Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическое изучение наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека JURKAT WT

На правах рукописи

Боят Ваня

Фармакологическое изучение наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека

ЛЛЖАТ\УТ

Специальность 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

4857582

Работа выполнена на кафедре фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Аляутдин Ренад Николаевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, Профессор

Доктор медицинских наук, Профессор

Гарибова Таисия Леоновна

Сейфулла Рошен Джафарович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится _ 2011 года в _часов на

заседании Диссертационного совета Д.001.024.01 при Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ Фармакологии имени В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Е.А.Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Современная химиотерапия злокачественных новообразовании располагает арсеналом высокоактивных дитостатиков. Однако в клинической практике терапевтическая эффективность не всегда может быть достигнута, что в определенной степени обусловлено множественной лекарственной устойчивостью опухолевых клеток (Aller S.G., 2009; Yuan H., 2008). Одним из механизмов, определяющих резистентность опухолевых клеток к цитостатикам, является система активного выведения препарата из клеток, представленная Р-гликопротеином и белком множественной лекарственной устойчивости (Aller S.G., 2009; Chavanpatil M.D., 2006; Van der Sandt I.C.J., 2001). С целью преодоления этого барьера увеличивают дозы лекарственных препаратов, что в значительной степени приводит к усугублению побочных эффектов со стороны различных органов и систем. Таким образом, многие цитостатики, являющиеся субстратом Р-гликопротеина, теряют свою клиническую значимость (Huang J., 2008). Актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к преодолению множественной лекарственной устойчивостью посредством создания наносомальных форм цитостатиков, позволяющих доставить лекарственное вещество внутрь клеток. На сегодняшний день этот подход реализован в наносомальных препаратах на основе альбумина (Абраксан, производитель Абраксис (США)), полиглютаминовой кислоты (Ксиотакс, производитель Сел Терапеутикс (Южная Корея)), полимерных мицелярных наночастиц (Генексол, производитель Самиянг (Южная Корея)) и липосомальных наночастиц (Келикс, производитель Шеринг-Плау (США)). Представитель группы таксанов, паклитаксел обладает мощным цитотоксическим эффектом в исследованиях in vitro, однако его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: немелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом. Паклитаксел входит в европейские и российские клинические рекомендации как препарат первой и второй линии при

перечисленных выше показаниях (Артамонова Е.В., 2004; Переводчикова Н.И., 2001, Tulpule, 2002; Dhillon, 2005; Stebbing, 2006). Паклитаксел является субстратом Р-глнкопротеина в связи с чем, его эффективность в отношении резистентных опухолей существенно снижается (Vicari L., 2008; Prabu P., 2010; Huang J., 2008; Chavanpatil M.D., 2006). Низкая растворимость паклитаксела требует введения в лекарственную форму высокотоксичного солюбилизатора Cremophor EL®, а также ограничивает создание его лекарственных форм. Преодолеть множественную лекарственную устойчивость и улучшить биофармацевтические характеристики паклитаксела представляется возможным с использованием нанотехнологического подхода, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: Целью настоящего исследования явилось изучение внутриклеточного накопления наносомального паклитаксела и его цитотоксической активности в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA), определить % включения паклитаксела и размер полученных наночастиц.

2. Изучить кинетику высвобождения паклитаксела из матрикса наночастиц.

3. Исследовать внутриклеточное накопление наносомальной формы паклитаксела в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

4. Изучить противоопухолевую активность наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT) с использованием стандартных методик оценки цитотоксичности.

5. Изучить влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на способность наночастиц с паклитакселом подавлять функцию Р-гликопротеина.

Научная новизна:

Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела путем включения его в полимерный матрикс сополимера PLGA. Установлено, что размер наночастиц (НЧ) составил 300±100 нм, процент включения паклитаксела - 90-99%. Показано, что наносомальный

Впервые установлена способность наносомальной формы паклитаксела проникать и накапливаться в ядрах высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Впервые установлено, что использование НЧ приводит к 4-кратному повышению цитотоксичности паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat WT в сравнении с обычным раствором паклитаксела.

Практическая значимость:

Показана возможность преодоления опухолевой резистентности за счет включения паклитаксела в полимерный матрикс PLGA наночастиц в присутствии Pluronic® F68 и полисорбата 80 на клеточной линии высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Выявленные внутриклеточное накопление и цитотоксическая активность in vitro создают предпосылки для дальнейшего доклинического изучения наносомальной формы паклитаксела на клетках высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза.

Предложена для дальнейшего доклинического изучения наносомальная форма паклитаксела с улучшенными биофармацевтичевскими характеристиками.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно изготовлена наносомальная форма паклитаксела на основе PLGA, и выполнено

дальнейшее фармакокинетическое и фармакологическое изучения на модели высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека .Гигка! \УГ.

Апробация работы:

Основные положения и выводы диссертационной работы доложены на второй международной конференции «Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии» (Томск, 2010), научно -методической конференций кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (Москва, 2010), 11-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), VII Международной научно-практической конференция «Наука и современность» (Новосибирск, 2011).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 5 статьей, в том числе 4 статьи - в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 1- в зарубежном журнале и 4 тезиса в материалах российских и международных конференции.

Объем и структура диссертации:

Работа изложена на 125 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 143 источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 5 отечественных и 138 иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенная технология, позволяет получить стабильную наносомальную форму паклитаксела на основе сополимера РЬСА.

