Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Посттравматическая пластичность мотонейронов

На правах рукописи

ИСЛАМОВ Рустем Робертович

ПОСТТРАВМАТИЧЕСКАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ МОТОНЕЙРОНОВ

14.00.16. — патологическая физиология 03.00.25. — гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Казань - 2004

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования Казанском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения РФ и Университете Восточной Каролины (США)

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Челышев Юрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Миннибаев Марсель Миргаязович; чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Лнтвицкин Пётр Францевич; чл.-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Швалёв Вадим Николаевич.

Ведущее учреждение. Российский государственный медицинский

университет

Защита диссертации состоится « / » 2004 г. в ч

на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 пр»ГГОУ ВПО Казанском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения РФ по адресу: 420012 Казань, ул. Бутлерова, д. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО Казанского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения РФ (Бутлерова, 49«б»),

Автореферат разослан 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.П. Киясов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из фундаментальных свойств организма является восстановление утраченной или повреждённой структуры. Эффективность регенерации определяется характером популяций клеток (эмбриональная, статическая, растущая, обновляющаяся). В статической популяции особое место занимают нейроны (Leblond, 1964). Начиная с работ Сантьяго Рамон-и-Кахаля, приложившего клеточную теорию к нервной ткани (Cajal, 1909-1911), проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литературе резонирует пророческое высказывание Кахаля: «...в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно! Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, законченное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило» (Cajal, 1928).

Проблема регенерации в нервной ткани имеет не только теоретическое значение. Её актуальность для практической медицины представляется очевидной. При этом особую важность приобретает изучение регенерации периферического нерва. Дегенерация аксонов в периферических нервах может быть вызвана травмами опорно-двигательного аппарата, токсическими воздействиями, дефектами образования миелина, нарушениями аксонного транспорта, гипоксией и многими другими факторами. В реальной клинической ситуации наиболее часто встречаются травматические повреждения периферических нервных стволов, сопутствующие производственному, транспортному, спортивному и бытовому травматизму. Нарушение анатомической целостности нервного ствола приводит к полному выпадению функции нерва. Повреждения отростков двигательных и чувствительных нейронов вызывают паралич иннервируемых мышц и анестезию, а дегенерация аксонов вегетативных нейронов сопровождается сосудодвигательными расстройствами. При значительном расхождении центрального и периферического отрезков повреждённого нерва хаотично растущие нервные волокна на конце центрального отрезка образуют ампутационную неврому, которая препятствует реиннерва-ции органов-мишеней, в результате чего наступают атрофия скелетных мышц, дегенеративные изменения суставов, остеопороз. Необходимость более глубокого и всестороннего изучения механизмов регенерации периферического нерва обусловлена не только медицинскими запросами, но и имеет огромное социальное значение, поскольку реабилитация больных с посттравматическими повреждениями нерва до сих пор остаётся неразрешённой проблемой.

Важным аспектом посттравматической регенерации периферического нерва является изучение механизмов модуляции пластичности фенотипа регенерирующих мотонейронов. Пластичность, с одной стороны, отражает вариабельность генетически детерминированных признаков, а с другой — характер (созидательный или разрушительный) внутриклеточных При этом

можно надеяться, что выяснение роли конкретных сигнальных каскадов в поддержании регенерации на клеточном уровне позволит разработать механизмы модуляция пластичности нейронов. На самом деле суть проблемы значительно глубже, речь идёт о (1) вызванной активности конкретного спектра генов в аксотомирован-ных мотонейронах, (2) функциональной значимости активированных генов и (3) факторах, регулирующих активность функционально значимых генов.

Информационные межклеточные взаимодействия в системе «мотонейрон-скелетная мышца» модулируют активность разнообразных генов, контролирующих фенотипические признаки обоих клеточных партнёров. Травма периферического нерва прерывает регуляторные отношения между мотонейронами и скелетной мышцей. В денервированной мышце развивается постденервационный синдром (Полетаев, 1980; Shackelford and Lebherz, 1981; Волков, 1982; Bayline, Khoo et al., 1998). При этом в силу пластичности фенотипа скелетная мышца изменяет чувствительность к гуморальным факторам (Улумбеков, 1980; Резвяков, 1982; Вали-уллин, 1996). Поэтому — в рамках проблемы реиннервации скелетной мышцы — особое значение приобретает вопрос о факторах, модулирующих фенотипические признаки мышечных волокон в условиях денервации. Однако восстановление координированных функций в системе «мотонейрон-скелетная мышца» в первую очередь зависит от пластичности мотонейронов. Спектр транскрибируемых генов в аксотомированных мотонейронах во многом повторяет таковой в ходе нейроон-тогенеза и характеризуется повышенной активностью генов, контролирующих навигацию и рост аксонов, восстановление нервно-мышечного контакта (Purves and Lichtman, 1983). Вместе с тем пластические изменения фенотипа мотонейронов в условиях аксотомии изучены недостаточно. Не выяснены границы вариабельности генетически детерминированных признаков. Неизвестно, активность каких ещё генов регулирует процессы внутриклеточной регенерации. Не изучены временные характеристики активности генов.

Систематические исследования в этом направлении выявили спектр генов (гомеиозисных, факторов транскрипции, рецепторов факторов роста, протеин ки-наз, антиапоптозных и многих других), ориентированных на внутриклеточную регенерацию (Kaiser, Nisenbaum et al., 2003; Resnick, Schmitt et al., 2004). При этом функциональная значимость ряда генов, активированных в ходе регенерации мотонейронов, остаётся неизученной. Неизвестно, насколько закономерна активация этих генов в аксотомированных мотонейронах и в каких внутриклеточных каскадах участвуют продукты их экспрессии. В рамках этого вопроса особый интерес представляет исследование экспрессии рецепторов сигнальных молекул, регулирующих ангиогенез, — сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и эн-дотелинов. Нервы и сосуды формируют ветвящуюся сеть, согласованно продвигаясь единым маршрутом в раннем онтогенезе (Shima and Mailhos, 2000). Известно, что усиление экспрессии VEGF играет важную роль не только в росте сосудов, но и в навигации аксонов (Miao, Soker et al., 1999). Синтез VEGF в гладкомышечных клетках сосудов стимулируют эндотелины (Kozawa, Kawamura et al., 2000). При-

чём эндотелиновая система per se имеет выраженную нейропротекторную функцию (Yagami, Ueda et al., 2002). Следовательно, в нервной ткани роль ангиогенных факторов заключается не только в обеспечении роста сосудов и доставки к нервным клеткам кислорода и питательных веществ—сигнальные молекулы ангио-генеза дополнительно функционируют как нейротрофические факторы (Ehrenreich, Nau et al., 2000; Oosthuyse, Moons et al., 2001). Вместе с тем до сих пор неясны механизмы нейропротекторной функции этих молекул, поэтому выяснение характера экспрессии рецепторов VEGF и эндотелннов в мотонейронах представляется перспективным для исследования механизмов выживания нейронов в условиях ак-сотомии.

Другой важный вопрос в понимании механизмов модуляции фенотипа аксото-мированных мотонейронов касается возможности направленной стимуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, обеспечивающих регенерацию аксонов. Навигация и рост регенерирующих аксонов на большие расстояния (более 1 м у человека) регулируются разнообразными сигнальными молекулами (Челышев, 1995). Нейро-трофические факторы, факторы роста, цитокины, молекулы адгезии и межклеточного матрикса, обеспечивающие элонгацию аксона, продуцируются шванновскими клетками (Zochodne and Cheng, 2000; Kubo, Yamashita et al., 2002), скелетными мышечными волокнами (Sakuma, Watanabe et al., 2001), макрофагами (Shamash, Reichert et al., 2002) и фнбробластами (Pu, Zhuang et al., 1999). Однако не существует однозначного и, тем более, исчерпывающего ответа на вопрос, какие из этих факторов могут быть рекомендованы для стимуляции регенерации периферического нерва в практической медицине. Неясно также влияние гуморальной системы на аксотоми-рованные мотонейроны. Важность изучения влияния гормонов на регенерацию мотонейронов обусловлена их способностью оказывать регуляторное влияние на уровне как спинного мозга, так и периферического нерва (Jones, Brown et al., 2001; Storer, Houle et al., 2002; Fiore, Inman et al., 2004). На наш взгляд, в этом плане значительный интерес представляют стероидные гормоны — эстрогены.

Биологическое влияние эстрогенов в организме млекопитающих не ограничивается эффектами на клетки-мишени в органах репродуктивной системы. Согласно современным представлениям, функциональное значение эстрогенов выходит за рамки «женских половых гормонов» (Allen and Doisy, 1983). Многочисленные исследования установили высокую значимость эстрогенов для развития и функционирования мозга (Lee and McEwen, 2001). Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферических нервов представляется перспективной по нескольким причинам. Эстрогены — ключевые гормоны при тканевой регенерации в органах женской половой системы. Вместе с тем, эффект эстрогенов на регенерацию распространяется и на другие системы, в частности на нервную ткань (McEwen and Alves, 1999). Липофильные гормоны свободно проникают через плазматическую мембрану нейронов, изменяя режим функционирования клетки через классический и/или альтернативный механизм (Watson and Gametchu, 1999). Показано, что эстрогены проявляют нейропротекторные свойства при ишемии и травмах

головного мозга (Behl, 2001). Заместительная терапия эстрогенами у женщин постклимактерического периода предупреждает развитие болезни Альцхаймера (Slooter, Bronzova et а1., 1999) и способствует частичной коррекции двигательных расстройств при болезни Паркинсона (Тза^, Но et а1., 2000) В этой связи необходимо отметить, что экспрессия эстрогеновых рецепторов документирована не для всех нейронов ЦНС, в частности, не установлен факт их экспрессии в мотонейронах спинного мозга Поэтому до сих пор не известны эффекты эстрогенов на регенерацию периферического нерва. Не исследованы также механизмы нейропротекторного действия эстрогенов при аксотомии мотонейронов.

Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферического нерва имеет важное значение не только для выяснения механизмов действия эстрогенов на внутриклеточные восстановительные процессы, но и для клинического применения гормонов. Однако, вследствие того, что эстрогены активируют пролиферацию эпителиальных клеток молочных желез и матки, применение эстрогенов может быть крайне ограничено В то же время работами последних лет было показано, что синтетические фармакологические вещества, селективно ингибирующие рецепторы эстрогенов в тканях репродуктивных органов, обладают нейропротекторными свойствами эстрогенов (вгапёЬо18, Мойззейе et а1., 2000; СаШег, Мойззейе et а1, 2001). При этом влияние этих препаратов на регенерацию периферического нерва не изучено.

Анализ состояния проблемы регенерации периферического нерва на сегодняшний день свидетельствует об актуальности исследования посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов. Выяснение механизмов регуляции активности конкретного спектра генов в денервированной скелетной мышце и регенерирующих мотонейронах является основой в исследованиях направленной стимуляции регенерации периферических нервов и восстановления функции скелетных мышцу человека.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является анализ механизмов регуляции посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов спинного мозга и скелетных мышц в условиях повреждения периферического нерва и фармакологических воздействий на его регенерацию. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: ' 1. В аксотомированных мотонейронах спинного мозга мышей изучить экспрессию:

а) рецепторов эстрогенов

б) УБвР и его рецепторов Р1к-1 и РИ-1;

в) рецепторов эндотелинов ЕТА и ЕТВ.

2. Исследовать влияние 17р-эстрадиола и селективного модулятора эстрогеновых рецепторов аналога ралоксифена ЬУ117018 на регенерацию седалищного нерва у мышей.

3. Выяснить механизмы действия агонистов рецепторов эстрогенов на внутриклеточную регенерацию мотонейронов спинного мозга у мышей после повреждения седалищного нерва.

4. Изучить экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга мышей после повреждения седалищного нерва на фоне воздействия 17Р-эстрадиола.

5. Изучить влияние 17(5-эстрадиола на ретроградный аксонный транспорт и внутриаксонный синтез белка в мотонейронах спинного мозга у мышей.

6. Изучить влияние железотранспортирующего белка трансферрина и ионов трёхвалентного железа на фенотипические признаки медленной камбаловидной мышцы крысы и морской свинки в условиях денервации и блокады аксонного транспорта.

7. Исследовать влияние одностороннего повреждения седалищного нерва на пластичность фенотипов медленной камбаловидной и быстрой червеобразной мышц в опытной и контралатеральной конечностях у крыс.

Научная новизна

В работе охарактеризована активность генов в спинном мозге мышей после передавливания седалищного нерва и выявлена роль эстрогенов в регенерации периферических нервов. Все приведённые в этом разделе основные научные результаты получены впервые. После передавливания седалищного нерва у мышей 17Р-эст-радиол и аналог ралоксифена ЕУ117018 ускоряют рост и созревание нервных волокон, что приводит к более ранней реиннервации скелетных мышц. Методами имму-ногистохимии, иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции получены доказательства экспрессии рецепторов эстрогенов в мотонейронах спинного мозга. Аксотомия существенно увеличивает продукцию обеих изоформ рецепторов эстрогенов в спинном мозге. При этом рецепторы эстрогенов перемещаются в составе антероградного аксонного транспорта и аккумулируются в регенерирующих нервных волокнах. Выявлены геномный и негеномный механизмы действия эстрогенов на аксотомированные мотонейроны. Через геномный механизм 17р-эстрадиол активирует транскрипцию генов-регуляторов клеточной пролиферации, роста, дифферен-цировки, апоптоза. По альтернативному негеномному механизму эстрогены путём активации протеин киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), усиливают ретроградный аксонный транспорт и поддерживают синтез белка в аксоплазме.

Установлено облигатное участие рецепторов VEGF и эндотелинов в регенерации мотонейронов. В мотонейронах спинного мозга выявлена ядерная локализация рецептора УЕСБ (Р1г-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ). В аксотомирован-ных мотонейронах показано усиление экспрессии VEGF, его рецептора РН-1 и рецептора эндотелинов ЕТВ как на уровне гена, так и белка. Обнаружено, что 17Р-эстрадиол потенцирует экспрессию VEGF в аксотомированных мотонейронах.

Исследование внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции показало, что короткая интерферирующая РНК, апплицированная на центральный отрезок периферического нерва, может быть трансфецирована в аксоплазму мотонейронов. Интерферирующая РНК, комплементарная мРНК нейрональной формы Р-тубулина, локально ингибирует трансляцию белка в аксоплазме, что приводит к структурным повреждениям микротр) бочек и нарушению аксонного транспорта в мотонейронах спинного мозга.

В условиях повреждения седалищного нерва показано, что влияние гуморальных факторов на фенотип мышцы обусловлено характером повреждения нерва. В медленной камбаловидной мышце железотранспортирующий белок трансферрин при перерезке нерва (блокада проведения импульсов и аксонного транспорта) увеличивает экспрессию медленного миозина, а при аппликации колхицина на нерв (блокада аксонного транспорта) — быстрого. Одностороннее повреждение седалищного нерва вызывает изменение фенотипа скелетных мышц не только в опытной конечности, но и в контралатеральной. В быстрой червеобразной и медленной камбаловидной мышцах контралатеральной конечности увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

Положения, выносимые на защиту

1. Усиление экспрессии генов рецепторов эстрогенов (а И Р), рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста и рецептора эндотелинов (ЕТВ) в мотонейронах спинного мозга поддерживает регенерацию двигательных нервных волокон и восстановление функций в системе «мотонейрон-скелетная мышца».

2. Агонисты рецепторов эстрогенов стимулируют регенерацию мотонейронов через геномный и негеномный сигнальные пути. Альтернативный негеномный путь реализуется за счёт активации ERK-зависимого внутриклеточного сигнального каскада.

Научно-практическая ценность

Теоретическое значение результатов проведённых исследований определяется раскрытыми закономерностями пластичности фенотипов клеточных партнёров в системе «мотонейрон-скелетная мышца» в условиях повреждения периферического нерва. Анализ экспрессии 1176 генов в поясничном отделе спинного мозга после передавливания седалищного нерва представляет интерес для понимания патогенеза нейродегенератпвных процессов в спинном мозге. Выявленный спектр активированных генов в аксотомированных мотонейронах дополняет существующее представление о механизмах внутриклеточной регенерации. Данные о пластичности фенотипа скелетных мышц в денервированной и контралатеральной конечностях следует учитывать при выяснении компенсаторных механизмов, способствующих выживанию скелетной мышцы до восстановления иннервации, и могут быть использованы для разработки методов коррекции фенотипических изменений в денервированных скелетных мышцах в практической медицине.

В работе сформулировано представление о механизме стимулирующего влияния эстрогенов на регенерацию нервной ткани. Выявленный положительный эффект 17Р-эстрадиола и селективного модулятора рецепторов эстрогенов аналога ралоксифена ЬУ117018 на регенерацию периферического нерва и восстановление функции денервированных скелетных мышц имеет прикладное значение в клинике нервных болезней. Выяснение механизмов действия агонистов эстрогеновых рецепторов на аксотомированные мотонейроны позволяет расширить существую-

щие представления о нейропротекторной функции эстрогенов при ишемии, травмах и возрастных изменениях ЦНС. Выяснение механизмов перекрёстного взаимодействия эстрогенов с сигнальными каскадами сосудистого эндотелиального фактора роста и эндотелинов открывает новые перспективы для направленной стимуляции регенерации периферического нерва.

