным (Р С Сахаров, И О Перепечина, Г В Виха, 1986) методами

Запатентованная технология получения пептидов анти-0 и разработанная техника РАЭ с их использованием представлены в главе 5.

В некоторых случаях более подробные характеристики использовавшихся материалов и методов приведены в разных главах по мере написания работы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация модифицированной РАЭ к выявлению ЙИ антигенов в следах крови

Как известно, фиксация материала при определении РИ-антигенов в следах крови не применяется из-за выраженного снижения чувствительности РАЭ после фиксирования материала (Вагдадпа, Регега, 1967).

Причиной, побудившей нас исследовать возможность применения фиксирования следов крови при выявлении в них ЯИ-антигенов модифицированной РАЭ, в которой фиксация исследуемого материала применяется обязательно, явилось понимание того факта, что 1^1-антигены, в отличие от гликопротеиновых антигенов всех других изосерологических систем, являются чисто протеиновыми структурами, для которых может быть далеко не безразличным воздействие на пятна высокоактивных, в том числе микробных, протеаз Мы полагали, что фиксирование, возможно, создаст защитную пленку из денатурированных сывороточных белков Однако, этого не произошло, поскольку опыты показали, что, в частности, пятна крови с

небольшой давностью образования (до 6 месяцев) и, особенно, свежеобраэованные пятна крови (2 недели -1 месяц) не надо ни в коем случае ни обрабатывать протеазами, ни фиксировать, тк энзимирование пятен крови в этих случаях может привести к заметному ухудшению выраженности и даже к полному ингибированию реакции выявления антигена О

Применение же фиксирования и последующего энзимирования иногда приводило к заметному повышению неспецифичности РАЭ

В то же время, при исследовании пятен крови с достаточно длительной давностью образования (9 месяцев и выше) применение энзимирования пятен является обязательным, т к позволяет значительно повысить чувствительность выявления антигена О Особенно наглядно это проявилось при исследовании очень старых пятен крови (в наших опытах - с давностью образования 14 лет) В этом случае обработка исследуемых пятен крови протеазой-С позволила уверенно выявить в них антиген О, при полной несостоятельности трипсин-альбуминового теста (табл 1) К сожалению, работа со старыми пятнами крови требует применения особых, со «зрелыми» (Оаепз51еп е1 а1., 1985) иммуноглобулинами !дв анти-0 с исключительно высоким титром антител (до 1 32000 и выше в ферментных тестах) Такие высокоактивные антитела анти-0 получали при многократной, порой многолетней иммунизации доноров-добровольцев, с целью получения активных иммунопрепаратов; однако, в настоящее время, в связи с широким распространением тяжелых заболеваний, передающихся через кровь (гепатиты, сифилис и др), никакие интенсивные искусственные иммунизации добровольцев невозможны из-за реальной опасности инфицирования донора Поэтому, сыворотки анти-Р со «зрелыми» 1дв анти-0 в настоящее время очень редки, что, в свою очередь, вызывает большие затруднения в применении этой прекрасной методики определения резус-принадлежности старых и очень старых пятен крови с помощью модифицированной РАЭ Необходима технология выявления Р11-антигенов с помощью обычных (со средним титром) сывороток анти-РЬ Использование в РАЭ пептидов анти-0 и позволило создать такую технологию.

Анализ литературных данных показал, что результаты, полученные различными авторами по нахождению оптимальных условий для реакции антиген-антитело при выполнении РАЭ при выявлении РИ-антигенов - крайне противоречивы. Это означало, что нам самим необходимо было найти оптимальные условия реакции антиген-антитело для разрабатываемой нами модифицированной РАЭ В результате проведения большого объема исследований мы пришли к следующему

Этап абсорбции. Оптимальная длительность этапа абсорбции -17-24 часа (в течение ночи), температурный режим абсорбции - 4-60 С.

Опыты показали, что интенсивность отмывания материала от нвсвязавшихся антител в интервале 4-6 раз, дает одинаковую выраженность и специфичность РАЗ Мы остановились на 6-кратном отмывании.

Этап алюции. В работе использовалась тепловая элюцию (.апс^еюег и МШвг (1925) Опыты показали, что проведение алюции при 53-56° С дает несколько лучшие результаты, чем при 49-51° С Точно также элюция на предметных стеклах в физиологический раствор оказалась наиболее пригодным вариантом, как достаточно чувствительным и не дающим неспецифических результатов.

Подбор пригодных для РАЭ антирезусных сывороток анти-О. Это один из самых трудных и важных вопросов РАЭ, от правильности решения которого зависит вся работа, т е специфичное и четкое выявление (или невыявление) исследуемого антигена Главным оказалась присущая сыворотке изначально ее пригодность или непригодность к использованию в РАЭ. Так, как показано ниже в табл. 6, из двух сывороток с достаточно высоким и практически одинаковым титром антител одна сыворотка (анти-О сер. Зин) прекрасно выявляла в пятнах

Табл. 1

Выявление антигена О в пятне крови с давностью образования 14 лет

Разведения сыворотки анти-D Трипсин-альбуминовый тест Протеазный модифицированный метод

Пятна крови Пятна крови

Rh+ Rh- Rh+ Rh-

Эритроциты Эритроциты

D d D d D d D d

Н - - - - ++++ - ++ -

2 - - - - ++++ - - -

4 - - - - ++++ - -

8 - - - - +++ - -

16 - - - - ++ - -

32 - - - - + - -

64 - - - - - - -

Условия опыта' трипсин-альбуминовый метод выполнен по методике Е Е Гальцевой (1973); при выполнении протеазного модифицированного метода (P.C. Сахаров, М.В.Федулова, 1998; 1999) применялась только обработка исследуемых пятен крови 0,2% раствором протеазы-С без их предварительного фиксирования глютаровым альдегидом

крови антиген D, другая (анти-D сер Map) в реакции абсорбции-элюции была совершенно неактивна Указанная частая непригодность сывороток анти-D, причины которой до сих пор не совсем ясны, сильно тормозит широкое внедрение выявления антигена D в практическую судебно-медицинскую экспертизу пятен крови и свидетельствует о необходимости налаживания квалифицированного централизованного изготовления и снабжения практической экспертизы антирезусными сыворотками, пригодными для выявления Rh-антигенов в пятнах крови с помощью РАЗ.

Таким образом, ревизия основных этапов РАЗ, предпринятая с целью изучения возможности адаптации модифицированной РАЗ для выявления и антигенов системы Rh, показала следующее.

Модифицированная РАЗ в том виде, в котором она применяется при выявлении антигенов системы ABO (те при фиксировании и энзимировании пятен крови) - непригодна для выявления антигенов системы Rh Как показали эксперименты, свежеобразованные и пятна с небольшим сроком хранения (до 4-6 месяцев), необходимо вводить в РАЗ в нативном виде, поскольку фиксирование и последующее энзимирование таких пятен в большинстве случаев резко ухудшают выраженность РАЗ, делают ее более неспецифичной В то же время при исследовании крови с достаточно длительным (9 месяцев и выше) и длительным (несколько лет) сроком хранения, наоборот, энзимирование (без фиксирования) исследуемых пятен является обязательным, поскольку только в этом случае выявление антигена D становится возможным (см , например, табл 1) Другими словами, применение модифицированной РАЗ при выявлении Rh-антигенов возможно и необходимо лишь при исследовании длительно хранившихся, старых пятен Однако, в этом случае модифицированная РАЗ сама должна быть "модифицирована", те изменена, а именно1 необходимо применять только энзимирование исследуемых пятен без их предварительного фиксирования

Приведенные выше данные являются отражением протеиновой природы Rh-антигенов

О СЕРОЛОГИЧЕСКИ ВЫЯВЛЯЕМОМ НАЛИЧИИ В СЛЕДАХ КРОВИ РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ( cde) ЛИЦ D-ПОДОБНОГО РЕЗУС-АНТИГЕНА

В отличие от распространенного в судебно-медицинской серологии мнения о специфичности, чувствительности и надежности РАЗ с использованием протеаз при выявлении Rh антигенов в следах крови, в случае применения протеаз, особенно микробной протеазы-С. и применении обычных среднеактивных сывороток, мы столкнулись с проблемой неспецифичности РАЗ Она заключалась в том, что при исследовании получаемых элюатов, с Rh(+) энзимированными эритроцитами реагировали элюаты не только из Rh(+), но и из rh(-)

пятен крови, при полном отсутствии реакции с гЬ(-) энзимированными эритроцитами Если же применялась модифицированная РАЭ (с энзимированием пятен крови), то при исследовании старых пятен, наряду с резким повышением выраженности специфической реакции, одновременно заметно повышалась выраженность и неспецифической реакции Точно также при исследовании свежих пятен (которые нельзя обрабатывать протеазой), наряду с ухудшением выраженности специфической реакции, снижалась выраженность и неспецифической реакции (табл. 2).

