Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Получение и изучение фармакологической активности спарфлоксацина, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 14.04.02
Автореферат диссертации по медицине на тему Получение и изучение фармакологической активности спарфлоксацина, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот
На правах рукописи
004604773
Буй Тхи Зыонг Квинх
ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СПАРФЛОКСАЦИНА, ВКЛЮЧЕННОГО В НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРА МОЛОЧНОЙ И ГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТ
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
~ 3 и ЮН 2010
МОСКВА - 2010
004604773
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова». Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Аляутдин Ренад Николаевич
доктор фармацевтических наук,
профессор Раменская Галина Владиславовна
Официальныеоппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Чельцов Виктор Владимирович доктор фармацевтических наук,
профессор Казьмина Эмма Максимовна
Ведущая организация: ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Защита состоится «21» июня 2010 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова по адресу 119019, Москва, Никитский б-р, 13
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу 117998, Москва, Нахимовский пр-т, д.49.
Автореферат разослан « ¿У» алррд^ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, ¡/С профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Туберкулез сегодня - пандемия, распространяющаяся по планете с катастрофической скоростью - два миллиарда человек - треть населения мира инфицировано микобактерией туберкулеза (ВОЗ, 2006г.). Каждый десятый заболевает активной формой туберкулеза, 95% которого приходится на туберкулёз органов дыхания. Огромной проблемой является стремительное распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (при резистентности к препаратам первой линии - рифампицину и изониазиду: ежегодно регистрируется 500 ООО новых случаев). Для лечения необходима длительная (до двух лет) терапия дорогостоящими препаратами, вызывающими выраженные побочные реакции. При неэффективности стандартной терапии каждый больной активной формой туберкулеза может заразить еще 10-15 человек в год. В связи с этим, возникла острая необходимость в разработке качественно нового подхода в лечении туберкулеза. Создание наносомальной формы противотуберкулезных средств позволит значительно повысить их эффективность и уменьшить токсичность. В практической медицине, по мере повышения эффективности и безопасности лечения туберкулеза используют нетрадиционные группы антимикробных препаратов, обладающих высокой противотуберкулезной активностью и к которым еще не возникла резистенность, такие как фторхинолоны [7еогщ У1 и др., 2008].
Особо перспективным путем при лечении туберкулеза является использование направленной системы транспорта лекарственных веществ на основе биодеградирующих, биосовместимых, низкотоксичных полимеров (например, сополимер молочной и гликолевой кислот) в инфицированные клетки, например в макрофаги [О'Нага Р. и др.,2000; АшБтоуа У.У., 2000]. При циркуляции таких полимерных носителей, содержащееся в них биологически активное вещество защищено от инактивации. Благодаря своему подходящему размеру, наносомальная форма может целенаправленно проникать в очаг, и постепенно освобождать включенный препарат, поэтому она обладает пролонгированным свойством [Аляутдин Р.Н. и др. 2003]. В последнее время в
литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей и морских свинок [Khuller G.K., and Pandey R, 2005]. Однако эта область применения наночастиц мало изучена. Данное направление исследований приобретает особую актуальность в условиях значительного роста заболеваемости туберкулезом во всех странах мира.
Исходя из вышесказанного, представляется целесообразно получить наносомальную форму препаратов из группы фторхинолонов, в частности спарфлоксацина (СПФ), состоящую из биодеградирующих, биосовместимых полимеров, и включенных в них лекарственные вещества. Можно полагать, что создание такой формы позволит повысить эффективность, уменьшить кратность дозирования и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств.
Цель и задачи исследования
Цель исследования: Разработать наносомальную лекарственную форму спарфлоксацина (СПФ-НЧ) для перорального введения на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГ), с последующим изучением антибактериальной активности и фармакокинетики.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.
1. Разработать методику получения наносомальной формы спарфлоксацина на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот; изучить влияние различных параметров технологического процесса на характеристики наночастиц.
2. Разработать методику анализа спарфлоксацина в наносомальной форме и в биологических образцах. Разработать методику оценки качества наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина.
3. Сравнить противотуберкулезную активность наносомального спарфлоксацина и свободной лекарственной формы спарфлоксацина (субстанция спарфлоксацина).
4. Сравнить фармакокинетику наносомального спарфлоксацина и
зарегистрированной лекарственной формы спарфлоксацина (таблетки 200
мг).
Научная новизна
Впервые разработана наносомальная лекарственная форма спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучены технологические параметры процесса получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина путем наносоосаждения (нанопрецитации).
Впервые изучена противотуберкулезная активность наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Практическая значимость
Показано, что применение наночастиц позволило целенаправленно изменять фармакокинетику спарфлоксацина, способствуя его прологирующему действию. Антибактериальная активность наносомальной формы спарфлоксацина в отношении Mycobacterium tuberculosis аналогична свободной форме.
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной формы спарфлоксацина, могут быть использованы при создании наносомальных систем транспорта других препаратов.
Сформулирован ряд критериев для стандартизации наносомальных лекарственных форм и предложены соответствующие методы оценки качества.
Результаты фармакокинетического исследования могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы спарфлоксацина.
Основные положения, выносимые на зашиту
1. Технология получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, также методы оценки качества полученной лекарственной формы.
2. Результаты оценки антибактериальной активности лекарственных форм спарфлоксацина в отношении микобактерий.
3. Результаты фармакокинетического исследования наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина по сравнению со свободной формой (таблетки 200мг).
Апробация работы
Апробация диссертационной работы прошла на совместном заседании кафедры фармакологии и фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (Москва, 2010).
Материалы работы представлены на: Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008); V Всероссийской Бурденковской научной конференции (Белгород, 2009); Всероссийской научной школе для молодежи, «Наномедицина и нанотоксикология» (Москва, 2009); IV Всероссийской конференции - школе, «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Московская область, 2009); X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Иновационые технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009).
Публикации
Основное содержание диссертации опубликовано в 7 печатных изданиях, в том числе 2 - в ВАК журналах
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, главы I «Обзор литературы», главы II «Материалы и методы», главы III «Результаты и их обсуждение», общих выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 113 листах
машинописного текста и содержит 29 рисунков, 27 таблиц. Список литературы состоит из 135 наименований (115 из которых зарубежные).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод получения. ПЛГ - наночастицы получали методом наносоосаждения в ацетоне. В процессе исследования проводили подбор количества спарфлоксацина и сополимера: спарфлоксацин (в интервале 1-20 мг), полимер ПЛГ (в интервале 10-100 мг) растворяли в 2,5 мл ацетона. К полученному раствору при перемешивании на магнитной мешалке (Magnetic Stirrer, Kika Werke - RT 10 power) при 500 об/мин, температуре 50°C медленно добавляли 5 мл водного раствора плюроника F-68 - 1%. Синтез продолжали еще 2,5 часа, при температуре 40-50°С для выпаривания органического растворителя ацетона. Добавляли криопротектор - маннит (0,3 г), фильтровали через пористый стеклянный фильтр, разливали по флаконам (обычно по 1-2 мл), замораживали и лиофилизовали (лиофильная сушка Heto drywinner, Германия) в течение 24 часов.
Из лиофилизированного порошка, содержащего ПЛГ-наночатицы спарфлоксацина получены твердые капсулы «спарфлоксацина - 0,4».
Методы оценки качества полученной наносомалыюй формы спарфлоксацина. Определение размера наночастиц (методом фотонной корреляционной спектроскопии на наносайзере (Submicron Particle Sizer NICOMP 380, Santa Barbara, California, USA); изучение стабильности спарфлоксацина (по изменению размеров наночастиц и спектрофотометрическим методом); устойчивость лиофилизированных наночастиц к длительному хранению (по показателям размеров частиц); определение степени включения спарфлоксацина (методом ультрацентрифугирования); ресуспендируемось (визуально); количественное определения (спектрофотометрическим методом и методом ВЭЖХ).
