Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и изучение биологических свойств фракций иммуномодулина

Р Г Б ОД 2 О МАЙ 1997

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ВТОРОЙ ТАШКЕНТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи ТУРДИЕВ УМИД АБДУРАХМАНОВИЧ

УДК615.012/.014+615.07:612.8.018.3

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФРАКЦИЙ ИММУНОМОДУЛИНА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1997

Работа выполнена во Втором Ташкентском Государственном медицинском институте, Ташкентском Государственном университете им. Мирзо Улугбека, Институте биоорганической химии им. акад. Садыкова A.C. АН РУ, НПЦ "Иммунопрепарат".

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор Ф. 10. Гариб Научный консультант - кандидат химических наук

Н.Ж. Сагдиев

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук

профессор Р.М. Рузыбакиев

2. Доктор биологических наук

профессор В.И. Иванов

Ведущая организация - Первый Ташкентский Государственный медицинский институт.

Г?

Защита диссертации состоится УЗ" ^ 1997 г. в_час. на

заседании Специализированного совета Д.087.09.02 при Втором Ташкентском Государственном медицинском институте ( Ташкент, ул. Фароби, 2, Главный учебный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке П ТашГосМИ.

Автореферат разослан У?-^" (У- 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук , профессор

A.A. Батырбеков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляция иммуногенеза остается сложной проблемой биологии. Известен ряд пептидов тимусного происхождения, которые стимулируют или угнетают иммунный ответ [Арион В.Я. с соавт., 1982; Hadden J.H., 1993; Петрова Т.А., 1993.].

Новым иммуноактивным препаратом является иммуномодулин, применяемый в медицинской практике в качестве иммунокорректора и биостимулятора [Регистрационное удостоверение № 96/671/22, выдано Главным управлением по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники МЗ РУ]. Иммуномодулин имеет молекулярную массу до 6 кДа и состоит из комплекса биологически активных пептидов, выделенных из тимусов овечьих плодов [Гариб Ф.Ю., 1997].

Для изучения механизмов иммунобиологических эффектов иммуно-модулина необходимо разделение его на фракции с изучением его функциональных свойств и состава. Однако такой подход остался не реализованным. Нужно подчеркнуть, что исследование высокоочищенных природных соединений выделенных из тимуса является актуальной задачей биологии и медицины, поскольку создает реальные возможности для исследования иммунорегуляторных пептидов.

Цель работы

Выделить фракции иммуномодулина, изучить их иммунобиологическую активность и физико-химическую характеристику.

Задачи исследования:

- методами ионообменной и высокоэффективной жидкостной хрома-то графий выделить фракции иммуномодулина, изучить их электрофоре! и-ческую подвижность и аминокислотный состав;

-определить пептидные фракции иммуномодулина, обладающие иммунобиологическими свойствами в системе IN VIVO у интактных животных и на моделях вторичного иммунодефицита с сублетальным облучением и острым токсическим гепатитом;

- разработать метод оценки активности пептидов тимуса на иммуно-регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов-хелперов (СД 4+) и Т- супрес-соров (СД 8+) с использованием микродоз исследуемого вещества;

- изучить в системе IN VITRO влияние выделенных пептидов на им-мунокомпетентные клетки: Т-хелперы, Т-супрессоры, В-лимфоциты и фагоциты;

- выявить фракции пептидов иммуномодулина, обладающие избирательным влиянием на отдельные звенья иммуногенеза и кроветворения;

-выявить сходство между механизмом действия иммуномодулина и его пептидным спектром.

Научная новизна.

Впервые произведено разделение иммуномодулина на 13 пептидных фракций и определен их аминокислотный состав. Выявлены конкретные пептиды в составе иммуномодулина, обладающие иммунобиологической активностью в системах IN VIVO - стимуляция антителогенеза, пролиферация спленоцитов и стволовых клеток, эритро- и лейкопоэза; IN VITRO -стимуляция экспрессии рецепторов на лимфоцитах человека (Е-, Т-лимфоциты); СД 4 (Т-хелперы); СД 8 ( Т-супрессоры); ЕМ (В-лимфоциты) и фагоцитарной активности нейтрофилов. Совокупность исследований пептидных фракций иммуномодулина раскрывает новые механизмы его иммунобиологической активности.

Практическая ценность работы.