Результаты исследования внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции имеют общебиологическое значение. Полученные доказательства высокоселективной посттранскрипционной блокады трансляции белка в аксонах мотонейронов спинного мозга с помощью короткой интерферирующей РНК in vivo могут найти применение в генной терапии.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989), Всесоюзном симпозиуме «Структурно-энергетическое обеспечение механической работы мышц» (Москва, 1990), Международной конференции «Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований» (Москва, 1990), VI Всесоюзном симпозиуме «Физиология медиаторов. Периферический синапс» (Казань, 1991), Обществе анатомов (Марбург, 1994), II Республиканской научной конференции молодых учёных и специалистов (Казань, 1996), Конференции анатомов, гистологов и эмбриологов «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных» (Казань, 1997), V Всероссийской школе молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1998), VI Европейском конгрессе по невропатологии (Барселона, 1999), Международном конгрессе по миологии (Ницца, 2000), Международной конференции «Физиология мышечной деятельности» (Москва, 2000), XVIII Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001), Международном симпозиуме «Нейробиология развития» (Сидней, 2001), V, VI, VII Симпозиумах по нейро-биологическим исследованиям в Университете Восточной Каролины (Гринвилл, 2001, 2002, 2003), Международных конгрессах «Экспериментальная биология» (Новый Орлеан, 2002; Сан-Диего, 2003; Вашингтон, 2004), 32-м, 33-м Съездах общества нейробиологов (Орландо, 2002; Новый Орлеан, 2003), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино на Оке, 2004), XIX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), расширенном заседании общества патофизиологов г. Казани (Казань, 2004), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004).

Реализация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ (статьи — 11, тезисов — 34). Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов Казанского государственного медицинского университета по патофизиологии, гистологии, анатомии и физиологии. Результаты исследования положены в основу

разработки перспективы клинического применения селективных модуляторов рецепторов эстрогенов при лечении ишемических повреждений периферического нерва и стимуляции посттравматической регенерации аксонов в Научно-исследовательском центре Татарстана «Восстановительная травматологии и ортопедия».

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, изложения материалов и методов исследования, б глав результатов исследований, общего заключения с выводами, указателя литературы. Каждая глава результатов исследования включает обзор литературы, описание экспериментальных данных, обсуждение и заключение. Диссертация изложена на 191 страницах, содержит 11 таблиц, 67 иллюстраций. Список литературы включает 304 источника на русском и английском языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на половозрелых лабораторных животных: белых беспородных крысах-самцах, п=68 (Институт органической химии им. А.Е. Арбузова Казанского филиала РАН), морских свинках-самцах, п=27 (КНИИЭМ), белых ICR мышах обоего пола, n=308 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Камбало-видную и червеобразную мышцы крыс и морских свинок изучали после повреждения седалищного нерва путем перерезки, передавливания или аппликации на нерв раствора колхицина. У мышей изучены седалищный нерв и поясничный отдел спинного мозга после перерезки или передавливания седалищного нерва. У мышей-самок в конце эксперимента собирали кровь для радиоиммунологического анализа. Обработку данных проводили по t-критерию Стьюдента и с помощью теста множественного сравнения (One-Way ANOVA Newman-Keuls). Опыты на животных, выполненные в Казанском государственном медицинском университете, соответствуют приказу Министерства Здравоохранения СССР (12 августа 1977 г. №755) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Протоколы опытов на мышах в Университете Восточной Каролины (США) утверждены Комитетом по охране и использованию экспериментальных животных.

Изучение регенерации периферического нерва мыши Фармакологические воздействия. Эстрогеновые капсулы, содержащие 24 мкг 17р-эстрадиола (Sigma) в сезамовом масле, имплантировали подкожно через 1 неделю после билатеральной овариэктомии. Для приготовления капсул использовали силиконовую трубку длиной 15 мм и внутренним диаметром 1,55 мм. Селективные модуляторы рецепторов эстрогенов — тамоксифен (Sigma) и аналог ралоксифена LY117018 (любезно предоставленный фармацевтической компанией Eli Lilly) — инъецировали овариэктомированным мышам в течение 3 недель после передавливания седалищного нерва. Тамоксифен вводили ежедневно внутри-брюшинно (1 мг/кг веса) (Sato, Rippy et al., 1996). LYU7018 вводили подкожно (3 мг/кг) 5 раз в неделю (Li, Takahashi et al., 1998).

Поведенческий тест. Эффективность регенерации периферического нерва оценивали с помощью функционального индекса седалищного нерва (8Р1), отражающего степень восстановления функции скелетных мышц денервированной конечности. 8И вычисляли по формуле 1шегга й а1., (1998) (рис. 1) на основании измерений длины и ширины отпечатков стоп оперированной и здоровой конечности. Поведенческий тест был проведён при воздействии на регенерацию передавленного седалищного нерва 17(3-эстрадиола на 16 мышах (п=8 в контрольной и подопытной группах), тамоксифена— на 10 мышах (п=5 в контрольной и подопытной группах) и аналога ралоксифена ЬУ117018 — на 20 мышах (п=10 в контрольной и подопытной группах).

Рис. 1. Формула для расчёта SFI. ETS — Experimental Toe Spread — расстояние между первым и пятым пальцами в эксперименте, NTS — Normal Toe Spread —расстояние между первым и пятым пальцами в норме, EPL — Experimental Paw Length — длина стопы в эксперименте, NPL — Normal Paw Length — длина стопы в норме.

Полутонкне срезы седалищного нерва мыши готовили в соответствии с общепринятым протоколом (Sato, Shamoto et al., 1970). В большеберцовом пучке {fasciculus tibialis) подсчитывали количество регенерирующих миелиновых волокон и измеряли площадь аксонов в программе ImageJ (NIH). Морфометрический анализ регенерации седалищного нерва проводили после его передавливания на 7-е, 14-е (п=3 в контрольной и подопытной группах) и 21-е (п=6) сутки при воздействии 17р-эстрадиола и на 7-е, 14-е (п=5 в контрольной и подопытной группах) и 21-е сутки (п=10) на фоне введения аналога ралоксифена LY117018.

Исследование экспрессии генов в спинном мозге мыши Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) выполнена с помощью диагностического набора SuperScriptTM One-Step RT-PCR в присутствии Platinum® Taq (Invitrogen, Life Technologies, CA). В спинном мозге изучена экспрессия рецепторов эстрогенов а и Р (ERa и ERP). Суммарную РНК выделяли из поясничного отдела спинного мозга на 4-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после передавливания седалищного нерва у подопытных мышей с имплантированными эстрогеновыми капсулами и контрольных (плацебо) животных (п=3 на каждом сроке в каждой группе).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени выполнена с помощью диагностического набора Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScriptTM One-Step System в присутствии Platinum® Taq (Invitrogen, Life Technologies, С А). У овариэкто-мированных мышей, подопытных (с имплантированными эстрогеновыми капсула-

Таблица. 1. Мышиные ген-специфичные праймеры

Ген-мишень Нуклеотидная последовательность смысловой (С) и антпсмысловой (А) нитей Размер продукта амплификации • (П.Н.)

VEGF С: 5-CTCTACCTCCACCATGCCAAG-3' • 600

A: 5'-GGTACTCCTGGAGGATGTCCACC-3'

FIt-1/VEGFR-l С: 5'-TGGAAGGAGGCGAGGATTACAGTGAGA-3' 453

A: 5'-GGTAGATTTCAGGTGTGGCATACTCTGGTG-3'

Flk-l/VEGFR-2 С: S'-GTACTCCAGCGACGAGGCAGGACTTTTA-S' 445

A: 5'-TTTTATCCAGTTTCACAGAGGGCTCCATTG-3'

GAPDH С: 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3' 195

А: 5-5'-ТСССТСAAGATTGTCAGCАА-3'

ЕТд С: 5,-CGAGGTCATGAGGCTПTGG-3, 787

А: 5'-GTGTTTAAGCTGTTGGCGGG-3'

ЕТВ С: 5 '-TGCACACCTTTCCGCAAGCACG-3 ' 919

А: 5*-AGCTGGTGCCCTTC ATACAGAAGGC-3'

ERa С : 5 '-GGC-TGG-AG A-TTC-TG A-TG A-TTG-G-3 ' 608

A: 5'-GGG-TAT-GTA-GTA-GGT-TrG-TAA-GG-3'

ERP (351) С: 5 '-CTA-TGA-CАТ-ТСТ-ACA-GTC-C-3 * 351

А: 5 '-GTA-ATG-AT А-ССС-AG A-GC А-3 *

ERP (507) С: 5 '-CTT-GCC-TGT-AAA-CAG-AG A-GAC-C-3 ' 507

А: 5 '-GAC-GGC-TCA-CTA-GCA-CAT-TGG-3 '

Примечания: GAPDH — Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase — глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа; п.н. — пара нуклеотидов.

ми, п=6) и контрольных (плацебо, n=6), изучали экспрессию ERct и ER0 через 1 неделю после повреждения нерва. У мышей-самцов изучали экспрессию VEGF, рецепторов VEGF(FIt-l/VEGFR-l и Flk-l/VEGFR-2), рецепторов эндотелинов (ЕТА и ЕТВ) на 4-е сутки после повреждения нерва. Активность генов-мишеней оценивали по результатам трёх независимых экспериментов (n=4 в каждом). Список генов-мишеней и последовательность праймеров представлены в табл. 1.

Матричная гибридизация комплементарной ДНК. На матрицах, содержащих 1176 ДНК-проб (Atlas Mouse 1.2 Array, Clontech, CA), изучено влияние 17р-эстрадиола на экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга мышей на 4-е сутки после передавливания седалищного нерва. Для синтеза комплементарной ДНК было использовано по 40 мкг суммарной РНК, выделенной из спинного мозга подопытных (с имплантированными эстрогеновыми капсулами, n=10) и контрольных (плацебо, n=10) мышей.

Иммуногистохимня и нммуноблотннг в исследованиях спинного мозга и седалищного нерва мыши Иммуногистохимическое исследование выполнено непрямым иммунопероксидазным методом согласно общепринятым протоколам (Полак и Ван Норден, 1987). На продольных срезах седалищных нервов выявляли ЕЛа и ЕЯр, фосфо-ЕЯК, неГфональную форму р-тубулина, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР-2). На поперечных срезах спинного мозга — ЕЯа и ЕЯР, УЕСР, рецепторы УЕвР (Рк-1 и Р1к-1), рецепторы эндотелинов (ЕТА и ЕТВ), фосфо-ЕЯК, белок теплового шока с молекулярной массой 25 кД (Нзр25). Антитела (АТ), использованные в иммуногистохимии, перечислены в табл. 2.

Таблица. 2. Антитела, применённые в нммуногнстохимнческнх методах

Антиген Антитела Разведение Производитель

Fast МНС Мышь, MOHO 1:400 Sigma

Fast МНС Мышь, moho 1:200 Novocastra

Slow МНС Мышь, моно 1:200 Novocastra

ERct Кролик, поли 1:2000 Upstate Biotechnology

ERp Кролик, поли 1:200 Upstate Biotechnology

ERß Кролик, поли 1:800 Chemicon

Hsp25 Кролик, поли 1:5000 StressGen Biotechnology

VEGF Кролик, поли 1:400 Santa Cruz Biotechnology

Flt-l/VEGFR-1 Кролик, поли 1:400 Santa Cruz Biotechnology

Flk-1/VEGFR-2 Кролик, поли 1:400 Santa Cruz Biotechnology

TuJl Мышь, моно 1:2000 Cell Signaling

ETa Кролик, поли 1:150 Alomone labs

ETb Кролик, поли 1:150 Alomone labs

Фосфо-р44/р42 Кролик, поли 1:200 Cell Signaling

MAP-2 Мышь, моно 1:2000 Sigma

Примечания: моно — моноклональные AT; поли — поликлональные AT; Fast МНС —тя> жёлые цепи быстрого миозина; Slow МНС —тяжёлые цепи медленного миозина; TuJl — AT против нейрональной формы Р-тубулина; фосфо-р44/р42 —фосфо-ЕЯК1/2.

Методом иммуноблотинга (Western-blot) определяли количественное содержание белка-мишени в поясничном отделе спинного мозга и седалищном нерве после передавл и вания нерва у мышей (табл. 3). В белковых экстрактах из спинного мозга выявляли VEGF, его рецепторы (Flt-1 и Flk-1), рецепторы эндотелинов (ЕТЛ и ЕТВ). В белковых экстрактах из седалищного нерва идентифицировали рецепторы эстрогенов (ERct и ERP), Hsp25, фосфо-ERK Иммунопреципитат визуализировали с помощью ECL+plus (Amersham, Life Science, UK), после чего мембраны экспонирова-

ли на рентгеновскую плёнку. Денситометрический анализ проводили в программе Kodak Digital Science ID Image Analysis (Eastman Kodak, Rochester, NY).

Таблица. З. Иммуноблотинг при различных экспериментальных условиях

Ткань Антнтела Иммуноблотинг

Спинной мозг на 4-й день после перелавливания седалищного нерва у мышей-самцов VEGF( 1:250), Flt-I (1:250), Flk-1 (1:250). ЕТА( 1:150), ETg (1:150) 2 независимых эксперимента(n=6в каждом), 4 иммуноблотинга

Спинной мозг на 4-й день после передавливания седалищного нерва у овариэктомированных мышей с эстрогсновыми капсулами VEGF (1:250) 1 эксперимент (п=6), 3 иммуноблотинга

Спинной мозг на 4-й день после передавливания седалищного нерва у овариэктомированных контрольных мышей VEGF( 1:250) 1 эксперимент (п=6), 3 иммуноблотинга

Седалищный нерв на 7-й день после передавливания у овариэктомированных мышей с эстрогеновыми капсулами ERa (1:5000), ERp (1:2000), Hsp25 (1:2000), фосфо-p44/p42 (1:1000) 1 эксперимент (п=5), 3 иммуноблотинга '

Седалищный нерв на 7-й день после передавливания у овариэктомированных контрольных мышей ERa (1:5000), ERP (1:2000), Hsp25 (1:2000), фосфо-p44/p42 (1:1000) 1 эксперимент (п=5), 3 иммуноблотинга

Исследование ретроградного аксонного транспорта у мыши

На модели ретроградного транспорта флюоресцентного маркёра нейронов Fluorogold изучены механизмы влияния 17Р-эстрадиола на аксонный транспорт в мотонейронах мыши. Правый седалищный нерв перерезали в средней трети бедра (до бифуркации) и на центральный отрезок нерва нанизывали силиконовую трубку длиной 7 мм. Трубку заполняли 7 мкл 5% Fluorogold, свободный дистальным конец запечатывали вазелином. Вместе с Fluorogold в трубку вводили 10 нМ 17Р эстрадиола (Sigma) (Singh, Setalo et al., 2000), IMKM LY117018 (Hisamoto, Ohmichi et al., 2001), 1 мкМ 1CI182,780 (Tocris) — антагониста рецепторов эстрогенов (Singh, Setalo et al., 2000), 30 мкМ SB203580 (Calbiochem) — ингибитора р38 (Davies, Reddy et al., 2000), 1 мкМ SP600125 (Calbiochem) — ингибитора JNK (киназа N-конца стресс активированного c-Jun) (Bennett, Sasaki et al., 2001), 100 мкМ U0126 (Cell Signaling) — ингибитора MEK/ERK каскада (Davies, Reddy et al., 2000), где МЕК — митоген активированная киназа ERK; 100 мкМ LY294002 (Calbiochem) — ингибитора PI 3-K (Shi, Jan etal., 2003); 10 мкг/мл циклогексимида — ингибитора синтеза белка (Sigma) (Ming, Worg et al., 2002); 7 мкл 100 нМ siRNA, комплементарной

мРНК нейронал ьной формыР-тубулина (Yu, DeRuiter et al., 2002) ил и 100 нМ контрольной siRNA, в которой 57% пар нуклеотидов приходится на пару «гуанин-цитозин» (Dharmacon). Через 24 часа после операции поясничный отдел спинного мозга готовили для морфометрического анализа. Серийные поперечные срезы спинного мозга (30 мкм) были исследованы в спектре широкополосного ультрафиолетового фильтра при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM 510 Confocal Laser Scanning Microscope). Fluorogold-позитивные мотонейроны подсчитывали в каждом срезе спинного мозга. Экспериментальные режимы и количество животных в исследованиях ретроградного аксонного транспорта представлены в табл. 4.

Таблица 4. Экспериментальные режимы и количество животных в исследованиях ретроградного аксонного транспорта

Характер воздействия на ретроградный транспорт флуоресцентного маркёра нейронов Fluorogold Количество животных

контрольная группа 10

системный 17р-эстрадиол 4

локальный 17Р-эстрадиол 4

ICI 182,780 3

ICI 182,780 +системный 17р-эстрадиол 4

ICI 182,780 + локальный 17Р-эстрадиол 3

аналог ралоксифена LY117018 3

ICI 182,780 + аналог ралоксифена LY117018 3

LY294002 3

SP600125 4

SB203580 4

U0126 4

U0I26 + локальный 17р-эстрадиол 4

U0126 + аналог ралоксифена L Y117018 3

циклогексимид 4

циклогексичид + локальный 17р-эстрадиол 4

контрольная siRNA 5

siRNA, комплементарная мРНК нейроналыюй формы р-т>булина 7

Радиоавтографические методы Радиоиммунологический метод определения концентрации 173-эстради-ола в сыворотке крови. Кровь для анализа собирали у овариэктомированных подопытных (с имплантированными эстрогеновыми капсулами) и контрольных (плацебо) мышей на 4-е, 7-е, 14-е (п=3 в каждой группе) и 21-е (п=6 в каждой группе) сутки после передавливания седалищного нерва. Концентрацию !7Р-эстрадиола измеряли у каждого животного в отдельности с помощью радиоиммунологической системы Estradiol Coat-A-Count (Diagnostic Products Corporation; Los Angeles, CA).

