Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Полиморфизм генов CYP1A1, GSTM1 и CYP2E1 у больных раком легкого (РЛ)

На правах рукописи

Суворова Ирина Константиновна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ CYP1A1, GSTM1 и CYP2E1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО

Специальность: 14.00.14 -онкология, 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Рабата выполнена в ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Министерства Здравоохранения Российской Федерации (директор академик РАМН, профессор K.IL Хансон)

Научные руководители:

академик РАМН, профессор К. П. Хансон

доктор медицинских наук Е.Н. Имянитов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор . АХ. Барчук

доктор биологических наук, профессор В.П. Комов

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П Павлова Минздрава РФ

t 2004 г. в ^

Защита диссертации состоится «__» 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Министерства Здравоохранения Российской Федерации (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, академик РАЕН, д.м.н., профессор

В. В. Худолей

ВВЕДЕНИЕ

Рак легкого (РЛ) - одно из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований. РЛ является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний у мужчин и занимает второе место (после рака молочной железы) у женщин (Hung RJ. et al., 2003). В разных географических регионах у мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев РЛ на 100000 человек в год, заболеваемость женщин - в 6-10 раз ниже. В России ежегодно от РЛ погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. В Санкт-Петербурге РЛ сохраняет первое место в структуре смертности от новообразований (Мерабишвили В.М, Дятченко О.Т., 2000; Барчук А.С, Мерабишвили В.М., Кисельникова И.В., 2001).

80-90% случаев рака легкого вызвано курением (Худолей В.В., 1999; Заридзе Д.Г., 2000). В то же время известно, что РЛ возникает не у всех курильщиков, и этот факт позволяет предполагать существование генетических факторов риска. В настоящее время наибольший интерес в молекулярно-генетических исследованиях РЛ вызывают онкоассоциированные генные полиморфизмы. Установлено, что присутствие в генотипе «неблагоприятных» аллелей генов HRAS-1 и L-MYC может повышать риск возникновения РЛ (Weston A. et al., 1992, 1994; Tamai S. et al., 1990; Fong K.M. etal., 1996; Zborovskaya I. et al., 1996). Предполагается, что индивидуальная предрасположенность к развитию РЛ также связана с полиморфизмом генов, продукты которых принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма (Bartsch Н. et al., 2000; Benhamou S. et al., 2002; Garcia-Closas M et al., 1997). Следует учитывать, что сведения о влиянии «неблагоприятных» полиморфных аллелей и их сочетаний на риск РЛ противоречивы. Невысокая воспроизводимость результатов работ, выполненных в разных лабораториях, по крайней мере, отчасти объясняется низкой пенетрантностью нормальных генных полиморфизмов (Shields P.G., Harris С.С, 2000; Imyanitov E.N. et al., 2003).

В связи с тем, что вероятность развития онкологических заболеваний в течение жизни для женщин составляет 38%, а для мужчин - 48%, в традиционных контрольных выборках, представленных лицами среднего возраста, присутствует значительное количество потенциальных онкологических пациентов (Ries L.A. et al., 1996). В целях увеличения демонстративности молекулярно-эпидемиологического анализа в настоящей работе использовалась дополнительная группа- сравнения, состоящая из пожилых лиц без онкологической патологии в анамнезе. Как показали предыдущие эксперименты, подобный нетрадиционный подход может существенно увеличить эффективность изучения генных полиморфизмов (Белогубова Е.В. и соавт., 2000; Того А.В. и соавт., 1999).

(•ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

библиотека !

CiWiertlW/y

09 1

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить причастность некоторый полиморфных генов, продукты который принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма, к риску возникновения РЛ. В связи с этим поставлены следующие задачи:

1) охарактеризоваты распределение аллелей ключевыж генов метаболизма ксенобиотиков - полиморфный 1СУР1А1, СБТМ!, СУР2Е1 у здоровый жителей Санкт-Петербурга;

2) сравнить распределение аллелей данных генов в группах здоровый доноров и больныгх РЛ. Вышвить полиморфные варианты, ассоциированные с риском возникновения рака легкого;

3) установить, наблюдается ли связь между наличием определенный аллелей генов и гистологическим типом опухшей;

4) изучить влияние комбинаций неблагоприятный аллелей перечисленных генов на риск возникновения рака легкого;

5) оценить перспективность включения в исследование пожилык индивидуумов без онкологических заболеваний в анамнезе в качестве дополнительной контрольной группы в модекулярно-эпидемиологических исследованиях.