Неспецифичность РАЭ наблюдалась также и при выполнении трипсин-альбуминового и папаинового тестов. Это заставило нас обратить особое внимание на сущность неспецифической реакции, которую часто имеют элюаты сывороток анти-О, примененных в РАЭ нативными (неразведенными, неабсорбированными), независимо от того, какой протеазой (животного, растительного или микробного происхождения) были обработаны тест-эритроциты, использовавшиеся для исследования элюатов.

В результате многочисленных абсорбционно-элюционных экспериментов мы пришли к парадоксальному выводу о наличии в резус-отрицательных (сйе) эритроцитах антигена с 0>подобной резус-специфичностью.

Действительно, специфичность элюатов как из КИ(+), так и из гИ(-) пятен крови серологически определялась как антитела анти-0 (табл. 3).

Увеличение числа процедур отмывания сенсибилизированного материала с 6 до 12 не приводило к устранению неспецифичности РАЭ.

Попытка устранения неспецифичности РАЭ предварительной абсорбцией сывороток анти-0 резус-отрицательными энзимированными эритроцитами оставляла без изменения неспецифичность реакции. Однако, применение для этой цели материала Ф(-) - отрицательных эшимированных пятен крови приводило к тому, что элюат переставал реагировать с ИЬ(+) -положительными эритроцитами, особенно при повторении абсорбционных процедур, аналогичным образом можно было инактивировать не только элюаты, но даже и сыворотки анти-0 (табл. 4).

Все исследователи, разрабатывавшие методики выявления РЬ-антигенов в следах крови, единодушны во мнении, что после превышения какого-то предела активности вводимой в РАЭ сыворотки анти-О, РАЭ становится неспецифичной Саепз81еп е4 а1 (1985) считают, что водимая в РАЭ сыворотка анти-0 не должна иметь титр выше, чем 1:512 в папаиновом тесте, а для трипсин-альбуминового метода, по мнению Е.Е Гальцевой (1973), оптимальным является титр анти-0 1:32-1:64.

Неспецифичность в РАЭ элюатов из rh(-) пятен крови с разной давностью образования

Старые пятна крови Свежие пятна крови

Нативные Энзимированные Нативные Энзимированные

ccDEe ccddee ccDEe ccddee ccDEe ccddee ccDEe ccddee

D d D d D d D d D d D d D d D d

++++ - +++ - ++++ +++ - ++++ - ++++ +++ - ++

+++ - ++ - ++♦ - +++ - +++ ++ - + -

++ + ++++ ++ - ++ - ++ - + - i -

+ - ± +++ - + - ++ - + - ± - - -

+ - - ++ - ± - ++ - ± - - - - -

- - - ++ - - - + - - - • - - -

- - - - + - - - ± - - - - -

-

Примечания Старые пятна - срок давности 9 мес, свежие пятна - срок давности 1 мес Сыворотка анти-D сер 6804, титр в протеазном методе - 1 2048, разведена в 10 раз физиологическим раствором Энзимированные пятна крови и стандартные эритроциты обрабатывали 0,2% раствором протеазы-С, нативные пятна - не обработанные протеазой-С, ccDEe и ccddee -резус-фенотипы исследуемых пятен крови, D и d - тест-эритроциты, титрование - до 1128

Однако, наши опыты с протеазой-С показывают, что дело здесь не только в оптимальном титре вводимой в РАЭ сыворотки анти-D, сколько, по-видимому, в самой структуре антигена D Полученные нами серологические данные, с учетом современных представлений о структуре и функции эритроцитарных антигенов и генов (Agree Р. et al, 1999; Lutz Р et al., 1992) позволяют дать иное объяснение неспецифичности РАЭ Мы считаем, что для понимания неспецифичности РАЭ, прежде всего необходимо учитывать большую чувствительность РАЭ при использовании протеазы-С по сравнению с ее ругонным аналогами Это повышение чувствительности РАЭ, особенно при обработке протеазой-С старых пятен приводит к большей доступности антигена для связывания с антителами анти-D, что проявляется в повышении выраженности специфической реакции и в появлении хорошо замечаемой видимой неспецифичности РАЭ. Описанные выше результаты серологических исследований однозначно свидетельствуют, что эта неспецифичность РАЭ ни в коем случае не

связана с недостаточным отмыванием от вводившихся в РАЭ антител анти-0 (чем обычно и пытаются объяснить неспецифичность РАЭ) Выполненные нами абсорбционно-элюционные исследования также определенно свидетельствуют о том, что антиген, присутствующий в пятнах г+|(-) крови и вызывающий неспецифичность РАЭ, серологически идентифицируется как резус-антиген О или Э-подобный (табл 3) При этом полная специфичность сывороток анти-0 с морфологически целостными образцами эритроцитов жидкой крови и неспецифическое реагирование в РАЭ этих же сывороток с этими же образцами крови, но находящимися в виде сухих пятен, в которых эритроциты полностью гемолизированы (те когда внутренняя цитоплазматическая сторона мембраны эритроцита становится доступной как для действия протеаз, так и антител анти-О), свидетельствует о том, что резус-антиген Э резус-отрицательных (с(1е) эритроцитов находится на внутренней (цитоплазматической) стороне мембраны резус-отрицательных эритроцитов и в неизмененных эритроцитах жидкой крови совершенно недоступен для связывания с антителами анти-О.

Публикуя полученные результаты (Р С.Сахаров, И В Кондратова, М В Федулова, 2002), мы были убеждены, что о наличии в эритроцитах резус-отрицательных (с(3е) лиц резус-антигена 0 сообщается впервые Однако, в дальнейшем оказалось, что к подобным же выводам, но значительно раньше нас, пришли Р1арр е» а), 1979 Авторы, применяя достаточно

Табл. 3

Антитела анти-О, выявляемые в элюатах из РИ(+) и гЬ(-) пятен крови

Резус-фенотип стандартных энзимированных эритроцитов Элюат из пятна Элюат из пятна

СсОее ++++ ++++

СссЮее ± ±

СсОее ++++ ++++

СсОЕе ++++ ++++

СсОЕЕ ++++ ++++

сссйее - -

Устранение активности сыворотки анти-Р в РАЭ с пятнами крови и гЬ(-) после ее абсорбции 1+|(-) - отрицательным пятном крови

Титр элюата Нативная сыворотка анти-Р Абсорбированная сыворотка анти-Р

Пятно крови ссРЕе Пятно крови сссйее Пятно крови ссРЕе Пятно крови сссИее

Эритроциты Р Эритроциты О Эритроциты Р Эритроциты Р

Н +++ +++ ± ±

2 +++ ++ ± -

4 ++ ++ - -

8 ++ + - -

16 + - - -

32 - - - -

сложный метод постепенной очистки Р-антигена вРв-растворенных мембран эритроцитов путем аффинной хроматографии в колонках совместно с анти-Р и используя также метод ингибиции реакции агглютинации, пришли к выводу, что мембраны и гИ(-) эритроцитов содержат одинаковое количество О антигена. При этом на мембранах резус-отрицательных эритроцитов антиген не выявляется до тех пор, пока мембраны не будут растворены.