Радиоавтографическин метод выявления 17(3-эстрадиола в нервной ткани. У интактных мышей-самок (п=2) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва нанизывали силиконовую трубку, в которую вводили 1 мкл 10 нМ 3Н-17Р-эстрадиола (ПО Ки/Мм) (PerkinElmer Life Science, Inc., Boston, MA). Радиоактивность в седалищном нерве и спинном мозге у каждого животного измеряли в отдельности с помощью анализатора TRI-CARB 21OOTR (Packard).

Исследование фенотипа скелетной мышцы крысы и морской свинки Камбаловидные (медленные) и червеобразные (быстрые) мышцы изучали после: (1) иссечения фрагмента седалищного нерва, (2) передавливания нерва и (3) аппликации на нерв колхицина (табл. 5). В условиях перерезки седалищного нерва или

Таблица. 5. Типирование камбаловидной (КМ) и червеобразной (ЧМ) мышц крысы и морской свинки

Экспериментальные условия АТФаза Пммуногистохимия

КМ км 4M

Интактная мышца (крыса) п=10 п=3 п=3

Перерезка седалищного нерва (крыса) п=10 п=5 п=6

Передавливание седалищного нерва (крыса) п=5 п=6

Перерезка седалищного нерва + РеС13 (крыса) п=10

Перерезка седалищного нерва + трансферрин (крыса) п=10

Интактная мышца (морская свинка) п=3 п=3

Перерезка седалищного нерва (морская свинка) п=6 п=6

Аппликация колхицина на седалищный нерв (морская свинка) п=6 п=6

Интактная мышца + трансферрин (морская свинка) п~6

Аппликация колхицина на седалищный нерв + трансферрин (морская свинка) п=6

блокады аксонного транспорта подопытным животным ежедневно в течение 3 недель внутрибрюшинно вводили 10"* М FeClj (Hasegava, Saito et al., 1981) или внутримышечно в оперированную лапу — 0,5 мг/кг веса трансферрин (Sigma) (Wada, Ueno et ah, 1983).

Выявление активности АТФазы миозина проводили на поперечных срезах мышц толщиной 10 мкм по методу Guth and Samaha (1970).

Иммуногистохимическим методом-на поперечных срезах мышц толщиной 10 мкм выявляли быстрые и медленные мышечные волокна. Камбаловидные и подошвенные мышцы типировали с AT против тяжёлых цепей быстрого миозина, а червеобразные — с AT против тяжёлых цепей медленного миозина (см. табл. 2).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние агонистов рецепторов эстрогенов на посттравматнческую регенерацию периферического нерва

Нейропротекторное действие эстрогенов считается доказанным (Behl, 2001; Lee and McEwen, 2001; McEwen, 2001). Эстрогены поддерживают выживание нейронов in vitro (Toran-Allerand, Ellis et al., 1988; Green, Bishop et al., 1997; Nakamizo, Urushitani et al., 2000) и in vivo (Cardona-Gomez, Mendez et al., 2001; Wise, Dubai et al., 2001). При возрастных изменениях в ЦНС, ишемических и травматических повреждениях мозга эстрогены проявляют свойства нейротрофических факторов (Lee and McEwen, 2001). Однако, несмотря на то, что нейропротекция включает в себя не только выживание, но и регенерацию, эффекты эстрогенов на восстановление повреждённой структуры нейронов остаются малоизученным и. В данном разделе работы получены экспериментальные подтверждения гипотезы о нейропро-текторном действии агонистов рецепторов эстрогенов при регенерации аксотоми-рованных мотонейронов.

Влияние 17Р-эстрадиола на регенерацию седалищного нерва у овариэк-томированных мышей. После передавливания седалищного нерва у овариэкто-мированных мышей нами изучено влияние экзогенного 17Р-эстрадиола на: (1) ги-стоморфологические характеристики регенерирующих нервных волокон, (2) функциональное восстановление скелетных мышц и (3) иммуноэкспрессию Hsp25 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга. В целях нивелирования циклических изменений в крови уровня эндогенных эстрогенов за 2 недели до передав-ливаиия седалищного нерва мышам проводили билатеральную овариэктомию. Через неделю после овариэктомии силиконовые капсулы, содержащие -эстрадиол (24 мкг) или сезамовое масло, имплантировали подкожно подопытным и контрольным мышам соответственно. На 7-е сутки после имплантации капсул у животных в обеих группах передавливали правый седалищный нерв.

В течение 3 недель регенерации седалищного нерва концентрация 17Р-эстра-диола в крови у подопытных животных была существенно выше, чем у контрольных мышей (рис. 2). Анализ восстановления функционального индекса седалищного

нерва (8Н) показал, что реиннервация скелетных мышц у мышей, получавших 17Р-эстрадиол, наступала на 1 неделю раньше, чем в контроле (рис. 3). Гистоморфо-логическое исследование большеберцового пучка седалищного нерва подтвердило данные поведенческого теста. У подопытных мышей через 1 неделю после повреждения нерва общее количество регенерирующих нервных волокон было существенно больше, чем в контроле, а через 3 недели средняя площадь поперечного сечения аксонов достигала уровня ложнооперированных животных (рис. 4). Иммуногисто-химическое исследование, выполненное с АТ против Нр25 на поперечных срезах поясничного отдела спинного мозга, обнаружило повышенную иммунореактивность мотонейронов на оперированной стороне в обеих группах животных на 4-е, 7-е и 14-е сутки. Через 3 недели интенсивность иммунногисгохимической реакции у мышей, получавших 17 Р-эстрадиол, на оперированной и контралатералыюй сторонах была одинаковой и напоминала иммуноэкспрессию Нр25 у интактных животных. В то же время, у плацебо-мышей на оперированной стороне сохранялась повышенная иммунореактивность мотонейронов.

Влияние селективных модуляторов рецепторов эстрогенов на регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей. Исходя из полученных нами результатов, свидетельствующих о потенцирующем влиянии 17 Р-эстра-диола на регенерацию седалищного нерва у мышей, мы решили проверить возможность селективных модуляторов рецепторов эстрогенов (БЕКМ) имитировать

Рис. 4. Влияние 17Р-эстрадаола на количество (Л) и среднюю площадь поперечного сечения аксонов (Б) регенерирующих миелиновых волокон в большеберцовом пучке седалищного нерва. Чёрный столбик —ложноопериро-ванные мыши (п=3); белый столбик—контрольные мыши; серый столбик—мыши, получавшие 17Р-эстрадиол (п=3 на 7-е и 14-е сутки; п=6 на 21-е сутки в каждой группе). * — р<0,05.

положительный эффект эстрогенов на регенерацию периферических нервов. У овариэктомированных мышей нами исследовано влияние SERM (тамоксифена и аналога ралоксифена LY117018) на регенерацию седалищного нерва. С момента передавливания нерва подопытным мышам в течение 3 недель вводили тамокси-фен или ЬУ117018. Контрольные животные получали инъекции глицерола в эквивалентном объёме.

У мышей, получавших инъекции тамоксифена, и контрольных (плацебо) животных значения SFI на всех установленных сроках регенерации нерва практически не отличались. Однако LY117018 стимулировал реиннервацию скелетных мышц, и характер восстановления БИ напоминал таковой у мышей на фоне 17р-эстрадиола. Более того, анализ гистоморфологического исследования показал, что у мышей, получавших ЬУП7018, в течение первой недели регенерации нерва количество миелиновых волокон и площади поперечного сечения аксонов были значительно выше, чем у контрольных животных.

Сравнительный анализ влияния агонистов рецепторов эстрогенов на регенерацию седалищного нерва по эффективности действия выявил следующую закономерность: 17 р-эстрадиол > аналог ралоксифена LY117018 > тамоксифен. На фоне 17р -эстрадиола через 2 недели после передавливания нерва происходило полное восстановление функции скелетных мышц, а через 3 недели морфометрические данные регенерирующего нерва (количество миелиновых волокон и площадь поперечного сечения аксонов) приближались к значениям интактного седалищного нерва. Опережающий рост нервных волокон, зарегистрированный в первую неделю регенерации, отразился и на более раннем созревании аксонов у мышей, получавших

17р-эстрадиол. Эффект LY117018 не отличался от влияния 17р-эстрадиола на характер реиннервации скелетных мышц, однако был менее выраженным в отношении темпов роста и созревания нервных волокон. Тамоксифен на регенерацию седалищного нерва не влиял, что подтверждали данные по характеру восстановления SFI.

Таким образом, проведённые эксперименты свидетельствали о нейропротек-торном действии агонистов рецепторов эстрогенов на аксотомированные мотонейроны. 17 ß-эстрадиол и LY117018 снижали стрессовую реактивность мотонейронов после аксотомии, стимулировали рост и созревание регенерирующих аксонов, ускоряя тем самым восстановление функции скелетных мышц. Тот факт, что LY117018 обнаружил положительный эффект на регенерацию седалищного нерва, указывал, что данный препарат при регенерации в нервной системе действовал как агонист эстрогенов. Поскольку применение эстрогенов в клинической практике крайне ограничено, то, исходя из имеющихся сведений и полученных нами результатов, разработка концепции по применению агонистов рецепторов эстрогенов с целью стимуляции регенерации периферических нервов является перспективной для практической медицины.

Геномный механизм действия эстрогенов на мотонеГфоны спинного мозга при аксотомии

В нашем исследовании установлено, что 17 ß-эстрадиол существенно ускоряет регенерацию двигательных волокон седалищного нерва у овариэктомирован-ных мышей. Эффекты эстрогенов на клетки ЦНС реализуются через рецепторы эстрогенов по классическому геномному и/или альтернативному (геномному и негеномному) пути (Behl, 2001) (рис. 5 и рис. 7). В данном разделе работы рассматривается геномный механизм действия 17 ß-эстрадиола на аксотомированные мотонейроны поясничного отдела спинного мозга в ходе регенерации седалищного нерва. У овариэктомированных мышей с имплантированными эстрогеновыми капсулами (подопытных) и плацебо-капсулами (контрольных) на различных сроках после передавливания седалищного нерва исследованы экспрессия рецепторов эстрогенов в мотонейронах и влияние 17 ß-эстрадиола на активность генов в поясничном отделе спинного мозга.

Иммуноэкспрессия ERa Ii ERß в спинном мозге и седалищном нерве мыши. Иммуногистохимическим методом нами впервые выявлены ERa и ERß иммунопозитивные мотонейроны в спинном мозге мыши. Осадок иммуногисто-химической реакции локализуется в ядре, перикарионе и отростках нейронов. На продольных срезах седалищного нерва иммунопреципитат с AT против ERa и ERP был равномерно распределён в нервных волокнах. Через 1 неделю после передавливания седалищного нерва у контрольных и подопытных мышей в спинном мозге на ипсилатеральной (оперированной) стороне была выявлена повышенная имму-нореактивность мотонейронов в сравнении с контралатеральной стороной.

Методом иммуноблотинга локазано, что в белковых экстрактах седалищных нервов контрольных и подопытных мышей присутствуют рецепторные белки ERa и

Е2 -

Рис. 5. Классический геномный механизм действия эстрогенов на животную клетку (по Behl, 2001, с изменениями). Липофильные эстрогены (Е2) свободно проникают через клеточную мембрану в цитоплазму, где связываются с рецептор-ными белками (ER). Активированные рецепторы эстрогенов освобождаются от мо-лекул-шаперонов (белков теплового шока Hsp70 и Hsp90) и формируют димеры, которые транспортируются в ядро и инициируют транскрипцию гена-мишени.

ERP. Денситометрический анализ иммуноблотинга подтвердил увеличение экспрессии рецепторов эстрогенов в мотонейронах после аксотомии. В регенерирующих нервах контрольных и подопытных мышей уровень ERa и ER0 был выше, чем в интактных нервах.

Экспрессия мРНК ERa и ERfl в поясничном отделе спинного мозга. Методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) изучена экспрессия мРНК ERa и ERß в поясничном отделе спинного мозга мышей на 4-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки после передавливания седалищного нерва. Сравнительный анализ экспрессии мРНК ERa и ERP у контрольных и подопытных мышей на всех сроках исследования существенных различий не выявил. Несмотря на то, что им-муногистохимическим методом нами была обнаружена повышенная экспрессия рецепторов эстрогенов в аксотомированных нейронах, амплификация мРНК ER в спинном мозге у интактных или ложнооперированных животных не отличалась от таковой у животных после передавливания нерва. Таким образом, традиционная RT-PCR подтвердила экспрессию ERa и ERß на уровне мРНК, но не обнаружила количественных различий в экспрессии генов-мишеней в спинном мозге у интак-тных и оперированных животных.

Чтобы подтвердить представление об усилении транскрипции генов рецепторов эстрогенов в мотонейронах после аксотомии, мы изучили экспрессию мРНК ERa и

методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Суммарную РНК для исследования выделяли раздельно из правой (оперированной) и левой (контрала-

Таблица. 6. Влияние 17Р-эстрадиола на экспрессию мРНК генов-мишеней на правой (оперированной) и левой (контралатералыюн) сторонах поясничного отдела спинного мозга у овариэктомированных мышей через 1 неделю после передавливания правого седалищного нерва

Ген Ct генов-мишеней КН Ct генов-мишеней КН

ОП' ОЛ ОП ОЛ КП КЛ КП КЛ

GAPDH 15,29 15.65 15,52 15,56

ERa 15,28 17,77 ' 0.99 1,14 16,71 18,35 0,96 1.03

ERß 14,66 16,1 1,08 1,18 16,1 18,09 1.04 1.16

Примечания. Ct— среднее значение пороговых величин двух независимых реакций PCR; ОП и ОЛ — правая и левая стороны подопытных мышей; КП и КЛ — правая и левая стороны контрольных мышей Коэффициент нормализации (КН) — отношение Ct ERa и ERp к Ct GAPDH.

теральной) половин поясничного отдела спинного мозга через 1 неделю после передавливания правого седалищного нерва у контрольных и подопытных мышей.

Значения порогового цикла (Ct), реально отражающие начало амплификации, были значительно ниже для ERa и ERß на ипсилатеральной (оперированной) стороне у контрольных и подопытных мышей. Следует напомнить, что чем раньше начинается амплификация, т.е. чем ниже Ct, то тем больше исследуемой мРНК присутствует в ткани. Нормализация значений Ct ERa и ERß по отношению к Ct глнцеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) подтвердила нарастание экспрессии мРНК ERa и ERß на ипсилатеральной стороне по сравнению с контралатеральной (табл. 6). Результаты показали, что продукт амплификации полимеразной цепной реакции достигает плато через 35 циклов во всех реакциях RT-PCR. Этот факт объясняет результаты, полученные при помощи традиционной RT-PCR, где мы не зарегистрировали изменений в экспрессии мРНК ERa и ERß при различных экспериментальных условиях. Конечный продукт амплификации в ходе традиционной RT-PCR оценивали также после 35 циклов. Следовательно, с учётом результатов иммуногистохимического исследования и иммуноблотинга можно заключить, что в мотонейронах в ответ на аксотомию усиливается экспрессия ERa И ERß как на уровне мРНК, так и продукта её трансляции.

Влияние 17р-эстрадиола на экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга. Методом матричной гибридизации комплементарной ДНК с матрицей, содержащей 1176 ДНК-проб (Atlas Mouse 12 Array, Clontech, CA) нами изучено влияние ^ß-эстрадиола на экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга на 4-е сутки после передавливания седалищного нерва у овариэктомированных мышей. Ранее было показано, что в указанный срок у животных, получавших Hß-эстрадн-ол, начинается заметное восстановление SFI. Из 1176 генов нами документировано 265. В обеих (подопытной и контрольной) группах животных выявлены гены-регу-

ляторы клеточной пролиферации, роста, дифференцировки, апоптоза. Однако на фоне 17Р-эстрадиола экспрессия 42 генов была существенно выше, среди которых—гены, кодирующие факторы транскрипции, протеин киназы, белки механохимического преобразователя и цитоскелета, антигипоксанты и антиапоптозные белки.

Эффекты эстрогенов на транскрипцию генов реализуются через ядерные ре-цепторные белки ERa и ERp (Behl, 2001). Активированные рецепторы эстрогенов транслируют эстрогеновый сигнал в клетку по классическому и/или альтернативному пути (McEwen, 2001). Согласно нашим данным, по классическому пути 17р-эстрадиол активировал транскрипцию гена VEGF. Через альтернативный геномный механизм, путём стимуляции ERK-каскада, эстрогены усиливали экспрессию GAP-43 (нейромодулина), НIF-la (фактор, индуцированный гипоксией-la) и, вероятно, многих других ERK-акгивируемых генов (Lee and McEwen, 2001). При этом эстрогены стимулировали экспрессию и ERK1, и киназы, активирующей ERK1 (МЕК.1). Влияние эстрогенов наэкспрессию VEGF обращает на себя особое внимание. Экзогенный 17р-эстрадиол в 1,5 раза усиливал экспрессию мРНК VEGF и более чем в 2 раза — мРНК HIF-la в поясничном отделе спинного мозга после пере-давливания седалищного нерва. Известно, что промотор гена VEGF содержит эстроген-чувствительный элемент (Klinge, 2001). Причём HIF-1 а, как н эстрогеновые комплексы, специфически взаимодействует с промотором гена VEGF, активируя его транскрипцию (Lambrechts, Storkebaum et al., 2003). Эстрогены модулируют экспрессию HIF-la через альтернативный геномный механизм (путём активации мито-ген-активируемой протеин киназы ERK) (Sang, Stiehl et al., 2003) (рис. 6).