Определение антибактериальной активности лекарственных форм спарфлоксацина в отношении микобактерий.
Исследование проведено на базе Национального института фтизиопульмонологии (Вьетнам), в экспериментальных условиях, выполненных in vitro с применением комплекса микробиологических методов исследования.
В качестве биотестов в работе использовали лабораторный штамм Mycobacerium tuberculosis H37Rv и клинический штамм, выделенный из диагностического материала больных туберкулезом, находящихся на лечении в стационаре больницы туберкулеза.
В соответствии с планом исследования на начальном этапе проводили наращивание биомассы тест-штаммов, для чего выбранную культуру засевали на плотную питательную среду Левенштейиа-Иенсена (международный стандарт). Через 21 день из выросшей культуры готовили суспензию микобактерий соответствующую V стандарт оптической плотности (5x108 млн. микробных тел в 1 мл). Готовую суспензию засевали (по 0,2 мл) в пробирки с 2 мл жидкой питательной среды Школьниковой, содержащей изучаемые соединения в соответствующих концентрациях - от 50,0 до 0,05 мкг/мл. Необходимая концентрация препаратов в пробирках достигалась титрованием (метод серийных разведений).
После 14 суток инкубации в термостате при 37°С пробирки с жидкой средой центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин., надосадочную жидкость сливали, а осадок суспензировали в 0,8 мл стерильного 0,9% NaCl. Из 0,1 мл суспензии готовили мазки, которые затем окрашивали по методу Циля-Нильсена. Оставшуюся часть осадка засевали по 0,2 мл в две пробирки с плотной питательной средой Левенштейна-Иенсена. Рост микобактерий на плотной среде учитывали через 21-28 дней культивирования в термостате при 37°С. Контролем служили пробирки, с посевом тест-штаммов не подвергавшихся воздействию СПФ-НЧ и препарата сравнения (спарфлоксацина).
Тактика фармакокинетического исследования.
Для исследования использовали 12 здоровых кроликов-самцов породы Шиншилла (6 животным вводили капсулы, 6 - таблетки). Масса тела кроликов 2,9±0,1 кг, удельные дозы препарата, полученные животными 138,1±5,4 мг/кг.
Животных содержали в стационарных условиях при естественном
световом режиме и стандартном рационе (комбикорм, вода). За 12 часов до начала эксперимента животных лишали пищи, оставляя свободный доступ к воде. Исследуемые лекарственные формы спарфлоксацина вводили кроликам однократно внутрижелудочно в дозе 400 мг (2 таблетки по 200 мг или 1 капсула по 400 мг).
Пробы крови в объеме, достаточном для получения 0,5 мл плазмы, отбирали из краевой ушной вены кроликов шприцом в пластмассовые гепаринизированные пробирки до применения препарата (контрольная проба) и через 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36 и 48 часов после введения. Плазму крови отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в лабораторной центрифуге Beckman J-6B (США) и хранили до анализа при температуре -20°С.
Экстракцию спарфлоксацина из плазмы крови осуществляли по следующей схеме: к пробам плазмы крови (0,5 мл) добавляли 2,5 мл этилацетата, встряхивали пробирку в течение 15 минут в аппарате для встряхивания (Laboratory shaker type 358S, Польша) и центрифугировали 10 минут при 5000 об/мин. Органическую фазу отделяли и выпаривали на водяной бане при 70°С в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,1 мл подвижной фазы. 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую колонку с помощью петлевого крана-дозатора фирмы «Rhcodyne» (США), модель 7125.
Изучение сравнительной фармакокинетики различных лекарственных форм препарата и его относительной биодоступности возможно лишь при наличии высокочувствительного и специфичного метода анализа. Таковым в настоящее время для большинства препаратов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Методику количественного определения спарфлоксацина в биологическом материале с использованием обращённо-фазной ВЭЖХ разрабатывали на основе ранее известных методик.
Хроматографический анализ содержания спарфлоксацина в плазме крови кроликов проводили на жидкостном хроматографе Series 200 фирмы Perkin Elmer (США), оснащенном градиентным насосом, спектрофотометрическим
детектором и компьютером Pentium 4 с программным обеспечением «MultiChrom».
Условия хроматографирования:
Неподвижная фаза - колонка «X Terra MS» фирмы Waters с обращённо-фазным сорбентом С18 (3.0x50 мм; 5 мкм), температура колонки 40°С. При исследовании проводили подбор оптимальный состав подвижной фазы из следующих составов:
Подвижная фаза I - ацетонитрил - вода (pH 2,5; Н3РО4) 20:80 Подвижная фаза II - ацетонитрил - вода (pH 2,5; фосфатный буфер) 15:85 Подвижная фаза III - ацетонитрил - вода (pH 2,5; фосфатный буфер) 20:80
Скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; изократический режим работы насоса; детектирование на УФ-спектрофотометре при Х=297 нм, соответствующей максимуму поглощения вещества; объем петли хроматографа -50 мкл. Хроматографировали при комнатной температуре. Перед хроматографированием подвижную фазу фильтровали и дегазировали на ультразвуковой бане. Такая система очистки позволила избежать появления дополнительных пиков во время анализа.
Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Statistica v6.0». В таблицах представлены средние арифметические значения величин (М), стандартные отклонения среднего результата (SD), стандартная ошибка среднего арифметического (SEM), доверительный интервал (а=0,05), ошибка среднего результата (s%). Данные на рисунках представляются в виде M±SD. Достоверность различий фармакокинетических параметров оценивали по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. Иллюстративный материал представлен с использованием программы «OriginPro».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение экспериментальной лекарственной формы и оценка ее качества
Выбор условий проведения получения ПЛГ-наночастиц, содержащих спарфлоксацин.
Для оптимизации процесса получения и стандартизации ПЛГ-наночастиц были проведены исследования, в результате которых определили оптимальные условия получения.
В ходе проведенных исследований выявили, что оптимальными условиями для получения ПЛГ-наночастиц являются:
• рН среды получения - в пределах от 6,8 до 7.0 (наночастицы с спарфлоксацином, полученные при указанных условиях, были стабильными, имели оптимальный размер частиц (270 - ЗООнм), не образовывали агломератов, процесса коагуляции также не наблюдали);
• Соотношение СПФ:ПЛГ -1:2. Как рассмотривали раньше, способность наноночастиц проникать внутрь клеток наиболее эффективно для частиц размером от 250 до 500 нм. Полученные результаты по размеру наночастиц при разных отношениях СПФ:ПЛГ находятся в этом пределе. При увеличении отношения СПФ:ПЛГ выше 1:2, дальнейшего возрастания степени включения не происходит, в связи с тем целесообразно остановиться на указанном соотношении 1:2.
• Выбор растворителя. При использовании ацетона отмечаются, что с увеличением отношения ПЛГ: ацетон выше 4:1, степень включения в дальнейшем не возрастает, поэтому целесообразно остановиться на указанном соотношении 4:1.
• скорость перемешивания - 500 об/мин, при такой скорости перемешивания процесс получения происходил с минимальным вспениванием, а наночастицы, полученные при перемешивании с данной скоростью, были относительно однородны по размеру частиц.
• стабилизатор и его концентрация - оптимальным при синтезе ПЛГ-
наночастиц является использование в качестве стабилизатора плюроника-Р68 концентрацией 1%.
• Выбор концентрации спарфлоксацина - Размер наночастиц установляется на постоянном уровне со значения концентрации спарфлоксацина 2,0 мг/мл. Поэтому оптимальной исходной концентрацией спарфлоксацина в среде мы сочли 2,0 мг/мл.
