Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение, характеристика и биологические свойства комплекса иммунорегуляторных пептидов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР 2-е МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДТЩИ НСКИЙ ИНСТИТУТ им. НИЛИРОГОВА

КАРАСЕВА МАРИНА ВИКТОРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА. И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ

На прыях рукописи УДК (61211254 +€1211255)0171-063

14-0056 - Аллергология в иммунология

Автореферат

днауг.рхации на соискание уяеной степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА-1991

Работа выполнена на кафедре иммунологии 2-го Московского ордена Ленина Государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова.

Научны й руководитель

доктор медицинских наук, профессор — Л. В. Ковальчук.

О ф п ц и а л ь н ы е о н и о н е н т ы:

доктор медицинских наук — Л. С. Сеславина, доктор медицинских наук — С. С. Василейский.

Ведущее учреждение — НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н- Ф- Гамалеи.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1992 г. на заседании специализированного совета К-084.14.06 2-го Московского ордена Ленина Государственного медицинского института им: Н. И. Пирогова (117869, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . . . ».....1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т. Е. Кузнецова

{

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

-.<- Актуальность проблемы. Активное изучение цитокинов в ~"ТТОЯледние годы позволило определить их важнейшую роль в обеспечении межклеточного взаимодействия при иммунологических и воспалительных реакциях. Цитокины вырабатываются широкий'спектром клеток в организме и способны регулировать пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность не только иммуно-яомпетентных клеток, но и клеток нелиыфоидной природы.

Нарушения выработки или проявления активности медиаторов иммунитета имеют важное значение в патогенезе ряда заболеваний: при воспалительных процессах различной этиологии, инфекционных и вирусных поражениях иммунной системы, регенеративных процессах, болезнях ооединптельной ткани /ревматоидный артрит, склеродермия, псориаз/ и др.

Действие цитокинов проявляется в усилении активности клеток фагоцитарной системы, вовлечении в процесс других клеток -фибробластов, эндотелиальных клеток, а также непосредственном воздействии на чужеродные агенты.

Эффекты комбинаций качественно и количественно отличны от '.;ех, которые вызываются индивидуальными цитшинамл Цитокины в комбинации действуют либо оинергично, усиливая свой эффек2, либо, наоборот, антагонистично, подавляя активность других. Понимание эффекта комбинаций цитокинов позволит открыть но>

вые подходы в лечении ряда заболеваний.

К настоящему времени показано существование сложной сети цитокиповых взаимодействий, в которой одни цитокины индуцируют продукцию других, трансмодулируют цитокиновые клеточно-поверх-ностные рецепторы и действуют в комбинации друг с другом на клеточные функции, обеспечивая каскадность вызываемых зйектов, и, формируя широкую сеть цитокинових сигналов /-• I

Информационное содержание, передаваемое клетке, находится не в индивидуальных пептидах, а в группе регуляторньвс пептидных молекул, к которш эта клетка чувствительна. Ключевая роль в сети цитокиновых взаимодействий отводится ИЛ-1, ФНО-^, ИЛ-6, ^-интерферону, благодаря их широкому опектру действия на многие клетки-мишени и способности индуцировать высоки!! уровень экспрессии многих других цитокивов. Вое это позволяет говорить о перспективности использования иммуворегупяторных пептидов и, оообенно, их сочетаний в качестве инмунофармагалогических препаратов.

На кафедре иммунологии 2-го ШЛГШ им.Н.И.Пирогова /зав. кафедрой - академик Р.В.Петров/ проводится работа по разработке способов получения и поиску путей практического использования препаратов естественного происхождения, полученных на оонове комбинаций цитокинов, в качестве юшунофармакологичес-ких средств.

Вышеизложенные данные, а также эффективность применения цитокинов в клинической практике свидэтельствуют об актуальности проблемы получения и изучения препаратов имиунорегуляторных пептидов. Особое значение имеет разработка подходов к получении и изучению свойств медиаторов различного животного происхождения .

• Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилась разработка споооба получения, изучение физико-химических свойств и биологической активности комплексов иммунолепти-дов, секретируеиых мононукпеарными клетками периферической крови свиньи. В связи о этим были поотавиены следующие конкретные задачи:

I. Выделение комплексов естественных юшукоцитокинов из культур стимулированных мононуклеарных клеток периферической

крови ОВИИЬЙ.

2. Изучение физико-химических свойств и чаотичная характеристика биологической активности комплексов еотеотвенных иммуноцитокинов в тестах in vitro и in ^.vo .

3. Исследование действия комплексов естественных иымуно-цитокинов на пролиферативную активность фиброблаотов и синтез ими коллагена.

4. Разработка возможных подходов к коррекции нарушений Функций фибробпастов комплексами естественных иммуноцитокинов в культуре in vitro. ,

Научная новизна. Впервые разработаны основные этапы получения комплексов иммунопептидов, обозначенных как М- и Л-комп-,пенсы,из культур стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови свиньи.

Обнаружено, что комплексы естественных иммуноцитокинов М- /и.п. 15-30 кД/ и Л- /ц.м. 60-80 кД/ представляют собой гетерогенные фракции, содержащие ,как минимум, восемь компонентов /для М-/ и три компонента /для Л-/» определены изоэлектри-ческие точки этих компонентов методом изоэлектрофокусированйя в агарозном геле.

В биологичеоких тестах in vitro М комплекс иммунопептидов обладает активностью ИЛ-1, ФИОинтерферона-^, ИЛ-2, МИФ.