Положения, выносимые на защиту:

1) носителыство аллеля т2 ген СУР1А1 ¡иировано с повышенным риском плоскоклеточного РЛ;

2) «дефицитный» генотип проявляет тенденцию к преобладанию у больных РЛ по сравнению с пожилыми лицами контрольной группы;

3) комбинация m2-содержащего генотипа CYP1A1 и «дефицитного» варианта GSTM1 увеличивает риск РЛ в большей степени, чем каждый го перечисленных полиморфизмов по отдельности.

Научная, новизна полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования были получены следующие приоритетные данные:

1) обнаружено, что замена в аллеле гена ассоциирована с повышенным риском возникновения плоскоклеточного рака легкого;

2) показано, что генотип ассоциирован с незначительным увеличением риска рака легкого;

13) выявлено, что неблагоприятная значимосты аллеля с заменой гена усиливается при условии сочетания с дефицитным

генотипом 08ТМ1;

4) показано отсутствие взаимосвязи между полиморфизмом гена СУР2Е1 и предрасположенностью к РЛ;

5) продемонстрировано, что включение в исследование пожилых доноров в качестве дополнительной контрольной группы увеличивает демонстративность исследований онкоассоциированных полиморфизмов.

Практическая значимость. Диссертация имеет научно-практический характер. В частности, данные об ассоциации полиморфизма генов GSTM1 и CYP1A1 и их сочетаний с предрасположенностью к РЛ, могут быть использованы для оценки индивидуального риска развития данного заболевания. Это позволит выделить группу людей, которым особенно противопоказано как курение, так и работа, связанная с канцерогенными воздействиями. Усиленное медицинское наблюдение за подобными индивидуумами увеличит возможность ранней диагностики, что, в свою очередь, должно положительно влиять на результаты лечения.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на объединенной научной конференции отдела биологии опухолевого роста НИИ онкологии им. проф. НН. Петрова и лаборатории молекулярной генетики ГБ № 31 (январь, 2004), а также на заседании кафедры оториноларингологии с клиникой Санкт-Петербургского Государственного Медицинского Университета им. акад. И.П Павлова (февраль, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 122 публикации па русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группа пациентов (РЛ) (возрастной интервал: 30-77 лет, средний возраст 60 ± 8 лет) состояла из 146 больных раком лёгкого, лечившихся в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова в 1991 - 2000 гг.

259 пожилых доноров (ПД) (возрастной интервал: 75-92 года; средний возраст 83,5 ± 8,5 лет) были представлены пациентами Госпиталя для ветеранов войн и Городской больницы №31. Отсутствие онкологических заболеваний в настоящем и прошлом было подтверждено опросом, клиническими исследованиями и анализом историй болезни.

230 образцов крови здоровых доноров среднего возраста (ЗД) (возрастной интервал: 18-55 лет, средний возраст 36 ± 11 лет) были случайным образом отобраны в отделениях переливания крови НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова и Городской больницы № 31.

В качестве источника ДНК использовали лейкоциты периферической крови. Эритроциты разрушали гемолизом, вызванным 5-кратным разведением

крови дистиллированной водой. Лейкоциты осаждали центрифугированием, ресуспецдировали в воде и повторно осаждали центрифугированием. После отмывки от эритроцитов лейкоциты ресуспендировали в буфере TNE и лизировали добавлением детергента Triton X-100 до концентрации 1%. Инкубация с детергентом приводила к повреждению цитоплазматической мембраны, но не повреждала ядра. Ядра отделяли от цитоплазматической фракции центрифугированием, ресуспендировали в TNE и лизировали додецилсульфатом натрия (конечная концентрация - 0,5%). Частичный протеолиз белков осуществляли с помощью протеиназы К (100 мкг/мл) при температуре 65° С в течение 1 часа. Затем к препарату добавляли раствор NaCl до конечной концентрации 1,5 М и равный объем хлороформа. Экстракция проводилась в течение 30 минут и приводила к удалению нерастворимых компонентов клеток. После центрифугирования ДНК, содержащуюся в водной фазе, переносили в новый эппендорф и переосаждали добавлением 2-х объемов 96 % этанола. Осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в буфере ТЕ (Miller SA et ah, 1988; Mullenbach R. et al. 1989).