В последующем эти авторы опубликовали еще ряд работ, в которых подтверждаются приведенные выше данные

В 1982 г Юеетап е1 а1 опубликовали свою работу с результатами иммунохимического изучения мембранной топологии резус-антигена О. По данным авторов, антиген О четко выявлялся только на плазменной стороне мембраны О - положительных эритроцитов Никакой иммунологической активностью мембраны Р-отрицательных эритроцитов не обладали

Что же касается нас, то мы являемся той третьей группой исследователей, которые впервые, базируясь только лишь на несложных и доступных любой лаборатории серологических методах исследования, совершенно самостоятельно пришли к выводу о наличии в резус-отрицательных эритроцитах резус-антигена, подобному резус-антигену Р, тем самым, как оказалось, солидаризировавшись с ранее выполненной работой Р1арр е1 а1 Более того, мы считаем, что и работа Юеетап ей. а1 ни в коем случае не может служить

опровержением выводов Plapp et al„ поскольку Kleeman et al не выполнили одного из главных требований выявления антигена D в резус-отрицательных эритроцитах иммунохимическими методами - полного растворения эритроцитов с помощью детергентов, после чего содержащиеся в мембране резус-отрицательных эритроцитов антигены D становятся доступными для связывания с антителами анти-D и последующего серологического выявления.

Таким образом, мы полагаем, что все сказанное выше с несомненностью свидетельствует о наличии резус-подобного антигена D в резус-отрицательных (cde) эритроцитах В силу своей хорошей изолированности от внешней среды (от плазмы крови) на внутренней (цитоплазматической) стороне мембраны резус-отрицательных эритроцитов, он не принимает участия в обычных иммунологических реакциях и потому не имеет трансфузионного значения и не должен приниматься в расчет при типировании эритроцитов в случае, когда они сохраняют свою морфологическую целостность.

Что же касается судебно-медицинской серологии, то наличие антигена D-подобного в резус-отрицательных эритроцитах создает серьезные трудности при определении резус-принадлежности крови в пятнах, имеющихся на вещественных доказательствах.

По данным молекулярно-генетических исследований по изучению структуры Rh-генов, у некоторых D-отрицательных лиц фенотипов Ccddee и ccddEe присутствуют фрагменты О-гена или нефункционирующий D-ген в то время как у rh(-) - отрицательных (cde) лиц наличие гена D не установлено (Cartron J-P , 1994) Серологически же мы установили наличие D-подобной структуры и в эритроцитах резус-отрицательных (cde) лиц Поэтому, по-видимому, не следует исключать и такую возможность, что при дальнейшем совершенствовании молекулярно-генетических методов исследования, они будут способны устанавливать наличие D-гена или его фрагментов и в клетках rh(-) - отрицательных (cde) лиц Во всяком случае, полученные нами данные вполне объясняют, почему у резус-отрицательных лиц до сих пор достоверно не открыто наличие резус-антигена Hr0(d).

РАЗРАБОТКА ТЕХНИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС - АНТИГЕНОВ В СЛЕДАХ КРОВИ

Для судебно-медицинской серологии наличие D-подобного антигена в резус-отрицательных эритроцитах создает серьезные трудности при определении резус-принадлежности крови в пятнах, имеющихся на вещественных доказательствах Эти трудности - в практической невозможности определения антигена D из-за выраженной неспецифичности РАЭ с подавляющим большинством сывороток анти-D.

Исследования также показали, что, сыворотки анти-D могут давать достаточно заметную неспецифическую реакцию со многими предметами-носителями

Таким образом, мы пришли к такому положению, когда определение антигена О в следах крови было практически невозможно из-за неспецифичности, связанной, как мы полагаем, с наличием О-подобного антигена в резус-отрицательных эритроцитах, так и с реагированием сывороток анти-0 с предметами-носителями

Результаты наших экспериментов и данные других авторов [Р1арр е< а1 ] показывали, что антигены О резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов имеют разную топологию

Анализируя результаты исследований, мы пришли к пониманию того, что для устранения неспецифического реагирования сывороток анти-0 нужно воздействовать непосредственно на их молекулярное строение так, чтобы они не могли связываться с 0-подобной структурой резус-отрицательных пятен (и с материалом предметов-носителей), что возможно, по-видимому, при укорочении длины молекулы антител анти-О.

Ранее было найдено [Сахаров РС, Каверзнева ЕД, 1988; Сахаров Р.С, 1988;], что воздействие протеаз на сывороточные белки приводит к постепенному расщеплению их молекул на более короткие пептиды При этом с уменьшением длины молекул этих пептидов уменьшается и их способность к связыванию с соответствующими им антигенами (антителами), что наиболее характерно для действия протеаз микробного происхождения, в частности, протеазы-С. При этом важно отметить, что прогрессирующий протеолиз белков оставляет реакцию антиген-антитело с иммунологически активными пептидами полностью специфичной

Приведенные выше данные окончательно убедили нас в том, что вполне возможно ферментативно укоротить антитела сыворотки анти-0 до оптимального размера так, чтобы полученные короткие пептиды анти-О, легко связываясь с более доступным антигеном О резус-положительных эритроцитов, находящимся на поверхности внешнего листка эритроцитарной мембраны, не могли бы «добраться» до ниже лежащей О-подобной структуры резус-отрицательных эритроцитов, к тому же глубоко утопленной в липидном матриксе их цитогшазматической мембраны.

Для этой цели было решено непосредственно в сыворотку анти-0 добавлять микробную протеазу - протеазу-С или растительную протеазу - папаин. Количество протеазы, а также продолжительность ферментативной реакции отрабатывались экспериментально Кроме того, для остановки дальнейшего действия фермента, чтобы он не разрушал уже образовавшиеся пептиды оптимального размера, необходимо было подобрать и условия ингибиции протеазы-С В результате выполнения большого комплекса иммуносерологических и иммунохимических исследований была разработана технология получения из аллоиммунных сывороток анти-0

пептидов IgG анти-D, специфически выявляющих резус-антиген D в следах крови (табл 5).

Работа с полученными пептидами позволила подтвердить уже известные и открыть новые серологические феномены Так, например, как и при работе с нативными сыворотками, было найдено, что наиболее активные и специфичные пептиды получаются далеко не из всех сывороток, даже если сыворотки, имеют высокий, практически одинаковый титр антител анти-D (табл 6). Это полностью совпадает с серологическими свойствами нативных сывороток анти-D, поскольку также далеко не каждая нативная сыворотка анти-D пригодна для выявления антигена D реакцией абсорбции-элюции Исключительно важными являются многократно подтвержденные экспериментально данные, показавшие, что при использовании пептидов анти-D в РАЭ исследуемые пятна крови ни в коем случае нельзя предварительно обрабатывать протеазами, т к с энзимированными пятнами пептиды анти-D попностью не активны (табл 7). На разработанную технику получения и применения пептидов анти-D был выдан патент №2209434 от 27 03 2003 г . «Способ получения пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений»

При исследования полученных элюатов они обязательно подвергаются титрованию При этом искомый антиген считается выявленным, если титр агглютинации тест-эритроцитов, бывших в контакте с элюатом из исследуемого пятна крови и с элюатом из пятна крови, являющегося положительным эритроцитарным контролем, на 3-4 ступени кратного титрования выше титра тест-эритроцитов, бывших в контакте с элюатом из контрольного отрицатепьного пятна крови и с элюатом из предмета-носителя При исследовании пятен крови, давность образования которых не превышает 3-5 месяцев, неспецифических реакций практически не бывает Опыты показали что при исследовании достаточно старых пятен даже с пептидами анти-D иногда наблюдалась с той или иной степенью выраженности неспецифическая агглютинация, которую мы пытались перевести в коэффициенты неспецифичности (тн Scoring system), характерные для Rh(+) и rh(-) крови Тем не менее, эксперименты показали, что наиболее надежным способом борьбы с неспецифической реакций является исследование достаточно свежих пятен - до 5 месяцев (для антигена D) и 3-4 месяцев для минорных антигенов

Устранение неспецифической реакции в РАЭ при использовании резус-пегтгидов /дЭ анти-Р, полученных из исходной сыворотки

Разведения элюатов (пептидов) анти-D Исходная сыворотка анти-D сер Д Резус-пептиды IgG анти-D сер Д

Пятно крови Rh{+) Пятно крови rh(-) Пятно крови т*) Пятно крови rh(-)