Разработан экспресс-микрометод для тестирования тимусных пептидов на экспрессию рецепторов СД 4 и СД 8 иммунорегуляторных Т-лимфоцитов - Т хелперов и Т-супрессоров.

Полученные данные о способности пептидов иммуномодулина избирательно стимулировать конкретные звенья иммуногенеза являются основой для создания нового поколения иммунокорегирующих препаратов для медицины и ветеринарии.

Основные положения выносимые на защиту

- Иммуномодулин разделен на 6 фракций ионообменной хроматографией и 13 фракций высокоэффективной жидкостной хроматографией. Изучена электрофоретическая подвижность фракций, полученных ионообменной хроматографией и аминокислотный состав фракций, выделенных ВЭЖХ.

- Определены фракции иммуномодулина, обладающие достоверной стимуляцией экспрессии рецепторов Т- и В- лимфоцитов, пролиферации стволовых клеток, фагоцитоза, эритро- и лейкопоэза, антителогенеза.

- Экспериментально обосновано избирательное влияние пептидных фракций иммуномодулина на Т-хелперы (CD 4+), Т- супрессоры (CD 8+), В-лимфоциты (ЕМ), фагоцитоз, пролиферацию стволовых клеток.

- Отмечена функциональная активность иммуномодулина - влияние на конкретные звенья иммунной системы, которая связана с гетерогенностью его пептидов по количеству и составу аминокислот.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Академии наук РУ (1996), конференции НДЦ ТашГосМИ-2 (1996), на обществе иммунологов института иммунологии (1996), на межкафедральной конференции ТашГосМИ-2 (1996).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 стр. машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (2 главы), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 139 источников. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы.

В работе были использованы 150 мышей линии СВА, 100 мышей линии Balb и 500 беспородных мышей. Эксперименты проводились на животных обоего пола, весом 18-20 г. Животные содержались в условиях вивария, получали лабораторное питание. Каждая экспериментальная группа состояла из шести - десяти животных.

С целью создания иммунодефицитного состояния животных облучали на установке РУМ 17 и «Агат» (5-6 Гр). Другой моделью иммунодефицита служил экспериментальный острый токсический гепатит у мышей индуцированный введением внутрибрюшинно 20 % масляного раствора тет-рахлорметана в течение 3 дней [Хаитов P.M., 1985].

Иммунокоррекцию у животных проводили иммуномодулином (производства НПЦ «Иммунопрепарат», серия 010196, К767) и его фракциями, полученными ионообменной хроматографией на колонке 2,6x20 см (6 фракций) и высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке NucleoSil 5 Cj8 (13 фракций) в дозе 1 мкг/кг.

Определяли электрофорешческую подвижность фракций (Hashimoto F. et al, 1984) и аминокислотный состав (LevinaN.B., 1984).

Влияние фракций иммуномодулина на антителогенез определяли классическим методом локального гемолиза (Jeme N.K., Nordin A.A., 1963). У иммунодефицитных животных параллельно подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов и спленоцитов в камере Горяева, общепринятым способом.

Пролиферацию стволовых клеток определяли по числу макроколоний на поверхности селезенки сублетально облученных мышей (Till J Е., McCulochE.A. 1961)

Общий пул Т- и В- лимфоцитов выявляли методом спонтанного ро-зеткообразования Е -РОК (Jondal М. at al., 1972) и EM-РОК (Gupta J., at al., 1975).

Оценку активности препаратов по влиянию на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных определяли при помощи разработанной нами методики с использованием микродоз исследуемого вещества и моноклональных антител к маркерам CD4, CD8 в тесте не-

прямого розеткообразования (Гариб Ф.Ю. и соавт., 1994; патент №2426 РУз).

Результаты исследования обрабатывались статистически. Вычисляли среднюю арифметическую ряда (М), ошибку средней арифметической (т), достоверность различий (р) согласно критерию -t Стьюдента (Бессмертный Б.С. 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для скрининга активности на первом этапе мы разделяли иммуномо-дулин на фракции с использованием анионообменной хроматографии. Была использована хроматография на колонке 2,6x20 см с ДЭАЭ-TSK в градиенте молярности NH4HCO3 (рис.1.). В результате были получены 6 фракций (А, В, С, D, Е, F). При проведении физико-химического анализа полученных фракций с использованием электрофореза была выявлена их гете-рогешюсть.