Таким образом, полученные нами результаты позволяют рекомендовать следующие условия получения наносомальной формы спарфлоксацина на основе наночастиц из ПЛГ (таблица 1):
Таблица 1
Состав среды синтеза (для получения 5 мл лиофилизата)
№ Компонент Количество
1 Ацетон 2,5мл
2 Сополимер ПЛГ 10 мг
3 Спарфлоксацин-субстанция 5 мг
4 Плюроник Р68,1% 5 мл
Оценка качества полученных наночастиц
В ходе проведенных исследований выявили, что суспензия, приготовленная из наночастиц, полученных при описанных выше условиях, остается стабильной в течение 24 часов. Также при ресуспендировании лиофилизированных наночастиц образуется слегка опалесцирующая суспензия без видимых включений и агломератов.
Следует отметить, что методика отличается хорошей воспроизводимостью: размер наночастиц 270 ± 6,51 нм, степень включения 68,33 ± 2,11 %, выход по спарфлоксацина 87%, содержание спарфлоксацина в 1 мл полученного лиофилизата - 0,445г ± 0,01, соответственно соотношение СПФ на полимер в полученной лекарственной форме составляет 0,445г ± 0,01/1мг.
Предварительная оценка стабильности наносомальной формы спарфлоксацина показала, что через 12 месяцев хранения лиофилизата при 4°С
размер частиц несколько увеличился (на 20-30%), однако не превысил установленного нами предела (<0,5 мкм).
Изучение антибактериальной активности наночастиц с спарфлоксацнном в отношении культуры Mycobacterium tuberculosis
Нами были осуществлены микробиологические исследования на предмет изучения антибактериального действия СПФ-НЧ в опытах in vitro. Целью данного исследования было выяснить, эффективны СПФ-НЧ в отношении культуры Mycobacterium tuberculosis, которые, собственно и являются агентом, вызывающим характерные для туберкулеза поражения органов и тканей.
В работе использовали порошок-субстанцию спарфлоксацина (Dr Reddy's, India) и полученную наносомальную форму спарфлоксацина.
В опытах in vitro определены минимальная подавляющая и минимальная бактерицидная концентрации изучаемого препарата для различных штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ). Всего изучено 2 штамма М. tuberculosis, из них 1 лабораторный - H37Rv и 1 клинический. Клинические изоляты охарактеризованы в отношении противотуберкулезных препаратов как чувствительные. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) препарата определяется как наименьшая концентрация антибиотика при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного времени. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) определяется как наименьшая концентрация антибиотика, способная подавить видимый рост микроорганизмов in vitro.
Подавление видимого роста микобактерий лабораторного штамма H37Rv наблюдалось при достаточно близких значениях концентраций СПФ-НЧ во всех 2 сериях и определялось в пределах от 0,174 ± 0,005 до 0.184 ± 0,005 мг/л в пересчете на спарфлоксацин, для контрольного спарфлоксацина от 0.170 ± 0,006 до 0.190 ± 0,004 мг/л. Средние значения МБК, полученные по результатам 2 серий опытов, составляют для СПФ-НЧ 0.222 мт/л в пересчете спарфлоксацина, для контрольного спарфлоксацина - 0.225 мг/л. (таблица 2).
Таблица 2
Минимальные бактерицидная и подавляющая концентрации СПФ и СПФ-НЧ (мкг/мл) ) для лабораторного и клинических штаммов Mycobacerium tuberculosis
Лабораторный штамм Клинический штамм
СПФ СПФ-НЧ СПФ СПФ-НЧ
Минимальная бактерицидная концентрация, мкг/мл 0,210 ±0,007 0,200 ± 0,005 0,240 ± 0,004 0,244 ± 0,006
Минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл 0,170 ±0,006 0,174 ±0,005 0,190 ±0,004 0,184 ±0,005
Наночастицы с спарфлоксацином обладает высокой бактерицидной активностью в отношении микобактерий туберкулеза как лабораторных, так и клинических штаммов, не уступая спарфлоксацину в традиционной форме. Величины МБК и МПК для лабораторного штамма и клинического штамма статистически достоверно не различаются. Это говорит о том, что спарфлоксацин в достаточном количестве высвобождается из наночастиц, что позволяет ему воздействовать на микобактерий.
Таким образом, можно считать наночастицы перспективной терапевтической системой доставки спарфлоксацина во внутриклеточную среду организма.
Сравнительная фармакокинетика лекарственных форм спарфлоксацина
Параметры для оценки пригодности хроматографической системы представлены в таблице 3 - эффективность колонки по основному пику (число теоретических тарелок Ы) и фактор симметрии (Т), так же указано абсолютное время удерживания 0Г)
Таблица 3
Хроматографические характеристики при использовании различных ПФ
Лекарственное вещество Параметр ПФ I ПФИ ПФШ
Спарфлоксацин 1г, мин 11,72 10,94 9,84
N 7700 9400 17500
Т 1,92 1,57 1,21
Экспериментально установлено, что лучшими показателями при определении спарфлоксацина в лекарственной форме отличалась система ПФ III -ацетонитрил - вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 20:80. При этом эффективность составила максимальное - около 17500 теоретических тарелок (нормативное значение более 2000) и фактор симметрии 1,21, что соответствует стандартным фармакопейным требованием для фактора симметрии -0,8-1,5
Таким образом, было установлено, что в условиях обращено фазовой ВЭЖХ наиболее оптимальное значение эффективности, фактора симметрии и время удерживания пика спарфлоксацина наблюдаются в подвижной фазе ацетилнитрил - вода (рН 2,5; фосфатный буфер) 20:80 при температуре колонки 40°С. Предел обнаружения разработанной методики 80,0 нг/мл.
Концентрацию спарфлоксацина измеряли в плазме крови кроликов в моменты времени, определенные протоколом исследования, и рассчитывали фармакокинетические параметры по полученным фармакокинетическим кривым.
Полученные значения процента экстракции приведены в таблице 4. Установлено, что процент экстракции спарфлоксацина (среднее из 3-х определений на точку) составил: 90,54±1,59%.
Таблица 4
Определение процента экстракции спарфлоксацина из плазмы крови животных
Взято (мкг/мл) Найдено (%) М SEM SD
1.0 92.1 88.3 89.9 90.10 1.10 1.91
5.0 91.2 89.6 90.7 90.50 0.47 0.82
10.0 89.8 89.9 93.4 91.03 1.18 2.05
90.54 0.92 1.59
Метрологическая характеристика методики количественного определения спарфлоксацина в плазме крови (in vitro) представлена в таблице 5.
Таблица 5
Метрологическая характеристика методики количественного определения спарфлоксацина с применением ВЭЖХ в плазме крови (при t(95%;9) =2,26)
Взято (мкг/мл) М SD Доверит, интервал 8% (ошибка метода)
1.00 1.03 0.06 0.052 5.035
5.00 5.05 0.16 0.131 2.590
10.00 10.02 0.08 0.067 0.665
Линейность калибровочных кривых в диапазоне концентраций 0.5 - 50.0 мкг/мл спарфлоксацина плазмы демонстрируется средними коэффициентами корреляции г=0,9989. Калибровочная кривая описывается уравнением: 8=19.84*СХ + 3.49 (где 8 - площадь пика, мВ*с; Сх - концентрация спарфлоксацина, мкг/мл). Калибровочная кривая приведена на рис. 1
Концентрация спарфлоксацина, мкг/мл
Рис. 1. Зависимость концентрации спарфлоксацина от площади хроматографических пиков.
Концентрацию (С) анализируемого вещества в опытных образцах рассчитывали по формуле:
_ СххК С= , где
2
Сх - концентрация вещества, найденная по калибровочной кривой, мкг/мл; V] - объем растворителя сухого остатка, мл; У2 - объем пробы, мл.