2. Наносомальная форма паклитаксела обеспечивает проникновение и цитотоксический эффект паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

3. Цитотоксическая активность наносомальной формы паклитаксела проявляется в диапазоне низких концентрации (от 1*10"6М до 6.8*10'бМ), в отличие от раствора паклитаксела, который в данном диапазоне концентрации не проявлял цитотоксическую активность.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Получение наночастиц с паклитакселом и определение их физико-химических характеристик

Наночастицы получали методом замены растворителя (соосаждения). 0.5 - 10 мг паклитаксела (Calbiochem, США), 100 мг PLGA (Absorbable Polymers International, США) растворяли в 5 мл ацетона. Полученный раствор смешивали с 10 мл 1% водного раствора полоксамера 188 (Pluronic F68, BASF, Германия); образовавшуюся суспензию перемешивали при помощи магнитной мешалки в течение 2-3 часов при температуре 50-60°С для удаления органического растворителя, после чего добавляли 3% раствор маннита. Затем суспензию фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» (размер пор 3 мкм) и лиофилизовали (Alpha Christ 2-4). Наночастицы для флуоресцентной микроскопии получали аналогичным способом. В качестве флуоресцентного маркера в состав наночастиц вводили 0,05 % раствора кумарина-6.

Размер наночастиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) (Coulter N4MD, Coulter Electronics).

Процент включения паклитаксела в наночастицы в лиофильно высушенных образцах определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе SP 8000 фирмы «Спектра-Физикс» (США) после обработки образца метанолом для растворения паклитаксела и разрушения наночастиц.

Выход паклитаксела (в процентах) определяли как отношение паклитаксела, найденного в образце, к введенному в синтез.

Ptx %=(Выход Ptx/Введенный Ptx) *100% Стабильность наносомальной формы паклитаксела определяли методом ускоренного хранения «замораживания-оттаивания». Наносомальную форму паклитаксела подвергали трем циклам замораживания-оттаивания «-20°С-комнатная температура (+20°С)»

Тест-высвобождение паклитаксела из наночастиц проводили в шейкере-термостате при 37.2 °С. Суспензию наночастиц разбавляли до концентрации паклитаксела 2 мкм/мл в 70 мл среды для высвобождения. В качестве среды для высвобождения использовали: а) фосфатный буфер (Химмед, Россия) (pH 7.4); б) 1% полисорбат 80 (BASF, Германия) в фосфатном буфере (pH 7.4). В качестве контроля использовали раствор паклитаксела. Среду для высвобождения инкубировали с различными формами паклитаксела и через определенные промежутки времени аликвоту суспензии отбирали, подвергали ультрафильтрации (микрофильтры Microcon 30 kDa, 20 минут, 15000 оборотов в минуту) (Центрифуга Eppendorf 5418, Германия), аликвоту ультрафильтрата переносили во флаконы емкостью 5 мл, высушивали (10 мин, 120 градусов) и хроматографически проводили количественное определение паклитаксела.

Микроскопическое исследование внутриклеточного накопления наночастиц проводили методом флуоресцентной микроскопии.

В клеточные культуры добавляли 1 мл суспензии наночастиц с кумарином-6 (Sigma, США), спустя 2 ч инкубации фиксировали клетки 70% раствором этанола и выдерживали при температуре 37 °С 20 минут. Затем клетки трижды промывали фосфатным буфером и добавляли пропидий йодид в концентрации 1 мкг/мл (PI, Sigma, США) для окрашивания клеточных ядер. По окончанию окрашивания клетки трижды промывали фосфатным буфером и рассматривали методом флуоресцентной микроскопии (Olympus ВХ51). При микроскопическом изучении НЧ с

кумарином-6 флуоресцировали зеленым светом, а ядра клеток окрашивались в красный цвет.

Цитотоксическая активность экспериментальных форм определялась в трех биохимических тестах: МТТ-тесте пролиферативной активности клеток

3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил-2-Н-тетразолия бромид (МТТ), лактатдегидрогеназном (ЛДГ) и адезинотрифосфатном (АТФ) (Хабриев Р.У., 2005).

Инкубация клеток. Клетки Jurkat WT были предоставлены НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей им. H.H. Блохина РАМН. Клетки Jurkat WT в экспоненциальной фазе роста на питательной среде (90% RPMI 1640 без глутамина, 10% FBS-эмбриональная телячья сыворотка, витамины, незаменимые аминокислоты, L-глутамин (Sigma, США)) пересевали в лунки 96- или 24-лучночного планшета (50-100 тыс. клеток в лунку), инкубировали в атмосфере 5% С02 при 37°С. Через 12 ч. инкубации вносили аликвоты исследуемых форм до получения концентраций 10"4 M - 5*10'7 M паклитаксела (Calbiochem, США). Клетки инкубировали в присутствии различных форм паклитаксела при 37°С в атмосфере 5% С02 в течение 24 часов. Контролем служили интактные клетки, инкубированные в аналогичных условиях (методика Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей- Лаборатория фармакоцитокинетики).

Методика изучения цитотоксической активности экспериментальных форм в МТТ-тест. В контрольные и опытные образцы клеточных культур за

4-6 часов до окончания инкубации вносили по 10 мкл раствора МТТ (3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил-2-Н-тетразолия бромид, стоковый раствор 5 мг/мл, Sigma, USA). По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 5-7 минут. Супернатант отбирали, вносили в каждую лунку по 60 мкл ДМСО (Sigma, USA); осадки ресуспендировали и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем определяли оптическую плотность раствора формазана при длине волны 540

нм (спектрофотометр вертикального сканирования Titerteck Multiscan МСС/340 (Flow Lab., USA)). Результаты измерения обрабатывали с использованием программы Elisafit.