В дальнейшем было изучено влияние этих фракций на антителогенез иммунодефицитных и интактных мышей, пролиферацию спленоцитов, эритро- и лейкопоэз in vivo, а также на экспрессию Е-, CD4, CD8, ЕМ-рецепторов, Т- и В-лимфоцигов и фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro (см. ниже).

Влияние фракций иммуномодулина на антителогенез выявляли классическим методом локального гемолиза в геле у иммунодефицитных и интактных животных. Моделирование иммунодефицитного состояния достигалось классическими методами:

1) сублетальное облучение;

2) острый токсический гепатит вызванный тетрахлорметаном.

В группе животных, которым были введены фракции А и D наблюдалась максимальная стимуляция превосходящая показатели иммуномодулина (рис.2.). Под их влиянием достоверно увеличилось количество АОК в группах с облучением и в контрольной. Иммуномодулин обладал достоверно стимулирующим эффектом, занимая среднее положение по индексам стимуляции по сравнению с активностями фракций.Фракции В и С стимулировали антителогенез в группе животных с острым токсическим гепатитом, где наблюдалось усиление иммунного ответа преобладающее над им-муномодулином. Вероятно во фракциях, в которых отмечалась достоверная стимуляция, сконцентрированы молекулы обладающие стимулирующей активностью, а в группах с его отсутствием наряду со стимуляторами, возможно находятся и ингибиторы.

Следовательно, методом ионообменной хроматогратографии нами были получены фракции иммуномодулина, превосходящие его по биологической активности.

А (280 пМ) Я

0 100 200 300 400

V (т1)

Рис.1. Ионообменная хроматография иммуномодулина Примечание: А, В,С,0,Е,Р -фракции иммуномодулина Ось ординат: поглощение при 226 нМ Ось абсцисс: объем элюента

Индекс соотношения

♦ Облучение □ Гепатит а Интактные

Рис.2. Влияние фракций иммуномодулина на антителогенез у интактных и

иммунодефицитных мышей.

|| Щ ¡11) - зона отсутствия биологической активности Им.-иммуномодулин

Известно, что важнейшим звеном иммунного ответа являются Т-лимфоциты, созревающие под влиянием факторов тимуса. Таким путем происходит экспрессия E-рецепторов, характерных для зрелых Т-клеток. Вместе с тем, факторы тимуса прямо и опосредованно влияют на фагоцитоз.

Для оценки активности иммуномодулин и фракции тестировались in vitro по влиянию на экспрессию E-рецепторов Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования и фагоцитарную активность нейтрофилов. При инкубации лимфоцитов человека с Т-иммунодефицитом иммуномодулин в дозе 0,05 мкг/мл увеличил экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов на 50%. Аналогичным эффектом обладала и фракция F. Фракции А, С и Е стимулировали экспрессию E-рецепторов в среднем в 1,25 раза (Р<0,05).

На фагоцитоз достоверно стимулирующее влияние оказали фракции В, D, Е и F. Поскольку фракции В и D не проявляли активности по отношению к Т-лимфоцитам, но простимулировали иммунный ответ у мышей (см. выше). Очевидно, что они проявили свое действие через звено фагоцитов, где в среднем наблюдается стимуляция на 20%. Максимальные показатели были получены с фракцией В (76% фагоцитоза, это в 1,3 раза выше контроля) и иммуномодулином (аналогично).

Так как наиболее точным из существующих методов выделения физиологически активных соединений из сложных смесей является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на следующем этапе иммуномодулин был разделен с использованием данного метода, причем использовался вариант обращеннофазовой гидрофобной хроматографии. На колонке Nucleosil 5Ci§ в градиенте концентрации ацетонитрила удалось получить 13 фракций (рЗ.) для каждой из которых был проведен аминокислотный анализ, позволивший установить, что данные фракции содержат пептиды включающие в себе от 3 до 16 аминокислотных остатков.

ВЭЖХ была также использована для анализа фракций полученных ионообменной хроматографией. Эти хроматограммы позволяют сделать некоторые выводы, в частности выяснилось, что во фракциях А, В и D -одинаковое распределение 4, 5, 6 и 7 фракций, но отличается их процентное соотношение чем, по всей вероятности, и определяется их схожая биологическая активность.

Дальнейшее исследование было направлено на изучение иммунобиологических свойств 13 фракций иммуномодулина, полученных ВЭЖХ.