Впервые выявлено, что М и Л комплексы естественных цитоки-нов наряду о клетками фагоцитарного звена активно регулируют; клетки соединительной ткани --фибробласты. И-комплеко стимулирует пролиферативную активнооть фибробпастов и оказывает модулирующий эффект на синтез коллагена в культуре in vitro , проявляя стимулирующий или ингибирующий эффект в зависимости от исходного уровня продукции коллагена фибробластами.

Для Л-комплекса выявлено стимулирующее влияниетч относе-

нии роота фибробпаотов и оинтеаа иии крллагена.

. Обнаруженные эффекты комплексов иммунопептидов на функциональную активнооть фибробпаотов позволили разработать возможные подходы к коррекции нарушений функциональной активности клеток 1п vi.trо при использовании фиброблаотов, полученных из келоидного рубца больного, М-комплеко ингибирует продукцию коллагена фиброблаотами.

Практическая ценнооть работы. Разработаны условия получения биологичеоки активных коиплекоов иимуноцитонвнов /М и Л-комппексы/ из культур стимулированных Ш1К периферической крови свиньи.

Использование периферической крови овииьи при получении комплексов иммунорегуляторных пептидов является перспективный и безопасный в овете распространения СПИД, а также позволяет получить исходный материал И комплексные препараты с меньшими экономическими затратами по сравнению о аналогами из периферической крови человека.

Выявленные различив И- и Л-коиплекоовчиимунопептйдов на миграционную активность макрофагов и лейкоцитов позволяет ио* ■ пользовать их в дальнейшем в качестве дзагноотйкумов для оценки функций этих клеток-мишеней.

Данные о способности М- и Л-комплекоов естественных шыу-ноцитокйнов регулировать функции фагоцитов и фибробпаотов создают предпосылки для активного использования их в качеотве имыу-нокорригируюцих препаратов при хронических воспалительных заболеваниях, процесса* регенерации и др. нарушениях.

Модулирующее действие Ы-комппекса на оинтез коллагена фиб-робластами в зависимости от исходного уровня продукции коллагена моиет быть учтено при разработке новых охем индивидуального применения нимуноцитокинов.

Апробации ¡аиооертации. Сановные положения диссертации доложены и обауждены на заседаниях кафедры иммунологии МБФ 3-го Ы0ЛГ1М им. Н,И.Пярогова /Иооква, 1988-1991гг./. «а Международном симпозиума "Структура иммунорегУляторных пептидов" /Мооква, 1988г./, на Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии" /Мооква, 1989г./, на Международном симпозиуме "Проблемы имму-яофармакологиа" /Тбилиои, 1990г./,

Апробация работы состоялась на научной конференции кафедра иммунологии и отдела иммунологии Ш|К 2-го МОЛГШ им.Н.И.Пи-рогоза /Москва,1991г./,

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 8 работ, получено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диооертация изложена на ■//О страницах машинописного текста и соотоит из введения, четыро* глав; "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты собственных иооледований", "Обсуждение результатов" и выводов.. Список использованной литературы содержит 198 ссылок» цэ них 35 - отечественных и 163 - иностранных автаров, Диссертацич содержит 7 таблиц и 19 рисунков

НАТЕРШИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для получения комплексов цитокинов в качестве иоточника мононукпеарных ядеток использовали кровь свиньи.

Моцонукяеарные клетки выделяли ? градиенте плотности фи-колн-верографина / вЗуит л, ,1968/, Бесклеточные цитокиноод^п-жацие оуяернатанты получали из купьтур ФГА-стимулированных мо-нонукдеаров периферической крови овиньи, которые в течение 3-х часов обрабатывали ФГА в дозе 8-10 мкг/мл. Затем митоген удаляли 2-х кратным отмыванием и клетки культивировали - бессиао-роточной среде в течение 24-х часов. Супериатонти получали «ос-

ле осаждения клеток центрифугированием, Концентрирование су-пернатантов проводили лиофилизацией, ультрафильтрацией или осаждением белков сульфатом аммония,

• Фракционирование сконцентрированных оупернатантов проводили на хроматографической колонке /"Yrtwtman" , I х 100 ом/, заполненной сефадекооц 6 -100. Элюцию проводили 0,9 % физиологическим раотвором /рН = 7,4/. Запись хроматографии вели в автоматическом режиме с помощью прибора "Uvicord-2" Дкв .Швеция/, регистрируя экстинцию при длине волны 280 нм. Насчет молекулярных масс веществ, присутствующих во фракциях после проведения гель-фильтрации, проводили по результатам предварительно полученных данных элюции маркеров о извеотной молекулярной массой. Содеркание белка во фракциях определяли опектрофото-метринеским методом /Авдеев В.Г., 1977/. Собранные фракции после проведения гель-хроматографии стерилизовали фильтрацией / "Miilipor - GS" ,США, диаметр пор - 0,22 мкм/.

Фракции, полученные после 5-6 прозеденных гель-хромато-графий на сефадекое С -100, лиофилизировали и обессоливали. Обессоливание проводили на колонке с сефадекоом С -15, уравновешенной дистиллированной водой. Фракции, содержащие белковый материал, собирали, лиофилизировали и хранили в виде по; тшка при -20°С.