Методика изучения цитотоксической активности экспериментальных форм в лактат-дегидрогеназном тесте. В контрольные и опытные образцы клеточных культур за 4-6 часов до окончания инкубации вносили 0,1% раствора Тритон Х-100 (Химмед, Россия). По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 5-7 минут. Супернатант отбирали, вносили в каждую лунку по 10 мкл соли тетразолия (Roche, Швейцария); осадки ресуспендировали и инкубировали 30 минут при 37°С. Определяли оптическую плотность раствора формазана при длине волны 590 нм.

Методика изучения цитотоксической активности экспериментальных форм в АТФ-тесте. В контрольные и опытные образцы клеточных культур за 30 минут до окончания инкубации вносили по 100 мкл реакционной смеси (содержащей люциферин и люциферазу CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, США). Измеряли интенсивность люминесценции (люминометр Microlumat LB 96Р (Berthold, Германия)).

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием программы STATISTICA 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение наночастиц с паклитакселом методом замены растворителя.

Наночастицы получали методом замены растворителя (метод соосаждения или нанопреципитация) (Galindo-Rodriguez S.A. et al., 2005; Fonseca С. Et al. 2002), который широко используется для получения наночастиц с нерастворимыми в воде лекарственными веществами. Органическая фаза с растворенным в ней лекарственным веществом перемешивается с водной фазой, в которой присутствует ПАВ.

Перемешивание происходит при температуре 50-60°С с помощью магнитной мешалки. Использование магнитной мешалки позволяет уменьшать размер частиц органической фазы, которая подвергается диспергированию.

По мере удаления органического растворителя, растворимость паклитаксела и полимера снижается, что, при правильном подборе параметров синтеза, приводит к образованию частиц субмикронного размера (300±100 нм). В процессе оптимизации технологии варьировали количество паклитаксела, введенного в синтез. Выход паклитаксела был тем ниже, чем выше было его исходное количество. Это обусловлено тем, что РЬвА обладают определенной сорбционной емкостью и могут сорбировать определенное количество ЛВ; затем происходит насыщение сорбента, и повышение количества сорбируемого вещества не влияет на его конечный выход. При исходном соотношении паклитаксел/полимер 1 к 100 и ниже синтез проходил практически без потерь по лекарственному веществу (таб.1).

Метод получения Исходные количества компонентов Выход РТХ, % Потери по полимеру

Органическая фаза Водная фаза

РТХ РША растворитель 1%Полоксамер 188

НП 0.5 мг 100 мг Ацетон 5 мл 10 мл 99.5 нет

НП 1 мг 100 мг Ацетон 5 мл 10 мл 91.4 нет

НП 3 мг 100 мг Ацетон 5 мл 10 мл 9,2 нет

НП 10 мг 100 мг Ацетон 5 мл 10 мл 4,7 нет

НП - нанопреципитация (соосаждение, замена растворителя), РТХ - паклитаксел, Р1ЛЗА -сополимер молочной и гликолевой кислот

Таблица 1. Влияние технологических параметров получения наночастиц на выход паклитаксела.

Следует также отметить, что при любом соотношении паклитаксел/полимер образовывалась гомогенная суспензия, легко проходящая через фильтр с размером пор 3 мкм, что косвенно свидетельствует об отсутствии потерь по полимеру. Методика отличается хорошей воспроизводимостью: средний размер частиц 250-300 нм, % включения паклитаксела составил - 90 - 99%. После добавления криопротектора маннита полученная лекарственная форма была устойчива к

замораживанию и последующей лиофилизации: суспензия не теряла агрегативной устойчивости после, по меньшей мере, 3 циклов <<-20°С -+20°С».

Изучение высвобождения паклитаксела из наночастиц

Тест высвобождения был проведен на 4-х образцах: чистый паклитаксел (Р1х), паклитаксел с полисорбатом 80 (Р1х-Р880), наносомальный паклитаксел (РТХ-МР), наносомальный паклитаксел с полисорбатом 80 (РТХ-ИР-Р880).

Кинетические кривые высвобождения паклитаксела представлены на рис. 1.

Показано, что за сутки высвобождается 60-90% паклитаксела из наночастиц. Из рисунка 1 следует, что наносомальный паклитаксел имеет двухфазную кинетику высвобождения.

100 ------------------------------------

0 -1-1-1-1

0 20 40 60 80

время, часы

Рисунок 1. Кинетические кривые различных форм паклитаксела в тесте высвобождения in vitro

В течение первых 10 часов происходит активное высвобождение паклитаксела (примерно 70%) из наночастиц с полисорбатом 80 (PTX-NP-PS80), что может быть обусловлено растворением и диффузией препарата, который плохо включился в полимерный матрикс. Схожие эффекты при тесте высвобождения паклитаксела in vitro был уже ранее описаны в

литературе (Ни I. Et al. 2007; Ми L. Et al. 2003) и получили название «эффект взрыва». В последующие 60 часов наблюдается более медленное и длительное высвобождение JIB (оставшиеся 30%), что можно объяснить диффузией препарата, локализованного в матриксе наночастиц. Наносомальная форма паклитаксела (PTX-NP) обеспечивала плавное высвобождение паклитаксела в течение 24 часов в фосфатном буфере (рН 7.4), имитирующей плазму крови и внутриклеточную жидкость. В процессе высвобождения паклитаксела из наносомальной формы без суперпокрытия мы тоже наблюдали «эффект взрыва», однако его выраженность проявлялась в меньшей степени, чем в присутствии полисорбата 80 (ПС-80) (за первые 10 часов высвободилось 45% JIB).