D d D d D d D d

Н ++++ - +++ - ++++ - - -

2 ++++ - ++ - ++++ - - -

4 ++++ - + - +++ - - -

8 +++ - ± - +++ - - -

16 +++ - - - ++ - - -

32 ++ - - - + - - -

64 + - - - - - - -

Условия опыта давность образования пятен - 3,5 месяца

Табл. 6

Разная пригодность антирезусных сывороток для получения пептидов анти-О, используемых при выявлении антигена О в пятнах крови с помощью РАЭ

Разведения пептидов анти-D Сыв-ка анти-D сер. Зин. Сыв-ка анти-D сер Map

CcDEe ccddee СсОЕе ccddee

D D D d D d D d

Н ++++ - - + - - -

2 ++++ - - ± - - -

4 +++ - - - - -

8 ++ - - - - -

16 + - - - - - -

32 ± - - - - - - -

Условия опыта, титр в протеазном методе - анти-D сер Зин 1:4096, анти-D сер. Map. 1:8192

Неэффективность пептидов анти-0 в РАЭ при выявлении антигена О в предварительно энзимированных пятнах крови

Разведения пептидов анти-0 НАТИВНЫЕ ПЯТНА КРОВИ ЭНЗИМИРОВАННЫЕ ПЯТНА КРОВИ

ссОЕе сс0с!ее ссОЕе ссййее

О С| О О а 0 б

Н ++++ - - - - - - -

2 ++++ - - - - - -

4 +++ - - - - - -

8 ++ - - - - - - -

Условия опыта давность образования пятен - 4 и 5 месяцев

ВЫЯВЛЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕХНИКОЙ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РН В СЛЕДАХ КРОВИ При разработке способа модификации иммуноглобулинов 1дв анти-0 и техники исследования полученных элюатов, описанных в главе 5, было выполнено 146 постановок РАЭ, в которых антиген О определялся 504 раза Однако, для всех этих постановок РАЭ и выявлений антигена О характерным являлось то, что все они выполнялись с кровью, резус-принадлежность которой была заведомо известна Поэтому, после экспериментальной отработки оптимальных условий проведения всех этапов РАЭ с использованием пептидов анти-О, было решено разработанной техникой исследовать достаточное количество образцов крови, резус-принадлежность которых экспериментатору (автору работы) была неизвестна Это позволяло наиболее объективно оценить эффективность разработанной техники. Для этого было зашифровано 20 образцов (№№ 1-20) пятен крови живых лиц с указанием для каждого пятна ориентировочного срока его образования (от недели до 6 месяцев) и все это было передано экспериментатору Результаты эксперимента в виде слепых опытов представлены в таблице 8 Как видно из табл. 8, результаты определения слепыми опытами резус-принадлежности всех 20 пятен крови, полностью совпали во всех случаях с предварительно определенной резус-принадлежностью жидкой крови, т.е. разработанная техника во всех 100% случаях правильно определила резус-принадлежность пятен крови живых лиц с давностью образования пятен в пределах 1 неделя - 6 месяцев Более того, был четко определен также и

слабовыраженный редкий (1-1000) вариант антигена О - тн антиген О и Насколько нам известно, в судебно-медицинской иммунологии о выявлении в пятнах крови антигена О " сообщается впервые

Табл. 8

Результаты определения антигена О в пятнах крови слепыми опытами

№№ исследовавшихся пятен крови Установленный ранее РЪ-фенотип этих же образцов жидкой крови Резус-принадлежность пятен крови, определенная в слепых опытах

1 ссОЕе Э+

2 СсОее 0+

3 сссМее О-

4 ссОЕе 0+

5 С"сОЕе О*

6 СсОее О*

7 СсРее 0+

8 саИее 0-

9 сссМее Р-

10 СсО"ее 0+

11 ССОее Р+

12 ссОЕЕ 0+

13 СсОее 0+

14 сссМее 0-

15 СсОее 0+

16 сссйее й-

17 СсОее 0+

18 СсОее 0+

19 сссИее 0-

20 СсОее

При определении резус-принадлежности крови пятен, полученных из незагнившей трупной крови (через 1-3 сутки после наступления смерти) было найдено, что антиген Б в крови пятен из трупной крови выявляется разработанной техникой четко и специфично, хотя выраженность реакции агглютинации под влиянием элюатов из трупной крови была заметно слабее, чем под влиянием элюатов из пятен крови живых лиц.

Таким образом, результаты определения антигена О в различных, в том числе трупных, пятнах крови позволяют утверждать, что разработанная техника РАЭ с использованием пептидов анти-О и установлением коэффициента неспецифичности (КН) РАЭ позволяет уверенно выявлять антиген О, не делая ошибок

Вместе с тем, мы наблюдали несколько образцов крови резус-отрицательных лиц, пятна которых в течение 4-5 и даже 6 месяцев в РАЭ реагировали совершенно специфично, однако в процессе старения (хранения) пятен, через 9-10 месяцев они начинали давать выраженную неспецифическую реакцию, не позволявшую определять резус-принадлежность их крови (КН находился в зоне неопределенности) Предсказать заранее развитие такой ситуации -невозможно Поэтому, несмотря на то, что мы впервые в мире доказали возможность выявления антигена Э модифицированной РАЭ (см главу 3) в чрезвычайно старых (14-летних) пятнах крови, в условиях, когда отсутствует централизованное квалифицированное изготовление и снабжение сыворотками антирезус, всесторонне проверенными и специально предназначенными для выявления резус-антигенов в пятнах крови, учитывая также протеиновую природу ИИ-антигенов, обладающих меньшей устойчивостью к внешним воздействиям, целесообразно ограничить выявление антигена О с помощью пептидов анти-О пятнами крови, имеющими давность образования не более 5 месяцев Это позволяет говорить о гарантированном определении резус-принадлежности крови пятен

Такой вывод практически соответствует имеющимся литературным данным (Саепвв^п е( а1. (1985). Эти авторы считают, что «ложно-положительные реакции не являются проблемой при проведении исследований в сроки, оптимальные для выявления ЯЬ антигенов» Такими оптимальными сроками они считают давность образования исследуемых пятен не более б месяцев

Следует отметить, что при определении антигена О с использованием пептидов анти-О, полученных из разных сывороток анти-О, мы ни разу не наблюдали реакции с предметами-носителями (различными образцами марли, фланели, ситца, постельным бельем)

ВЫЯВЛЕНИЕ МИНОРНЫХ РЕЗУС-АНТИГЕНОВ С, С", С, Е, •

Проверка активности, специфичности и пригодности для РАЗ минорных антител - те же, что и антител анти-П В отличие от сывороток анти-О, работа с минорными антителами не требует получения из них пептидов, т к нативные минорные антитела, в общем случае, работают в РАЗ совершенно специфично Кроме того, получить из минорных антител сколько-нибудь активные пептиды - обычно не удается Титр минорных антител, по сравнению с мажорными антителами анти-О, как правило, заметно ниже Поэтому, в случае необходимости (например, при отсутствии других серий антител) в РАЗ могут быть использованы минорные антитела с относительно низким титром, например, 1 16, тк ив этом случае, могут бьггь получены вполне отчетливые положительные результаты Обязательные условия - в каждое разведение сыворотки вводится не 1, а 2 ниточки по 5 мм каждая, давность образования исследуемых пятен крови не должна превышать 3-4 месяцев, каждое минорное антитело элюата исследуется гомозиготными тест-эритроцитами

Опыты показали, что вследствие нестабильности, а часто и полностью отрицательных результатов, моноклональные антитела (во всяком случае клоны МКА, имевшиеся в нашем распоряжении) - непригодны для использования в РАЗ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ ЭКСПЕРТНЫХ ПЯТЕН, Разработанной техникой было произведено определение резус-принадлежности (выявление антигена О) 32 пятен крови, находившихся на вещественных доказательствах экспертиз, которые выполнялись в ноябре-декабре 2004 г. в биологическом отделении Московского городского Бюро судебно-медицинской экспертизы ГУЗМ (За предоставленный экспертный материал автор выражает свою искреннюю благодарность зав биологическим отделением ГУЗМ ГА Антоненко)

Апробация разработанной техники определения резус-принадпежности крови пятен на экспертном материале показала, что эта методика, разработанная на экспериментальных пятнах крови, в реальных экспертизах дает такие же результаты, что и в эксперименте

В процессе диссертационной работы выполнены 292 постановки РАЗ, произведено 6517 титрований получаемых элюатов, исследовано 236 пятен крови с использованием 211 образцов эритроцитов с различными резус-фенотипами, 47 серий сывороток и пептидов анти-О, а также сывороток к минорным антигенам, 9 образцов различных протеаз и 4 образцов гликозидаз что, в целом, составило 7269 серологических исследований

ВЫВОДЫ

1 Разработана специфичная и чувствительная техника определения ЯИ-антигенов Р, С, С", с, Е, е в следах крови

2 Впервые серологическими методами обнаружен О-подобный антиген на цитоплазматической поверхности резус-отрицательных эритроцитов

3 Доказано, что неспецифическая реакция в РАЭ обусловлена наличием указанного 0-подобного антигена, что затрудняет определение резус-принадлежности сухих пятен крови на вещественных доказательствах В частности, при выявлении антигена О необходимо использовать пептиды анти-О.