'Изоэлектрическое фокусирование кошлексов иммуноцитоки-нов, полученных после гель-фильтрации на сефадексе 6 -100, и обессоленных проводили на пластинах о тонким слоем агарозы на приборе Multiphor 2117 Дкв « Швеция/. Для ооздания градиента рН использовали набор амфолитов-носителей с интервалом pl от 3,5 до 10 / Ampholine 1818, рН 3,5 - 9,5, LKB «Швеция/. Обесоолешше и лиофилизировашше комплексы шшуноцитокинов раст воряли в дистиллированной воде,наносили яа фильтры, которые по-

мещали на гель. В качестве маркеров иопользовали коимзрчеокий набор белков о известными pi /Broad Calibration Kit рН 3-10, Pharmacia , Швеция/. Изоэлектрические точки компонентов, полученных при ЙЗФ комплексов, определяли по оэлибровочной кривой, построенной в результате ИЭФ маркерных белков и отражающей зависимость между pi и расстоянием от места внеоения образца до места его фикоации в изоэлектричёской точке /Ригетти П., 1986/.

Аналитический вариант гель-хроматографии высокого давления комплексов иммуноцитокинов проводили о помощью оистемы Ultrochrom gt^ /ькв , Швеция/. В работе иопользовали колонки, ТйС-gel 2000 SW /7,5 х 300 мм/ и TsK-gel 3000SIY /8 X 300 мм/ /ькв , Швеция/. Элюцив вели 0,1 М CH3C00itf4 буфером, рН 6,0, ИЭФ и ВЭИ проводили в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ /зав. лаб. - д.б.н. Арион В.Я./.

При определении действия комплексов цитокинов на миграционную активность фагоцитов иопользовали непрямой микрокапиллярный метод, в котором клетками-мишенями служили лейкоциты периферической крови здоровых доноров, лейкоциты крови свиньи и макрофаги перитонеаяьного экооудата мышей C57BI/6. Клетки пери-тонзального экооудата мышей получади по общепринятой методике /stuart » 1978/. ЛеИкоциты периферической крови получали отстаиванием о 6 % раотвором декстрана и.последующим центрифугированием. Количественным показателем отепени подвижности клеток явился индеко миграции /ИМ/. }

площадь зоны миграции в опыте

ИМ ----2-------------------х 100 J6.

площадь зоны миграции в контроле

Достоверными считали изменения миграционной активности фагоцитов при ИМ менее 80 % или более 120

Одна единица МИФ-активности определялась как обратная величина максимального разведения образца, вызывающего 50 % иьтиблции

ниграции /ИМгБО '¡if.

Тестирование активности интердейкина-1 /ИЛ—I/ в беокле-точных оупернатантах и комплексах иммуноцитокинов проводили совместно о н.о. ПНИД "Иммунорегуляция ti иммувокорракция" Осмоловокой C.B. и аспиранткой кафедры акушерства и гинекологии Хамоевой Ю.А, ПО методу "LAP - asea?'/ Mice! S., 1982/, оонованному на определении изменения пролифаративгой активности тимоцитов мышей. Критерием активности ИЛ-I олувид коэффициент активации:

^ CPU в приоутотвии иооледуеыого образца CPU в контроле

* CPM - среднее чиопо имлульоов в триплете / включение аН-тими-дина еа I мин. в триплете /.

Чиоло единиц ИЛ—I в образце определяли, умножая на Ю, обратную величину от.разведения-образца, активноохь которого ооотавляет 50 % от максимальной / amis s.,1978/.

Определение активнооти фактора нокроза опухоли /ФНО/ проводили в цитотокоичеокои теота /Flick D.et а1ч 1984/. В качеотве клеток-мишеней иопольаовалн трансформированные фиброблаоты линии L929. Активнооть ФИО в беоклеточных оупернатантах и комплекоах иммунопелтидов определяли в присутствии I мкг/мл актиномицина-Д /«Serva» /. За условную единицу ФНО принимали разведение образца, вызывающее 50 % лизис клеток-мишеней.

При изучении дейотвия комплексов естественных иммуноци-токинов на фиброблаоты кожи человека иопользовали первично установленные и поддерживаемые паооированием культуры клеток. Определение пролиферахивной активности фиброблаотов проводили по включению 3Н-тимидина /Хаймен Д и др.,1976/. Содержание секретируемого в среду коллагена в культуре фиброблаотов

- э ~

оценивали, используя модификацию радиоизотопных методов / Peterhofaky В.,1971, Postlethwaite А., 1984 /, разработанную в лаборатории соединительной ткани инотитута медицинокой и биологической химии АМН СССР /зав.лаб. - д.оУн. Дельвиг A.A./. В оонове метода лежит специфическое раощепление радиоактивного по пролину коллагена, оинтеэируемого в культуре клеток, вы-сокоочищенной бактериальной коллаганазой /коллагеназный теот/.

Для изучения влияния комплексов на фиброблаоты десен получали первичные культуры.фиброблаотов из кусочков десны, взятых при удалении зубов / Гринберг К.Н. и др.,1987/.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статиоти-ческч общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение комплекса еотеотвенных цитокинов, который регулирует функции, о одной отороны, клеток фагоцитарной системы, а с другой, клеток соединительной ткани - фиброблаотов, представляет большой интёрес для клинического использования в качеотве препарата при лечении патологических процессов, ооотояний о нарушенными функциями фиброблаотов и.фагоцитов, таких как длительно незаживающие раневые процессы и др.

Для получения такого комплекса регуляторных пептидов иопольвовапи отработанную ранее на кафедре иммунологии сиську получения цитокиноодержащих оупернатантоз стимулированных МНК из периферической крови человека /Ганковокая Л,В., Гвоздева И,А,, 1986/. В качестве источника мононуклейрных клеток была йспольаована кровь свиньи, что позволило увеличить выхо; конечного продукта,.определяемого по биологической активяооти выделенных фракций /табл.1/.