Введение в инкубационную среду ПС-80 в качестве солюбилизатора обеспечивало более высокую скорость высвобождения паклитаксела по сравнению с немодифицированным фосфатным буфером.

Использование ПС-80 в технологии получения наносомальной формы паклитаксела было обусловлено его способностью солюбшшзировать трудно растворимый паклитаксел. Кроме того, согласно литературным данным (Chavanpatil M.D. et al. 2006; Ambruosi A. et al. 2006; Sun W. et al. 2004), полисорбат-80 способен ингибировать р-гликопротеин - мембранный белок, ответственный за обратный транспорт ксенобиотиков во внеклеточную среду. Р-гликопротеин экспрессируется клетками Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat WT, в связи с чем представляло интерес сравнить цитотоксическую активность паклитаксел-содержащих наночастиц не только со свободным паклитакселем, но и с композициями, содержащими ПС-80. Изучение внутриклеточного накопления наночастиц

Для подтверждения проникновения наночастиц в высокорезистентные клетки Jurkat WT нами было проведено микроскопическое исследование. Флуоресцентная микроскопия показала, что PLGA НЧ (без паклитаксела) с флуоресцентным (FITC) кумарином-6 захватываются клетками Jurkat WT. После инкубации клеток с НЧ, мечеными кумарином-6, наблюдается

интенсивная флуоресценция 11Ч. При микроскопическом рассмотрении клеток через пропидий йодид фильтр ядра окрашены в красный цвет (рис.2А). Флуоресценция кумарина-6 наблюдается как вокруг ядер так и в самих ядрах (рис.2Б), что указывает на захват клетками Дигка! ШТ меченых наночастиц. При наложении первых двух изображении четко видно расположение наночастиц относительно ядер (рис.2В).

Рисунок 2. Внутриклеточное распределение наночастиц в клетках ,1игка1 \УТ. Клеточные ядра окрашивались пропидия йодидом, на фото они красного цвета (А) НЧ с флюоресцентным кумарином-6 зеленого цвета (Б). Наложение первых двух рисунков представленых на рисунке (В). Увеличение 62 раза.

Нами также была проведена сравнительная флуоресцентная микроскопия внутриклеточного распределения простых РЬОА наночастиц и наночастиц с суперпокрытием ПС-80 (рис. ЗА и ЗБ соответствено).

Рисунок 3. Внутриклеточное распределение наночастиц в клетках 1игка1 WT. Клетки были инкубированы в течении 2 ч с РЬвА наночастицами, мечеными флуоресцентным кумарином-6 (А). НЧ, покрытые ПС-80 с кумарином-6 (Б).

После инкубации клеток с НЧ, мечеными кумарином-6 наблюдается интенсивная флуоресценция обычных НЧ и НЧ, покрытых ПС-80. Флуоресценция обычных НЧ, меченых кумарином-6, наблюдается преимущественно вокруг клеточных ядер (рис.ЗА) (красные ядра окрашены пропидия йодидом). Интенсивная флуоресценция наночастиц, покрытых ПС-80, наблюдается как в цитоплазме, так и в самих ядрах высокорезистентных клеток Ляка! \УТ (рис. ЗБ).

Изучение цитотоксической активности различных форм паклитаксела

Внутриклеточное накопление и противоопухолевая активность НЧ с паклитакселом были изучены на мультирезистентной клеточной линий .Гигка! \\ГГ. Для оценки цитотоксической активности наноформ паклитаксела были использованы три биохимических теста: МТТ, ЛДГ и АТФ, которые обладают разной чувствительностью и основаны на различных механизмах детекции повреждающего действия цитостатиков (Р^аЫв в. Е1 а1. 2006). Согласно литературным данным цитотоксическая активность препарата считается высокой, если подавляется не менее 50% (ИК50) клеточной биомассы. При этом цитотоксичность препарата должна проявляться в диапазоне низких концентрации (10"5 - 10"6). Повышение ИК50 до 10"4 приводит к увеличению токсического воздействия на здоровые органы и ткани (Хабриев Р.У., 2005). Экспериментальные формы паклитаксела тестировалась в диапазоне концентрации от - 10"7 до 10"4. ИК50 определяли графически (рис. 4,5,6). МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил-2-Н-тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимые в воде голубые кристаллы формазана. При этом количество образовавшегося формазана прямо пропорционально числу выживших

клеток. В МТТ тесте раствор паклитаксела в диапазоне концентрации от 5*10-7 до 1*10-4 не достигал ИК50. При этом % клеток, сохранивших жизнеспособность превысил 100%, что свидетельствует об отсутствии цитотоксической активности раствора паклитаксела в отношении 1игка1 \ЛГГ клеток. Наночастицы с паклитакселом не модифицированые ПС-80 достигали ИК50 начиная от концентрации 6,8*10-6 и выше; % выживших клеток в зависимости от тестируемых концентрации составил 45% при концентрации 6,8*10-6 и 30% при концентрации 1*10-4. Таким образом НЧ с паклитакселом без ПС-80 в отличие от раствора паклитаксела оказывают цитотоксический эффект в низком диапазоне концентрации. Наибольшей цитотоксической активностью обладали НЧ с паклитакселом, модифицированные ПС-80; ИК50 достигалось в концентрации 6,8*10-6, при этом 39% клеток сохранило жизнеспособность. В самой высокой из исследуемых концентрации 1*10-4 только 25% клеток сохранило жизнеспособность, (рис.4).