Рис. 6. Индуцированная эстрогенами экспрессия УЕСРв аксотомирован-ных мотонейронах спинного мозга. Через классический геномный механизм эстрогеновый комплекс, взаимодействуя с промотором гена УЕСИ, активирует его транскрипцию. По альтернативному геномному механизму эстрогены путём активации протеин киназы ERK индуцируют транскрипцию гена Н1Р-1а. Н1Р-1а усиливает экспрессию УЕвР, прямо взаимодействуя с промотором гена. Е2 — 17р-эстрадиол.

Е2 Е2 ■ ER ERt

VEGF

WAYAYAYAY;

HIF-1ct '

Таким образом, нами впервые методами иммуногистохимии, иммуноблотин-га и полимеразной цепной реакции были получены доказательства экспрессии ЕЯа и ЕИр в мотонейронах спинного мозга мыши. Усиление иммуноэкспресии ЕЯа и ЕИР в мотонейронах и седалищном нерве после передавливания соответствовало повышенной транскрипции генов в спинном мозге на оперированной

стороне. Следовательно, эстрогены оказывают нейропротекторный эффект на ак-сотомированные мотонейроны через рецепторные белки ЕЯа и ЕЯр. По классическому и альтернативному геномному механизмам эстрогены усиливают экспрессию генов, контролирующих выживание и внутриклеточную регенерацию.

Негеномный ERK-завнснмын механизм действия эстрогенов на

Альтернативный сигнальный каскад начинается в плазматической мембране клетки, где ассоциированные с мембраной рецепторы эстрогенов ERa и ER(3 связываются с эстрогенами (Lee and McEwen, 2001) и путем активации системы вторых посредников вызывают геномный и/или негеномный ответ клетки (Watson and Gametchu, 1999) (рис. 7). Альтернативный геномный путь предполагает индуцированную эстрогенами транскрипцию генов-мишеней, в промоторе которых отсут-

Рис. 7. Альтернативный механизм действия эстрогенов на жнвотную клетку (по Behl, 2001, с изменениями). Рецепторы эстрогенов, ассоциированные с плазматической мембраной, путём активации системы вторых посредников модулируют активность генов-мишеней (геномный механизм) и/или немедленно изменяют режим функционирования клетки (негеномный механизм). Е2— 17р-эст-раднол; ER — рецепторы эстрогенов; G-protein — G-белок; PLC—фосфолипаза С; DAG — диацилглицерол; IP-3 — ннозитолтрифосфат; РКС — протеин киназа С; МАРК — митоген-активированная протеин киназа; сАМР — циклический адено-зинмонофосфат (цАМФ); РКА — протеин киназа A; CREB — белок, взаимодействующий с цАМФ-чувствительным элементом.

мотонейроны спинного мозга при аксотомии

Е2 Е2

ствует эстроген-чувствительный элемент. Альтернативный негеномный механизм действия эстрогенов характеризуется немедленным функциональным ответом клетки, например модулированием гомеостаза внутриклеточного кальция (Mermelstein, Becker et al., 1996), инактивацией высокореактивных свободных радикалов (Mooradian, 1993). В соответствии с целью исследования нами экспериментально проверена гипотеза об альтернативном негеномном механизме действия эстрогенов в регуляции аксонного транспорта и синтеза белка в аксоплазме.

Роль эстрогенов в регуляции механизмов аксонного транспорта. Анте-роградные и ретроградные потоки различных мембранных структур и белковых комплексов контролируются многочисленными регуляторными белками (протеин киназами и фосфатазами). Тот факт, что эстрогены усиливают ретроградный транспорт мозгового нейротрофического фактора (BDNF) (Jezierski and Sohrabji, 2003) и действие эстрогенов на клетку может быть реализовано по альтернативному механизму (Wagey, Lurot et al., 2001), предполагает, что эстрогены локально влияют на транспортные потоки в аксоне путём взаимодействия с внутриклеточными каскадами, регулирующими аксонный транспорт.

Гипотеза о возможном влиянии эстрогенов на аксонный транспорт через альтернативный негеномный механизм экспериментально проверена у овариэк-томированных мышей на модели ретроградного транспорта флюоресцентного маркёра нейронов Fluorogold. Локальный эффект эстрогенов на ретроградный транспорт был исследован после аппликации на нерв Fluorogold вместе с lTß-эстрадиолом. Системное влияние гормона изучено на мышах, которым после аппликации на нерв Fluorogold подкожно инъецировали 17ß -эстрадиол. В обеих сериях опыта Hß-эстрадиол увеличил количество Fluorogold-позитивных мотонейронов (рис. 8). Исходя из наших данных, что в нервных волокнах седалищного нерва мыши присутствуют обе изоформы рецепторов эстрогенов можно предположить, что потенцирующее действие -эстрадиола на аксон-ный транспорт опосредовано рецепторами эстрогенов. Эксперименты с антагонистом рецепторов эстрогенов ICI 182,780 подтвердили наше предположение. Аппликация на нерв ICI 182,780 вызвала значительное снижение общего количества Fluorogold-позитивных мотонейронов у мышей на фоне системного воздействия Hß-эстрадиола. Однако при локальной аппликации nß-эстрадиола на нерв эффект ICI 182,780 был незначительным (рис. 8). Тот факт, что -эстрадиол, апплицированный на нерв вместе с 1С1182,780, частично снимает блокирующий эффект ингибитора, указывает на конкурентное взаимодействие 17Р-эстрадиола и ICI 182,780 с ER. Анализ этих данных приводит к выводу о том, что ^ß-эстра-диол, локально апплицированный на нерв, усиливает ретроградный транспорт Fluorogold и эффект гормона опосредован рецепторами эстрогенов. Проведённое радиоавтографическое исследование седалищного нерва и поясничного отдела спинного мозга мышей через 24 часа после аппликации на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва 3Н-17Р-эстрадиола выявило, что эст-рогеновые комплексы (лиганд-рецептор) не транспортируются в перикарион;

Рнс. 8. Влияние 17Р-эстрадиола и антагониста- рецепторов эстрогенов- ICI 182,780 на общее количество Fluorogold-no-знтнвных мотонеиронов в поясничном отделе спинного мозга. FG — 5% Fluorogold (n=7). Ej-C — Fluorogold, апплицированный на нерв, и 17р-эстрадиол, инъецированный подкожно (системный эстроген, n=4). E2-JI — Fluorogold и 17Р-эстрадиол,апплицированные на нерв (локальный эстроген, n=4). ICI — аппликация Fluorogold с антагонистом рецепторов эстрогенов ICI 182,780 (п=3). 1С1+Е2-С — системный эстроген в сочетании с аппликацией на нерв Fluorogold и ICI 182,780 (п=4). 1С1+Е2-Л — аппликация на нерв Fluorogold с 17Р-эстрадиолом и ICI 182,780 (п=3).

следовательно, 17р-эсграциол «работает» локально в месте аппликации по альтернативному негеномному механизму.

Согласно нашим данным SERM LY117018 стимулирует регенерацию седалищного нерва после его передавливания у овриэктомированных мышей. Аналогично 17р-эстрациолу, LY117018 ускоряет восстановление SF1, а также рост и созревание регенерирующих нервных волокон. В этом разделе работы мы исследовали влияние LY117018 на ретроградный аксонный транспорт. Аппликация на нерв LY117018 усиливала транспорт Fluorogold. Через 24 часа после операции общее количество Нио^оЫ-позитивных мотонейронов в LY117018 группе мышей было выше, чем в контрольной. Коаппликация LY117018 и ICI 182,780 существенно понизила количество FIuorogold-позитивных мотонейронов (рис. 9).

Рис. 9: Влияние аналога ралокси-фена LY117018 на общее количество FIuorogold-позитивных мотонейронов в поясничном отделе спинного мозга.

FG — 5% Fluorogold (n=3). LY — аппликация Fluorogold вместе с аналогом ралок-сифена LY117018 (n=3). LY+ICI — аппликация Fluorogold с аналогом ралокси-фена LY117018 и антагонистом рецепторов эстрогенов ICI 182,780 (п=3).

Таким образом, агонисты рецепторов эстрогенов регулируют ретроградный аксонный транспорт. Действие Hß-эстрадиола и LY117018 на аксонный транспорт опосредовано рецепторами эстрогенов. Однако LY117018 уступает антагонисту рецепторов эстрогенов ICI 182,780 в конкурентном связывании с рецепторами.

Известно, что митоген-активированные протеин киназы (МАРК) и фосфати-дил инозитол 3-киназа (PI 3-K) взаимодействуют с эстрогеновым сигнальным каскадом (Singh, Setalo et al., 2000; Behl, 2001; Lee and McEwen, 2001). Нами было исследовано влияние ингибитора PI3-K(LY 294002), ингибитора MEK/ERK-кас-када(1Ю126), ингибитора р38 (SB203580) и ингибитора JNK(SP600125) на ретроградный транспорт флюоресцентного маркёра нейронов Fluorogold. У овариэкто-мированных мышей на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва нанизывали силиконовую трубку, в которую вводили Fluorogold с одним из ингибиторов. Во всех сериях эксперимента смесь вводили в трубку через 15 мин после воздействия на нерв ингибитора, входящего в состав смеси.

Локальная аппликация на нерв ингибиторов PI 3-К, р38 и JNK не влияла на уровень ретроградного транспорта Fluorogold (рис. 10). Общее количество Fluorogold-позитивных мотонейронов через 24 часа после аппликации на нерв ингибиторов не отличалось от контрольного значения. Существенное снижение количества Fluorogold-позитивных мотонейронов было зарегистрировано при аппликации на нерв ингибитора MEK/ERK-каскада. 17Р-эстрадиол или LY117018, апплицированные вместе с ингибитором MEK/ERK-каскада, не проявили потенцирующего эффекта на ретроградный транспорт Fluorogold. Более того, количество Fluorogold-позитивных мотонейронов при аппликации ингибитора с 17р-эст-радиолом или LY117018 было значительно ниже, чем в контроле (рис. 11).

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что ERK-модулируемый сигнальный каскад играет важную роль в регуляции аксонного транспорта. Тот факт, что 17Р-эстрадиол и аналог ралоксифена LY117018 не сняли эффект ингибитора MEK/ERK-каскада, указывает, что 17Р-эстрадиол и LY117018, по-видимому, поддерживают аксонный транспорт Fluorogold через активацию ERK.

Рис. 10. Влияние ингибиторов протеин киназ на общее количество Fluorogold-позитивных мотонейронов в поясничном отделе спинного мозга. FG — 5% Fluorogold (n=7). LY 294002 — аппликация Fluorogold с ингибитором PI3-K (n=3). SP600125 — аппликация Fluorogold с ингибитором JNK (n=4). SB203580 — аппликация Fluorogold с ингибитором р38 (п=4). U0126 — аппликация Fluorogold с ингибитором MEK/ERK-каскада (п=4).

Рис. 11. Влияние 17Р-эстрадиола, аналога ралоксифена ЬУ117018 и ингибитора. МЕК/ЕКК-каскада на общее количество Fluoгogold-позитив-ных мотонейронов в поясничном отделе спинного мозга. FG — 5% Fluorogold (п=7). Ш126 — аппликация Fluorogold с ингибитором MEK/ERK-каскада (п=4). U0126+Е2 — аппликация Ркюгс^оИ с 17Р-эстрадиолом и ингибитором MEK/ERK-каскада (п=4). U0126+LY — аппликация Fluorogold с аналогом ралоксифена ЬУ117018 и ингибитором MEK/ERK-каскада (п=3).

В целях исследования активации ERK в мотонейронах после аксотомии нами было предпринято изучение иммуноэкспрессии фосфо-ERK в седалищном нерве овариэктомированных мышей через сутки после передавливания нерва. Иммуно-гистохимически с применением AT против фосфо-р44/р42 в седалищном нерве ложнооперированных мышей были выявлены слабопозитивные нервные волокна. Через 24 часа после передавливания в проксимальном отрезке нерва характер реакции отличался слабой интенсивностью и напоминал иммуноэкспрессию фосфо-р44/р42 в контроле. В дистальном сегменте нерва мы обнаружили интенсивно прокрашенные регенерирующие нервные волокна. Сравнительный денситометричес-кий анализ выявил существенное различие в интенсивности иммуногистохими-ческой реакции в дистальном и проксимальном сегментах нерва. Таким образом, через 24 часа после передавливания седалищного нерва в регенерирующих нервных волокнах происходят накопление (по-видимому, за счётантероградного транспорта [Reynolds, Hendry et al., 2001]) и активация ERK.

Для доказательства активирующего влияния эстрогенов на ERK-каскад в регенерирующих аксонах нами изучено влияние 17Р-эстрадиола на иммуноэкспрессию фосфо-ERK в спинном мозге и седалищном нерве через 1 неделю после передавливания нерва у овариэктомированных контрольных (плацебо) и подопытных (с эстрогеновыми капсулами) мышей. Иммуногистохимическим методом с AT против фосфо-р44/р42 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга интакт-ных мышей было обнаружено специфическое примембранное распределение им-муиопреципитата. Через 1 неделю после передавливания седалищного нерва интенсивность иммуногистохимической реакции в мотонейронах на ипсилатераль-ной стороне спинного мозга у контрольных и подопытных животных была выше, чем на контралатералыюй стороне. Кроме того, на ипсилатеральной стороне в белом веществе были выявлены ERK-позитивные нервные отростки.

В седалищном нерве у контрольных и подопытных мышеи методом иммуно-блотинга было изучено количественное содержание фосфо-ERK. Через 1 неделю после передавливания нерва денситометрический анализ показал, что уровень фос-фо-ERK был в 1,8 раза выше у контрольных и в 2,2 раза выше у подопытных мышей в сравнении с интактными животными. Следует подчеркнуть, что в нервах подопытных мышей содержание фосфо-ERK было на 40% выше, чем у контрольных. Согласно нашим данным, в аксотомированных мотонейронах поясничного отдела спинного мозга повышается экспрессия M P H K E RK. ERK антероградно транспортируется по аксону и аккумулируется в зоне роста. 17Р-эстрадиол существенно увеличивает экспрессию ERK в спинном мозге, а также усиливает накопление и активирование белка в регенерирующих нервных волокнах седалищного нерва.

Таким образом, рецепторы эстрогенов и ERK аккумулируются в аксонах, где эстрогены непосредственно выступают в роли триггера ERK-каскада. Активированный эстрогенами ERK-каскад фосфорилирует различные белки аксоплазмы, в частности, МАР-2 (ассоциированный с микротрубочками белок 2) (Sanchez, Diaz-Nido et al., 2000) и Hsp25 (белок теплового шока молекулярной массы 25 кД) (Geum, Son et al., 2002), которые играют важную роль в регуляции аксонного транспорта (рис. 12).

Е2

ICI 172,7801-1

Е2 Е2 ER ER U 0126 ь—

ERK

Hsp25 '

X.

Актин

Рис 12. Альтернативный негеномный ERK-зависимый механизм действия эстрогенов в регуляции аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка. Эстрогены (Е2) активируют ассоциированные с мембраной рецепторы эстрогенов (ER). Через систему вторых посредников эстрогеновый комплекс фосфорилирует протеин киназу ERK. В аксоне активированный ERK-каскад стимулирует синтез белков и фосфорилирует различные белки аксоплазмы, например МАР-2 и Hsp25, стабилизирующие тубулиновые микротрубочки и актиновые филаменты. ICI182,780 — антагонист рецепторов эстрогенов; U0126 — ингибитор MEK/ERK-каскада; циклогексимид — ингибитор синтеза белка.

1ИД(——

Циклогексимид - МАР-2 ,

т

Тубулин

Влияние эстрогенов на внутриаксонныи синтез белка. Структурная целостность и функциональная готовность аксона требуют постоянного обновления цитозольных и мембранных белков. Многие процессы, происходящие в нервной терминали более чем за 1 м от перикариона, нуждаются в быстром реагировании нейрона путем локального синтеза белка (Tobias and Koenig, 1975; Eugenin and Alvarez, 1995; Schacherand Wu, 2002). ERK-каскад участвует в регуляции экспрессии белка в нейронах, как на уровне транскрипции гена, так и трансляции белка (Steward and Schuman, 2001; Ming, Wong et al., 2001). Согласно нашим данным, эстрогены взаимодействуют с ERK-каскадом в аксоплазме, потенцируя аксонный транспорт. В этом разделе работы изучены внутриаксонныи синтез нейрональной формы Р-тубулина и влияние 17Р-эстрадиола на аксонный транспорт Fluorogold в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида.

Внутриаксонныи синтез нейрональной формы ß -тубулина изучен методом РНК-интерференции при помощи короткой интерферирующей РНК (siRNA), комплементарной мРНК нейрональной формы ß-тубулина (Yu, DeRuiter et al., 2002). Впервые трансфекция siRNA в аксоны мотонейронов мыши была выполнена путём аппликации на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва конъюпгрованной с FITC siRNA, комплементарной мРНК люциферазы. Через 24 часа после операции на срезах седалищного нерва в аксонах была обнаружена мелкозернистая специфическая флюоресценция. Флюоресцирующие зёрна максимально концентрировались в участке аппликации siRNA протяжённостью около 1 мм, постепенно исчезая в направлении к пернкариону. На срезах спинного мозга в перикарионах мотонейронов свечение отсутствовало. Оно не было зарегистрировано в центральном отрезке нерва и спинном мозге в контрольных экспериментах с аппликацией на нерв только FITC. Таким образом, убедившись, что siRNA, апплицированная на нерв, проникает внутрь нервных отростков и накапливается в них, в следующем эксперименте нами на центральные отростки перерезанных аксонов была апплицирована siRNA, комплементарная мРНК нейрональной формы ß-тубутина (функциональная siRNA). Трансфекция функциональной и контрольной siRNA продолжалась 24 часа в присутствии Fluorogold. Предварительная 6-часовая аппликация на нерв функциональной siRNA (до введения в трубку Fluorogold) значительно влияла на ретроградный транспорт Fluorogold. Количество Fluorogold-позитивных мотонейронов у мышей после трансфекции функциональной siRNA было существенно меньше, чем в контроле (рис. 13).