Генотипирование генов CYP1A1, GSTM1 и CYP2E1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфные аллели генов CYP1A1 и CYP2E1 выявляли после гидролиза ПЦР-продукта соответствующими эндонуклеазами рестрикции (табл. 1). Полиморфизм GSTM1 выражался в присутствии или отсутствии вышеупомянутого гена. Для подобного анализа проводили мультиплексную ПЦР, в которой в качестве контроля использовали ген Р-глобина (табл. 1).

Объем реакционной смеси составлял 12мкл и содержал 10-100 нг исследуемой ДНК, 1 ед. термостабильной полимеразы Taq 1/1-кратный ПЦР-буфер, 200 мкМ дезоксирибонуклеотидов и 1 мкМ отигопуклеотидов. Концентрация хлорида магния колебалась от 1,5 до 2,2 мМ, в зависимости от используемых праймеров (табл. 1).

Полимеразная цепная реакция включала в себя 30-35 циклов, состоящих из фазы отжига праймеров (55 - 60°С, 1 мин), фазы синтеза (72°С, 1 мин - 1 мин 20 сек) и фазы денатурации ДНК (95°С, 35 сек). Температура отжига и длительность фазы синтеза для используемых праймеров представлены в табл. 1.

Анализ результатов гепотипирования проводили посредством фракционирования ПЦР-продукта в 10% полиакриламидном геле. Для визуализации результатов полимеразной цепной реакции применяли окрашивание бромистым этидием.

Статистический анализ проводили по методу хи-квадрат.

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР

Ген Тип полиморфизма Праймеры Размер ПЦР-продукта, п. о. Названия и размер аллелей Конц. Mg2+, мМ t отжига, •с Время фазы синтеза

CYP1A1 MspI-ПДРФ 5' - GGC TGA GCA АТС ТОА ССС ТА - 3* и 5' • ATA ССС ССС ССТ САС ТСС АО - 3' 221 ml -221 п.о. т2-125 и 96 п.о. 1,5 58 1 мин

GSTM1 Делеция гена GSTM1: 5* - GAA СТС ССТ ОАА AAG СТА AAG С - 3' и 5' - GTT GGG СТС AAA TAT ACQ GTGG-3' 215 GSTM1(+)-215 п.о. GSTM1(-)-hct амплификата 1,5 60 1 мин 20 сек

р-глобин: 5* - CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC - 3' я 5' -GAA GAG CCA AGG АСА GGTAC-3' 268 Наличие продукта (268 п. о.) -положительный контроль качества мультиплексной ПЦР 1,5 60 1 мин 20 сек

CYP2E1 RsaI-ПДРФ 5' - АТС САС AAG TGA TTT GGC TG - 3' и 5' - CTT CAT АСА GAC CCT CTT CC - 3' 250 cl -100 и 150 п.о. с2-250п.о. 1.5 60 1 мин 20 сек

CYP2E1 DraI-ПДРФ 5* - AGT CGA CAT GTG GAT GGA ТСС A - 3' и 5' - GAC AGG GTT TCA TCA TGT TGG-3* 373 D-240 и 133 п.о. С - 373 п.о. 2,2 60 1 мин 20 сек

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полиморфизм CYP1A1 и предраспаюжешюсть к раку легкого

Результаты генотипирования CYP1A1 представлены на рис. 1,2 и в табл. 2. м 1 2 з

489+534 404 331 242 190 147 110-1-111 67 34 26

Рисунок 1. Анализ полиморфизма гена СУР1А1. Дорожка 1 - генотип т1т2; дорожка 2 - генотип т1т1; дорожка 3 -генотип т2т2. 5 качестве маркера молекулярного веса использовалась плазмида риС19, рестрицированная ферментом Мзр1 (дорожка М), слева - размеры фрагментов маркера (в п.о.)

100%1 80%

60% 40%

20%

ПД N=259 ЗД N=230 PЛN=146

Рисунок 2. Распределение генотипов CYP1A1 в группах пожилых доноров, доноров среднего возраста и пациентов с раком легкого.