На первом этапе эксперименты были проведены in vivo на интактных и иммунодефицитных мышах (облучение и острый токсический гепатит). Как выяснилось, действие фракций иммуномодулина на антителогенез весьма гетерогенно (рис.4.). Наряду с иммуномодулином, схожим стимулирующим, а нередко и преобладающим эффектом обладали фракции 1, 7 и 11 (р<0,002). Фракции 2 и 3 простимулировали антителогенез в несколь-

А (226 пМ)

Рис.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография иммуномодулина

Примечание: 1-13 -№№ фракций иммуномодулина Ось ординат: поглощение при 226 нМ Ось абсцисс: объем элюента

Индекс соотношения 11

9

7 + 5 3 1

1 I V '

-1 -М*

-з

I !!1 ¡Ш

1 ♦

......К»

1ш| '! .....

А1

¡И®"

Ч-Ь

ч-ь

||:!а

щ

ч-ь-

Им. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ♦ Облучение ° Гепатит а Интактные

Рис. 4. Влияние фракций иммуномодулина на антителогенез у интактных и

иммунодефицитных мышей.

- зона отсутствия биологической активности Им. - иммуномодулин

ко раз сильнее, чем цельный иммуномодулин: 2 фракция в 6 раз при облучении и 3 фракция в 11 раз при гепатите (по отношению к контролю - им-мунодефицитным животным, не получавшим препарат).

Интересно отметить, что наряду со стимулирующим действием препаратов наблюдался и обратный процесс - угнетение иммунного ответа. Так 13 фракция подавляла антителогенез в 2 раза. Остальные фракции проявляли активность ниже, чем иммуномодулин или же не обладали ею.

Как известно, иммунодефицитное состояние сопровождается нарушением гемопоэза. Поэтому представлялось важным определить влияние фракций не только на иммунологические реакции, но и на гематологические показатели периферической крови. На количество эритроцитов у им-мунодефицитных животных достоверно стимулирующее действие оказали фракции 1, 2, 5, 6, 8 и 13. Фракции 5 и 8, не активные по отношению к ан-тителогенезу, в данном тесте увеличили количество эритроцитов на 30%.

На лейкопоэз у этих же животных достоверной стимуляцией обладали 4 фракции: 3, 6, 8 и 10, здесь отмечается стимуляция в среднем на 30%. Более высокий стимулирующий эффект на лейкопоэз оказал цельный иммуномодулин (~ 3 раза), возможно из-за синергизма фракций.

Обнаружив способность фракций иммуномодулина стимулировать гемопоэз мы предположили, что этот эффект достигается стимуляцией пролиферации стволовых клеток. И поэтому, in vivo нами было изучено влияние фракций иммуномодулина на пролиферацию стволовых клеток сублетально облученных мышей. Максимальное количество макроколоний на поверхности селезенки насчитывалось под действием фракции 2 - на 60%, т.е. в 1,6 раза, а иммуномодулина - на 40%. Фракции 1 и 11 показали схожие результаты, где отмечается стимуляция в 1,2 раза (р<0,05). Остальные фракции оказались неактивными в данном тесте.

Следовательно в системе ш vivo на иммунодефицитных и интакгных животных удалось обнаружить влияние фракций иммуномодулина, полученных ВЭЖХ, на антителогенез, гемопоэз, пролиферацию стволовых клеток. Однако, на наш взгляд характеристика иммунологических свойств фракций была бы не полной без учета их влияния на конкретные клетки иммунной системы: Т-лимфоциты, их иммунорегуляторные субпопуляции - Т-хелперы (CD4) и Т-супрессоры (CD8), В-лимфоциты, фагоциты и тем самым более углубленно выявить механизм их действия и подойти к объяснению механизма действия самого иммуномодулина.

Исходя из этого, на данном этапе было выяснено влияние фракций на Т- и В-лимфоциты по общепринятым методам: Е- и ЕМ- розеткообразова-ния посредством стимуляции экспрессии этих рецепторов на поверхности лимфоцитов.

Было выяснено, что почти все фракции, кроме 3, 6 и 12 достоверно стимулировали экспрессию E-рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов.

Максимальная экспрессия регистрировалась в группе с 7 и 11 фракциями, где отмечалась достоверная стимуляция (в 1,7 и 1,8 раза соответственно) по отношению к контролю и ко всем группам.