р<0,0001

1000

Рис. 13. Влияние РНК-иптерференцмн на общее количество Fluorogold-позитивных мотонейронов в поясничном отделе спинного мозга мыши через 24 часа после аппликации на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва siRNA. К^РМА — контрольная (п=5).

Ф-siRNA — функциональная siRNA, комплементар-

I

800

600

400

200

K-siRNA

Ф-siRNA ная мРНК нейрональной формы ß -тубулина (п=7).

Такое выраженное снижение количества Ииогс^оИ-позитивных мотонейронов в поясничном отделе спинного мозга после трансфекции функциональной по-видимому, обусловлено посттранскрипционной блокадой локального синтеза тубулина в аксоплазме мотонейронов. В подтверждение нарушения синтеза тубулина в аксоне нами было выполнено иммуногистохимическое исследование седалищного нерва с ЛТ против нейрональной формы р -тубулина.

Иммуногистохимическая реакция на продольных срезах седалищного нерва показала, что после аппликации функциональной з1ККЛ нервные волокна в дис-тальной части центрального отрезка седалищного нерва не реагируют с ЛТ, тогда как в проксимальной части все волокна иммуноположительны. После аппликации на нерв контрольной отростки нейронов равномерно окрашены на всём

протяжении.

Следует заметить, что участок нерва, не реагирующий с ЛТ, в точности совпадает с флюоресцирующей частью центрального отрезка нерва после трансфекции 81Ы1чГА, конъюгированной с БЕГС. В местах концентрации 81ШЧА отсутствует экспрессия Р-тубулина. Следовательно, трансфекция 8ИША, комплементарной мРНК нейрональной формы Р-тубулина, индуцирует РНК-интерференцию и блокирует трансляцию тубулина в аксоплазме. Функционально заблокированный синтез тубулина выражается в нарушении аксонного транспорта.

Микротрубочки, помимо аксонного транспорта, обеспечивают также рост аксонов в нейроонтогенезе и при регенерации. Так, ингибитор синтеза белка цик-логексимид, локально апплицированный на периферический нерв крысы, сдерживает регенерацию нерва (вае1е, Каше1ё й а1., 1998). Нами изучено влияние 17 Р~ эстрадиола на ретроградный аксониый транспорт Ииогс^оИ в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида. Через 2 недели после билатеральной овари-эктомии на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва нанизывали силиконовую трубку, заполненную смесью из Ииогс^оИ и циклогексимида или F1uorogo1d, циклогексимида и 17 Р-эстрадиола. Морфометрический анализ показал, что аппликация на нерв циклогексимида значительно снижает количество F1uorogo1d-позитивных мотонейронов (рис. 14). Однако 17 Р-эстрадиол, апплици-

1200-1 г 1000 - Т

р<0,05 р=0,05

400-

800-

600-

I

Рис. 14. Влняние 17р-эстрадиола и циклогексимида на общее количество Пиого^оМ-позитивных мотонеиронов в поясничном отделе спинного мозга ова-риэктомированных мышеи. ГС — 5% Пиоп^оИ (п=7). ЦГ — ингибитор синтеза белка циклогексимид вместе с Р1иого£о1(1 (п=4). ЦГ+Эстр —смесь, включающая циклогексимид, 17Р-эстрадиол и Пиоп^оИ

Рй ЦГ ЦГ+Эстр (п=4).

рованный на нерв после 15 мин преинкубации с циклогексимидом, частично снимал блокирующий эффект ингибитора на аксонный транспорт. Количество FIuorogold-позитивных мотонейронов после аппликации 17 ß-эстрадиола статистически не отличалось от контрольных значений.

В этом разделе работы было получено подтверждение важности локального синтеза белка в аксоне для выполнения транспортных функций. Методом РНК-интерференции мы установили,.что siRNA, комплементарная мРНК ней-рональной формы ß -тубулина, локально ингибирует трансляцию тубулина в ак-соплазме и вызывает структурные и функциональные повреждения в транспортном аппарате аксона мотонейронов спинного мозга мыши. Тот факт, что 17Р-эстрадиол, локально апплицированный на нерв, частично снимал эффект ингибитора синтеза белка циклогексимида, подтверждал наше предположение о влиянии эстрогенов на внутриаксонный синтез белка. Согласно нашим данным, активированный эстрогенами MEK/ERK сигнальный каскад существенно потенцирует ретроградный аксонный транспорт. При этом ERK-каскад регулирует экспрессию белка в мотонейронах, как минимум двумя способами: (1) путём усиления экспрессии мРНК ERK-активируемых генов (GAP-43, МАР-2, ß-тубулина) (Lee and McEwen, 2001) и (2) путём регуляции трансляции мРНК в аксоплазме (Steward, 2002). Таким образом, альтернативный ERK-зависимый механизм действия эстрогенов на мотонейроны спинного мозга заключается не только в регуляции фосфорилирования белков (например, МАР-2 и Hsp25), контролирующих транспортные потоки в аксоне, но и в стимуляции внутриак-сонного синтеза белка (см. рис. 12).

Дифференциальная экспрессия рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста и эндотелинов в мотонейтронах спинного мозга мыши Общепринято, что VEGF и эндотелины стимулируют пролиферацию эндоте-лиальных и гладкомышечных клеток и регулируют проницаемость сосудистой стенки. В то же время в ЦНС роль VEGF и эндотелинов не сводится только к обеспечению роста сосудов. VEGF и эндотелины дополнительно выступают в роли нейро-трофических и антиапопотозных факторов (Lambrechts, Storkebaum et al., 2003; Ogunshola, Antic et al., 2002; Yagami, Uedaet al., 2002).

Роль VEGF/Flt-1 сигнального каскада в аксотомироваиных мотонейронах. Экспрессия VEGF и его рецепторов (Flt-1 и Flk-1) изучена в поясничном отделе спинного мозга на 4-е сутки после передавливания седалищного нерва у мышей-самцов. У интактных и опытных мышей иммуно-гистохимическим методом с AT против VEGF, Flk-1 и Flt-1 в спинном мозге на уровне L4-L5 выявлены иммунопозитивные мотонейроны. Иммунопре-' ципитат с AT против VEGF имел ядерно-цитоплазматическую локализацию. Внутриклеточное распределение рецепторных тирозин киназ Flk-1 и Flt-1 обнаружило выраженную компартментализацию. Осадок иммуногистохими-ческой реакции с AT против Flk-1 локализовался в ядрах и цитоплазме кле-

Рис. 15. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Анализ экспрессии мРНК УБОР, Fit-1 и Р1к-1 в поясничном отделе спинного мозга интактных мышей (Инт), на контралатеральной (Кон) и ипсилатеральной (Ипс) сторонах спинного мозга на 4-е сутки после одностороннего передавливания седалищного нерва. По оси ординат — количество копий мРНК, полученных в трех независимых экспериментах, в процентах; * — р<0,001.

ток. Иммунореактивность с АТ против Ш-1 была выявлена исключительно в ядрах мотонейронов.

Экспрессия мРНК УБОР, Fit-1 и Рк-1 была изучена методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты исследования показали, что экспрессия мРНК УБОР на ипсилатеральной (оперированной) стороне поясничного отдела спинного мозга была значительно повышена в сравнении с контралатераль-ной стороной или интактной тканью (рис. 15). Выраженное различие нами зарегистрировано в экспрессии мРНК РЙ-1 и Р1к-1. Относительное содержание количества копий мРНК Р1к-1 было одинаковым в контроле, а также на ипсилатеральной и контралатеральной сторонах спинного мозга. Напротив, экспрессия мРНК РЙ-1 была значительно усилена на оперированной стороне по сравнению с контралате-ральной стороной или интактной тканью.

Данные по активности генов УБОР, РЙ-1 и НИ были подтверждены при помощи иммуноблотинга. Денситометрический анализ интенсивности экспрессии белков обнаружил 3-кратное увеличение уровня УБОР на контралатеральной стороне и 6-кратное увеличение — на ипсилатеральной по сравнению с интактным спинным мозгом. Содержание Р1к-1 на ипсилатеральной стороне практически не отличалось от уровня белка на контралатеральной стороне и в контроле. Уровень Р11-1 в интактной ткани и на контралатеральной стороне был одинаковым. Однако на ипсилатеральной стороне содержание РЙ-1 было в 1,3 раза выше по сравнению с контралатеральной. Таким образом, после передавливания седалищного нерва на ипсилатеральной стороне спинного мозга усиливалась экспрессия УБОР и его ядерного рецептора РЙ-1 как на уровне мРНК, так и белка.

Влияние эстрогенов на экспрессию VEGF у оварнэктомированных мышей. На основе полученных данных о модулирующем влиянии эстрогенов на экспрессию VEGF у овариэктомированных мышей и об активации VEGF/Flt-кас-када в аксотомированных мотонейронах мышей-самцов нами изучено влияние 17р-эстрадиола на иммуноэкспрессию VEGF и его рецепторов FIt-1 и Нк-1 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга после передавливания седалищного нерва у овариэктомированных мышей.

Через неделю после билатеральной овариэктомни мышам подопытной и контрольной групп были имплантированы силиконовые капсулы, содержащие 24 мкг 17р-эстрадиола или сезамовое масло, соответственно. На 7-е сутки после имплантации капсул у животных передавливали правый седалищный нерв. На 4-е сутки после повреждения нерва поясничный отдел спинного мозга подготавливали для иммуногистохимического исследования и иммуноблотинга.

Иммуногистохимическая реакция с АТ против VEGF, Flk-1 и РЙ-1 на поперечных срезах поясничного отдела спинного мозга у мышей в обеих группах выявила иммунопозитивные мотонейроны. Характер внутриклеточной локализации иммунопреципитата напоминал иммуноэкспрессию белков у мышей-самцов. Осадок иммуногистохимической реакции с АТ против VEGF и Flk-1 имел ядерно-цитоплазматическую локализацию, а с АТ против Flt-1 был обнаружен исключительно в ядрах мотонейронов. Анализ серийных срезов спинного мозга у подопытных мышей показал повышенную иммунореактивность мотонейронов с АТ против VEGF на ипсилатеральной стороне по сравнению с контра-латеральной.

Денситометрический анализ иммуноблотингов выявил существенное различие в содержании VEGF в белковом экстракте из спинного мозга контрольных и подопытных мышей на 4-е сутки после передавливания седалищного нерва. У подопытных мышей мы зарегистрировали 3-кратное увеличение уровня VEGF по сравнению с контрольными животными.

Активация эндотелии/ЕТ системы в мотонейронах спинного мозга после одностороннего передавливания седалищного нерва. Экспрессия рецепторов эндотелинов ЕТА и ЕТВ изучена на контралатеральной и ипсилате-ральной сторонах поясничного отдела спинного мозга после одностороннего передавливания седалищного нерва у мышей-самцов. Иммуногистохимичес-ким методом была выявлена дискретная субклеточная локализации рецепторов эндотелинов в мотонейронах. Иммунопреципитат с АТ против ЕТА локализовался в цитоплазме, тогда как с АТ против ЕТВ — в ядрах мотонейронов. При этом была замечена повышенная иммунореактивность мотонейронов с АТ против ЕТВ на ипсилатеральной стороне. Результаты исследования экспрессии мРНК ЕТа и ЕТВ показали, что на ипсилатеральной стороне активность транскрипции гена ЕТа была понижена, а гена ЕТВ, наоборот, существенно повышена по сравнению с контралатеральной стороной и интактным спинным мозгом (рис. 16). В подтверждение данных об активности транскрипции генов ЕТА и

Рис. 16. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Экспрессия мРНК рецепторов эндотелинов ЕТА (А) и ЕТВ (Б) в поясничном отделе спинного мозга интактных мышей (Инт) и на контралатеральной (Кон) и ипсилатеральной (Ипс) сторонах спинного мозга на 4-е сутки после передавливания седалищного нерва. По оси ординат — количество копий мРНК, полученных в трёх независимых экспериментах, в процентах; * — р<0,001.

ЕТВ нами при помощи иммуноблотинга был выполнен количественный анализ экспрессии их белкового продукта в таких же экспериментальных условиях. Денситометрический анализ интенсивности ЕТА обнаружил незначительное снижение уровня белка на оперированной и контралатеральной сторонах в сравнении с интактным спинным мозгом. Однако, нами была выявлена выраженная разница в экспрессии ЕТВ в исследуемых тканях. Уровень ЕТВ на ипсилатеральной стороне в 1,8 раза был выше при сравнении с интактной тканью и в 1,2 раза — с контралатеральной стороной. Таким образом, пониженная экспрессия мРНК ЕТА незначительно влияла на трансляцию белка, тогда как повышенная активность транскрипции гена ЕТВ сопровождалась выраженным усилением синтеза его продукта.

В этом разделе работы выявлено облигатное участие VEGF и эндотелиновой сигнальных систем в регенерации аксотомированных мотонейронов. Нами впервые показана ядерная локализация рецептора VEGF ^Й;-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ) в мотонейронах спинного мозга мыши. При передавливании седалищного нерва экспрессия Flt-1 и ЕТВ в мотонейронах спинного мозга значительно возрастает как на уровне мРНК, так и белкового продукта. Дифференциальная активность генов рецепторов VEGF (ИМ и Flk-1) и рецепторов эндотелинов (ЕТА и ЕТВ) свидетельствует о том, что нейропротекторное действие лигандов реализуются через ядерные изоформы рецепторов. Экзогенный 17Р-эстрадиол значительно увеличивает экспрессию VEGF в аксотомированных мотонейронах, тем самым усиливая нейропротекторное действие VEGF. Таким образом, полученные данные

свидетельствуют о перекрёстном антнапоптозном снгиале эстрогенов, VEGF и эндотелинов в мотонейронах после

и» »

Аксотомия

^—► Нейропротекция

МЕК ЕЯК

Рис. 17. Нейропротекцня аксотомированных мотонейронов с участием эстрогенов, эндотелинов и VEGF. Аксотомия усиливает экспрессию рецепторов эстрогенов (ЕЯ), рецептора УЕвЕ (Ей-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ). Эстрогены (Е2) активируют транскрипцию генов по классическому (УЕвЕ) и альтернативному (например, генов-регуляторов ВБМЕ-каскада [ТЯК-В, МЕК, ЕЯК]) пути. Антиапоптозные сигнальные каскады, активированные эстрогенами, УЕвЕ и эн-дотелинами (Э), поддерживают выживание регенерирующих мотонейронов. ВБМЕ — мозговой нейротрофический фактор; ТЯК-В — рецепторная тирозин киназа В (ВБОТ/Ж-3 рецептор).

Пластичность фенотипа скелетных мышц в условиях денервации

Структурно-функциональные свойства скелетных мышц развиваются и находятся под постоянным контролем со стороны двигательных нейронов (Улумбеков, 1981). Показано, что при разных функциональных и патологических состояниях фенотипические признаки скелетных мышц изменяются в широких пределах (Резвяков, 1982; Валиуллин, 1996). В связи с этим особое значение приобретает вопрос о факторах, регулирующих пластическую реакцию мышцы. В соответствии с целью исследования нами было предпринято гистохимическое и иммуногистохимическое изучение пластичности фенотипа скелетных мышц в условиях одностороннего повреждения периферического нерва и воздействия трёхвалентного железа и трансферрина.

Влияние трёхвалентного железа и трансферрнна на мышечную пластичность. Через 3 недели после перерезки седалищного нерва у крыс соотношение типов волокон в медленной камбаловидной мышце достоверно не изменялось, но наблюдалась незначительная тенденция мышцы к «замедлению»: в ней уменьшалось относительное содержание волокон типа II. В денервированной камбало-видной мышце на фоне введения ЕеС13 продолжается снижение доли мышечных волокон типа II. Значительное уменьшение относительного содержания волокон с высокой активностью АТФазы миозина нами было зарегистрировано в денервированной мышце после введения трансферрина (табл. 7).

Таблица. 7. Относительное содержание (%) мышечных волокон, типи-рованных по активности АТФазы миозина, в медленной камбаловидной мышце крысы (М±ш)

- различия при сравнении с интактной мышцей; р< 0,05.

Камбаловидная мышца интактных морских свинок гомогенна по составу: все мышечные волокна относятся к волокнам типа I. Через 3 недели после перерезки седалищного нерва денервированная мышца не изменяет исходный гистохимический профиль по активности АТФазы миозина и не реагирует с AT против тяжёлых цепей быстрого миозина. В экспериментах с блокадой аксонного транспорта в камбаловидной мышце морских свинок de novo экспрессируется быстрый миозин. Введение трансферрина после блокады аксонного транспорта существенно увеличивает относительное содержание мышечных волокон, реагирующих с AT против тяжёлых цепей быстрого миозина (табл. 8).

Таким образом, в скелетной мышце в условиях нарушенной иннервации повышается чувствительность к гуморальным факторам. Железотранспортирующий белок трансферрин в экспериментах с перерезкой нерва и блокадой аксонного транспорта усиливает эффект фактора, инициирующего изменения фенотипа мышцы. В денервированной мышце трансферрин потенцирует экспрессию медленного миозина, а при блокаде аксонного транспорта — быстрого.