В нулевое время (до введения препарата) исследование проб крови у всех животных не показало присутствия в плазме спарфлоксацина. На рисунке 2 представлены фармакокинетические кривые усредненного содержания спарфлоксацина после внутрижелудочного введения изучаемых лекарственных форм (таблеток и капсул) кроликам в дозе 400 мг.
Рис. 2. Фармакокинетические кривые усредненных концентраций спарфлоксацина в плазме крови кроликов после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул в дозе 400 мг.
Из приведенного рисунка 2 видно, что спарфлоксацин, как после введения капсул, так и после введения таблеток, определяется в плазме крови кроликов на протяжении 48 часов. При этом Стах составляет 28,09 ± 2,31 мкг/мл, Ттах - 4 часа для таблеток, а Стах составляет 20,24 ± 2,55 мкг/мл, Ттах - 10 часов для капсул.
В таблице 6 приведены рассчитанные по полученным кривым фармакокинетические параметры: Сшах, Tmax, AUC(0^48), Т1/2, kji, MRT, C1, Vd и
отношение Стах/АиС(0-,48), отражающие степень, скорость всасывания и элиминацию спарфлоксацина при применении изучаемых лекарственных форм и позволяющие оценить его относительную биодоступность.
Таблица 6
Усредненные значения фармакокинетических параметров спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения капсул и таблеток спарфлоксацина
кроликам в дозе 400 мг
№№ Т Атах г ^тах А1ГС(о —48) ке! С1 МЯТ V* С / АиС( 0—48)
Таблетки
М 4 28.09 617.48 14.52 0.048 0.595 15.84 12.20 0.046
- 2.31 88.81 1.83 0.007 0.121 1.04 0.72 0.004
Довер. инт-л а=0,05 1.85 71.06 1.47 0.006 0.097 0.84 0.58 0.003
Капсулы
М 10 20.24 * 647.25 29.23** 0.024* 0.432 22.11 ** 17.97* 0.031
БО - 2.55 95.69 2.72 0.002 0.086 0.43 2.40 0.001
Довер. инт-л а=0,05 - 2.04 76.57 2.17 0.002 0.069 0.34 1.92 0.001
* - достоверность различий фармакинетических параметров спарфлоксацина в плазме крови (* - р <0,05; ** - р<0,01).
35
30
20
15
10
о. 5
0 А-
□ таблетки СПФ Ш капсулы СПФ
Рис. 3. Период полуэлиминации спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг (п=6).
** - статистически достоверное различие параметра (р <0,01)
03
4
□ таблетки СПФ И капсулы СПФ
Рис. 4. Среднее время удерживания спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг.
** - статистически достоверное различие параметра (р <0,01)
Рис. 5. Кажущий объем распределения спарфлоксацина после однократного внутрижелудочного введения таблеток и капсул препарата в дозе 400 мг.
* - статистически достоверное различие параметра (р <0,05)
Из материалов основных фармакокинетических параметров спарфлоксацина, представленных в таблице 6 и рис. 3,4,5 видно, что действующее вещество всасывается быстрее из желудочно-кишечного тракта при применении таблетированной лекарственной формы. Максимальные концентрации спарфлоксацина достигаются быстрее после введения таблеток (Ттах=4,0 ч) по сравнению с капсулами (Ттах=10,0 ч) и составляют соответственно 28,09±2,31 мкг/мл и 20,24±2,55 мкг/мл, Величины Стах для таблеток и капсул достоверно различаются (р <0,05). Периоды полуэлиминации препарата (Т1/2) статистически достоверно (р<0,01) увеличивается в 2 раза после введения капсул (Т1/2=29,23±2,72 ч) по сравнению с Т1/2 таблеток (Тщ=14,52±1,83 ч) (рис.3), поэтому препарат медленнее выводится и соответственно дольше находится в кровяном русле после введения капсул. Дополнительным подтверждением более интенсивной элиминации действующего вещества из плазмы крови животных после введения таблеток также является низкая величина среднего времени удерживания лекарственного вещества в организме (МЯТ=15,84±1,04 ч) в сравнении с аналогичными фармакокинетическими
параметрами, рассчитанными для капсул (МКТ=22,11±0,43 ч). Величины МЯТ для капсул и таблеток между собой достоверно различаются (р<0,01) (рис.4). Статистически достоверно увеличивается кажущийся объем распределения (У<|) после введения капсул (р<0,05) (рис.5), что свидетельствует о более полном распределении и большем степени проникновения препарата в ткани и клетки организма.
Таким образом, проведенное на кроликах исследование особенностей фармакокинетики разработанной лекарственной формы спарфлоксацина (капсулы желатиновые, действующее вещество в виде ПЛГ-наночастиц 400 мг) и оценка его относительной биодоступности в сравнении с таблетками (200 мг), выпускаемыми промышленностью, показало, что пероральное введение спарфлоксацина в виде ПЛГ - наночастиц в капсулах приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: статистически достоверно (р<0,01) увеличивается период полуэлиминации (Т1/2), статистически достоверно возрастает среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (МЯТ) (р<0,01) и кажущийся объем распределения (Уй) (р<0,05), но при этом площадь под фармакокинетической кривой «концентрация - время» (АиС(0_48)) достоверно не изменяется и относительная биодоступность составляет 104,8%.
Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле в концентрациях достаточных для эффективного воздействия, что позволяет предположить пролонгацию действия спарфлоксацина в виде ПЛГ-наночастиц в капсулах.
ВЫВОДЫ
1. Разработана методика получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе биодеградирующих наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот.
2. Предложены методы качественного и количественного определения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
3. Показана высокая антибактериальная активность наночастиц с спарфлоксацином в отношении микобактерий туберкулеза как лабораторных, так и клинических штаммов.
4. Отработана методика изучения фармакокинетики наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе ПЛГ. Пероральное введение спарфлоксацина в виде ПЛГ-наночастиц в капсулах приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: статистически достоверно увеличиваются период полуэлиминации (Т1/2) (р<0,01), среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT) (р<0,01) и кажущийся объем распределения (Vd) (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле, что соответствует более полное и длительное распределение препарата в тканях и позволяет предположить пролонгацию действия спарфлоксацина в виде ПЛГ - наночастиц в капсулах.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Буй Т.К. Разработка наносомальных противотуберкулезных средств // Международный форум по нанотехнологиям, 2008. - С. 499-450.
2. Буй Т.З.К, Блынская Е.В., Аляутдин Р.Н. Изучение фармакокинетической особенности наносомальной формы спарфлоксацина по сравнению со свободной формой // X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Иновационые технологии в биологии и медицине», 2009. - С. 18-19.
3. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх, Аляутдин Р.Н., Алексеев К.В. Разработка технологии и фармакокинегтическое исследование наноразмерных систем доставки лекарственных веществ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот // Всероссийская научная школа для молодежи, раздел «наномедицина и нанотоксикология», 2009. - С. 7-9.
4. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх, Аляутдин Р.Н., Алексеев К.В. Исследование динамики фармакокинетических наноразмерных систем доставки лекарственных веществ на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот // IV Всероссийская конференция - школа, СИетШ 2009.- С.5.
5. Блынская Е.В., Буй Зыонг Квинх. Обоснование составов и технологических режимов создания наносомальных систем направленного транспорта лекарственных веществ на основе сополимеров молочной кислоты. // V Всероссийской Бурденковской научной конференции (Белгород, 2009). - С. 3839;
6. Алексеев К.В., Аляутдин Р.Н., Блынская Е.В., Квинх Буй.Т. Основные направления в технологии получения наноносителей лекарственных веществ // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - № 2. - С. 142 -145.