Спектр действия пептидов на популяцию В-клеток оказался меньшим. Здесь стимуляция экспрессии ЕМ-рецепторов наблюдалась только под влиянием фракций 3, 4 и 11 (р<0,02). Иммуномодулин по индексам соотношений фракций проявил средние показатели.

Известно, что в межклеточных взаимодействиях иммунного ответа особое место занимает процесс фагоцитоза. С этой целью нам крайне важно было изучение влияния фракций иммуномодулина in vitro и на это звено иммуногенеза. На фагоцитоз стимулирующим действием обладали фракции усиливающие и процесс антителообразования - это 2, 4, 6, 7 и 9 фракции. Здесь наблюдалась стимуляция в среднем на 25% (р<0,05).

И в заключительной серии исследований мы изучали влияние фракций иммуномодулина на регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов: Т-хелперы (CD4+) и Т-супрессоры (CD8+). 10 из 13 фракций усиливали экспрессию Е-рецепторов общего пула Т-лимфоцитов. Поэтому представлялось необходимым выяснение влияния фракций на субпопуляции Т-лимфоцитов, их избирательность с помощью специально разработанной нами методики с использованием моноклональных антител направленных против основных маркеров : Т-хелперов и Т-супрессоров и микродоз исследуемого вещества (рис.5).

Выяснилось, что фракции избирательно влияют на те или иные клетки субпопуляций Т-лимфоцитов После инкубации с фракциями 1, 2, 3, 7, 9 количество CD4+ увеличивается в среднем в 1,5 раза (р<0,02). Было обнаружено, что не все фракции обладали активностью в данном исследовании. Аналогичные результаты были получены и при определении CD8+. Инкубация с фракциями 1, 4, 7 и 13 привела к достоверному увеличению су-прессоров в среднем в 1,4 раза (р<0,02). Фракции 1 и 7 привели к максимальным значениям CD4+ и CD8+. Надо отметить, что некоторые фракции, например 3, не оказывая влияния на экспрессию Е-рецепторов и не влияя на CD8+, простимулировала CD4+ в 1,5 раза (р<0,02), а под влиянием фракций 1, 4 и 7 отмечалось достоверное увеличение как общего пула Т-лимфоцитов (в среднем на 55%), так и CD4+ и CD8+ (в 1,6 и 1,4 раза, соответственно).

Установлено также, что фракции 10 и И избирательно влияют на экспрессию Е-рецепторов (стимуляция в 1,3 раза), не затрагивая экспрессию CD8+ и CD4+ рецепторов. Фракция 13 наряду с Е-рецепторами достоверно увеличила экспрессию только CD8+ в 1,3 раза (р<0,05).

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что фракции иммуномодулина обладают способностью влиять на важнейшие звенья иммунной системы. По результатам приведенным в табл.1

11

Индекс соотношения (%)

60 50 40 30 20 10

60 50 40 30 20 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Им. Фракции иммуномодулина

■ Т-хелперы (Сй4+) о Т-супрессоры (С08+)

Рис.5. Сравнение индексов соотношения по влиянию фракций иммуномодулина на Т-хелперы (СБ4+) и Т-супрессоры (С08+).

- зона отсутствия достоверного эффекта

Таблица 1.

Оценка иммунобиологических свойств фракций иммуномодулина, полученных ВЭЖХ

Тесты Иммуно- Фракции иммуномодулина

модулин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. АОК

1.1. Интактные т - - т т - - г - т - т - ь

1.2. Облучение п т п т т т т - - - -

1.3. Гепатит т т т п - - - т - - - - - т

2. Спленоциты т - - - т - - - - т - - - -

3. Стволовые клетки т т т - - - - т - - - т - -

4. Эритроциты т т т - - 1 - т т - т - т

5. Лейкоциты 1- - - т - - т - т т т т - -

6. Т (ЕЯ+) тт т т - т т т п т т т т - т

7. Т (СБ4+) т т т т 1- т - т - т - - - -

8. Т (СБ8+) т т - - т - - т - - - - - т

9. В (ЕМ+) т - т т т - - - - - - т - -

10. Фагоцитоз т - - - т - т т - т - - - -

Т-стимуляция, 4-- подавление

и>

можно судить даже об избирательности действий отдельных фракций. Например, 13 фракция, которая стимулирует экспрессию только CD8+ Т-лимфоцитов, за счет которого наблюдается подавление иммуного ответа у интактных и облученных животных (рис.4). Фракция 11 избирательно влияет на В-лимфоциты, что отражается на усилении процесса антителоге-неза в системе in vivo.