120% г ■

к

I-

5*10-7 1*10-6 6,8*10-6 1*10-5 5*10-5 1*10-4

Концентрация паклитаксела, М

ЕЗ Паклитаксел ЕПаклитаксел+наночастицы ^Паклитаксел+наночаст|лцы+пописорбат80

Рисунок 4. Цитотоксичность различных форм паклитаксела в МТТ тесте *- достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0,01) ЛДГ тест основан на измерении активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), выделившейся из цитоплазмы поврежденных клеток. Выделившаяся

ЛДГ восстанавливает NAD+ до NADH+ путем окисление лактата в пируват. Во второй ферментативной реакции 2Н+ переносятся с NADH+ на желтую соль тетразолия (2-(4-йодофенил)-3 -(4-нитрофенил)-5фенил-2Н-тетразолия хлорид); в ходе реакции получается водорастворимый красный формазан. В ЛДГ тесте раствор паклитаксела в диапазоне концентрации от 5*10-7 до 1*10-4 не достигал ИК50. При максимальной исследуемой концентрации 1*10-4, % клеток сохранивших жизнеспособность составил 78%, что свидетельствует об низкой цитотоксической активности раствора паклитаксела в отношении Jurkat WT клеток. Наночастицы с паклитакселом не модифицированные ПС-80 достигали ИК50 начиная от концентрации 6,8*10-6 и выше; % выживших клеток в зависимости от тестируемых концентрации составил 47% при концентрации 6,8*10-6 и 27% при концентрации 1*10-4. НЧ с паклитакселом, модифицированные ПС-80, достигали ИК5о в концентрации 6,8*10-6, при этом 44% клеток сохранило жизнеспособность. В самой высокой из исследуемых концентрации 1*10-4 только 25% клеток сохранило жизнеспособность. Результаты оценки цитотоксичности, полученные в ЛДГ тесте, коррелируют с данными МТТ теста (рис.5). При этом между раствором паклитаксела и его наносомальными формами наблюдаются статистически достоверные различия (р<0,01).

5*10-7 1*10-6 6,8*10-6 1*10-5 5*10-5 1*104

ЕЗПаклитаксел ОЛаклитаксел+наночастицы О Паклитаксел+наночастицы+полисорбат80

Рисунок 5. Цитотоксичность различных форм паклитаксела в ЛДГ тесте *- достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0,01) АТФ теет основан на измерении АТФ в метаболически активных клетках с использованием фермента люциферазы. Люцифераза катализирует реакцию образования света из ее субстрата люциферина и АТФ. Свет, выделившийся в ходе реакции, измеряется на люминометре в относительных световых единицах (БШи).

Данные АТФ теста показывают отсутствие цитотоксической активности раствора паклитаксела в концентрациях 5*10-7 6,8*10-6. В более высоких концентрациях 1*10-4 цитотоксическая активность была выше, однако ИК50 не достигалось и жизнеспособность сохранило 60% меточной массы. Наночастицы с паклитакселом не модифицированные ПС-80 достигали ИК50 начиная от концентрации 6,8*10-6 и выше; % выживших клеток в зависимости от тестируемых концентрации составил 30% при концентрации 6,8*10-6 и 18% при концентрации 1*10-4. В АТФ тесте наносомальная форма паклитаксела модифицированная ПС-80 достигала ИК50 в минимальной концентрации 1 *10"6 М и в максимальной концентрации 1*10-4 % выживших клеток составил 15% (рис.6).

ИПаклитаксел О Паклитаксел+наночастицы О Паклитаксел+наночастицы+полисорбат80

Рисунок 6. Цитотоксичность различных форм паклитаксела в АТФ тесте

*- достоверные отличия относительно контрольной группы (р<0,01)

Во всех трех тестах снижение концентрации раствора паклитаксела с 1*1СГ4М до 6.8*10~6М приводило к постепенному снижению его цитотоксичности, а в концентрации 6.8*10"6 М количество жизнеспособных клеток составляло 95% по отношению к контролю. Очевидно, что в больших разведениях активность паклитаксела снижается. В концентрации 6.8*10"6 М наносомальные формы паклитаксела проявили выраженный цитотоксический эффект в сравнении с обычным раствором паклитаксела -в МТТ и ЛДГ тестах жизнеспособность сохранили около 30-40 % клеток, а в АТФ тесте - 27% клеток. Наносомальные формы паклитаксела перешли порог ИК50 во всех трех биохимических тестах в низком диапазоне концентрации 6.8* 10"6 и ниже (таб.2). Кроме того, в АТФ тесте наносомальная форма паклитаксела с ПС-80 достигла ИК50 в концентрации 1*10"6, при этом количество выживших клеток составило 48%.

Наличие выраженной цитотоксической активности наносомальных форм в отличие от обычного раствора паклитаксела свидетельствует о способности наносомального паклитаксела проникать в клетки 1игка1 \¥Т,

эксспресирующие Р-гликопротеин. Предположительно, входящие в состав экспериментальных форм паклитаксела ПС-80 и полоксамер 188 способны подавлять функцию Р-гликопротеина (Gallo J.M. et al. 2003).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что НЧ на основе РЬвА способны повышать цитотоксичность паклитаксела в отношении мультирезистентных клеток ,1игка1 \УТ.