Табл. I. Сравнительная характеристика получения М и Л . комплексов иммуноцатокинов из крови человека и свиньи.

Исследуемые параметры | Кровь здоровых доноров ! Свиная ! . кровь

I. Иопользуемый объем /«п Г • 300 300

2. Количество выделенных лимфоцитов /Хх06/ 260+32,6 415+68,3

3. Средний объем полученных оупернатантов /мл/ 60*9,8 82+13,8

4. Концентрация белка в выделенных комплексах цитокинов /мкг/мл/: . Л-комплекс М-комплеко 80j;9,ö 100+14,2 100,4+8,97 160+15,9

5. Биологическая активность / по МИФ-активнооти, уд.ед./мг белка / М-комплеко 2260+18а 3200+400

Данные, представленные в таблице., достоверно отличаются при использовании в качестве источника МНК крови свиньи и человека / р <0,05 /,

Проведение фракционирования на оефадексе С -100 поавопидо вьиелить из оупернатантов стимулированных ФГА моно'нукдеаров пять фракций: I - м.м. более 80 кД, П- и.м. 60-80 кД, Ш- м.м. 30-60 кД, 1У- м.м. 15-30 кД, У- u.M. менее 15 кД, две из которых - П и 1У обладали ярко выраженной биологической активность« в отношении клеток фагоцитарной сиотемы /макрофаги, моноциты, нейтрофилы/ и были обозначены соответственно; Л- и М- комплексы естественных цитокинов /КЕЦ/ /рис.1/.

В системе мононуклеарных клеток, отимулировенных ФГА, вырабатываются ИЛ—I, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, интерферон -у ,

ФН0-</,/6 , МИФ, ЛИ® И др. /АгДагзооп и.,1988,1990, УзХекапп 1.1., 1989,0аис1м^ л..,1989 /. С цельв выявления степени гетерогенности и определения состава комплексов иммунорегуляторных пептидов проводили изоэлектрофокусирование в тонком слое агарозы. Данный метод является одним из совершенных способов фракционирования и характеристики веществ белковой природы, основанный на разделении их в градиенте рН под действием электрического поля. Использование метода ИЭФ в тонком слое агарозы позволило выявить в Ы-компдекое цитокинов 8 компонентов в облаоти ¡зН от 3,5 до 10, причем, основное их количество сосредоточено в облаоти кислых значен;?;* /р1 3,7 - 6,7/. р1 выявленных компонентов М-комплекса соответственно: 6,7; 6,45; 6,0; 5,5; 4,8; 4,7; 3,75. Л-комплеко содержал три компонента с р1: 4,3; 4,7; 4,8 также расположенных в области кислых значений. Проведение аналитического варианта гель-хроматографии высокого давления подтвердило многокомпонентнооть исследуемых комплексов цитокинов -Ми Л.

Рио, I. Профиль элюции оупернатанта культур МНК, регистрируемый в ходе гель-фильтрации на сефадексе & -100 . и содержание белка во фракциях /---/. По оси ординат слева - экстинция при длине волны 280 им, справа - концентрация белка, мкг/ил. Свеоху - выход маркеров. По оси абсцисс - объем элюции, л.

- 12 -

Определение биологической активности пептидов, входящих в иоследуеиые комплексы цитокииов. В-.1 работах, проводимых на кафедре иммунологии 2-го МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова /Гиае H.A., 1989, Баярт Б., 1989/, было показано, что комплексы естественных цитокинов /М и Л/ обладает ранозаживляющим, противовоспалительным и противоопухолевым эффектами. Для объяснения механизмов активации эхах процеосов и частичной характеристики комплексов были проведены эксперименты по определению биологичеокоВ активности пептидов, входящих в исследуемые коиплекоы.

Известно, что за локализацию клеток, пришедших в очаг повреждения, отвечают цитокины, ингибирующие подвижность. Су-пернатанты, полученные от стимулированных МНК,обладали активностью факторов, угнетающих миграцию макрофагов перитонеаль-ного экссудата мышей и лейкоцитов периферической крови здоровых доноров, причем, в.качестве клеток-мишеней использовались также' лейкоциты, полученные иа крови овиньи. Таким образом, было показано, что оупернатанты не обладают видовой специфичностью /ИМ а 53,4+9,37 % для лейкоцитов овиньи и ИМ в 58,6+10,8 % - для г~1коцитов кроьи человека, р>0,05/. При проведении фракционирования оупернатантов НИФ-активность . лщентрировалась в Ы-комплексе естественных шмунопептидов о u.u. 15-30 кД, активность фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов выявлялась в Л-комплекое, причем, Л-комплекс также как и оупернатанты не обладал видоспецифичноогыо и изменял подвижность лейкоцитов как человека, так и свиньи /ри0.2/

Активность МИФ в М-компкексе составила 512+64 ед./мл или 3200+400 уд.ед./мг. Обнаружили, что значение ИМ = 50 % достигается для Ы-комплекса, как иинииум, 3 раза, что возможно объясняется следующими предположениями:

Ю-ЕЛ-30-50-5ТЗ-ОТ-ТО-Уэ. ,11 л

Рио. 2. Действие фракций цитокинов на подвижность

. различных популяций фагоцитов: клеток перитонеаль-ного экооудата мышей - /а/ и лейкоцитов периферической крови человека - /б/. По оси ординат - значения индекоа миграции. По оси абоциоо - объем элюции, мл.