4 Разработан способ получения из аллоиммунных сывороток анти-О пептидов 1дв анти-О, не реагирующих с О-подобным антигеном резус-отрицательных эритроцитов (патент № 2209434 от 27 07 2003 г «Способ получения резус-пептидов анти-О, специфически выявляющих антиген №0 в следах крови и выделений»

5. Принимая во внимание протеиновую природу ЯЬ-антигенов, менее устойчивую во внешней среде, целесообразно ограничить выявление антигена О с помощью пептидов анти-О пятнами крови с давностью образования не более 5 месяцев, а выявление минорных антигенов С, С", с, Е, е - пятнами крови с давностью образования 3-4 месяца Соблюдение указанных условий позволяет говорить о гарантированном определении ВЬ-антигенов крови пятен

6 Установлено, что вследствие нестабильности, а часто и полностью отрицательных получаемых результатов, моноклональные антитела (во всяком случае, клоны МКА, имевшиеся в нашем распоряжении) непригодны для использования в РАЭ

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Кондратоеа И В Определение резус-принадлежности следов крови в судебно-медицинских целях // Сб работ 69-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, Курск, 2004, 1 часть, С 107-108

2. Сахаров P.C., Кондратова И В, Федулова М В, Гургенидзе Е В. Современные представления о структуре и функции эритроцитарных антигенов (Обзор литературы к 100-летию открытая групп крови) // Суд -мед. экспертиза, 2001, № 5, С 38-43.

3 Сахаров Р С , Кондратова И В , Федулова М.В , Крестьянова И Н О серологически выявляемом наличии в следах крови резус-отрицательных (cde) лиц резус-антигена D. // Суд -мед экспертиза, 2002, No 2, С 25-28.

4 Сахаров Р С , Кондратова И В., Федулова MB. О выявлении резус-антигена D в следах крови// Актуальные проблемы судебной медицины (Сб. научных работ), М, 2003, С. 143147.

5. Сахаров P.C., Кондратова И.В., Федулова М.В. О наличии в эритроцитах резус-отрицательных (cde) лиц резус-антигена D. // Проблемы гематологии и переливания крови, М , 2003, С 25-31.

6 Кондратова И В, Сахаров Р С , Федулова М.В Определение резус-антигенов в следах крови в судебно-медицинских целях II Проблемы экспертизы в медицине, Ижевск, 2003, № 3, т. 3, С 27-29.

7. Сахаров Р.С , Кондратова И.В, Федулова М.В, Виха Г В Способ получения резус-пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений // Патент на изобретение № 2209434 Бюлл № 21 от 27 07 2003 г

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 22.04.06 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

ZooG(\ 33G7

Из всех известных и наиболее значимых эритроцитарных антигенных систем -ABO, Rh, MNS, Kell, Duffy, Kidd, система Резус (Rh) обладает наиболее выраженным антигенным полиморфизмом и высокой информативностью. Это делает исключительно актуальным ее использование в судебно-медицинских целях, в частности, при разграничении следов крови на вещественных доказательствах.

Именно высокой значимостью указанной системы объясняются многочисленные попытки исследователей разработать чувствительные, пригодные для практической экспертизы, методики выявления Rh-антигенов в пятнах крови.

Анализ этих работ показывает, что такими методами чаще всего является реакция абсорбции-элюции (РАЭ) с использованием различных ферментных тестов. Так, в отечественной судебно-медицинской практике в качестве метода выявления Rh-антигенов в следах крови в настоящее время наиболее часто применяется разработанная Е.Е. Гальцевой (1973) трипсин-альбуминовая модификация РАЭ. В зарубежной практике обычно используется модификация РАЭ с применением папаина [87, 88].

Недавно отечественными исследователями [39, 40, 41] была разработана техника с использованием высокоактивных микробных и растительных протеаз для обработки не только стандартных тест-эритроцитов, но и исследуемых следов крови и выделений. Эта техника, названная авторами модифицированной РАЭ, позволяла значительно повысить чувствительность и специфичность выявления антигенов АВО в микроследах крови и выделений.

Поэтому, нами было предпринято изучение возможности повышения чувствительности и специфичности выявления в следах крови с помощью модифицированной РАЭ также и Rh-антигенов. Для этого было проведено широкое сравнительное изучение возможностей протеазной, папаиновой и трипсин-альбуминовой модификаций РАЭ, применявшихся при выявлении Rh-антигенов и выполнявшихся с использованием как классической техники, так и техники модифицированной РАЭ, в том числе и с применением модифицированных иммуноглобулинов IgG анти-D (пептидов анти-D). Подобные исследования выполнены впервые и для судебной медицины являются актуальными.

Цель работы

Повышение чувствительности и специфичности выявления антигенов системы Rh в следах крови реакцией абсорбции-элюции (РАЭ) с использованием на различных ее этапах высокоактивных протеаз микробного и растительного происхождения.

Задачи работы

1) Адаптация модифицированной РАЭ к выявлению Rh-антигенов в следах крови.

2) Выяснение сущности неспецифичности РАЭ при выявлении в следах крови резус - антигена D.

3) Разработка способа модификации иммуноглобулинов IgG анти-D с целью устранения неспецифичности РАЭ.

4) Разработка чувствительного и специфичного способа определении резус-принадлежности следов крови с применением пептидов анти-D.

5) Разработка чувствительной и специфичной техники определения в следах крови минорных резус-антигенов С, Cw, с, Е, е .

Научная новизна

Впервые серологическими методами установлена абсорбция антител анти-D энзимированным материалом резус-отрицательных (cde) лиц. Серологически этот феномен проявляется как D или D-подобный антиген. Экспериментально установлено значение этого D-подобного резус-антигена как причины неспецифичности РАЭ при определении резус-принадлежности следов крови. Разработан оригинальный способ устранения указанной неспецифичности (патент № 2209434 от 27.07. 2003 г.). Установлены также оптимальные сроки давности образования пятен крови для специфического выявления в них Rh-антигенов.

Практическая значимость работы

Разработана чувствительная, простая и надежная техника определения антигенов Rh-Hr в следах крови, что существенно повышает дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств.

Апробация работы и внедрение результатов Материалы диссертации доложены на научной конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ в декабре 2002 г. Апробация работы состоялась 21 февраля 2006 г. на расширенной конференции отдела судебно-медицинского исследования вещественных доказательств ФГУ РЦ СМЭ Росздрава. На апробации диссертации присутствовали специалисты из отдела судебно-медицинской идентификации личности и танатологического отдела ФГУ РЦ СМЭ, приглашенные специалисты из ГНЦ РАМН по специальности 14.00.29. - гематология и переливание крови. В Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию России представлена на утверждение подготовленная Сахаровым Р.С. и Кондратовой И.В. усовершенствованная медицинская технология: «Выявление антигенов системы Rh в следах крови», М., 2005 г.

Публикация результатов работы По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, из них 5 - в центральной печати. Получен патент № 2209434 от 27.07.2003 г.

Структура диссертации Диссертация изложена на 142 страницах компьютерной печати и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы. Текст иллюстрирован 38 таблицами и 3 рисунками. Список литературы содержит 159 источников, из которых на русском языке - 61 и 98 - на английском и других языках.