Цитотоксический Паклитаксел Паклитаксел+наночастицы Паклитаксел+наночастицы+ полисорбат 80

тест ик50 % выживших ик50 % выживших ИК5„ % выживших

значения клеток при ИК 50 значения клеток при ИК 50 значения клеток при ик50

МТТ не достигнуто 6,8*10"' 44,1% 6,8*10"6 39,1%

ЛДГ не достигнуто 6,8*10"6 47,8% 6,8*10"6 44,1%

АТФ не достигнуто - 6,8*10'6 30,3% 1*ю-6 48,6%

Таблица 2. Значение ИК50 для разных форм паклитаксела, полученные в разных цитотоксических тестах

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. Предложенная технология позволяет получать стабильную наносомальную суспензию с размером частиц 300±100 нм при степени сорбции паклитаксела 90-99,5%.

2. Наносомальная форма позволяет обеспечить плавное, длительное и полное высвобождение паклитаксела из матрикса наночастиц. Высвобождение паклитаксела из наносомальной формы составило 90%, при продолжительности высвобождения около 80 часов.

3. Флуоресценция наночастиц в цитоплазме и в ядрах опухолевых клеток подтверждает проникновение наночастиц в высокорезистентные клетки Т-лимфобластного лейкоза (1игка1 \УТ).

4. Цитотоксическая активность наносомальных форм паклитаксела в МТТ, ЛДГ и АТФ тестах проявляется в низком диапазоне концентрации (от

1*10"6М до 6.8*10"6М). При этом раствор иаклитаксела не достигает ИК 50 в диапазоне указаных концентрации.

5. Цитотоксической активностью в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза (Jurkat WT) обладают наносомальные формы паклитаксела, модифицированные полоксамером 188 и/или полисорбатом 80.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Боят В. Лекарственные формы паклитаксела [Текст]/Боят В., Оганесян Е.А., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Российский Биотерапевтический Журнал,- 2009,- №3,- С. 37-44.

2. Боят В. Изучение цитотоксической активности наносомального паклитаксела на клеточной линии JURKAT WT [Текст]/Боят В., Баранов Д.С., Оганесян Е.А., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Российский Биотерапевтический Журнал.-2010.- №3,- С. 5-6.

3. Боят В. Получение наносомальной лекарственной формы паклитаксела [Текст]/Боят.В., Хамди Я., Оганесян Е.А., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Фармация,- 2010,- №4,- С. 32-33.

4. Боят В. Противоопухолевая активность паклитаксела, включенного в матрикс полимерных наночастиц [Текст]/Боят В., Баранов Д.С., Оганесян Е.А., Хамди Я.М., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Сборник научных работ с материалами трудов 2-ой международной телеконференции «Фундаментальные наука и практика». Томск- 2010.- №3, Том 1,- С. 90-92.

5. Боят В., Внутриклеточное накопление наносомального паклитаксела в высокорезистентной клеточной линии JURKAT WT [Текст]/Боят В., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н. // Сборник материалов VII Международной научно-практической конференции «Наука и современность». Новосибирск -2010.-С. 130-132.

6. Боят В. Цитотоксическая активность и внутриклеточное накопление наночастиц с паклитакселом [Текст]/Боят В. Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.//Российский Биотерапевтический Журнал. 2011.- №1,- С.13.

7. Боят В. Цитотоксический эффект паклитаксела, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот [Текст] /Боят В., Баранов Д.С., Оганесян Е.А., Хамди Я.М., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,-2011.- Т.151, №3,- С. 315-318.

8. Боят В. Внутриклеточное накопление и противоопухолевая активность наносомальных форм паклитаксела [Текст]/Боят В., Балабаньян В.Ю., Аляутдин Р.Н.// Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2011,-Т.74, №3.- С. 22-25.

9. Bojat V. The entrapment of paclitaxel in PLGA nanoparticles increases its cytotoxicity against multiresistant cell line [TeKCT]/Bojat V., Balabanyan V.Yu., Alyautdin R.N.// British Journal of Medicine and Medical Research. -2011,-№1(4).-P. 306-319.

Подписано в печать дата: 03.10.11 Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 1056. Объем б п. л. Отпечатано в типографии ООО «Линия отрыва».

Паклитаксел - химиотерапевтическое средство из группы таксанов, ингибитор образования микротрубочек с антиангиогенным и апоптотическим действием [1,2]. Паклитаксел обладает мощным цитотоксическим эффектом в исследованиях in vitro [37, 41, 44, 48, 49, 64, 68, 93, 117, 121,140], при этом его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: не-мелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом. Отсутствие активности паклитаксела in vivo в определенной степени обусловлено множественной лекарственной устойчивостью опухолевых клеток [8, 10, 144, 122]. Одним из механизмов, определяющих резистентность опухолевых клеток к цитостатикам, является система активного транспорта препарата из клеток, представленная Р-гликопротеином и белком множественной лекарственной устойчивости [24, 25, 26, 27, 127]. С целью преодоления этого барьера увеличивают дозы лекарственных препаратов, что в значительной степени приводит к усугублению побочных эффектов со стороны различных органов и систем. Таким образом, многие цитостатики, являющиеся субстратом Р-гликопротеина, теряют свою клиническую значимость [54, 58]. Паклитаксел является субстратом Р-гликопротеина, что существенно снижает его эффективность при лечении высокорезистентных опухолей, продуцирующих Р-гликопротеин [21, 54]. В доступной литературе отсутствуют данные по цитотоксической активности наносомального паклитаксела в отношении высокорезистентных опухолевых клеток. В этой связи, значительный интерес представляет изучение наносо-мальной формы паклитаксела на высокорезистентных клеточных линиях, в частности на клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (JurkatWT). Аффинитет к Р-гликопротеину в сочетании с низкой растворимостью субстанции, требующей включения в состав лекарственной формы токсичных солю-билизаторов Cremophor EL® и этанола, создали предпосылки для разработки наносомальной формы паклитаксела. На сегодняшний день этот подход реализован в наносомальных препаратах на основе альбумина (Абраксан, производитель Абраксис, США), полиглютаминовой кислоты (Ксиотакс, производитель Сел Терапеутикс, США), полимерных мицелярных наночастиц (Ге-нексол, производитель Самиянг, Южная Корея) и липосомальных наночастиц (Келикс, производитель Шеринг-Плау, США). Известно, что включение лекарственных веществ в матрикс наночастиц с последующим покрытием поверхности различными поверхностно-активными веществами, приводит к внутриклеточному накоплению лекарственных веществ, в том числе субстратов Р-гликопротеина [12, 13, 14, 147]. Кроме этого, эффект повышенной проницаемости новообразованных капилляров опухоли также приводит к накоплению и выходу наночастиц из сосудистого русла в зону опухолевого роста [125, 143, 146]. Преодолеть множественную лекарственную устойчивость и улучшить биофармацевтические характеристики паклитаксела нам представляется возможным с использованием нанотехнологического подхода, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось изучение внутриклеточного накопления наносомального паклитаксела и его цитотоксической активности в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Дигк^ \УТ).Разработать технологию получения и подходы к стандартизации нано-сомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликоле-вой кислоты (РЬСА).