7. Буй Тхи Зыонг Квинх, Блынская Е.В., Аляутдин Р.Н., Раменская Г.В., Бапабаньян В.Ю. Фармакокинетическое изучение наносомальной формы и свободной форм спарфлоксацина // Фармация. - 2010. - № 2. - С 42-44.
Оглавление диссертации Буй, Тхи Зыонг Квинх :: 2010 :: Москва
Список основных сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Наносомальная система направленного транспорта лекарственных веществ
1.2. Наносомальная система транспорта лекарственных веществ как способ повышения эффективности противотуберкулезных агентов
1.3. Применение производных фторхинолона при туберкулезе
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Методы получения и оценка качества наносомальной формы спарфлоксацина.
2.2.2. Получение и оценка качества твердых капсул, содержащих наночастицы с спарфлоксацином
2.2.3. Определение антибактериальной активности лекарственных форм спарфлоксацина в отношении штаммов микобактерий
2.2.4. Сравнительное фамакокинетическое исследование лекарственных форм спарфлоксацина.
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Получение наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина ^
3.2 Выбор различных технологических параметров для получения оптимальной наносомальной формы спарфлоксацина 58 3.3. Оценка качества полученной наносомальной формы спарфлоксацина.
3.4. Оценка качества полученных капсул. Оптиманизация метода ВЭЖХ для качественного и количественного анализа наносомального спарфлоксацина в капсулах.
3.5. Изучение антибактериальной активности наночастиц с спарфлоксацином в отношении культуры
Mycobacterium tuberculosis
3.6. Сравнительная фармакокинетика наносомальной и свободной лекарственной формы спарфлоксацина
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Буй, Тхи Зыонг Квинх, автореферат
Актуальность темы
Туберкулез сегодня - пандемия, распространяющаяся по планете с катастрофической скоростью - два миллиарда человек - треть населения мира инфицировано микобактерией туберкулеза (ВОЗ, 2006г.). Каждый десятый заболевает активной формой туберкулеза, 95% которого приходится на туберкулёз органов дыхания. Огромной проблемой является стремительное распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (при резистентности к препаратам первой линии — рифампицину и изониазиду: ежегодно регистрируется 500 ООО новых случаев). Для лечения необходима длительная (до двух лет) терапия дорогостоящими препаратами, вызывающими выраженные побочные реакции. При неэффективности стандартной терапии каждый больной активной формой туберкулеза может заразить еще 10-15 человек в год. В связи с этим, возникла острая необходимость в разработке качественно нового подхода в лечении туберкулеза. Создание наносомальной > формы противотуберкулезных средств позволит значительно повысить их эффективность и уменьшить токсичность. В практической медицине, по мере повышения эффективности и безопасности лечения туберкулеза используют нетрадиционные группы антимикробных препаратов, обладающих высокой противотуберкулезной активностью и к которым еще не возникла резистенность, такие как фторхинолоны [75].
Особо перспективным путем при лечении туберкулеза является использование направленной системы транспорта лекарственных веществ на основе биодеградирующих, биосовместимых, низкотоксичных полимеров (например, сополимер молочной и гликолевой кислот) в инфицированные клетки, например в макрофаги [21;28]. При циркуляции таких носителей, содержащееся в них биологически активное вещество (БАВ) защищено от инактивации. Благодаря своему подходящему размеру, наносомальная форма может целенаправленно проникать в очаг, и постепенно освобождать включенный препарат, поэтому она обладает пролонгированным свойством
115]. В последнее время в литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей и морских свинок [113; 114]. Однако эта область применения наночастиц мало изучена. Данное направление исследований приобретает особую актуальность в условиях значительного роста заболеваемости туберкулезом во всех странах мира.
Исходя из вышесказанного, представляется целесообразно получить наносомальную форму препаратов из группы фторхинолонов, в частности спарфлоксацина, состоящую из биодеградирующих, биосовместимых полимеров, и включенных в них лекарственные вещества. Можно полагать, что создание такой формы позволит повысить эффективность, уменьшить кратность дозирования и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств. Цель и задачи исследования
Цель исследования: Разработать наносомальную лекарственную форму спарфлоксацина для перорального введения на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот, с последующим изучением антибактериальной активности и фармакокинетики.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.
1. Разработать методику получения наносомальной формы спарфлоксацина на основе наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот; изучить влияние различных параметров технологического процесса на характеристики наночастиц.
2. Разработать методику анализа спарфлоксацина в наносомальной форме и в биологических образцах. Разработать методику оценки качества наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина.
3. Сравнить противотуберкулезную активность наносомального спарфлоксацина и свободной лекарственной формы спарфлоксацина (субстанция спарфлоксацина).
4. Сравнить фармакокинетику наносомального спарфлоксацина и зарегистрированной лекарственной формы спарфлоксацина (таблетки 200 мг).
Научная новизна
Впервые разработана наносомальная лекарственная форма спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучены технологические параметры процесса получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина путем соосаждения (нанопрецитации).
Впервые изучена противотуберкулезная активность наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Впервые изучена фармакокинетика наносомальной лекарственной формыспарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
Практическая значимость
Показано, что применение наночастиц позволило целенаправленно изменять фармакокинетику спарфлоксацина, способствуя его прологирующему действию. Антибактериальная активность наносомальной формы спарфлоксацина в отношении Mycobacterium tuberculosis аналогична свободной форме.
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения наносомальной формы спарфлоксацина, могут быть использованы при создании наносомальных систем транспорта других препаратов.
Сформулирован ряд критериев для стандартизации наносомальных лекарственных форм и предложены соответствующие методы оценки качества.
Результаты фармакокинетического исследования могут быть использованы при выборе доз и режимов лечения в последующих биологических испытаниях наносомальной формы спарфлоксацина.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы прошла на совмесном заседании кафедры фармакологии и фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (Москва, 2010).
Материалы работы представлены на:
Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008);
V Всероссийской Бурденковской научной конференции (Белгород, 2009);
Всероссийской научной школе для молодежи, «Наномедицина и нанотоксикология» (Москва, 2009);
IV Всероссийской конференции - школе, «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Московская область, 2009);
X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Инновационые технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009).
Публикации
Основное содержание диссертации опубликовано в 7 печатных работах.
Структура и объем диссертации
Заключение диссертационного исследования на тему "Получение и изучение фармакологической активности спарфлоксацина, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот"
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Разработана методика получения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе биодеградирующих наночастиц из сополимера молочной и гликолевой кислот.
2. Предложены методы качественного и количественного определения наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе сополимера молочной и гликолевой кислот.
3. Показана высокая антибактериальная активность наночастиц с спарфлоксацином в отношении микобактерий туберкулеза как лабораторных, так и клинических штаммов.
4. Отработана методика изучения фармакокинетики наносомальной лекарственной формы спарфлоксацина на основе ПЛГ. Пероральное введение спарфлоксацина в виде ПЛГ-наночастиц в капсулах приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: статистически достоверно увеличиваются период полуэлиминации (Ti/2) (р<0,01), среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT) (р<0,01) и кажущийся объем распределения (Vd) (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле, что соответствует более полное и длительное распределение препарата в тканях и позволяет предположить пролонгацию действия спарфлоксацина в виде ПЛГ - наночастиц в капсулах.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Буй, Тхи Зыонг Квинх
1. Аляутдин Р.Н., Джинждихашвили И.А.,Курахмаева К.Б., Балабаньян
2. B.Ю., Петров В.Е., Воронина Т.А. Направленный транспорт лекарственных веществ в мозг с помощью нанотранспортных систем. // Молекулярная медицина. — 2008. №3 . - С. 21-25.
3. Басел А.А., Петров В.Е., Балабаньян В.Ю., Гельперина С.Э., Трофимов
4. C.С, Воронина Т.А., Аляутдин Р.Н. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц, покрытых полисорбатом-80. // Российский медю журнал. 2006. - №4. - С. 28-38.