выводы

1. Разработана специфичная и чувствительная техника определения Rh антигенов D, С, Cw, с, Е, е.

2. Впервые серологическими методами обнаружен D- подобный антиген на цитоплазматической поверхности резус- отрицательных эритроцитов.

3. Доказано, что неспецифическая реакция в РАЭ обусловлена наличием указанного D- подобного антигена, что затрудняетопределениерез/с- принадлежности сухих пятен крови на вещественных доказательствах. В частности, при выявлении антигена D в РАЭ необходимо использовать пептиды анти-D.

4. Разработан способ получения пептидов IgG анти- D, не реагирующих с D-подобным антигеном резус-отрицательных эритроцитов (патент № 2209434 от 27.07.2003 г. «Способ получения резус-пептидов анти- D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений»).

5. Принимая во внимание протеиновую природу Rh-антигенов, менее устойчивую во внешней среде, целесообразно ограничить выявление антигена D с помощью пептидов анти-D пятнами крови с давностью образования не более 5 месяцев, а выявление минорных антигенов С, Cw, с, Е, е - пятнами крови с давностью образования 3 -4 месяца. Соблюдение указанных условий позволяет говорить о гарантированном определении Rh-антигенов крови пятен.

6. Установлено, что вследствии нестабильности, а часто и полностью отрицательных получаемых результатов, моноклональные антитела (во всяком случае, клоны МКА, имевшиеся в нашем распоряжении) непригодны для использования в РАЭ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С открытием в 1940-45 г.г. антигенов системы Rh (D, С, Cw, с, Е, е) стало ясно, что эта высоко полиморфная система может иметь большое значение не только для иммунологии, но и для судебной медицины. Так, например, выявление в пятнах крови 18 резус-фенотипов, образуемых указанными выше 6-ю антигенами, позволяет на треть повысить дифференцирующие возможности судебно-медицинской экспертизы [31].

Однако, первые исследования по выявлению Rh-антигенов в следах крови ингибиционной (абсорбционной) техникой, выполненные спустя несколько лет после открытия резус-антигенов, привели к обескураживающим результатам. Так, оказалось, что антиген D переставал выявляться уже через 2 часа после высыхания D-положительного пятна крови (П.Н. Косяков, М.А. Умнова, 1950; М.А. Бронникова, В.А. Багдасаров, Л.О. Барсегянц, 1957). Поэтому, подводя итоги указанным исследованиям, П.Н. Косяков и М.А. Умнова, (1950) писали: «Своей неустойчивостью к высушиванию антиген D существенно отличается от других содержащихся в эритроцитах человека антигенов - видовых, групповых А и В, а также типовых М и N. В силу этого использование антигена D в судебно-медицинской практике идентификации пятен крови при современных методах исследования встречает большие трудности». Только лишь с разработкой в 1960-70 г.г. высокочувствительной реакции абсорбции-элюции (РАЭ) [11, 65, 66, 100, 101, 120, 130] стали получать удовлетворительные результаты выявления Rh-антигенов в следах крови.

В 80-х годах, после расшифровки химического строения Rh-антигенов, стала понятна их неустойчивость к различным внешним воздействиям. Оказалось, что Rh-антигены - единственные из множества антигенов других эритроцитарных антигенных систем, которые не имеют опорного углеводного каркаса, т.е. являются чисто протеиновыми структурами [4, 67, 73, 123].

Современные методы выявления Rh-антигенов в следах крови базируются, в основном, на применении реакции абсорбции-элюции (РАЭ), активность и специфичность получаемых элюатов которой исследуется с помощью высокочувствительных ферментных тестов - папаинового, протеазного, трипсин-альбуминового и др. Недавно отечественными исследователями [39, 40] была разработана техника, названная авторами модифицированной РАЭ, предназначенная для выявления антигенов АВО в следах крови и выделений, заключающаяся в применении серологически активных протеаз для обработки не только стандартных эритроцитов, но и исследуемых пятен крови и выделений. Эта методика существенно повышает чувствительность выявления антигенов АВО, что значительно расширяет экспертные возможности, позволяя, в частности, выявлять указанные антигены в микроследах.

Поэтому, целью наших первоначальных исследований, представленных в главе 3, было изучение возможности повышения чувствительности выявления антигенов системы Rh путем адаптации модифицированной РАЭ применительно также и к выявлению антигенов указанной системы. При выполнении модифицированной РАЭ в качестве протеаз использовались ферментные препараты микробного (протеаза-С) и растительного (папаин) происхождения. В опытах сравнения использовался также животный трипсин, а получаемые элюаты иногда исследовались антиглобулиновым и поликати-онным тестами. При проведении исследований все этапы реакции абсорбции-элюции были подвергнуты ревизии, т.е. выполнялись при различных условиях с целью разработки техники, наиболее пригодной для выявления Rh-антигенов в следах крови. Такая ревизия РАЭ была тем более необходима, поскольку влияние предварительной обработки исследуемых пятен крови указанными высокоактивными протеазами при выявлении в них Rh-антигенов, в судебно-медицинской иммунологии изучалось впервые.

Как известно, фиксация материала при определении Rh-антигенов в следах крови уже давно не применяется, поскольку в 1967 г. Bargagna и Pereira [65] доказали, что обработка пятен крови такими реактивами, как 100% метанол, полностью ингибирует выявляемость антигена D в следах крови с помощью РАЭ.

Причиной, побудившей нас исследовать возможность применения фиксирования следов крови при выявлении в них Rh-антигенов, явилось понимание того факта, что Rh-антигены, в отличие от гликопротеиновых антигенов всех других изосерологических систем, являются чисто протеиновыми структурами, для которых может быть далеко не безразличным воздействие на пятна высокоактивных, в том числе микробных, протеаз, применяющихся при постановке модифицированной РАЭ. При этом мы полагали, что как и в случае выявления антигенов системы АВО [33, 39, 40], предварительное фиксирование создаст ту защитную пленку денатурированных сывороточных белков, которая защитит протеиновые структуры Rh-антигенов от прямого воздействия протеаз при энзимировании пятен, поскольку действие протеаз в первую очередь будет направлено на «растворение» наиболее доступных для них белков этой защитной пленки.

В качестве фиксирующих средств нами испытывались 100% метанол и глютаро-вый альдегид, ранее примененный Greenwalt et al. (1992) для фиксирования на предметных стеклах эритроцитов при выявлении в них резус-антигена D. Опыты показали, что в случае применения как метанола, так и глютарового альдегида, в не энзимированных после фиксирования пятнах также наблюдалось выраженное ингибирование чувствительности РАЭ; однако, если после фиксирования пятен они затем подвергались энзимированию, то в пятне крови, фиксированном метанолом, и после энзимиро-вания наблюдалось полное ингибирование выраженности РАЭ. В то же время, если фиксированное глютаровым альдегидом пятно крови затем подвергалось энзимированию, то в этом пятне наблюдалось выраженное выявление антигена D (табл. 4).

Таким образом, широко распространенное мнение о недопустимости фиксирования пятен крови при определении Rh-антигенов - нуждается в коррекции в том смысле, что этот постулат справедлив не для всех фиксирующих реактивов. В частности, глю-таровый альдегид вполне может быть использован для фиксирования пятен при выявлении антигена D, как это показано в табл. 4. Однако, наши дальнейшие многочисленные эксперименты в этом направлении с разными сыворотками анти-D, с пятнами разных лиц и с пятнами разной давности образования, заставили нас внести существенные уточнения и дополнения в это утверждение.

Прежде всего, необходимо отметить, что наши опасения о небезразличности воздействия высокоактивных протеаз на протеиновые структуры Rh-антигенов оказались оправданными и они были связаны с давностью образования исследуемых пятен. Так, опыты показали, что пятна крови с небольшой давностью образования (до 6 месяцев) и, особенно, свежеобразованные пятна крови (2 недели - 1 месяц) не надо ни в коем случае ни обрабатывать протеазами, ни фиксировать, т.к. энзимирование пятен крови в этих случаях может привести не только к ухудшению выраженности, но и к полной ингибиции реакции выявления антигена D (табл. 9). Применение же фиксирования с последующим энзимированием повышало неспецифичность РАЭ. В то же время, при исследовании пятен крови с достаточно длительной давностью образования (9 месяцев и выше) применение энзимирования пятен является обязательным, т.к. значительно повышает чувствительность выявления антигена D (табл. 8). Особенно наглядно это установлено при исследовании очень старых пятен крови (в наших опытах -с давностью образования 14 лет). Обработка этих пятен крови протеазой-С позволила достоверно выявить в них антиген D, при полной несостоятельности трипсин-альбуминового теста (табл. 10).