1. Разработать технологию получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислоты (РЬвА), определить % включения паклитаксела и размер полученных наночастиц.

2. Изучить кинетику высвобождения паклитаксела из матрикса наночастиц.

3. Исследовать внутриклеточное накопление наносомальной формы паклитаксела в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

4. Изучить противоопухолевую активность наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT) с использованием стандартных методик оценки цитоток-сичности.

5. Изучить влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на способность наночастиц с паклитакселом подавлять функцию Р-гликопротеина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела путем включения его в полимерный матрикс сополимера PLGA. Установлено, что размер наночастиц (НЧ) составил 300=Ы 00 нм, процент включения паклитаксела - 90-99%.

Впервые установлена способность наносомальной формы паклитаксела проникать и накапливаться в ядрах высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Впервые установлено, что использование НЧ приводит к 4-кратному повышению цитотоксичности паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat WT в сравнении с обычным раствором паклитаксела.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Показана возможность преодоления опухолевой резистентности за счет включения паклитаксела в полимерный матрикс PLGA наночастиц в присутствии Pluronic® F68 и полисорбата 80 на клеточной линии высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Выявленные внутриклеточное накопление и цитотоксическая активность in vitro создают предпосылки для дальнейшего доклинического изуче7 ния наносомальной формы паклитаксела на клетках высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза.

Предложена для дальнейшего доклинического изучения наносомальная форма паклитаксела с улучшенными биофармацевтичевскими характеристиками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения и выводы диссертационной работы доложены на второй международной конференции «Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии» (Томск, 2010), научно - методической конференций кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (Москва, 2010), П-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), VII Международной научно-практической конференция «Наука и современность» (Новосибирск, 2011).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации автором опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи - в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 1- в зарубежном журнале и 4 тезиса в материалах российских и международных конференции.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 118 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы,-включающего 147 источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 5 отечественных и 142 иностранных источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Паклитаксел как химиотерапевтическое средство

Паклитаксел является первым представителем цитостатиков из группы таксанов (рисунок 1). Впервые он был выделен в 1971 г. из коры тисового дерева Taxus brevifolia. В настоящее время его также получают полусинтетическим и синтетическим путем. Паклитаксел является ингибитором митоза. Связываясь с бета-тубулином микротрубочек, паклитаксел нарушает процесс деполимеризации этого ключевого протеина, что приводит к подавлению нормальной динамической реорганизации сети микротрубочек, без которой невозможно осуществление клеточных функций в фазе митоза. Кроме того, паклитаксел вызывает образование аномальных пучков микротрубочек в течение всего клеточного цикла и образование нескольких центриолей во время митоза [2].

Химическое название:5р,20-Эпокси-1,2a,4,7ß/13а-гексагидрокситакс-11 -ен-9-он-4,10-диацетат-2-бензоат 13-эфир с (2R,3 8)-1Ч-бензоил-3-фенилизосерин. О сн3 о

РИСУНОК 1. Структурная формула паклитаксела

Паклитаксел это кристаллический порошок от белого до почти белого цвета. Он растворим в ацетоне, умеренно растворим в этиловом и метиловом спирте, практически не растворим в воде [1]. Температура плавления паклитаксела составляет 216-217 С°. У паклитаксела очень высокая молекулярная масса (854 кДа), и в то же время очень низкая растворимость в воде (<0,03мг/мл) [122]. В молекуле паклитаксела отсутствуют функциональные группы, которые могли бы быть ионизированы при изменении РН, или которые повысили бы его растворимость путем образования соли. Активные ингредиенты ЛС, согласно биофармацевтической классификационной системе (БКС), классифицируются по проницаемости и растворимости [6]:

• Класс I - высокая растворимость, высокая проницаемость.

• Класс II - низкая растворимость, высокая проницаемость.

• Класс III - высокая растворимость, низкая проницаемость.

• Класс IV - низкая растворимость, низкая проницаемость.

Согласно классификации БКС паклитаксел относится к 1У-ому классу.