I/. Присутствие в комплекое альтернативной активнооти - фактора, стимулирующего миграцию макрофагов, который может уменьшать эффект МИФ или противодействовать ему. 2/. МИФ может представлять собой семейство молекул, способных огрогироватьоя друг о другом, В этбм случае при проведении серийного разведения тестируемого МИФ-оодержащего об}, зца возможно проявление активности разных оубъединиц МИФ. В настоящее время обсуждается вопрос о ЛИФ- и МИФ- активностях как однил из характеристик других цитокинов или их•комбинаций: интерферона И КСФ /КаутвисМ. Т., 1986/. ' Супернатанты стимулированных ФРА мононуклеаров также обладают активностью МИФ, I мл оупернатанта содержит 32+8 ед. МИ • активности.

- 14 -

Цитокинсодержащие супернатанты культур стимулированных мононуклеарных клеток обладали активностью ИЛ-1 /КА = 4,1+0,29/. Во фракциях, полученных пооле гель-фильтрации на оефадексе 6-100 также- определяли наличие ИЛ-1. Фракции I, П, Ш, У не обладали активность» ИЛ-1, либо его оодержание в этих фракциях слишком мало и не определяется в биологическом тесте. Для фракции 1У -М-комплекса естественных цитокинов содержание ИЛ-1 составило 320+53 ед./мл или 3200+530 уд.ед./мг /рис.3/.

Для определения активности ФНО иопользовали цитотоксичес-кий тест, в котором э качестве клеток-мишеней выотупают трансформированные фибробласты мыши - Ь929. Было выявлено, что оу-пернатанты стимулированных ФГА МНК содержат всего 6-8 ед. ФНО, пооле проведения гель-фильтрации на оефадексе активность ФНО была сконцентрирована в Ы-комплексе и составила 34^8,5 ед./мл или 212,5+53,1 уд.ед./мг

■ *

280

0,2

0,1

Как .Кст

3,0 3,0

2,0 2,0

1,0 1,0

30

40

50

60 Уал.

Рио. 3. Распределение активностей ИЛ-1 /- - -/, ИЛ-2 /.../ и ФНО /—х—/ во фракциях, полученных после гель-фильтрации на сефадексе С -100 оупернатанта стимулированных ИНК. По оси ординат слева - экстинция при длине водны . 280 нм, справа - коэффициент активации для ИЛ-1, коэф фациент стимуляции - для ИЛ-2 и удельная бкологическа активность для ФШ /уд.ед./иг/. По оси абсцисс - объе :злюции, мл.

В обессоленном лиофилизированном М-комплексе естественных цито-кинов активность ФНО ооставииа 320+83,3 ед. или 320+93,3 уд.ед./мг.

Таким образом, в гетерогенном комплексе иммунопептидов

*

содержатся активности ИЛ-I, ИЛ-2, ФН0-*,£ , ШФ, интерферона-^. Определение активности ИЛ-2 и интерферона-у проводили сотрудники НИИЗМ им.Н.Ф.Гамалеи. ИЛ-2 определяли в тесте пролиферации селезеночных клеток и обнаружили, что супернатанты стимулированных ФГА мононуклеаров обладают активностью ИЛ-2 /рио.З/. Активность интерферона-i" «оцениваемая по противовирусной активности, была зарегистрирована в М-комплексе цитокинов и составила 2-4 Б&./мл.

Действие И- и Л-комплексов естественшх цитокинов на фиброблаоты.

Известно, что активными участниками раневого процесса являются, как минимум, две группы клеток; фагоцитарные клетки /макрофаги, гранулоциты/ и фиброблаоты - клетки соединительной ткани.

Для изучения механизма активации процесоа заживления ран комплексами иммунорегуляторных пептидов исоледовали действие М- и Л-комплексов на пролиферацию.и продукцию коллагена диплоидными фибробластами кожи человека в ионоолойной культуре in vitro.

М-комплеко естественных цитокинов о м.м. 15-30 кД ингиби-ровал синтез коллагена фибробластами кожи человека /ПОК - процент от контроля, ПОК = 72,3+10,7 ?&, р<0,05/ этот эффект был • зависим от дозы вносимого в культуру фибробластов препарата. Однако, действие комплекса кммунопептвдов имело противоположную направленность при использовании в качестве клеток-мишеней фибробластов того же штамма, но на более поздних пасоаяах • /ПОК = 196,69+9,56 ¡Й,р<0,05/ и не зависело от дозы вносимого препарата. Фиброблаоты поздних пассажей характеризуются снижь-

нийм пролиферативного потенциала и функциональной активности клеток, а также увеличенным б неоколько раз базальным уровнен продукции коллагёнаэы /Гринберг К.Н. и др.,1987, ИШв А. , 1989/.

Л-комплеко естественных иммуноцитокинов см. и. 60-80 кД активно стимулировал продукцию коллагена фибробластами кожи человека /ПОК = ¿64,65+15,9 р < 0,05/. При использовании в качестве, клеток-мишеней фибробдаотов поздних пассажей действие "Л-комплек-са не изменялось, эффект стимуляции сохранялся /рио.4/.

: .о к

¡00

а - влияние М-комплекса в зависимости от д., концентрации

б - влияние Л-комплекса в зависимости от ,,„. концентрации/*—

в - влияние М-комплекоа на синтез коллагена фиброблаота-ми поздних пасс; жей.