5. Государственная фармакопея СССР XI: Выпуски 1,2: репринтное издание-М.:Тимотек, 1998.
6. Дорофеев B.JL, Титов И.В., Арзамасцев А.П. Использование метода УФ-спектрофотометрии для количественного определения лекарственных средств группы фторхинолонов. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. 2004. - Вып.2. - С. 205-209.
7. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В, Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. - 384 с.
8. Коновалов А.А., Дороффев В.Л., Арзамасцев А.П. Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов III и IV поколений с использованием метода ВЭЖХ. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. 2004. -Вып.2. - С. 216-221.
9. Ю.Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. Москва: ГЭОТАР-МЕД, 2002.-192 с.
10. П.Падейская Е.Н. Фторхинолоны: значение, развитие исследований, новые препараты, дискуссионные вопросы. // Антибиотики и химиотерапия. — 1998.-Вып. 11.-С. 38-44.
11. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. — Москва: Издательство РАМН, 2000. 52 с.
12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. М.: ОАО Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.
13. Н.Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В.А. Фармакокинетика. — М.: Медицина, 1980.-423 с.
14. Стыскин E.JL, Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. Москва: Химия, 1986. -288 с.
15. Сюбаева С.Е., Дорофеев В.Л., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ в анализе лекарственных средств группы фторхинолонов. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. 2004. - Вып.2. — С. 258-265.
16. Хеншен А., Хупе К.-П., Лотшпайх Ф., Вёльтер В. (ред.) Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Москва: Мир, 1988.-688 с.
17. Цой А.Н., Архипов В.В. Спарфлоксацин в терапии инфекционных заболеваний. // Лечащий врач. 2006. - Вып. 8. - С.2-11.
18. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: основы теории, методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Зинатне, 1988. — 390 с.
19. Шмелев Е.И., В.И. Чуканов. Применение фторхинолонов при туберкулезе. // Пульмонология и фтизиатрия. 2000. - Vol.2(10). - Р. 429431.
20. Ahsan F., Rivas I.P., Khan М.А., Torres Suarez A.I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers liposomes and microspheres on the phagocytosis by macrophages. // J. Control Release. 2002 Vol. 79(1-3) P.29-40.
21. Ain Q., Sharma S, Khuller GK, Garg SK. Alginate-based oral drug delivery system for tuberculosis: pharmacokinetics and therapeutic effects. // J. Antimicrob Chemother.- 2003.- Vol. 51(4) .- P.931-938.
22. Ain Q., Sharma S., Garg S.D., Khuller G.D. Role of poly(DL-lactide-co-glycolide) in development of a sustained oral delivery system for antitubercular drug(s). //International Journal of Pharmaceutics.-2002.-Vol.239.-P. 37-46.
23. Alyautdin R., Gothier D., Petrov V., et al. Analgesic activity of the hexapeptide dalargin adsorbed on the surface of the polysorbate 80 coated poly (butyl cyanoacrylate) nanoparticles. // Eur J Pharm and Biopharm. - 1995. - Vol. 41(1). — P.44.
24. Alyautdin R.N., Petrov V.E., Kreuter J, Langer K., Kharkevich D.A. Delivery of loperamide across the blood-brain barrier with polysorbate 80 coated poly-butylcyanoacrylate nanoparticles. // Pharm Res. 1997. - Vol. 14(3). - P. 325328.
25. Alyautdin R.N., Rrichel A., Lobebberg R., et al. Interaction of poly (butylcyanoacrylate) nanoparticles with the blood-brain barrier in vivo and in vitro. // J Drug Target. 2001. - Vol. 9(3). -P. 209-221.
26. Alyautdin R.N., Tezikov E.B., Ramga P., et al. Significant entry of tubocurarine into the brain of rats by adsorption to polysorbate 80 coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles: in situ brain perfusion study. // J
27. Microencapsul. 1998. - Vol.l5(l). - P. 67.
28. Arnold M.M., Gorman E.M., Shieber L.J., Munson EJ., Berklad C. NanoCipro encapsulation in monodispaerse large porous PLGA microparticles. // J Control Release. -2007. Vol.121 (1-2)/ - P.100-109.
29. Aso Y., Yoshioka S., Po A.L.W., Terao, Т., Effect of temperature on mechanisms of drug-release and matrix degradation of poly(D,L-lactide) microspheres. // J. Controlled Release.-1994. Vol.31.- P.33-39.
30. Azoulay-Dupuis, E., E. Vallee, J. P. Bedos, and J. J. Pocidalo. Efficacy of sparfloxacin (SPFX) in experimental mouse pneumonia models. // Program Abstr. 30thlntersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother., abstr. 1245.
31. Bala I., Hariharan S., Kumar M.N. PLGA nanoparticles in drug delivery: the state of art. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2004. - Vol. 21. - P.387-422.
32. Balland O., Pinto-Alphandary H., Pecquet S., Andremont A., and Couvreur, P. The uptake of ampicillin-loaded nanoparticles by murine macrophages infected with Salmonella typhimurium. // J. Antimicrob. Chemother.-1994 Vol.33(3).- P.509-522.
33. Behan N, Birkinshaw C, Clarke N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation // Biomaterials.-2001 Jun.- Vol.22(11).- P.1335 -1344.
34. Ben-Dov I., and G. R. Mason. Drug-resistant tuberculosis in a Southern California Hospital. Trends from 1969 to 1984. // Am. Rev. Respir. Dis. 1994.- Vol.35.-P.1307-1310.
35. Bodmeier R. and Mcginity, J.W., Solvent selection in the preparation of poly(D,L-Lactide) micro-spheres prepared by the solvent evaporation method. // Int. J. Pharm.-1998.- Vol.43.- P. 179-186.
36. Borner K., Borner E., and Lode H. Determination of sparfloxacin in serum and urine by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. — 1992, Vol.579(2), P: 285-289.
37. Bouissou C., Van der Walle C. Poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres. // J. Taylor and Francis Group.: 2006. - P. 81-93.
38. Brady J.M., Cutright D.E., Miller R.A., and Barristone G.C., Resorption rate, route of elimination and ultrastructure of the implant site of polylactic acid in the abdominal wall of the rat. // J. Biomed. Mater. Res.- 2003.- Vol.7.- P.155-166.
39. British Pharmacopeia (2009)
40. Bummer PM. Physical chemical considerations of lipid-based oral drug delivery: solid lipid nanoparticles. // Crit Rev Ther Drug Carrier System. — 2004.- Vol.21.-P. 1-20.
41. Cao S.X., Zhang J.Y., Ji X.M., and Liu H.M. Quantitative analysis of sparfloxacin injection by high performance liquid chromatography. // Se Pu -2001, Vol.l9(5),P: 454-456.
42. Chaw C.S., yang Y.Y., Lym I.J., Phan T.T. Water-soluble betamethasone-loaded poly (lactide-co-glycolide) hollow microspheres as a sustained release dosage form. // J. microencapsulation. 2003. - Vol.20(3). - P.349-359.
43. Choi S.H., Park T.G. G-CSF loadedbiodegradable PLGA nanoparticles prepared by single oil-in-water emulsion method. //Int J Pharm. 2006. - Vol. 311(1-2). P.223-228.
44. Chu D. T. W., and P. B. Fernandes. Structure-activity relationships of the fluoroquinolones. // Antimicrobial Agents Chemotherapy .-1998.- Vol. 33.-P.131-135.
45. Conley J, Yang H, Wilson T, и соавт Aerosol delivery of liposome-encapsulated ciprofloxacin: aerosol characterization and efficacy against Francisella tularenis infection in mice. // Antimicrobial Agents Chemother.-1997.-Vol.41.-P.1288-1292.