Следовательно, в механизме действия иммуномодулина на систему иммунитета лежит способность влиять на все важнейшие звенья, определяющие силу иммунного ответа. Каждая из фракций воздействует на те или иные звенья иммунной системы, в отдельных случаях проявляет избирательность, что свидетельствует о высокой степени очистки препарата, возможно доведенной в некоторых фракциях до гомогенного состояния.

Суммируя все эти показатели можно объяснить эффект и механизм действия иммуномодулина во всех иммунологических тестах и его важную роль в качестве иммунокорректора.

Выводы

1. Доказана гетерогенность иммуномодулина: выделены 6 фракций ионообменной хроматографией и 13 пептидных компонентов высокоэффек-тиной жидкостной хроматографией. Изучена элекгрофоретическая подвижность фракций. В выделенных компонентах содержатся от 2 до 16 аминокислотных остатков.

2. Семь из 13-ти пептидных фракций (1, 3, 4, 7, 9, 11 и 13) иммуномодулина обладали достоверной иммунобиологической активностью - стимулировали экспрессию рецепторов Т- и В- лимфоцитов, пролиферацию стволовых клеток, фагоцитоз, антителогенез, эритро- и лейкопоэз.

3. Фракции полученные ионообменной хроматографией обладали иммуностимулирующими свойствами, но мало различались между собой по активности, что связано с их гетерогенностью доказанной ВЭЖХ.

4. Разработаны методы оценки активности пептидных фракций иммуномодулина на экспрессию рецепторов иммунорегуляторных субпопуляций - Т-хелперов (CD4+), Т- супрессоров (CD8+), В- лимфоцитов (ЕМ), фагоцитов и пролиферацию кроветворных стволовых клеток.

5. Обнаружены пептидные фракции иммуномодулина, избирательно стимулирующие Т-хелперы (CD4+), Т-супрессоры (CD8+), В-лимфоциты (ЕМ), фагоцитоз и пролиферацию кроветворных стволовых клеток.

6. Функциональная эффективность иммуномодулина связана с гетерогенностью его пептидов по количеству и составу аминокислот, что обуславливает механизм его действия на важнейшие звенья системы иммунитета: экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов (ER, CD4, CD8), В -клеток (ЕМ), стволовых клеток, фагоцитоза, антителогенез, эритро- и лейкопоэз.

Практические рекомендации

1. Разработан комплекс методов для скрининговой оценки иммуномоду-лирующих препаратов в системах in vitro и in vivo, позволяющие определить действие препаратов на антителогенез, гемопоэз, пролиферацию стволовых клеток, фагоцитоз, экспрессию рецепторов Т-, В-лимфоцитов и их субпопуляций.

2. Выявлены активные фракции иммуномодулина, которые в будущем могут пройти фармакологические испытания для разработки новых лекарственных средств.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гариб Ф.Ю. , Турдиев У.А., Мухамедьярова H.JL, Петрова Т.А., Хадий X., Комаров П.П. Коррекция иммунного ответа субфракциями иммуномодулина при вторичном иммунодефиците, вызванном облучением. //Нарушение механизмов адаптации и их коррекция. - Ташкент, 1995,-N2.-С. 16-18.

2. Турдиев У.А., Гариб Ф.Ю., Петрова Т.А., Мухамедьярова H.JI. Изучение влияния субфракций иммуномодулина на экспрессию рецепторов Т- лимфоцитов. //Профилактика и лечение иммунодефицитных состояний. -Ташкент, 1995,- С.53-56.

3. Гариб Ф.Ю., Турдиев У.А. Влияние препарата тимуса - иммуномодулина на антителогенез .// II Республиканская научная конференция молодых ученных посвященный 660 летаю Амира Темура ( 25-27 апрель, Ташкент, 1996г.);Тез. сек. и стендовых сообщений Т. 1996г. С.43.

4. Турдиев У.А. Влияние тимических пептидов на пролиферация стволовых клеток .// Материалы конференции: «Диагностика , лечение и профилактика региональных заболеваний в Узбекистане» .- Ташкент. 1996. -С. 56-57.

5. Гариб Ф.Ю., Турдиев У.А. Стимуляция иммунного ответа пептидами тимуса при экспериментальном токсическом гепатите.// Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии. Ташкент. 1996,- Т.8.-С.100-104.