Рис. 4. Влияние И- 1111И1 и Л- комплексов цитокинов

на продукцию коллагена фибробластами кожи человека. По оси ординат - ПОК - процент от контроля. р | - контроль.

Иц ооновании полученных данных было выдвинуто предположение: эффект Ы-кокшлекса иимуноцитокинов завиоим от функционального состояния клеток-мишеней и, следовательно, от исходного уровня продукции коллагена в культуре фибробластов. Доказательством данного предположения поолужили две группы экспериментов; I. Исследование влияния М-комппекса на продукцию коллагена фибро-слаотааи в отсутствии аскорбиновой кислоты в Культуральной сре-ле.. Известно, что аскорбиновая кислота является кофактором для

ко'лпгеноиых полипептидов, увеличивая его в 2,5 - 3 раза.

Обработка фиброблаотов кожи человека Ы-коиллексом остеотвенных иммуноцитокинов в дозе 10 мкг/мл в течение 24-х часов приводила к увеличении продукции коллагена по сравнении о контролем /ПОЯ = 156,9+17,9 %, р <0,05/ /рис.5/.

2. Изменение плотности засева фибробластов также влияет на коллагене патетическую функцию фибробластов. Н-комплеко иммуиоцитоки-нов оказывал разнонаправленное действие в зависимости от концентрации засеваемых фибробластов на чашку Петри. При концентрации 160 х Ю3/нл клеток наблюдалась ингибиция оинтеза коллагена' после обработки М-комплексом /ПОК = 62,9+8,5 р40,-05/; при концентрации - 80 х Ю3/мл - стимуляция синтеза коллагена /ПОК = 124,67+ + 18,3 <5, р<0,05, п=6/.

ПОК

100

50

I.

С

го3/ 160

80

40

а.

П.

Рис.5. Действие М-комплек-са цитокинов на синтез коллагена фибробластами коаи человека:

I.а - при нормальных куль-туральных условиях; 1,6 - в отсутствии аскорбиновой кислоты. ПОК - процент от контроля.

I_| - контроль

11|[|Ц- М-компиекс

П - влияние М-коыллекса на синтез коллагена в зависимости от. плотности засева клеток. По оси ординат - концентрация вносимых клеток в I ил.

I I - контроль - М-коиплекс

б

100

ПОК -

— АО —

Таким образом, показано, что при исходно низком уровне продукции коллагенов^ полипептидов Н-коаппекс естественных имнуно-пептидов оказывал стимулирующее влияние на продукцию коллагена и ингибировав окмеэ, е'сли бааальная продукция была нормальной "ли повышенной, т.е. оказывал нормализующее или модулирующее действие на продукцию коллагена фибробластами л зависимости от функционального состояния клеток.

При изучении влияния комплексов на пролиферативную активное фибробдастов показано, что как Ы- , так и Л- комплексы иммуно-пептидов увеличивают пролиферативную активнооть фиброблаотов кожи человека /ПОК = 174,9В + 13,5 р<0,05 для Ы-комплекса, ПОК = 163,6 + 18,7 р4 0,05 - для Л-комплекса/.

ПОК

%

150

100 • |-4

50

Исходя из возможной регулирующей роли (^-комплекса иммуно пептидоЕ крушенной коллагенпродуцирующей функции фиброблаотов,

• опоообнооти изменять продукцию коллагена в зависимости от функционального соотояния фиброблаотов, для возможной коррекции оин тетичеоких функций фиброблаотов в качестве клзтек-мишеней иопол зовали фибробласты, полученные из келоидного рубца больного /использовались штаммы, полученные сотрудниками лаборатории ..'I ,|И!1/. :юЛ тк-чш института медицинской и биологической хи-

Рио.6. Влияние М - и

lili III комплексов цитокинов на пролиферативную активнооть Фиброблаотов кожи человека. По оси ординат - ПОК - процент от контроля.

1 |- контроль.

- -19 -

мии, зав.лаб. - д.б.н. Дельвиг A.A./.

М-комплекс иимунопептидов снижал продукцию коллагена патологическими фибробластами, полученными из келоидного рубца больного /ПОК = 60,41 + 5,8 р< 0,05, п=6/. Следует отметить, что эффект М-комплекса был специфичным по отношению к колпагеновым белкам /в случае ингибиции продукции коллагена/ в не ильенял содержания общего белка.

Принимая во внимание положительный терапевтический эффект аутологичных цитокинсодержащих супернатантов в печении хронических воспалительных заболеваний челюстно-лицевой о5ласти /Гизе H.A., 1989, Баярт , 1989/, в совокупности с результатами, полученными по применения М- и Л-комплексов естественных цитокийов / исследования проводились совместно с сотрудниками ЦНИИС, положительный эффект от применения М- и Л- комплексов выражался в исчезновении болевых ощущений, более раннему началу элителизации раны, сокращении сроков полного заживления по сравнении с контрольной группой/, проводили изучение влияния комплексов иммунопептидов на фибробласты десны в системе in vitro . В качестве клеток-мишеней использовали фибробласты деаен здоровых доноров. При обработке фибробпастов десны М-комплексом в дозе Iü мкг/мл в течение 24-х часов выявили ингибирующий эффект на оинтез коллагена /ПОК = 47,1 + .4,3 рг.0,05,п=5/. Л-комплекс иимунопептидов оказывал отимулирующее влияние на продукцию коллагена /ПОК = 136,4 + 7,8 р< 0,05, п=5/ /рис.7/. Для ^комплекса также было выявлено модулирующее действие.