В целом, при однократной постановке РАЭ с одним и тем же кусочком материала, применение фиксирования оказалось ненужным, т.к. свежеобразованные пятна надо исследовать нативными, а старые пятна не нуждаются в фиксации, по-видимому, за счет достаточного количества денатурированных белков, образовавшихся в процессе хранения пятен.

Мы полагаем, что современные знания о химическом строении Rh-антигенов и их топографии на поверхности эритроцита как чисто протеиновых структур, лишенных обычного для эритроцитарных антигенов углеводного опорного каркаса и глубоко утопленных в липидный матрикс эритроцитарной мембраны, позволяет предположить, что при высыхании пятен, т.е. дегидратации крови, происходят конформационные (пространственные) изменения поверхностных структур мембраны эритроцитов, что приводит в той или иной степени к недоступности Rh-антигенов для соответствующих антител, т.е. к невозможности осуществления реакции антиген-антитело. Эти структурные изменения в известной степени аналогичны процессу, отображенному на рис. 2. Доказательством сказанного явились опыты, по применению модифицированной РАЭ (т.е. с предварительным энзимированием высокоактивной протеазой исследуемых пятен), когда антиген D был четко выявлен в очень старых (14-летних) пятнах крови при полной несостоятельности трипсин-альбуминового теста (глава 3, табл. 10). Мы полагаем, что эти данные наглядно подтверждают высказанное выше положение о причине невыяв-ляемости антигена D в старых пятнах как следствие «замуровывания» этого антигена старыми денатурированными сывороточными белками, освободившись от которых посредством энзимирования пятен крови, он вновь становится доступен для антител анти-D и начинает четко выявляться.

К сожалению, дальнейшие эксперименты показали, что высокоактивные сыворотки анти-D со «зрелыми» иммуноглобулинами IgG анти-D, специфически реагирующие в РАЭ, подобно сыворотке, использованной нами при выявлении антигена D в 14-летних пятнах крови, встречаются исключительно редко и эти, действительно, прекрасные возможности подлинной (с энзимированием исследуемых пятен крови) модифицированной РАЭ еще ждут своих специфически реагирующих гипериммунных антител IgG анти-D.

В отличие от распространенного в судебно-медицинской серологии мнения о специфичности, чувствительности и надежности РАЭ с использованием протеаз при выявлении Rh-антигенов в следах крови, в случае применения протеаз, особенно микробной протеазы-С, мы столкнулись с проблемой неспецифичности РАЭ при выявлении резус-антигена D с помощью обычных сывороток анти-D. Она заключалась в том, что при исследовании получаемых элюатов, с Rh(+) энзимированными эритроцитами реагировали элюаты не только из Rh(+), но и из rh(-) пятен крови, при полном отсутствии реакции с rh(-) энзимированными эритроцитами. Если же модифицированная РАЭ применялась при исследовании старых пятен, то наряду с резким повышением выраженности специфической реакции, одновременно заметно повышалась выраженность и неспецифической реакции. Точно также при исследовании свежих пятен (которые нельзя обрабатывать протеазой), наряду с ухудшением выраженности специфической реакции, снижалась выраженность и неспецифической реакции.

Ревизия всех этапов РАЭ: исследование материала, фиксированного различными фиксаторами, его обработка перед абсорбцией белковыми средами, подбор разведений стандартных сывороток анти-D перед введением их в этап абсорбции, количества абсорбируемого материала и числа отмываний от несвязавшихся антител, определение температурного оптимума элюции в различных средах, сравнение различных серологических методов (коллоидных, поликатионных, ферментных, антиглобулинового теста) при учете активности получаемых элюатов - при всех вариантах этапов РАЭ не было получено специфических результатов (глава 3).

Это заставило обратить особое внимание на сущность неспецифической реакции, которую часто имели элюаты нативных сывороток анти-D, независимо от того, какой протеазой (животного, растительного или микробного происхождения), были обработаны тест-эритроциты, использовавшиеся для исследования элюатов.

В результате проведенных многочисленных абсорбционно-элюционных экспериментов мы пришли к парадоксальному выводу о наличии в резус-отрицательных ( cde) эритроцитах антигена со специфичностью резус-антигена D (или D-подобного антигена).

Этот вывод основан на следующем: специфичность элюатов как из Rh(+), так и из rh(-) пятен крови серологически определялась как антитела анти-D (табл. 14); увеличение числа процедур отмывания сенсибилизированного материала с 6 до 12 не приводило к устранению неспецифичности РАЭ (табл. 15); попытка устранения неспецифичности РАЭ предварительной абсорбцией сывороток анти-D резус-отрицательными энзимированными эритроцитами оставляла без изменения неспецифичность реакции; однако, применение для этой цели материала rh(-) - отрицательных энзимированных пятен крови приводило к тому, что элюат переставал реагировать с Rh(+) эритроцитами, особенно при повторении абсорбционных процедур; аналогичным образом можно было инактивиро-вать не только элюаты, но даже и сыворотки анти-D (табл. 16). В силу своей хорошей изолированности от внешней среды (от плазмы крови) на внутренней (цитоплазматической) стороне мембраны резус-отрицательных эритроцитов, он не принимает участия в обычных иммунологических реакциях и потому не имеет трансфузионного значения и не должен приниматься в расчет при типировании эритроцитов в случае, когда они сохраняют свою морфологическую целостность.

Что же касается судебно-медицинской серологии, то наличие антигена D в резус-отрицательных эритроцитах создает серьезные трудности при определении резус-принадлежности крови в пятнах, имеющихся на вещественных доказательствах.

С точки зрения современных представлений [5, 62 73 123, 147], негликолизиро-ванные протеиновые змеевидные нити, каковыми являются антигены Rh, не только вы ступают над поверхностью эритроцита, но и проникают сквозь мембрану на ее внутреннюю сторону, выполняя свои физиологические функции в цитоплазме эритроцита -транспорт ионов и мембранную стабилизацию. По-видимому, эти же функции выполняет антиген D и в резус-отрицательных эритроцитах.

В настоящее время методами иммунохимии расшифрована даже аминокислотная последовательность Rh-протеинов, полученных из Rh-антигенов разной специфичности. Однако, знание этой последовательности не позволяет установить, каким конкретно из антигенов (С, Cw, с, D, Е, е) является данный белок, поскольку установить его иммунологическую специфичность возможно только с помощью антител, взаимодействующих с нативным Rh-белком [64, 69].

В связи с этим, является далеко не случайным, что обнаружение нами резус-антигена D в резус-отрицательных эритроцитах связано с использованием в экспериментах простых, чувствительных и специфичных серологических методов исследования.

Таким образом, мы пришли к такому положению, когда определение антигена D в следах крови с помощью имевшихся в нашем распоряжении сывороток анти-D, было практически невозможно из-за неспецифичности, связанной, как мы полагаем, с наличием D-подобного антигена в резус-отрицательных эритроцитах, так и с реагированием сывороток анти-D с предметами-носителями.

Результаты наших экспериментов и данные других авторов (Plapp et al., 1979) показывали, что антигены D резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов имеют разную топологию, а именно: антиген D резус-положительных эритроцитов находится на наружной (плазматической) стороне мембраны эритроцитов, тогда как антиген D резус-отрицательных эритроцитов находится на внутренней (цитоплазматиче-ской) стороне эритроцитарной мембраны. Другими словами, разница в расположении между этими антигенами на резус-положительном и на резус-отрицательном эритроците составляет, примерно, толщину мембраны эритроцитов, т.е. хотя и малую, но вполне дискретную величину.