Имеется ряд попыток химически модифицировать молекулу паклитаксела, чтобы повысить его растворимость [122, 123]. Низкая растворимость паклитаксела требует введения в лекарственную форму высокотоксичного солю-билизатора Сгетор1юг ЕЬ® (препарат Таксол, производитель - Бристол-Майерс Сквибб (США)), а также ограничивает создание его энтеральных форм.

Паклитаксел широко применяется в клинической онкологии, включен в европейские и российские клинические рекомендации. Сегодня в клинической практике наиболее широко используется инфузия паклитаксела препарат Таксол компании Бристол- Майерс Сквибб (США), где в качестве растворителя используется СгеторЬог ЕЬ® (ПЕГ-илированное производное касторового масла). Присутствие в Таксоле СгешорЬог ЕЬ® лишь усугубляет серьезные осложнения со стороны различных органов и систем. Особенности фармакокинетики в значительной степени определяются присутствием растворителя СгешорЬог ЕЬ®. Он индуцирует диссоциацию сывороточных липопротеинов, приводя к образованию не идентифицированных пока соединений, усиливающих связывание паклитаксела с белками плазмы, что может приводить к снижению циркулирующей в крови свободной фракции препарата [2].

Паклитаксел обладает мощным цитотоксическим эффектом в исследованиях in vitro, при этом его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: немелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом. Узкий перечень показаний связан с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), представленную Р-гликопротеином и белком множественной устойчивости. МЛУ характерна для большинства высокорезистентных опухолевых клеток.

На сегодняшний день существует ряд попыток преодолеть МЛУ и улучшить биофармацевтические характеристики паклитаксела в частности с использованием нанотехнологического подхода.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. Предложенная технология позволяет получать стабильную наносомальную суспензию с размером частиц 300±100 нм при степени сорбции паклитаксела 90-99,5%.

2. Наносомальная форма позволяет обеспечить плавное, длительное и полное высвобождение паклитаксела из матрикса наночастиц. Высвобождение паклитаксела из наносомальной формы составило 90%, при продолжительности высвобождения около 80 часов.

3. Флуоресценция наночастиц в цитоплазме и в ядрах опухолевых клеток подтверждает проникновение наночастиц в высокорезистентные клетки Т-лимфобластного лейкоза (.Гигка! \¥Т).

4. Цитотоксическая активность наносомальных форм паклитаксела в МТТ, ЛДГ и АТФ тестах проявляется в низком диапазоне концентрации (от 1*10"6М до 6.8*10"6М). При этом раствор паклитаксела не достигает ИК 50 в диапазоне указаных концентрации.

5. Цитотоксической активностью в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза (Jurkat WT) обладают наносомальные формы паклитаксела, модифицированные полоксамером 188 и/или полисорбатом 80.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты уточняют наши представления о сфере применения наночастиц как носителей ЛВ, а также свидетельствуют о высокой практической ценности этой технологии.

Так на примере паклитакеела показано, что наночаетицы способны изменять биофармацевтические характеристики паклитакеела, а также позволяют решить одну из важнейших проблем химиотерапии опухолей - множественную лекарственную устойчивость раковых клеток. Преодоление МЛУ позволяет расширить спектр действия этого известного препарата.

Впоследствии мы показали, что наночаетицы на основе PLGA, модифицированные полисорбатом, доставляют в высокорезистентные опухолевые клетки Т- лимфобластного лейкоза высокомолекулярный цитостатик — пак-литаксел. Наличие выраженной цитотоксической активности наносомальных форм в отличие от обычного раствора паклитакеела свидетельствует о способности наносомального паклитакеела проникать в клетки Jurkat WT, экс-спресирующие Р-гликопротеин. Предположительно, входящие в состав экспериментальных форм паклитакеела ПС-80 и полоксамер 188 способны подавлять функцию Р-гликопротеина.

Успех будущей наносомальной лекарственной формы зависит от множества факторов, наиболее важными из которых являются правильная постановка фармакологической задачи и выбор лекарственной субстанции. Последний, в свою очередь, определяется свойствами субстанции, как биологическими (особенности распределения в организме, фармакокинетические параметры, способность проникать в орган-мишень, клетки и пр.), так и технологическими (устойчивость в условиях образования наночастиц, достаточная растворимость, способность к сорбции и пр.). Важную роль играет также выбор носителя.

Создание наносомальных форм цитостатиков позволяет решить одну из основных проблем современной химиотерапии - преодолеть МЛУ и тем самым повысить эффективность лечения и снизить системную токсичность.

Примечательно, что данные трех тестов (МТТ, ЛДГ, АТФ) подтвердили отсутствие выраженной цитотоксической активности раствора паклитакеела; во всех трех тестах раствор паклитакеела не достигал ИК50 во всем диапазоне исследуемых концентраций. Вместе с тем, цитотоксическая активность наносомальной формы паклитаксела проявлялась в низком диапазоне концентрации от 1*10"6М до 6.8*10"бМ. При этом, наносомальные формы паклитаксела достигали ИК50 во всех трех тестах. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что НЧ на основе РЬвА способны повышать цитотоксичность паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток 1игка1 \УТ. Полученные результаты создают предпосылки для дальнейшего доклинического изучения наносомальной формы паклитаксела.

На сегодняшний день имеются паклитаксел разрешен к применению при раке молочной железы, мелкоклеточном раке легкого, раке яичников и саркомы Капоши у больных СПИДом. Получены предпосылки для дальнейшего доклинического изучение наносомальной формы паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток 1игка1. Нанотехнологический подход может дать новую жизнь старым препаратам: значительно увеличить их эффективность, снизить токсичность и улучшить биофармацевтические характеристики.