Показано, что функции фиброблаотов •активно регулируются такими извеотными цитокинами как ИЛ-I, ФИО-*, у-ИФН, ИЛ-6 и др. / Jhatna;;ar Н.,1986, ¿liaa J.,1990, Kaplan Й.,1989, Goldring 1.1., 1937, Jcharffetter к.,1989Л однако на сегодняшний день правильнее говорить о комплексном взаимодействии различных цитокинов,

Рио. 7, Влияние М - ^^ и Л - III I комплексов цитокинов на продукцию коллагена фиброблаотами десны. По оси ординат - процент от контроля.

I I- контроль.

контролирующих реконотруирование ткани, которое имеет меото при репарации или воспалении. Результатами Silas Jücharffetter к., 1990, показано, что аффекты индивидуальных цитокинов и различных nie комбинаций на пролиферацию фиброблаотов, синтез ими коллагена и коллагеназы имеют качественные-и количественные отличия.

Эффекты цитокинов зависят от ряда критических категорий, таких как источник фиброблаотов, условия их культивирования/ концентрация сыврротки, аскорбиновой кислоты/, точки кривой роста, на которой проводится эксперимент. Действие иицуноцигокинов. на фибробдаоты может быть опосредовано различными механизмами;

I Непосредственное действие на синтез коллагена /специфическое снижение или увеличение уровня мРНК/.

2.Изменение продукции биологически активных молекул, таких как ПГ Eg, к"илагеназа - фермент, контролирующий деградацию ¡штерстициального коллагена.

3.Эффекты комплексов цитокинов могут быть опосредованы ци-¡■о килами, продуцируемыми оамими фибробяастами /Ш1-1, ИЛ-6,КСФ и др./. Образуется целая комплексная цитокиновая сеть. В этой v:'i: аффект ^итокина меняется в зависимости от стадии активации

клетки-мишени, присутствия других цитокинов в местном окружении и опоообности клеток-мишеней продуцировать биологически активные вещеотва.

Эффект М-комплекса естественных иммунопептидов нэ роот и продукцию коллагена в культуре фибробластов человека, вероятно, обусловлен,именно,сочетанным действием как выявленных цитокинов /ИЛ—I, ФНО-а, ^-ИФН/, так и возможно присутствующими во фракции с м.м. 15-30 кД, полученной от стимулированных ФГА мононук-пеаров: ФАФ, ТФР-/5 , ИЛ-6 и др. и вовлекает различные механизмы, включая и специфическое дейотвие на мРНК, и продукцию ПГ Е^, коллагеназы, медиаторов самими фибробластами: ИЛ-1, ИЛ-6, КСФ, регулируя метаболизм коллагеновых полипептидов с использованием

I

механизма обратной связи.

Стимулирующее влияние Л-комплекса иммунопептидов на пролиферацию фибробластов и продукцию ими коллагена может быть связано о присутствием фактора, активирующего фиброблаоты, и фактора коллагенопродукции, это предположение ооновано на системе продукции этих факторов и молекулярных массах факторов, йопадающих в диапазон 60-80 кД.

Влияние комплексов на функциональную активность фибробластов, э также активирующее действие на фагоцитарные клетки позволяют говорить об эффективности применения их для коррекции нарушений функций фибробластов и фагоцитов, например, в раневом процессе. Так как, М-комплеко обладал в норне или при использовании клеток с повышенной продукцией коллагена ингибирующим эффектом на синтез коллагена, видимо, в нем приоутотвуют вещества, являющиеся индукторами или непосредственными элементами механизма подавления избыточного разрастания соединительной ткани при восстановлении дефекта, например, ИЛ-1, ФНО-* , которые повишая

И»

пролиферативную активнооть фибробластов, усиливают выброс

коллагеназн и ПГ. Таким образом, опоооботвуя процессу раноза--пблэния /активируя фагоциты и фибробласты/, Ы-комплекс иммуноцитокинов может одновременно подавлять избыточное разраотание

соединительной ткани и образование патологического келоидного к

рубца,'

Сочетание овойотв цитскинов позволит в перспективе осуществлять целенаправленную коррекцию ряда патологических состояний в клинике о учетом функционального статуса клеток-эффекторов. Сбалансированное оочетание регуляторных и эффекторных свойотв цитокинов, оказание ими комбинированных эффектов открывает уникальную возможность коррекции нарушенного хода репараций, направленных на поддержание гомеоотаза организма.

ВЫВОДЫ

1. Разработан опоооб получения биологически активных комплексов естественных цитокинов /М-комплеко с м.м, 15-30 кД и Л-комплеко с м.м. 60-80 кД/ из супернатантов культур стимулированных ФГА мононуклеарных клеток периферической крови свиньи.

2. Методом ИЭФ в агарозном гело выявлена гетерогенность М- и Л-комллексов иммуноцитокинов. В Ы-комплексе присутствует, кик -'инниум, 8 компонентов в области рН от 3,5 до 10, причем, основное количество оооредоточено в области кислых значений р1: 6,7; 6,45; 6,0; 5,5; 4,8; 4,7; 3,75 соответственно. Л-комплекс шиунопеп 1дов оодержит 3 компонента о р1; 4,8; 4,7; 4,3.

3. И- и Л-комплексы иммунопептидов обладают активностями факторов, ингибирующих миграцию. Л-комплекс ингибирует миграцию лейкоцитов периферической крови, обладая активностью фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов. М-коыплекс угнетает миграции клеток иеритонеапьного экссудата мышей, оодержит активность

шп-ио'ирувдего подвижной?ь макрофагов.