Таблица. 8. Относительное содержание (%) мышечных волокон, реагирующих с моноклональными AT к тяжёлым цепям быстрого миозина, в медленной камбаловидной мышце морской свинки (М±ш)

Группы животных Медленные Быстрые

Интактная 100 -

Денервация 100 -

Инъекция трансферрина 100 -

Аппликация колхицина 86,17±2,33 13,83±2,33

Аппликация колхицина + трансферрин 79,02±1,13* 20,98+1,13*

* — различия при сравнении с мышцей после аппликации колхицина при р <0,05.

Пластичность скелетных мышц опытной и контралатеральной конечностей после одностороннего повреждения седалищного нерва. Феномен рефлекторной возбудимости контралатерального спинального двигательного центра после одностороннего повреждения периферического нерва свидетельствует о функциональном сопряжении одноимённых мышц конечностей (Stain, Victor et al., 1995). Однако исследованию контралатеральных скелетных мышц уделяется значительно меньше внимания, чем ипсилатеральным мышцам. При этом в экспериментах с односторонним нарушением иннервации контралатеральные мышцы часто используются в качестве контроля (d'Albis, Couteaux et al., 1995). Нами через 4 недели после иссечения фрагмента седалищного нерва (или его передавливания на одной стороне) иммуногистохимическим методом с AT против тяжёлых цепей быстрого и медленного миозинов были типированы быстрая червеобразная и медленная камбало-видная мышцы денервированной и контралатеральной конечностей крысы.

В камбаловидной мышце денервация путём иссечения фрагмента нерва незначительно снижает относительное содержание быстрых мышечных волокон в мышце ипсилатеральной конечности. В то же время в мышце контралатеральной конечности в этих условиях происходит достоверное снижение доли быстрых мышечных волокон по сравнению с интактной мышцей. После передавливания нерва относительное содержание быстрых волокон в мышцах обеих конечностей не отличалось и было значительно ниже уровня контрольных значений (рис. 18, А).

Рис. 18. Относительное содержание (%) быстрых мышечных волокон в медленной камбаловидной (А) и быстрой червеобразной (Б) мышцах крыс в опытной и контралатеральной конечностях при различных условиях денер-вашш. Интакт — интактные животные. ИсОп и ИсКон —денервация иссечением фрагмента нерва в опытной и контралатеральной конечностях, соответственно. ПерОп и ПерКон — денервация передавливанием нерва в опытной и контралатеральной конечностях, соответственно. * — р <0,05 при сравнении с интактной мышцей.

В червеобразной мышце подопытной конечности после иссечения фрагмента нерва выявлено незначительное изменение соотношения мышечных волокон в сторону медленных. В то же время, в контралатеральной мышце происходит существенный рост доли медленных мышечных волокон. Передавливание нерва приводит к увеличению относительного содержания медленных мышечных волокон в червеобразных мышцах обеих конечностей, при этом соотношение быстрых и медленных волокон в мышцах не отличается между собой (рис. 18, Б).

Таким образом, билатеральная рефлекторная активность спинальных двигательных центров в ответ на одностороннее повреждение нерва стимулирует пластические изменения в контралатеральных мышцах. Как в быстрой червеобразной, так и в медленной камбаловидной мышцах нами зарегистрирован рост доли медленных мышечных волокон. Феномен «замедления» нпсилатеральных мышц после передавливания нерва, по-видимому, обусловлен их реиннервацией «медленными» мотонейронами. При этом не исключено, что именно активность «медленных» мотонейронов индуцирует перепрограммирование синтеза миозинов в мышцах кон-тралатеральной конечности.

4. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В ходе исследования проблемы регенерации периферического нерва мы проанализировали механизмы модуляции пластичности фенотипа мотонейронов поясничного отдела спинного мозга и экстрафузальных мышечных волокон скелетных мышц конечностей в условиях повреждения седалищного нерва у лабораторных животных (мыши, крысы, морской свинки). В соответствии с поставленной целью нами экспериментально проверена гипотеза о влиянии агоннстов рецепторов эстрогенов (17Р-эстрадиола и селективного модулятора рецепторов эстрогенов аналога ралоксифена ЕУ117018) на посттравматическую пластичность мотонейронов спинного мозга мыши и выявлены механизмы модуляции пластичности фенотипа клеток в ходе регенерации. Согласно нашим данным, агонисты рецепторов эстрогенов имеют выраженный нейропротекторный эффект в ходе регенерации двигательных волокон периферического нерва. 17Р-эстрадиол и ЕУ117018 поддерживают рост и созревание регенерирующих аксонов, ускоряют восстановление функции скелетных мышц. Нами впервые показано, что в мотонейронах спинного мозга мыши экспрессируются обе изоформы рецепторов эстрогенов (ЕЯа и ЕЯр). В ответ на аксотомию экспрессия ЕЯа и ЕЯР существенно усиливается как На уровне мРНК, так белка. Следовательно, для обеспечения внутриклеточных процессов регенерации в мотонейронах увеличивается потребность в рецепторах эстрогенов. При этом эстрогены влияют на режим функционирования клетки через геномный и негеномный механизмы.

Геномный механизм действия эстрогенов на аксотомированные мотонейроны был изучен методом матричной гибридизации комплементарной ДНК. Из 1176 ДНК-проб, иммобилизированных в матрицу, была зарегистрирована активность 265 генов, среди которых 42 гена имели повышешг/ю активность и 21 ген — пони-

женную. По классическому геномному пути 17Р-эстрадиол усиливал транскрипцию гена сосудистого эндотелиального фактора роста (УБвР). Через альтернативный геномный механизм, например, путём активации киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (Е11К), эстрогены стимулировали экспрессию мРНК нейро-модулина (ОАР-43), индуцированного гипоксией фактора- 1а(ШР- 1а) и, вероятно, многих других БКК-активируемых генов. Анализ экспрессии генов в аксото-мированных мотонейронах выявил, что одним из механизмов нейропротекторного действия эстрогенов является модуляция экспрессии УБвР. Исходя из полученных данных о дифференциальной активности генов рецепторов эстрогенов (ER.cc и ЕЯр), рецепторов УБвР (Р1к-1 и ИМ) и рецепторов эндотелинов (ЕТА и ЕТВ), нами сформулировано представление о перекрёстном антиапо птоз ном сигнале эстрогенов, УБОР и эндотелинов в мотонейронах в ответ на аксотомию.

В исследованиях альтернативного механизма действия эстрогенов впервые получены доказательства значимости эстрогенов в регуляции аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка через активацию ERK-зависимых внутриклеточных каскадов. Нами установлено, что ЕРК является одним из факторов, контролирующих транспортные потоки в аксоне, при этом 17Р-эстрадиол существенно повышает экспрессию ERK в спинном мозге, а также увеличивает накопление и фосфорилирование белка в нервных волокнах периферического нерва. Активированный эстрогенами ERK-каскад усиливает аксонный транспорт и стимулирует синтез белка в аксоне. Подтверждением участия эстрогенов в синтезе белка в ак-соплазме служат полученные нами данные о трансляции нейрональной формы Р-тубулина внутри аксона и потенцирующем влиянии 17Р -эстрадиола на аксонный транспорт в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида.

Таким образом, эстрогены оказывают модулирующее влияние на посттравматическую пластичность мотонейронов, которая выражается в интенсификации процессов внутриклеточной регенерации. В аксотомированных мотонейронах эстрогены поддерживают выживание мотонейронов, стимулируют рост и созревание аксонов, контролируют аксонный транспорт и синтез белка в аксоплазме. Уникальная способность эстрогенов воздействовать на мотонейроны по классическому и альтернативному пути многократно усиливает эффекты гормонов на регенерацию аксонов. Особенно следует отметить возможность эстрогенов регулировать жизненно важные функции мотонейронов не только на уровне перикариона, но и на всем протяжении аксона.

Применительно к скелетной мышце пластичность её фенотипа была изучена на основании типирования мышечных волокон по качественному составу миозинов. В дополнение к существующим представлениям о пластичности денервиро-ванной скелетной мышцы нами показано, что железотранспортирующий белок трансферрин усиливает эффект фактора, инициирующего изменения фенотипа мышцы. Так, в денервированной мышце трансферрин повышает экспрессию медленного миозина, а при блокаде аксонного транспорта — быстрого. Согласно нашим данным, перепрограммирование синтеза миозинов наблюдается не только в

мышцах денервированной конечности. В ответ на одностороннее повреждение нерва в контралатеральных быстрой и медленной мышцах увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

Проведённое нами исследование выявило новые закономерности пластической реакции мотонейронов и скелетной мышцы в условиях повреждения периферического нерва. Нами установлена важная роль эстрогенов в посттравматической регенерации аксонов. В этой связи, на наш взгляд, представляется перспективной разработка клинического применения селективных модуляторов рецепторов эстрогенов для стимуляции посттравматической регенерации периферического нерва у человека.

ВЫВОДЫ

1. 17Р-эстрадиол и селективный модулятор рецепторов эстрогенов аналог ралоксифена LY117018 оказывают нейропротекторное действие на аксотомирован-ные мотонейроны. Эти агонисты рецепторов эстрогенов ускоряют рост и созревание регенерирующих нервных волокон и тем самым потенцируют восстановление функции скелетных мышц.

2. Стимулирующий эффект 17Р-эстрадиола на регенерацию седалищного нерва опосредован рецепторами эстрогенов:

а) мотонейроны спинного мозга мыши экспрессируют обе изоформы рецепторов эстрогенов (ERa и ERß). ER конститутивно присутствуют как в перикарио-не (имеют ядерно-цитоплазматическую локализацию), так и в нервных отростках;

б) экспрессия мРНК ERoc и ERp существенно увеличивается после аксото-мии мотонейронов;

в) ERcc и ERP перемещаются в составе антероградного аксонного транспорта и аккумулируются в регенерирующих аксонах периферического нерва.

3. В спинном мозге мышей после передавливания периферического нерва повышается активность генов, ответственных за выживание нейронов и внутриклеточную регенерацию. 17Р-эстрадиол усиливает транскрипцию генов, активированных аксотомией, по классическому и альтернативному пути.

4. Индуцированная эстрогенами экспрессия гена VEGF усиливает нейропро-текторный эффект эстрогенов:

а) мотонейроны экспрессируют VEGF и его рецепторы Flk-1 и Flt-1. VEGF и FIk-1 имеют ядерно-цитоплазматическое распределение, Flt-1 локализуется исключительно в ядрах мотонейронов;

б) аксотомия увеличивает экспрессию VEGF и его рецептора Flt-1. Активация VEGF/Flt-1 каскада по аутокринному и/или паракринному механизму поддерживает выживание аксотомированных мотонейронов.

5. Активированная эндотелиновая система усиливает антиапоптозный эффект эстрогенов и VEGF:

а) мотонейроны экспрессируют обе изоформы рецепторов эндотелинов ЕТД и ЕТВ. ЕТД локализуется в цитопл азБТ^, — в ядрах мотонейронов;

б) в аксотомированных мотонейронах усиливается экспрессия ядерной изофор-мы эндотелинового рецептора ЕТВ и подавляется экспрессия цитоплазматической (ЕТА). Антиапоптозное действие активированных реализуется путем регуляции гомеостаза кальция в нуклеоплазме.

6. Эстрогены через альтернативный негеномный механизм путём активации ERK-каскада потенцируют ретроградный аксонный транспорт и стимулируют внут-рпаксонный синтез белка:

а) ERK является облигатным фактором, регулирующим ретрофадный аксонный транспорт. Активированный эстрогенами ERK-каскад вызывает фосфорили-рование различных белков аксоплазмы, в частности МАР-2 и Hsp25, стабилизирующие тубулиновые микротрубочки и актиновые филаменты, что играет важную роль в регуляции аксонного транспорта;

б) эффективность ретроградного аксонного транспорта зависит от синтеза Р-тубулина в аксоне. 17Р-эстрадиол частично снимает блокирующий эффект ингибитора синтеза белка циклогексимида на аксонный транспорт путём активации ERK-зависимой трансляции белка в аксоплазме.

7. Влияние гуморальных факторов на скелетную мышцу зависит от характера повреждения периферического нерва. В условиях перерезки нерва трансфер-рин увеличивает относительное содержание медленных мышечных волокон, а при блокаде аксонного транспорта — быстрых.

8. Одностороннее повреждение седалищного нерва индуцирует фенотипичес-кие изменения в мышцах обеих конечностей. В контралатеральных быстрой и медленной мышцах после перерезки или передавливания нерва увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Резвяков Н.П. Влияние трёхвалентного железа на денервированные скелетные мышцы / Резвяков Н.П., Исламов P.P., Салахов А.А., Улумбеков Э.Г. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 1986. - N 11. - С. 545-547.

2. Исламов P.P. Является ли активность АТФ-азы миозина надежным маркёром для типирования мышечных волокон? / Исламов P.P., Валиуллина М.Е., Вали-уллин В.В., Полетаев Г.И. //Тез. докл. VI Всесоюзн. конф. "Биохимия мышц". -Тбилиси. - 1989. - С. 53S

3. Валиуллина М.Е. Миозины медленной мышцы в условиях нарушения нейротро-фнческого юнггроля / Валиуллина М.Е., Исламов P.P., Валиуллин В.В., Улумбеков Э.Г. // Тез. докл. VI Всесоюзн. конф. по биохимии мышц. - Тбилиси. - 1989. - С. 30.

4. Девятаев A.M. Сократительные и иммуноцитохимические характеристики диафрагмальнон и подошвенной мышц морской свинки / Девятаев A.M., Теплое А.Ю., Рикунова И.С., Анисимова Ю.А., Валиуллина М.Е., Исламов P.P., Валиуллин В.В. //Тез. конф.: «Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований». - Москва. - 1990.-С. 11-} 2.

5. Валиуллин В.В. Нейротрофический контроль синтеза миозинов медлен-

ной мышпы морской свинки / Валиуллин В.В., Исламов P.P., Валиуллина М.Е., Полетаев ПИ. //Бюл. эксп. биол. и мед.- 1991. -N 2. - С. 201-203.

6. Валиуллин В.В. Является ли трансферрин нейротрофическим фактором, контролирующим состав миозинов скелетной мышцы? / Валиуллин В.В., Дзаму-ков РА, Исламов P.P., Прохоренко Э.Л., Полетаев Г.И. // Бюл. эксп. биол. и мед. -1992.-N 7.-С. 93-95.

7. Hartmann D. Tumorzellen als in vitro Modell fur die Entwicklung des peripheren Nervensystem / Hartmann D., Islamov R.R, und Sievers J. //Anatomische Gesellschalt.

- Marburg. - 1994. - Pr 46.

8. Исламов P.P. Аутотрансплантация измельчённой скелетной мышечной ткани в атрофированную скелетную мышцу / Исламов P.P., Ильяненко В.В., Фатыхова Э.Ф., Бойчук Н.В., Обыдёнов С.А, Шамсутдинов H.T Т Т // Тез. конф.: «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных». - Казань. - 1997. - С. 53-54.

9. Валиуллин В.В. Нейротрофический контроль функционирования скелетных мышц/ Валиуллин В.В., Дзамуков Р. А., Исламов P.P. // Тез. докладов «Актуальные проблемы нейробиологии». - Казань. - V Всероссийская школа молодых, учёных.-1998.-С. 6-7.

10. Islamov R.R. Autotransplantation minced skeletal muscle into the intact.m. gastrocnemius / Islamov R.R., Boychuk H.B., Ilyanenko VV., FatyhovaE.F., Obydenov S.A., Shamsutdinov N.Sh. // VI European Congress of Neuropathology. - Barcelona. -J. Neuropathology & Applied Neurobiology. - May 1999. - V. 25. - Suppl 1.

11. Islamov R.R. The attempt to stimulate restoration of atrophied skeletal muscle by autotransplantation into it of minced skeletal muscle tissue / Islamov R.R. // Congress International de Myologie. - 2000. - Nice. - P. 189.

12. Исламов P.P. Иммуногистохимическое изучение медленных мышц при различных способах денервацци / Исламов P.P., Гусева Д С, Валиуллин В.В. // Тез. докладов международной конференции «Физиология мышечной деятельности». -2000. - Москва. - С. 62-63.

13. Валиуллин В.В. Нервная и гуморальная регуляция пластичности скелетной мышцы / Валиуллин В.В., Исламов P.P., Чучков В.М. // Тез. докладов «XVIII Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова». - 2001. - Казань. - С. 47-48.

14. Гусева Д.С. Ксимедон подавляет синтез быстрого миозина в медленной мышце крысы / Гусева Д.С., Челышев ЮА, Валиуллин В.В., Исламов P.P. // Тез. докладов «XVIII Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова». -2001.

- Казань. - С. 74.

15. Исламов P.P. Иммуногистохимическое изучение камбаловидной мышцы крысы при различных способах денервацди / Исламов P.P., Гусева Д. С, Челышев Ю.А., Валиуллин В.В.//Бюл. эксп. биол. и мед.-2001.-Т. 131,N4.-^ 477-480.

16. Guseva D.S. Immunohistochemical profiles ofrat soleus muscles ofdenervated

and contralateral limbs / Guseva D.S., Bojchuk N.V., Valiullin V.V., Chelyshev Y.A., Islamov R.R. // Developmental Neuroscience. - 2001. - V. 19, N 8. - P. 731.