46. Culliton B. J. Drug-resistant ТВ may bring epidemic. // Nature (London).- 1998.-Vol. 356.- P:473.
47. Damge C., Michel C., Aprahamian M., Couvreur P., and Devissaguet J.P. Nanocapsules as carriers for oral peptide delivery. // J. Controlled Release.-I990.-Vol. 13(2—3).-P.233-239.
48. Deng M. and Uhrich K.E. Effects of in vitro degradation on properties of poly(D,L-lactide-co-glycolide) pertinent to its biological performance // J. Mater. Sci.— Mater. Med.-2002.-Vol. 13.-P. 1091-1096.
49. Dhillon J, Fielding R, Adler-Moore J, Goodall RL, Mitchison D. The activity of low-clearance liposomal amikacin in experimental murine tuberculosis. // J Antimicrob Chemother.- 2001 Dec. Vol.48(6). - P.869-76.
50. Donald PR, Sirgel FA, Venter A, Smit E, Parkin DP, Van de Wal BW, Mitchison DA The early bactericidal activity of a low-clearance liposomal amikacin in pulmonary tuberculosis. // J Antimicrob Chemother. 2001 Dec/ -48(6). — P.877-880
51. Drug Information for the Health Care Professional USP DI, 23rd ed.,2003.
52. Dutt M, Khuller GK. Chemotherapy of Mycobacterium tuberculosis infections in mice with a combination of isoniazid and rifampicin entrapped in Poly (DL-lactide-co-glycolide) microparticles. // J Antimicrob Chemother. 2001 Jun. -Vol.47(6). - P.829-835.
53. Dutt M, Khuller GK. Sustained release of isoniazid from a single injectable dose of poly (DL-lactide-co-glycolide) microparticles as a therapeutic approach towards tuberculosis. // Int J Antimicrob Agents. 2001 Feb. -Vol.l7(2).-P.l 15-122.
54. Dutt M, Khuller GK. Therapeutic efficacy of Poly(DL-lactide-Co-Glycolide)-encapsulated antitubercular drugs against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice. // Antimicrob Agents Chemother. 2001 Jan. -Vol.45(l). -P.363-366.
55. Elder AC, Gelein R, Oberdorster G, Finkelstein J, Notter R, Wang Z. Efficient depletion of alveolar macrophages using intratracheally inhaled aerosols of liposome-encapsulated clodronate. // Exp Lung Res.- 2004 Mar. Vol.30 (2). -P.105-120.
56. Ellard, G. A. Absorption, metabolism and excretion of pyrazinamide in man.// Tubercle. 1969.-Vol.50. -P.:144-158.
57. European Pharmacopeia, 6th ed. (2007).
58. Fattal E., Youssef M., Couvreur P., and Andremont A. Treatment of experimental salmonellosis in mice with ampicillin-bound nanoparticles. // Antimicrob. Agents Chemother.- 1999.- Vol.33(9). P. 1540-1543.
59. Fawaz F., Bonini F., Maugein J., Lagueny A.M. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles: pharmacokinetics and in vitro antimicrobial activity. // International Journal of Pharmaceutics. 1998. Vol.168.-P. 255-259
60. Florence AT. Issues in oral nanoparticle drug carrier uptake and targeting. // J Drug Target.- 2004. Vol.12. - P.:65-70.
61. Fuminori I., Hiroyuki F., Kimiko M. Factor affecting the loading efficiency of water-soluble drugs in PLGA microspheres. // Colloids and Surfaces В.- 2008.1. Vol 61. -P.25-29.
62. Fuminori I., Hiyuki F., Kimiko M. Incorporation of water-soluble drugs in PLGA microspheres. // Colloids and Surfaces B. 2007. - Vol.54. - P. 173178.
63. Gaspar MM, Neves S, Portaels F, Pedrosa J, Silva MT, Cruz ME. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection. // Antimicrob Agents Chemother. 2000 Sep. - Vol.44(9). - P.2424-2430.
64. Gelperina S., Kisich K., Iserman M., and Heilfets. The potential adventages of nanoparticle drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. // American journal of respiratory and critical care medicine. 2005. - Vol. 172.1. P.1487-1490.
65. Gref R., Minamitake Y. , Peracchia M.T., Trubetskoy V. , Torchilin V., and Langer, R., Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. // Scienc. — 1994.-Vol. 263(5153).-P. 1600-1603.
66. Grislain L., Couvreur P., Lenaerts V., Roland, M., Deprez-Decampeneere, D., and Speiser, P. Pharmacokinetics and distribution of a biodegradable drug-carrier. // Int. J. Pharm.-1993. Vol. 15(3). - P. 335-345.
67. Grosset, J. H. Present status of chemotherapy for tuberculosis. // Rev. Infect. Dis.1989. Vol.11. - P.347-352.
68. Jeong YI, Na HS, Seo DH, Kim DG, Lee HC Jang MK, Nang Sk, Roh SH, Kim SI, and Nah JW. Ciprofloxacin-encapsulated poly (dl lactde-co-glycolide) nanoparticles and its antibacterial activity. // Int J Pharm. 2008
69. Mar.-Vol. 352 (1-2). -P.317-323.
70. Ji. В., С. Truffot-Pernot, and J. Grosset. In vitro and in vivo activities of sparfloxacin (AT-4140) against Mycobacterium tuberculosis. // Tubercle. 1991. -Vol. 72. —P.181-186.
71. Kabanov A.V., Lemieux P., Vinogradov S., Alakhov V. Pluronic® block copolymers: novel functional molecules for gene therapy. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2004. - Vol. 54. - P. 223-233
72. Kamberi M., Kamberi P., Hajime N., Uemura N., Nakamura K., and Nakano S. Determination of sparfloxacin in plasma and urine by a simple and rapid liquid chromatographic method. // Ther. Drug Monit. 1999, Vol.21(4), P:411-415.
73. Khuller G.K., and Pandey R. Sustained Release drug delivery systems in management of tuberculosis. // Indian J Chest Dis Allied Sci. 2003. - Vol.45. - P. 229-230.
74. Khuller G.K., Kapur M., Sharma S. Liposome technology for for drug delivery against mycobacterial infections. // Curr Pharm Des. 2004. - Vol.10. - 32633274.
75. Klose D., Siepmann F., Elkharraz K., Krenzlin S., Siepmann J. How porosity and size affect the drug release mechanisms from PLGA-based microparticles. '// International Journal of Pharmaceutics. 2006. - Vol.314. - P. 198-206.
76. Kreuter J, Alyautdin RN, Kharkevich DA, Ivanov AA. Passage of peptides through the blood-brain barrier with colloidal polymer particles (nanoparticles). // Brain Res. 1995. - Vol. 674. - P. 171-174.
77. Kreuter J, Shamenkov D, Petrov V, Ramge P, Cychutek K, Koch-Brandt C, Alyautdin R: Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. // J Drug Target. 2002. - Vol. 10. - P. 317
78. Labana S, Pandey R, Sharma S, Khuller GK. Chemotherapeutic activity against murine tuberculosis of once weekly administered drugs (isoniazid and rifampicin) encapsulated in liposomes. // Int J Antimicrob Agents.- 2002 Oct. — Vol.20(4). -P.301-304.
79. Lamprecht A. Ubrich N., Hombreiro M., Lehr C., Hoffman M., Maincent P. Biodegradable monodispersed nanopartcles prepared by pressure homogenization-emulsifiction. // International Journal of Pharmaceutics. — 1999.-Vol.184.-P.97-105.
80. Lemaire V. , Belair J., and Hildgen P. Structural modeling of drug release from biodegradable porous matrices based on a combined diffusion/erosion process. // Int. J. Pharm.- 2003. Vol.258. - P. 95-107.