Анализируя результаты исследований, мы пришли к пониманию того, что для устранения неспецифического реагирования сывороток анти-D в РАЭ нужно воздейст вовать непосредственно на их молекулярное строение так, чтобы они не могли связываться с D-подобной структурой резус-отрицательных пятен крови (и с материалом предметов-носителей), что возможно, по-видимому, при укорочении длины молекулы антител анти-D.

Для этой цели было решено непосредственно в сыворотку анти-D добавлять микробную протеазу - протеазу-С. Ее количество, а также продолжительность ферментативной реакции отрабатывались экспериментально. Кроме того, для остановки дальнейшего действия фермента, чтобы он не разрушал уже образовавшиеся пептиды оптимального размера, необходимо было подобрать и условия ингибиции протеазы-С.

В результате экспериментальных исследований была разработана техника получения пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген D в следах крови и не реагирующих с материалом предметов-носителей. На разработанную технику был получен патент № 2209434 от 27.07.2003 г.: «Способ получения резус-пептидов анти-D, специфически выявляющих антиген RhD в следах крови и выделений».

Была разработана также оригинальная техника постановки РАЭ с применением кратных разведений пептидов анти-D на этапе абсорбции исследуемого материала, с элюцией сенсибилизированного материала на предметных стеклах в физиологический раствор с последующим добавлением в полученные элюаты соответствующих стандартных энзимированных эритроцитов, с подсчетом выраженности агглютинации (Scoring system) и расчетом коэффициента неспецифичности (КН). Это позволило четко определять резус-принадлежность исследуемых следов крови также и в тех случаях, когда с контрольными образцами резус-отрицательной (ccddee) крови наблюдается небольшая неспецифическая агглютинация.

Исключительно важными явились экспериментальные данные об ингибиции активности пептидов анти-D в РАЭ при исследовании пятен крови, предварительно обработанных протеазами (глава 5, табл. 26). Эти данные, по-видимому, отражают способность пептидов реагировать с наиболее поверхностно расположенными резус-антигенами и являются одной из серологических особенностей свойств пептидов анти-D, отличающих их от нативных сывороток анти-D. серологических особенностей свойств пептидов анти-D, отличающих их от нативных сывороток анти-D.

Не менее важны также и экспериментальные данные, показавшие, что не все ал-лоиммунные сыворотки анти-D, даже имеющие примерно равные титры антител, одинаково пригодны для получения активных в РАЭ пептидов анти-D. При этом моноклональные антитела анти-D, даже с высоким титром антител, для получения пептидов анти -D практически не пригодны.

Выявление антигенов системы Rh-Hr с помощью разработанной техники РАЭ (глава 6) показало, что антиген D, в том числе и его слабовыраженный вариант - антиген Du, четко выявляется в пятнах крови живых лиц, а антиген D - также и в пятнах незажившей трупной крови (табл. №№ 31, 32, 33, 34).

Вместе с тем, мы наблюдали несколько образцов крови резус-отрицательных лиц, пятна которых в течение 4-5 и даже 6 месяцев в РАЭ реагировали совершенно специфично; однако в процессе хранения пятен, через 9-10 месяцев они начинали давать выраженную неспецифическую реакцию, не позволявшую определять резус-принадлежность их крови (КН находился в зоне неопределенности). Предсказать заранее развитие такой ситуации - невозможно. Поэтому, несмотря на то, что мы впервые в мире доказали возможность выявления антигена D модифицированной РАЭ в чрезвычайно старых (14-летних) пятнах крови, в условиях отсутствия централизованного изготовления и снабжения сыворотками антирезус, отвечающих требованиям выявления резус-антигенов в пятнах крови, целесообразно ограничить выявление антигена D с помощью пептидов анти-D пятнами крови, имеющими давность образования не более 5 месяцев. Это позволит гарантировать точное определение резус-принадлежности крови пятен.

Такой вывод практически соответствует имеющимся литературным данным. Так, например, Gaensslen et al., [87], используя сыворотки, специально предназначенные для исследования пятен крови, считают, что «ложно-положительные реакции не являются проблемой при исследовании в сроки, оптимальные для выявления Rh-антигенов». Такими оптимальными сроками эти авторы считают давность образования исследуемых пятен не более б месяцев. Martin [125] также смог обнаруживать присутствие всех Rh-антигенов в пятнах возрастом до 6 месяцев с использованием техники, сходной с примененной Gaensslen et al. [87]. Bargagna et al. [65] нашли антиген D определяемым в пятнах до 6-месячного возраста.

Исследования показали, что при наличии достаточно активных и специфичных соответствующих сывороток, не имеется каких-либо проблем в выявлении в пятнах крови и минорных резус-антигенов: С, Cw, с, Е, е. В отличие от антител к мажорному антигену D, антитела к минорным антигенам не требуют превращения их перед использованием в РАЭ в соответствующие пептиды. Более того, из этих антител пептиды получить обычно и не удается. Вместе с тем, как и антитела анти-D, не все антитела к минорному антигену любой специфичности, были активны в РАЭ и требовалась предварительная проверка каждого минорного антитела на его пригодность применения в РАЭ.

Исследования показали, что наиболее надежное и стабильное выявление минорных антигенов обеспечивается применением в РАЭ соответствующих поликлональ-ных аллоиммунных резус-антител как неполной, так и, особенно, полной формы. Применяя активные в РАЭ указанные антитела в титре 1:32-1:64, мы во всех исследованных случаях наблюдали четкое и специфическое выявление соответствующих минорных антигенов.

Вместе с тем, не следует забывать о протеиновой природе Rh-антигенов, которая может напомнить о себе при неправильном хранении вещественных доказательств. При экспертном выявлении Rh-антигенов должна обеспечиваться безусловная надежность результатов РАЭ. Такое гарантированное выявление всех минорных Rh-антигенов (С, Cw, с, Е, е) разработанной нами ферментной техникой обеспечивается при исследовании пятен крови, хранившихся в условиях, близким к комнатным и имеющих давность образования не более 3-4 месяцев. Как мы уже отмечали выше, при выявлении антигена D, давность образования пятен не должна превышать 5 месяцев.

Полученные нами результаты, как мы уже отмечали выше, полностью совпадают с имеющимися современными литературными данными (Gaensslen et al., [87], Martin, [125], Bargagna et al.,[65]).

Апробация разработанной техники определения резус-принадлежности крови пятен на экспертном материале показала, что эта методика, разработанная на экспери ментальных пятнах крови, в реальных экспертизах дает такие же результаты, что и в эксперименте. Это позволяет обоснованно рекомендовать разработанную технику определения резус-антигенов в пятнах крови в экспертную практику.

Исследование смешанных пятен крови и выделений не входило в число решаемых задач нашей работы. Тем не менее, немногочисленные ориентировочные опыты со смешанными пятнами (крови и спермы) показали, что сыворотка, прекрасно выявляющая антиген D в пятне крови, может и не выявить этот антиген в смешанном пятне резус-положительной крови и резус-отрицательной спермы. И, наоборот, другой образец сыворотки с тем же титром антител анти-D, в этом же смешанном пятне может прекрасно выявлять этот антиген.

Молекулярные механизмы этого феномена пока не совсем ясны.

С практической точки зрения, по-видимому, при исследовании смешанных пятен крови и выделений (спермы, слюны, вагинальных выделений), активность вводимых в РАЭ сывороток (анти-D) должна быть предварительно проверена со смешанными пятнами. Мы полагаем, что выявление резус-антигенов в смешанных пятнах крови и выделений - должно явиться темой дальнейших научных исследований. В связи с этим, разработанную технику выявления резус-антигена D, пока не следует применять в экспертизах, связанных с сексуальными мотивациями.

Выполненные нами исследования убедительно свидетельствуют о необходимости налаживания централизованного производства антирезусных сывороток, специально предназначенных для выявления антигенов Rh-Hr в пятнах крови и выделений. Более того, как мы уже отмечали выше, эта задача является одной из наиболее актуальных задач практической судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, поскольку введение в практику экспертиз выявления резус-антигенов Rh-Hr, (в том числе и с исследованием резус-фенотипов), позволит почти на треть (на 28%) повысить дифференцирующие возможности экспертизы объектов биологического происхождения.