17. Исламов P.P. Ксимедон изменяет качественный состав миозинов в медленной скелетной мышце крысы / Исламов P.P., Гусева Д. С., Челышев Ю.А., Вали-уллин В.В. // Российские морфологические ведомости. -2001. -N 3-4. - С. 95-97.

18. Islamov R. 17p-estradiol stimulates regeneration ofsciatic nerve in female mice / Islamov R, Hendricks W., Jones R., Lyall G., SpanierN. and Murashov A //VNeuroscience Symposium at East Carolina University, Greenville, NC 27858, October 2001.

19. Islamov R.R. 17beta-EstradioI stimulates regeneration ofsciatic nerve in female mice / Islamov R.R., Hendricks WA, Jones J.R., Lyall G.J., Spanier N.S., Murashov A.K. // Brain Res. - 2002. - N 943. - P. 283-286.

20. Islamov R R. Estrogen treatment promotes regeneration ofsciatic nerve in female mice/ Islamov R. R., Hendricks W. A., Jones R. J., Lyall G. J., SpanierN. S., and Murashov A. K. // Experimental Biology 2002, New Orleans, Louisiana, April 20-24,2002.

21. Islamov R. Estrogen receptor mRN As expression in lumbar spinal cord following sciatic nerve injury in female mice / Islamov R., Hendricks W., Katwa L., McMurray R., and Murashov A. // VI Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2002.

22. McMurray R. LY117018 stimulates regeneration of sciatic nerve in ovariectomized female mice / McMurray R., Islamov R., Murashov A. // VI Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2002.

23. Smith M. Differentiation ofmurine embryonic stem cells into neuronal subtypes / Smith M., Hendricks W., Islamov R., Murashov A. //VI Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2002.

24. Hendricks W. Transplantation of embryonic stem cells after excitotoxic spinal cord injury in the mouse / Hendricks W., Smith M., Islamov R., Sierpinski P., Brewer K. L. and Murashov A. // VI Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2002.

25. Islamov R. R. Detection of estrogen receptors and effects of 17P-estradiol on gene expression in lumbar spinal cord following sciatic nerve crush injury in ovariectomized mice / Islamov R.R., Hendricks W.A., Jones R.J., McMurray R.J., Spanier N.S., Murashov A.K. // SFN 32nd Annual meeting 2002, Orlando, Florida, November 2-7,2002.

26. Smith M. Transplanted Embryonic Stem Cells Differentiate and promote recovery in excitotoxically injured mouse spinal cord / Smith M., Hendricks W., Islamov R., Murashov A. // SFN 32nd Annual meeting 2002, Orlando, Florida, November 2-7,2002.

27. Islamov R.R. Effect of 17p-estradiol on gene expression in lumbar spinal cord following sciatic nerve crush injury in ovariectomized mice / Islamov R.R, Hendricks WA, Katwa L.C, McMurray R.J, Pak E.S, Spanier N.S, Murashov A.K. // Brain Res. -2003.-N966. P. 65-75.

28. McMurray R. Raloxifene analog LY117018 enhances the regeneration ofsciatic nerve in ovariectomized female mice / McMurray R., Islamov R., Murashov A. // Brain Res.-2003.-N980.-P. 140-145.

29. Islamov R.R. Differential expression of endothelin receptors in regenerating spinal motor neuron in mice / Islamov R.R., Chintalgattu V., McMurray R.J., Рак E.S., MurashovA.K.,KatwaL.C.//Mol. BrainResearch.-2003.-Vll6/l-2.-P. 165-169.

30. Islamov R. Estrogen enhances retrograde axonal transport in regenerating motor neurons/ Islamov R., McMurray R., Weidner D., Murashov A. // Experimental Biology 2003, San Diego, California, April 11-15,2003.

31. McMurray R. LY 117018 Enhances the regeneration of sciatic nerve in ovariectomized female mice / McMurray R., Islamov R., Murashov A. // Experimental Biology 2003, San Diego, California, April 11-15,2003.

32. Smith M. NGF-P promotes differentiation ofneurons from murine embryonic stem cells / Smith M., Hendricks W., Islamov R., Tatko L., Murashov A. // Experimental Biology 2003, San Diego, California, April 11-15,2003.

33. Islamov R. Estrogen signaling in retrograde axonal transport: evidence of a non-genomic mechanism / Islamov R., McMurray R., Рак Е., Weidner D., Murashov A. // VII Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2003.

34. Hendricks W. Induced neuronal differentiation ofmouse embryonic stem cells: comparative treatment strategies and phenotypic characterization / Hendricks W., Рак E., Owensby P., Islamov R., Sierpinski P., Tatko L., Brewer K., and Murashov A. // VII Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October2003.

35. Heery С Delivery ofsiRNA into lumbar motor neuron / Heery C, Islamov R., Van Scott M., Murashov A. // VII Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2003.

36. Owensby P. Effects of raloxifene hydrochloride on sciatic nerve regeneration in ovariectomized mice / Owensby P., McMurry R., Islamov R., and Murashov A. // VII Annual Symposium Neuroscience Research at East Carolina University: Today and Tomorrow, Greenville, NC 27858, October 2003.

37. Islamov R. Local non-genomic action of 17P-estradiol on retrograde axonal transport / Islamov R., McMurray R., Рак E., Weidner D., Murashov A. // SFN 33rd Annual meeting 2003, New Orleans, Louisiana, November 8-13,2003.

38. Islamov R. Endothelin and vascular endothelial growth factor signaling in axotomized spinal motoneurons / Islamov R., Chintalgattu V, Katwa L., and Murashov A. // Experimental Biology 2004, Washington DC, April 17-21,2004.

39. Islamov R.R. Immunohistochemica! profile of slow and fast skeletal muscles in denervated and contralateral hindlimb ofrat/ Islamov R.R., Guseva D.S., Boychuk N.V., Valtullin VV. // International Symposium «Biological motility». - 2004. - Puschino. — P. 218-219.

40. Valiullin, VV. Skeletal muscle plasticity/Valiullin V.V, Islamov R.R. // International

Symposium «Biological motility». - 2004. - Puschino. - 2004. - P. 245-246.

41. MurashovA. Estrogen Increases Retrograde Labeling ofMotoneurons: Evidence ofa non-genomic mechanism / MurashovA., Islamov R., McMurray R., Рак E., Weidner D. //Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2004. r- V. 287. - N 2. - P. 320-326.

42. Исламов P.P. Возможная роль экстрапирамидной системы в регуляции фенотипа быстрой скелетной мышцы крыс / Исламов P.P., Гусева Д.С., Бойчук Н.В., Валиуллин В.В. // Тез. докладов «XIX Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова». -2004. - Екатеринбург.

43. Валиуллин В.В. Влияние трансферрина на экспрессию миозинов в медленной скелетной мышце при нарушении нейротрофического контроля / Валиуллин В.В., Бойчук Н.В., Исламов P.P. // VII Конгресс международной ассоциации морфологов. - Казань. - 2004.

44. Исламов P.P. Эстроген-индуцированная экспрессия сосудистого эндоте-лиального фактора роста оказывает нейропротективное действие на аксотомиро-ванные мотонейроны спинного мозга у мышей / Исламов P.P., Пак Е.С., Еникеева Г.И., Мурашов А.К. // VII Конгресс международной ассоциации морфологов. - Казань. - 2004.

45. Islamov R. Induction ofVEGF and its Fit-1 receptor after sciatic nerve crush injury / Islamov R., Chintalgattu Y, Pak E , Katwa L., Murashov A. // NeuroReport. -2004.-V. 15.-N 13.-R2ff7-2f2{.

58 7

Подписано в печать 23.08.2004 г. Ризография. Бумага офсетная 60 х 84/16 Объём 2,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 70 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49, типография КГМУ

Актуальность проблемы

Одним из фундаментальных свойств организма является восстановление утраченной или повреждённой структуры. Эффективность регенерации определяется характером популяций клеток (эмбриональная, статическая, растущая, обновляющаяся). В статической популяции особое место занимают нейроны (Leblond 1964). Начиная с работ Сантьяго Рамон-и-Кахаля, приложившего клеточную теорию к нервной ткани (Cajal, 1909-1911), проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литературе резонирует пророческое высказывание Кахаля: ". .в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, законченное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило" (Cajal, 1928).

Проблема регенерации в нервной ткани имеет не только теоретическое значение. Её актуальность для практической медицины представляется очевидной. При этом особую важность приобретает изучение регенерации периферического нерва. Дегенерация аксонов в периферических нервах может быть вызвана травмами опорно-двигательного аппарата, токсическими воздействиями, дефектами образования миелина, нарушениями аксонного транспорта, гипоксией и многими другими факторами. В реальной клинической ситуации наиболее часто встречаются травматические повреждения периферических нервных стволов, сопутствующие производственному, транспортному, спортивному и бытовому травматизму. Нарушение анатомической целостности нервного ствола приводит к полному выпадению функции нерва. Повреждения отростков двигательных и чувствительных нейронов вызывают паралич иннервируемых мышц и анестезию, а дегенерация аксонов вегетативных нейронов сопровождается сосудодвигательными расстройствами. При значительном расхождении центрального и периферического отрезков повреждённого нерва хаотично растущие нервные волокна на конце центрального отрезка образуют ампутационную неврому, которая препятствует реиннерва-ции органов-мишеней, в результате чего наступают атрофия скелетных мышц, дегенеративные изменения суставов, остеопороз. Необходимость более шубокого и всестороннего изучения механизмов регенерации периферического нерва обусловлена не только медицинскими запросами, но и имеет огромное социальное значение, поскольку реабилитация больных с посттравматическими повреждениями нерва до сих пор остаётся неразрешённой проблемой.

Важным аспектом посттравматической регенерации периферического нерва является изучение механизмов модуляции пластичности фенотипа регенерирующих мотонейронов. Пластичность, с одной стороны, отражает вариабельность генетически детерминированных признаков, а с другой — характер (созидательный или разрушительный) внутриклеточных процессов (Корочкин, 2002). При этом можно надеяться, что выяснение роли конкретных сигнальных каскадов в поддержании регенерации на клеточном уровне позволит разработать механизмы модуляция пластичности нейронов. На самом деле суть проблемы значительно глубже, речь идёт о (1) вызванной активности конкретного спектра генов в аксотомиро-ванных мотонейронах, (2) функциональной значимости активированных генов и (3) факторах, регулирующих активность функционально значимых генов.

Информационные межклеточные взаимодействия в системе "мотонейрон-скелетная мышца" модулируют активность разнообразных генов, контролирующих фенотипические признаки обоих клеточных партнёров. Травма периферического нерва прерывает регуляторные отношения между мотонейронами и скелетной мышцей. В денервированной мышце развивается постденервационный синдром (Полетаев, 1980; Shackelford and Lebherz, 1981; Волков и Полетаев, 1982; Bayline, Khoo et al., 1998). При этом в силу пластичности фенотипа скелетная мышца изменяет чувствительность к гуморальным факторам (Улумбеков и Резвяков, 1980; Резвяков, 1982; Валиуллин, 1996). Поэтому — в рамках проблемы реиннервации скелетной мышцы — особое значение приобретает вопрос о факторах, модулирующих фенотипические признаки мышечных волокон в условиях денервации. Однако восстановление координированных функций в системе "мотонейрон-скелетная мышца" в первую очередь зависит от пластичности мотонейронов. Спектр транскрибируемых генов в аксотомированных мотонейронах во многом повторяет таковой в ходе нейроонтогенеза и характеризуется повышенной активностью генов, контролирующих навигацию и рост аксонов, восстановление нервно-мышечного контакта (Purves and Lichtman, 1983). Вместе с тем пластические изменения фенотипа мотонейронов в условиях аксотомии изучены недостаточно. Не выяснены границы вариабельности генетически детерминированных признаков. Неизвестно, активность каких ещё генов регулирует процессы внутриклеточной регенерации. Не изучены временные характеристики активности генов.

Систематические исследования в этом направлении выявили спектр генов (гомейозисных, факторов транскрипции, рецепторов факторов роста, протеин киназ, антиапоптозных и многих других), ориентированных на внутриклеточную регенерацию (Kaiser and Nisenbaum, 2003; Resnick, Schmitt et al., 2004). При этом функциональная значимость ряда генов, активированных в ходе регенерации мотонейронов, остаётся неизученной. Неизвестно, насколько закономерна активация этих генов в аксотомированных мотонейронах и в каких внутриклеточных каскадах участвуют продукты их экспрессии. В рамках этого вопроса особый интерес представляет исследование экспрессии рецепторов сигнальных молекул, регулирующих ангиогенез, — сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелинов. Нервы и сосуды формируют ветвящуюся сеть, согласованно продвигаясь единым маршрутом в раннем онтогенезе (Shima and Mailhos, 2000). Известно, что усиление экспрессии VEGF играет важную роль не только в росте сосудов, но и в навигации аксонов (Miao, Soker et al., 1999). Синтез VEGF в гладкомышечных клетках сосудов стимулируют эндотелины (Kozawa, Kawamura et al., 2000). Причём эндотелиновая система per se имеет выраженную нейропротекторную функцию (Yagami, Ueda et al. 2002). Следовательно, в нервной ткани роль ангиогенных факторов заключается не только в обеспечении роста сосудов и доставки к нервным клеткам кислорода и питательных веществ — сигнальные молекулы ангиогенеза дополнительно функционируют как нейротрофические факторы (Ehrenreich, Nau et al., 2000; Oosthuyse, Moons et al., 2001). Вместе с тем, до сих пор неясны механизмы нейропротектор-ной функции этих молекул, поэтому выяснение характера экспрессии рецепторов VEGF и эндотелинов в мотонейронах представляется перспективным для исследования механизмов выживания нейронов в условиях аксотомии.

Другой важный вопрос в понимании механизмов модуляции фенотипа аксотомированных мотонейронов касается возможности направленной стимуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, обеспечивающих регенерацию аксонов. Навигация и рост регенерирующих аксонов на большие расстояния (более 1 м у человека) регулируются разнообразными сигнальными молекулами (Челышев, 1995). Нейротрофические факторы, факторы роста, цитоки-ны, молекулы адгезии и межклеточного матрикса, обеспечивающие элонгацию аксона, продуцируются шванновскими клетками (Zochodne, Cheng et al., 2001; Kubo, Yamashita et al., 2002), скелетными мышечными волокнами

Sakuma, Watanabe et al. 2001), макрофагами (Shamash, Reichert et al., 2002) и фибробластами (Pu, Zhuang et al., 1999). Однако не существует однозначного, и тем более, исчерпывающего ответа на вопрос, какие из этих факторов могут быть рекомендованы для стимуляции регенерации периферического нерва в практической медицине. Наряду с этим неясно влияние гуморальной системы на аксотомированные мотонейроны. Важность изучения влияния гормонов на регенерацию мотонейронов обусловлена их способностью оказывать регуляторное влияние на уровне как спинного мозга, так и периферического нерва (Jones, Brown et al., 2001; Storer, Houle et al., 2002; Fiore, Inman et al., 2004). На наш взгляд, в этом плане значительный интерес представляют стероидные гормоны — эстрогены.

Биологическое влияние эстрогенов в организме млекопитающих не ограничивается эффектами на клетки-мишени в органах репродуктивной системы. Согласно современным представлениям, функциональное значение эстрогенов выходит за рамки "женских половых гормонов" (Allen and Doisy, 1983). Многочисленные исследования установили высокую значимость эстрогенов для развития и функционирования мозга (Lee and McEwen, 2001). Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферических нервов представляется перспективной по нескольким причинам. Эстрогены — ключевые гормоны при тканевой регенерации в органах женской половой системы. Вместе с тем эффект эстрогенов на регенерацию распространяется и на другие системы, в частности на нервную ткань (McEwen and Alves, 1999). Липофильные гормоны свободно проникают через плазматическую мембрану нейронов, изменяя режим функционирования клетки через классический и/или альтернативный механизм (Watson and Gametchu, 1999). Показано, что эстрогены проявляют нейропротекторные свойства при ишемии и травмах головного мозга (Behl, 2001). Заместительная терапия эстрогенами у женщин постклимактерического периода предупреждает развитие болезни Альцхаймера (Slooter, Bronzova et al., 1999) и способствует частичной коррекции двигательных расстройств при болезни Пар-кинсона (Tsang, Но et al., 2000). В этой связи необходимо отметить, что экспрессия эстрогеновых рецепторов документирована не для всех нейронов ЦНС; в частности, не установлен факт их экспрессии для мотонейронов спинного мозга. Поэтому до сих пор не известны эффекты эстрогенов на регенерацию периферического нерва. Не исследованы также механизмы нейропротектор-ного действия эстрогенов при аксотомии мотонейронов.

Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферического нерва имеет важное значение не только для выяснения механизмов действия эстрогенов на внутриклеточные восстановительные процессы, но и для клинического применения гормонов. Однако, вследствие того, что эстрогены активируют пролиферацию эпителиальных клеток молочных желёз и матки, применение эстрогенов может быть крайне ограничено. В то же время работами последних лет было показано, что синтетические фармакологические вещества, селективно ингибирующие рецепторы эстрогенов в тканях репродуктивных органов, обладают нейропротекторными свойствами эстрогенов (Grandbois, Morissette et al., 2000; Callier, Morissette et al., 2001). При этом влияние этих препаратов на регенерацию периферического нерва не изучено.