81. Luna-Herrera J., Duzgune? N., Flasher D., Reddy M., , and Gangadharam P. Treatment of intracellular Mycobacterium avium complex infection by free and liposome-encapsulated sparfloxacin.// Antimicrob Agents Chemother. 1996. - Vol.40(l 1). - P.2618-2621.
82. Lyon D.J., Cheung S.W., Chan C.Y., and Cheng A.F.B. Rapid HPLC assay of clinafloxacin, fleroxacin, levofloxacin, sparfloxacin and tosufloxacin. // J. Antimicrob. Chemother. 1994, Vol.34, P:446-448.
83. Manisha Dutt and G.L. Kuller. Chemotherapy of Mycobacterium tuberculosis infection in mice with a combination of isoniazid and rifampicin entrapped in
84. Poly (dl-lactide-co-glycolide) microparticles. // J. Antimicrobial Chemotherapy.-2001. Vol.47. - P: 829-835.
85. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol Rev 2001. Vol.53. - P. 283318
86. Montay G., Bruno R., Vergniol J.C., и соав. Pharmacokinetics of sparfloxacin in humans after single oral administration at doses of 200, 400, 600, and 800 mg. // J. Clin. Pharmacol. 1994, Vol.34, P: 1071-1076.
87. Muller, R.H. Colloidal Carriers for Controlled Drug Delivery and Targeting. // CRC Press, Boca Raton FL. 1991. - P. 7-10.
88. Pandey R, Khuller G.R. Solid lipid particle-based inhalable suistained drug delivery system against experimetal tuberculosis. // Tuberculois (Edinb). -2005. Vol.85. - P.227-234.
89. Pandey R, Zahoor A, Sharma S, Khuller GK. Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against murine tuberculosis. // Tuberculosis (Edinb). 2003. - Vol.83(6). - P.373-378.
90. Pistner H., Bendix D.R., Muhling J., and Reuther, J.F. Poly(L-lactide) — a long-term degradation study invivo. Analytical characterization. // Biomaterials. 1993. - Vol. 14. - P.291-298.
91. Pretet S., A. Lebeaut R. Parrot C. Truffot J. Grosset A. T. Dinh-Xuan, and G.E.T.I.M. Combined chemotherapy including rifabutin for rifampicin and isoniazid resistant pulmonary tuberculosis. // Eur. Respir. J.-1999. Vol. 5:680684.
92. Quenelle DC, Staas JK, Winchester GA, Barrow EL, Barrow WW. Efficacy of microencapsulated rifampin in Mycobacterium tuberculosis-infected mice. // Antimicrob Agents Chemother.- 1999 May. Vol.43(5). - P. 1144-1151.
93. Salem I.I., Flasher D.L., Duzgunes N. Liposome-encapsulated antibiotics. И Methods Enzymol. 2005. - Vol.391. -P.261-291.
94. Seijo В., Fattal E., Roblot-Treupel L., Couvreur P. Design of nanoparticles of less than 50 nm diameter: preparation, characterization and drug loading. // International Journal of Pharmaceutics. 1999. - Vol.62. - P. 1-7
95. Sethuraman VV, Hickey AJ. Powder properties and their influence on dry powder inhaler delivery of an antitubercular drug. // AAPS PharmSciTech. -2002. — Vol.3(4). — P.28.
96. Sham J.O., Zhang Y., Filay W.H., Lobenberg R. Formulation and cheracterization of spray-dry powders containing nanoparticles for aerosol delivery to the lung. // Int J Pharm. 2004. - Vol.269. - P.457-467.
97. Shamenkov D A; Petrov V E; Alyautdin R N. Effects of apolipoproteins on dalargin transport across the blood-brain barrier. // Bulletin of experimental biology and medicine. 2006. - Vol. - 142(6). - P.703-6.
98. Sharma A, Pandey R, Sharma S, Khuller GK. Chemotherapeutic efficacy of poly (DL-lactide-co-glycolide) encapsulated antitubercular drugs at subtherapeutic dose against experimental tuberculosis. // Int J Antimicrob Agents. 2004. - Vol.24. - P.599-604.
99. Sharma A, Sharma S, Khuller GK. Lectin-functionalized poly (lactide-co-glycolide) nanoparticles as oral/aerosolized antitubercular drug carriers for treatment of tuberculosis. // J Antimicrob Chemother. 2004. - Vol.54. -P.761-766.
100. Simardeep G., Lobenberg R, Thbitha K., Shirzad A., Wilson R., and Elmar J. Nanoparticles: Characteristics, mechanisms of action, and toxicity in pulmonary drug delivery — a Review. // Journal of biomesical nanotechnology.- 2007. Vol.3. - P. 107-119.
101. Spenlehauer G., Vert M., Benoit J.P., and Boddaert A., Invitro and invivo degradation of poly(D,L-lactide glycolide) type microspheres made by solvent evaporation method. // Biomaterials. 2006. - Vol. 10, 557-563.
102. Suarez S, O'Hara P, Kazantseva M, Newcomer CE, Hopfer R, McMurray DN, Hickey AJ. Airways delivery of rifampicin microparticles for the treatment of tuberculosis. // J Antimicrob Chemother. 2001 Sep. - Vol.48(3). -P.431-434.
103. Thanoo B.C., Doll W.J., Mehta R.C., Digenis G.A., and DeLuca P.P., Biodegradable indium-Ill labeled microspheres for in vivo evaluation of distribution and elimination, Pharm. Res. 1995. - Vol.12. - P. 2060-2064.
104. The United States pharmacopeia, 30th revision (2007).
105. Trautmann M., Ruhnke M., borner K., Wagner J., and Koeppe P. Pharmacokinetics of sparfloxacin and serum bactericidal activity against pneumococci. // Antimicrobial Agens and chemotherapy. 1996. - Vol. 40(3). -P. 776-779.
106. Tsapis N., Bennett D., Jackson В., Weitz D.A., Edwards D.A. Trojan particles: large porous carrier of nanoparticles for drug delivery. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - Vol.99. - P.12001-12005.
107. Uchegbu I. Polymers in Drug Delivery. CRC Taylor & Francis Group, 2006.- P. 70-78.
108. Valerie L., Chantal T.P., Anne P., Jacques G., and Baohong J. Powerful Bactericidal Activity of Sparfloxacin (AT-4140) against Mycobacterium tuberculosis in Mice. // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1993. — Vol. 37(3). — P.407-413.
109. Verdun C., Brasseur F., Vranckx H., Couvreur P., and Roland M., Tissue distribution of doxorubicin associated with polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles. // Cancer Chemother. Pharmacol.- 1990. Vol.26(l). -P. 13-18.
110. Vinogradov S.V., Bronich Т.К., Kabanov Alexander V. Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2002. -Vol. 54. - P. 135-147
111. Von Burkersroda F., Schedl L., and Gopferich A. Why degradable polymers undergo surface erosion or bulk erosion. // Biomaterials. 2002. -Vol. 23. - P. 4221^4231.
112. Williams A., Graham J.H., Simon O., Karen E.G. Evaluation of vaccines in the EU ТВ Vaccine Cluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis. // Tuberculosis. 2005. - Vol.85. - P.29-38.
113. Wissing S.A., Kayser O., Muller R.H. Solid lipid nanoparticles for parenteral drug delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. - Vol.56. - P. 1257-1272.
114. World Health Organization Working Group. 1991. Tuberculosis research and development. WHO/TB/91-162. World Health Organization, Geneva.
115. Yoshioka S., Aso Y., and Kojima S., Drug release from poly (dl-lactide) microspheres controlled by gamma-irradiation. // J. Controlled Release. — 1995. -Vol. 37.-P. 263-267.
116. Zhu G., Mallery S.R., and Schwendeman S.P., Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide-co-glycolide). // Nat. Biotechnol.-2000.-Vol.18.-P. 52-57.