4. М-комплеко имиунопептидов обладает активностью ИЛ-1, определяемого в биологическом тесте по комитогенному эффекту

на пролиферацию тимоцитов мыши. Для Л-комплекса активности ИЛ-1 не выявлено. М-,но не Л-комплекс иммуноцитокинов содержит активность ФНО, выявляемую в цитотоксическом тесте.

5. В культуре фибробластов кожи человека и фибробластов десны показан.модулирующий эффект М-комплекса имиунопептидов на синтез коллагена в зависимости от исходного уровня продукции коллагена фибробластами. Выявлено, что М-комплеко стимулировал пролиферативную активность фибробластов кожи человека.

6. Л-комплекс цитокинов оказывал стимулирующее влияние в культуре фибробластов ко:ки человека и фибробластов десны, увеличивая рост фибробластов и синтез ими коллагена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕЦДАЦИЙ

Полученные М- и Л- комплексы иммуноцитокинов, обладающие активностью в отношении функций фагоцитов и фибробластов, в дальнейшем могут быть рекомендованы в качестве препаратов для лечения хронических воолалительных заболеваний челюотно-лице-вой области, длительно незаживающих ран, трофических язв и др.

Разработанный способ получения М- и Л- комплексов цитокинов из культур стимулированных МНК периферической крови свиньи может быть использован для получения практически значимых количеств препаратов.

Выявленные различия М-и Л- комплексов иммунопептидов на миграционную активность фагоцитов позволяет использовать их в • качестве диагностикумов для оценки функций этих клеток-мишеней. ..

Использование модулирующего действия М-комплекса цитоки-цов на синтез коллагена фибробластами кожи человека при практическом применении позволит предотвратить патологическое разрастание соединительной ткани.

- 24 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I, Ганковокая Л.В., Ковальчук Л.В., Москвина С.Н., Баярт Караоева М.В,¿Соколова В,В,, Линднер Д.П., Стеценко О.П. Имму нопептидные отимуляторы клеток фагоцитарной оиотеш.//Итоги "ауки и техники. Иммунология. - 1988г.,т.26, о,- 163-167.

■«?. Караоева М.В., Баярт Б. Влияние лиыфокинов на процесс регенерации.//Интерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии, Республиканский сборник научных трудов.-1989г., о. 95-97.

3, Апциаури Н.Э.,Караоева Ы.В. Влияние лимфокинов на функциональную активность макрофагов.//Синтез и исследование биологически активных соединений: Тез. докл. конференции моло дых ученых, г Рига, 1989г.,о.97.

4, ГашГовская Л.В,,Ковадьчук Л,В.,Караоева М.В.,Иванюш-ко Т,П, Эндогенные лимфокины в лечении воспалительных заболеваний челистно-дицевой области,//Проблемы иммунофармэкологии: Тез, дока, международного симпозиума,- Тбилиси, 1990г.,о.22.

5, Ковальчук Л,В.,Каримова Е,В.банковская Л.В,, Караоева Апциаури Н,ЭмСокоиова Е,В.,Титовец Р.12. Цитокинзави-симая регурция продукции ?и?-«с и актирных форм каодорода макрофагам^ интактных мышей и мышей о меланомой В 16,//Доклады 'кадемии Наук СССР, 1991?,, 1,3X8, й 6,0.1503-1506,

6, {Covalctyuk L,Vf?Gajicowska;ja L,W,,Aptsiauri N.i2.,Karafii va IvI,V.Shuikiiia E.fl, Superlimpb regulates functional propertJ of pacrpj.-i&eee,//Molecular aspects 'of immune response and infectious diseases, Abstracts, International conference. -iiorae, Italy, 1989, - Poster PD 27-46.

7, Uovalchuk Ii,V.,Klebanov G,I,,Ribarov J ,k..Kreinina li.

/iptsiauri II.ri.,Gankowskaya L.Y/. ,Kuraseva f.i,V.,Ghuikina E.E.,

Vindir.iirov Yu.A. Priming of ph<;ocytes by cytokines and water-

it

;..i|!]' i ...• products tit' Lipid peiv xidition.//Biomedical Science,

¿¡Ь -

1991, v.2 (3), p.221-231»

8. Gankowskaja L.ff.,Kovalchuk L.V.,Karaseva M.V., Ivanjushko T.P. Combination of natural cytokines, stimulating wound healing. //Abstracts, 11-th European Immunology Meeting.-Helsinki, Finland, 1991, 9b-13.

9. Ганковская Л.В., Коваяьчук Л.В., Гвоздева Н.АМ Карасе-ia М.В,, Москвина С.Н. Способ получения фактора, ингибирущего гиграционнуп активность макрофагов' и лейкоцитов.

'/ Авт. СВИД. № 1494274 от 15.03.1989р.

СПИСОК СОКРАЩЕННА.

ИЛ - зитерлейкин ИМ - индекс миграции ИФН - интерферон

КЕД - комплеко естественных цитокинов КСФ - колониеотимулирующий фактор ЛИФ - фактор,ингибирущий миграцию лейкоцитов МИФ - фактор,ннгибирующий миграцию макрофагов МН!{ - ионо;;уклеарные клетки ПГ - яростагландины ТФР - трансформирующий фактор роста ФАФ - фактор, активирующий фибробласты ФГА - фитогеиагглютинин .' ФИО - фактор некроза опухоли