Анализ состояния проблемы регенерации периферического нерва на сегодняшний день свидетельствует об актуальности исследования посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов. Выяснение механизмов регуляции активности конкретного спектра генов в денервированной скелетной мышце и регенерирующих мотонейронах является основой в исследованиях направленной стимуляции регенерации периферических нервов и восстановления функции скелетных мышц у человека.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является анализ механизмов регуляции посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов спинного мозга и скелетных мышц в условиях повреждения периферического нерва и фармакологических воздействий на его регенерацию. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. В аксотомированных мотонейронах спинного мозга мышей изучить экспрессию: а) рецепторов эстрогенов а и Р, б) VEGF и его рецепторов Flk-1 и Fit-1; в) рецепторов эндотелинов ЕТА и ЕТВ.

2. Исследовать влияние 17Р-эстрадиола и селективного модулятора эстроге-новых рецепторов аналога ралоксифена LY117018 на регенерацию седалищного нерва у мышей.

3. Выяснить механизмы действия агонистов рецепторов эстрогенов на внутриклеточную регенерацию мотонейронов спинного мозга у мышей после повреждения седалищного нерва.

4. Изучить экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга мышей после повреждения седалищного нерва на фоне воздействия 17Р-эстрадиола.

5. Исследовать влияние 17Р-эстрадиола на ретроградный аксонный транспорт и внутриаксонный синтез белка в мотонейронах спинного мозга у мышей.

6. Исследовать влияние железотранспортирующего белка трансферрина и ионов трёхвалентного железа на фенотипические признаки медленной камбаловидной мышцы крысы и морской свинки в условиях денервации и блокады аксонного транспорта.

7. Исследовать влияние одностороннего повреждения седалищного нерва на пластичность фенотипов медленной камбаловидной и быстрой червеобразной мышц в опытной и контралатеральной конечностях у крыс.

Научная новизна

В работе охарактеризована активность генов в спинном мозге мышей после передавливания седалищного нерва и выявлена роль эстрогенов в регенерации периферических нервов. Все приведённые в этом разделе основные научные результаты получены впервые. После передавливания седалищного нерва у мышей 17Р-эстрадиол и аналог ралоксифена LY117018 ускоряют рост и созревание нервных волокон, что приводит к более ранней реиннервации скелетных мышц. Методами иммуногистохимии, иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции получены доказательства экспрессии рецепторов эстрогенов а и Р в мотонейронах спинного мозга. Аксотомия существенно увеличивает продукцию обеих изоформ рецепторов эстрогенов в спинном мозге. При этом рецепторы эстрогенов перемещаются в составе антероградного аксонного транспорта и аккумулируются в регенерирующих нервных волокнах. Выявлены геномный и негеномный механизмы действия эстрогенов на аксотомиро-ванные мотонейроны. Через геномный механизм 17Р~эстрадиол активирует транскрипцию генов-регуляторов клеточной пролиферации, роста, дифферен-цировки, апоптоза. По альтернативному негеномному механизму эстрогены путём активации протеин киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), усиливают ретроградный аксонный транспорт и поддерживают синтез белка в аксоплазме.

Установлено облигатное участие рецепторов VEGF и эндотелинов в регенерации мотонейронов. В мотонейронах спинного мозга выявлена ядерная локализация рецептора VEGF (Fit-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ). В аксотомирован-ных мотонейронах показано усиление экспрессии VEGF, его рецептора Flt-1 и рецептора эндотелинов ЕТВ как на уровне гена, так и белка. Обнаружено, что 17{3-эстрадиол потенцирует экспрессию VEGF в аксотомированных мотонейронах.

Исследование внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции показало, что короткая интерферирующая РНК, апплицированная на центральный отрезок периферического нерва, может быть трансфецирована в аксоплазму мотонейронов. Интерферирующая РНК, комплементарная мРНК нейрональной формы (3-тубулина, локально ингибирует трансляцию белка в аксоплазме, что приводит к структурным повреждениям микротрубочек и нарушению аксонного транспорта в мотонейронах спинного мозга.

В условиях повреждения седалищного нерва показано, что влияние гуморальных факторов на фенотип мышцы обусловлено характером повреждения нерва. В медленной камбаловидной мышце железотранспортирующий белок трансферрин при перерезке нерва (блокада проведения импульсов и аксонного транспорта) увеличивает экспрессию медленного миозина, а при аппликации колхицина на нерв (блокада аксонного транспорта) — быстрого. Одностороннее повреждение седалищного нерва вызывает изменение фенотипа скелетных мышц не только в опытной конечности, но и в контралатеральной. В быстрой червеобразной и медленной камбаловидной мышцах контралатеральной конечности увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

Положения, выносимые на защиту

1. Усиление экспрессии генов эстрогеновых рецепторов (а и (3), рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста (Flt-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ) в мотонейронах спинного мозга поддерживает регенерацию двигательных нервных волокон и восстановление функций в системе "мотонейрон-скелетная мышца".

2. Агонисты эстрогеновых рецепторов стимулируют регенерацию мотонейронов через геномный и негеномный сигнальные пути. Альтернативный негеномный путь реализуется за счёт активации ERK-зависимого внутриклеточного сигнального каскада.

Научно-практическая ценность

Теоретическое значение результатов проведённых исследований определяется раскрытыми закономерностями пластичности фенотипов клеточных партнёров в системе "мотонейрон-скелетная мышца" в условиях повреждения периферического нерва. Анализ экспрессии 1176 генов в поясничном отделе спинного мозга после передавливания седалищного нерва представляет интерес для понимания патогенеза нейродегенеративных процессов в спинном мозге. Выявленный спектр активированных генов в аксотомированных мотонейронах дополняет существующее представление о механизмах внутриклеточной регенерации. Данные о пластичности фенотипа скелетных мышц в денервированной и контралатеральной конечностях следует учитывать при выяснении компенсаторных механизмов, способствующих выживанию скелетной мышцы до восстановления иннервации, и могут быть использованы для разработки методов коррекции фенотипических изменений в денервированных скелетных мышцах в практической медицине.

В работе сформулировано представление о механизме стимулирующего влияния эстрогенов на регенерацию нервной ткани. Выявленный положительный эффект 17Р-эстрадиола и селективного модулятора рецепторов эстрогенов аналога ралоксифена LY117018 на регенерацию периферического нерва и восстановление функции денервированных скелетных мышц имеет прикладное значение в клинике нервных болезней. Выяснение механизмов действия агонистов эстрогеновых рецепторов на аксотомированные мотонейроны позволяет расширить существующие представления о нейропротекторной функции эстрогенов при ишемии, травмах и возрастных изменениях ЦНС. Выяснение механизмов перекрёстного взаимодействия эстрогенов с сигнальными каскадами сосудистого эндотелиального фактора роста и эндотелинов открывает новые перспективы для направленной стимуляции регенерации периферического нерва.

Результаты исследования внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции имеют общебиологическое значение. Полученные доказательства высокоселективной посттранскрипционной блокады трансляции белка в аксонах мотонейронов спинного мозга с помощью короткой интерферирующей РНК in vivo могут найти применение в генной терапии.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); Всесоюзном симпозиуме "Структурно-энергетическое обеспечение механической работы мышц" (Москва, 1990); Международной конференции "Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований" (Москва, 1990); VI Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991); Обществе анатомов (Марбург, 1994); II Республиканской научной конференции молодых учёных и специалистов (Казань, 1996); Конференции анатомов, гистологов и эмбриологов "Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей и клеток организма человека и животных" (Казань, 1997); V Всероссийской школе молодых учёных "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 1998); VI Европейском конгрессе по невропатологии (Барселона, 1999); Международном конгрессе по миологии (Ницца, 2000); Международной конференции "Физиология мышечной деятельности" (Москва,

2000); XVIII Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань,

2001); Международном симпозиуме "Нейробиология развития" (Сидней, 2001); V, VI, VII Симпозиумах по нейробиологическим исследованиям в Университете Восточной Каролины (Гринвилл, 2001, 2002, 2003); Международных конгрессах "Экспериментальная биология" (Новый Орлеан, 2002; Сан-Диего, 2003; Вашингтон, 2004); 32-м, 33-м Съездах общества нейробиологов (Орландо, 2002; Новый Орлеан, 2003); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино на Оке, 2004); XIX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); Расширенном заседании общества патофизиологов г. Казани (Казань, 2004); V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004).

Реализация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ (статьи — 11, тезисов — 34). Материалы диссертации включены в лекционные курсы для студентов Казанского государственного медицинского университета по патофизиологии, гистологии, анатомии и физиологии. Результаты исследования положены в основу разработки перспективы клинического применения селективных модуляторов рецепторов эстрогенов при лечении ишемических повреждений периферического нерва и стимуляции посттравматической регенерации аксонов в

Научно-исследовательском центре Татарстана "Восстановительная травматологии и ортопедия".

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, изложения материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследований, общего заключения с выводами, указателя литературы. Каждая глава результатов исследования включает обзор литературы, описание экспериментальных данных, обсуждение и заключение. Диссертация изложена на 191 страницах, содержит 11 таблиц, 67 иллюстраций. Список литературы включает 304 источника на русском и английском языках.

Выводы

1. 17р~эстрадиол и селективный модулятор рецепторов эстрогенов аналог ралоксифена LY117018 оказывают нейропротекторное действие на аксотомирован-ные мотонейроны. Эти агонисты рецепторов эстрогенов ускоряют рост и созревание регенерирующих нервных волокон и тем самым потенцируют восстановление функции скелетных мышц.

2. Стимулирующий эффект 17|3-эстрадиола на регенерацию седалищного нерва опосредован рецепторами эстрогенов: а) мотонейроны спинного мозга мыши экспрессируют обе изоформы рецепторов эстрогенов (ERa и ERp). ER конститутивно присутствуют как в перикарионе (имеют ядерно-цитоплазматическую локализацию), так и в нервных отростках; б) экспрессия мРНК ERa и ERP существенно увеличивается после аксотомии мотонейронов; в) ERa и ERP перемещаются в составе антероградного аксонного транспорта и аккумулируются в регенерирующих аксонах периферического нерва.

3. В спинном мозге мышей после передавливания периферического нерва повышается активность генов, ответственных за выживание нейронов и внутриклеточную регенерацию. 17р-эстрадиол усиливает транскрипцию генов, активированных аксотомией, по классическому и альтернативному пути.

4. Индуцированная эстрогенами экспрессия гена VEGF усиливает нейропро-текторный эффект эстрогенов: а) мотонейроны экспрессируют VEGF и его рецепторы Flk-1 и Flt-1. VEGF и Flk-1 имеют ядерно-цитоплазматическое распределение, Flt-1 локализуется исключительно в ядрах мотонейронов; б) аксотомия увеличивает экспрессию VEGF и его рецептора Fit-1. Активация VEGF/Flt-1 каскада по аутокринному и/или паракринному механизму под держивает выживание аксотомированных мотонейронов.

5. Активированная эндотелиновая система усиливает антиапоптозный эффект эстрогенов и VEGF: а) мотонейроны экспрессируют обе изоформы рецепторов эндотелинов ЕТД и ЕТВ. ЕТД локализуется в цитоплазме, ЕТВ — в ядрах мотонейронов; б) в аксотомированных мотонейронах усиливается экспрессия ядерной изоформы эндотелинового рецептора ЕТВ и подавляется экспрессия цитоплазмати-ческой (ЕТД). Антипапоптозное действие активированных ЕТВ реализуется путём регуляции гомеостаза кальция в нуклеоплазме.

6. Эстрогены через альтернативный негеномный механизм путём активации ERK-каскада потенцируют ретроградный аксонный транспорт и стимулируют внутриаксонный синтез белка: а) ERK является облигатным фактором, регулирующим ретроградный аксонный транспорт. Активированный эстрогенами ERK-каскад вызывает фосфорили-рование различных белков аксоплазмы, в частности, МАР-2 и Hsp25, стабилизирующие тубулиновые микротрубочки и актиновые филаменты, что играет важную роль в регуляции аксонного транспорта; б) эффективность ретроградного аксонного транспорта зависит от синтеза (3-тубулина в аксоне. 17(3-эстрадиол частично снимает блокирующий эффект ингибитора синтеза белка циклогексимида на аксонный транспорт путём активации ERK-зависимой трансляции белка в аксоплазме.

7. Влияние гуморальных факторов на скелетную мышцу зависит от характера повреждения периферического нерва. В условиях перерезки нерва трансферрин увеличивает относительное содержание медленных мышечных волокон, а при блокаде аксонного транспорта — быстрых.

8. Одностороннее повреждение седалищного нерва индуцирует фенотипические изменения в мышцах обеих конечностей. В контралатеральных быстрой и медленной мышцах после перерезки или передавливания нерва увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

166

ГЛАВА 9. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В ходе исследования проблемы регенерации периферического нерва мы проанализировали механизмы модуляции пластичности фенотипа мотонейронов поясничного отдела спинного мозга и экстрафузальных мышечных волокон скелетных мышц конечностей в условиях повреждения седалищного нерва у лабораторных животных (мыши, крысы, морской свинки). В соответствии с поставленной целью, нами экспериментально проверена гипотеза о влиянии агонистов рецепторов эстрогенов (17Р-эстрадиола и селективного модулятора рецепторов эстрогенов аналога ралоксифена LY117018) на посттравматическую пластичность мотонейронов спинного мозга мыши и выявлены механизмы модуляции пластичности фенотипа клеток в ходе регенерации. Согласно нашим данным, агонисты рецепторов эстрогенов имеют выраженный нейропротекторный эффект в ходе регенерации двигательных волокон периферического нерва. 17р-эстрадиол и LY117018 поддерживают рост и созревание регенерирующих аксонов, ускоряют восстановление функции скелетных мышц. Нами впервые показано, что в мотонейронах спинного мозга мыши экспрессируются обе изоформы рецепторов эстрогенов (ERa и ERP). В ответ на аксотомию экспрессия ERa и ERP существенно усиливается как на уровне мРНК, так белка. Следовательно, для обеспечения внутриклеточных процессов регенерации в мотонейронах увеличивается потребность в рецепторах эстрогенов. При этом эстрогены влияют на режим функционирования клетки через геномный и негеномный механизмы.

Геномный механизм действия эстрогенов на аксотомированные мотонейроны был изучен методом матричной гибридизации комплементарной ДНК. Из 1176 ДНК-проб, иммобилизированных в матрицу, была зарегистрирована активность 265 генов, среди которых 42 гена имели повышенную активность и 21 ген — пониженную. По классическому геномному пути 17Р-эстрадиол усиливал транскрипцию гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Через альтернативный геномный механизм, например, путём активации киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), эстрогены стимулировали экспрессию мРНК ней-ромодулина (GAP-43), индуцированного гипоксией фактора-la (HIF-la) и, вероятно, многих других ERK-активируемых генов. Анализ экспрессии генов в аксо-томированных мотонейронах выявил, что одним из механизмов нейропротектор-ного действия эстрогенов является модуляция экспрессии VEGF. Исходя из полученных данных о дифференциальной активности генов рецепторов эстрогенов

ERa и ERp), рецепторов VEGF (Flk-1 и Flt-1) и рецепторов эндотелинов (ЕТД и ЕТ0), нами сформулировано представление о перекрёстном антиапоптозном сигнале эстрогенов, VEGF и эндотелинов в мотонейронах в ответ на аксотомию.

В исследованиях альтернативного механизма действия эстрогенов впервые получены доказательства значимости эстрогенов в регуляции аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка через активацию ERK-зависимых внутриклеточных каскадов. Нами установлено, что ERK является одним из факторов, контролирующих транспортные потоки в аксоне, при этом 17р-эстрадиол существенно повышает экспрессию ERK в спинном мозге, а также увеличивает накопление и фос-форилирование белка в нервных волокнах периферического нерва. Активированный эстрогенами ERK-каскад усиливает аксонный транспорт и стимулирует синтез белка в аксоне. Подтверждением участия эстрогенов в синтезе белка в аксоплазме служат полученные нами данные о трансляции нейрональной формы р-тубулина внутри аксона и потенцирующем влиянии 17р-эстрадиола на аксонный транспорт в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида.

Таким образом, эстрогены оказывают модулирующее влияние на посттравматическую пластичность мотонейронов, которая выражается в интенсификации процессов внутриклеточной регенерации. В аксотомированных мотонейронах эстрогены поддерживают выживание мотонейронов, стимулируют рост и созревание аксонов, контролируют аксонный транспорт и синтез белка в аксоплазме. Уникальная способность эстрогенов воздействовать на мотонейроны по классическому и альтернативному пути многократно усиливает эффекты гормонов на регенерацию аксонов. Особенно следует отметить возможность эстрогенов регулировать жизненно важные функции мотонейронов, не только на уровне перикариона, но и на всём протяжении аксона.

Применительно к скелетной мышце пластичность её фенотипа была изучена на основании типирования мышечных волокон по качественному составу миозинов. В дополнение к существующим представлениям о пластичности денервированной скелетной мышцы нами показано, что железотранспор-тирующий белок трансферрин усиливает эффект фактора, инициирующего изменения фенотипа мышцы. Так, в денервированной мышце трансферрин повышает экспрессию медленного миозина, а при блокаде аксонного транспорта — быстрого. Согласно нашим данным, перепрограммирование синтеза миозинов наблюдается не только в мышцах денервированной конечности.

В ответ на одностороннее повреждение нерва в контралатеральных быстрой и медленной мышцах увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.

Проведённое нами исследование выявило новые закономерности пластической реакции мотонейронов и скелетной мышцы в условиях повреждения периферического нерва. Нами установлена важная роль эстрогенов в посттравматической регенерации аксонов. В этой связи, на наш взгляд, представляется перспективной разработка клинического применения селективных модуляторов рецепторов эстрогенов для стимуляции посттравматической регенерации периферического нерва у человека.