6. Garib F.Ju., Murhamedyarova N.L., Turdiev U.A., Petrova T.A., Kakharov В. Immunomodulin- a new prospective for medicine immunocorrecting remedy.// Karadciriz Journal of medical sei. 1995,- V.8. -N.4.-P.220.

7. Турдиев У.А., Мухамедьярова H.JI., Петрова Т.А. Стимуляция иммуногенеза фракциями иммуномодулина ./ Актуальные вопросы медицины. Тезисы докл.и стенд.сообщ.- Ташкент, 1996.- С.32.

8. Турдиев У.А. Влияние пептидов тимуса плодов овец на фагоцитарную активность нейтрофилов./ Актуальные вопросы медицины. Тезисы докл.и стенд.сообщ.- - Ташкент, 1996,- С.108.

9. Заявка на изобретение «Способы оценки иммунобиологического препарата», № 3 NIHDP 9600685.1 (ГФ) дата 16.07.96 Гариб Ф.Ю., Муха-медьярова Н.Л., Петрова Т.А., Сагдиев Н.Ж., Турдиев У.А.

Турдиев У. А. "Иммуномодулин фракцияларини аж — ратиб олиш ва биологик хоссаларини урганиш"

ХУЛОСА

HPLC хроматография усули ёрдамида 13 та пептидли ком — понет ^амда ионалмашинув хроматография усули билан 6 та фракцияга ажратиш орк,али иммуномодулиннинг гетерогенлиги аникданди. Ушбу фракцияларнинг аминокислота таркиби урганилди. Ажратилган 13 пептиддан 7 таси иммунобиологик фаолликка эта, яъни Т— ва В— лимфоцитлар рецепторларининг экспрессияси, эритро — ва лейкопоэз, фагоцитоз ва антителоге — незни стимуллайди. Ионалмашинув хроматографияси ёрдамида ажратиб олинган фракциялар таркиби жи^атидан гетероген булгани учун иммунобиологик фаоллиги бир— биридан кам фа— ркданади. Т —хелперлар (CD4 + ), Т—супрессорлар ( CD8 + ), В — лимфоцитлар ( ЕМ) ва фагоцитлар рецепторлари экспрессиясига таъсир к;илувчи иммуномодулин фракцияларининг фаоллигини аникдовчи услуб ипь\аб чик;илди. Уларнинг орасида Т— хелперлар ( CD4+), Т— супрессорлар ( CD8 + ), В— лимфоцитлар ( ЕМ), фагоцитозга танлаб таъсир к,илувчи баъзи пептид фракциялар аникданди. Иммуномодулиннинг иммун системасига таъсир к;илувчи механизмини белгиловчи функционал фаоллиги гетероген булган пептидларининг аминокислота сифат ва микдорий таркибига боглик,.

Umid A. Turdiev.

Isolation and study of the biological property of immunomodulin

fractions.

RESUME

Conclusions heterogeneity of immunomodulin is proven: are allocated 6 fractions by ionchange chromatography and 13 peptides of components by high performance liquid chromatography. Is investigated electrophoretic mobility of fractions. For allocated components is determined aminoacid composition. Seven of 13-th peptides of fractions (1,3,4,7,9,11 and 13) of immunomodulin had authentic immunobiologic activity- stimulation of expression of T- and B- lymphocytes, eritro- and leukopoiesis , prolypheration of stem cells, phagocytosis and antitelogenesis.

Fractions received by ionchange chromatography had immunostimulation properties, but a little were distinguished among themselves till the ( certificate) activity, that is connected to their heterogeneity. Method of valuation of activity peptides of fractions of immunomodulin by influence on ( to) expression of receptor of immunoregulatory subpopulation -T- helpers( CD4+), T- supressors( CD8+), B- lymphocytes(EM), phagocytosis, proliferation of stem cells is developed. Are found out peptides of fractions of immunomodulin electoral stimulating of T-helpers (CD4+), T-suppressers( CD8+), B- lymphocytes ( EM), phagocytosis, proliferation of stem cells. The functional efficiency of immunomodulin is connected to heterogeneity its peptides on quality and composition of aminoacids, that definite its action on major links of a system of immunity: expression of receptors of T- lymphocytes, stem cells, phagocytosis, eritro- and leucopoiesis and antitelogenesis.