Таблица 2. Распределение аллелей и генотипов гена СУР1Л1 (Mspl-полиморфизм) у больных раком легкого и здоровых индивидуумов

Группы Генотипы СУР1А1 Аллели СУР1А1

т1гп1 ш1ш2 т2т2 Всего ш1 ш2 Всего

Пожилые доноры (всего) 206 (79)" 51 (20) 2(1) 259(100) 463(89) 55(И) 518 (100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 84(80) 74 (80) 10 (83) 21 (20) 19 (20) 2(17) 0(0) 0(0) 0(0) 105(100) 93 (100) 12(100) 189 (90) 167(90) 22(92) 21 (10) 19 (10) 2(8) 210 (100) 186 (100) 24(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 113(80) 34(83) 79(78) 28 (20) 7(17) 21 (21) 1(1) 0(0) 1(1) 142 (100) 41(100) 101 (100) 254(89) 75 (91) 179(89) 30(11) 7(9) 23(11) 284(100) 82(100) 202 (100)

Анамнез курения неизвестен (всего) Мужчины Женщины 9(75) 4(80) 5(71) 2(17) 0(0) 2(29) 1(8) 1(20) 0(0) 12 (100) 5(100) 7(100) 20(83) 8(80) 12 (86) 4(17) 2(20) 2(15) 24(100) 10 (100) 14 (100)

Всего мужчин Всего женщин 112(81) 94(78) 26(19) 25(21^ 1(1) 1(1) 139(100) 120(100) 250(90) 213 (89) 28 (10) 27(11) 278 (100) 240 (100)

Доноры среднего возраста (всего) 181 (79) 47 (20) 2(1) 230(100) 409(89) 51(11) 460(100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 107(80) 54(77) 53 (83) 26(19) 15(21) 11(17) 1(1) 1(1) 0(0) 134 (100) 70(100) 64(100) 240(90) 123 (88) 117(91) 28 (10) 17(12) 11(9) 268 (100) 140(100) 128(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 54(77) 17(74) 37 (79) 15 (21) 5(22) 10 (21) 1(1) 1(4) 0(0) 70 (100) 23(100) 47 (100) 123 (88) 39 (85) 84(89) 17 (12) 7(15) 10(11) 140(100) 46(100) 94(100)

Анамнез курения неизвестен (всего) Мужчины Женщины 20(77) 9(60) 11 (100) 6(23) 6(40) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 26(100) 15 (100) 11(100) 46(88) 24(80) 22(100) 6(12) 6(20) 0(0) 52(100) 30(100) 22(100)

Всего мужчин Всего женщин 80 (74) 101(83) 107 (73) 26 (24) 21 (17) 2(2) Оф 108 (100) 122 (100) 146(100) 186(86) 223 (91) 30(14) 21(9} 216(100) 244(100)

Пациенты с раком легкого (всего) 37(25) 2(2) 251(86) 41 (14) 292 (100)

немелкоклеточный плоскоклеточный аденокарцснома мелкоклеточный 71 (70) 46(66) 23(85) 14 (78) 28 (28) 22(31) 4(15) 4(22) 2(2) 2(3) 0(0) 0(0) 101 (100) 70 (100) 27 (100) 18(100) 170(84) 114(81) 50(93) 32 (89) 32 (16) 26 (19) 4(7) 4(11) 202 (100) 140(100) 54(100) 36 (100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 90(73) 86(72) 4(80) 32 (26) 31(26) 1(20) 2(2) 2(2) 0(0) 124(100) 119(100) 5(100) 212 (85) 203 (85) 9(90) 36 (15) 35(15) 1(10) 248 (100) 238 (100) 10 (100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 14 (78) 4(80) 10(77) 4(22) 1(20) 3(23) 0(0) 0(0) 0(0) 18(100) 5(100) 13 (100) 32 (89) 9(90) 23(88) 4(11) 1(Ю) 3(12) 36 (100) 10 (100) 26 (100)

Анамнез курения неизвестен (всего) 3(75) 1(25) 0(0) 4(100) 7(88) 1(12) 8 (100)

Всего мужчин Всего женщин 93(73) 14(78) 33 (26) 4(22) 2(2) 0(0) 128(100) 18(100) 219(86) 32 (89) 37(14) 4(11) 256(100) 36(100)

Возрастные группы <=50 >50 И (85) 96(72) 2(15) 35(27) 0(0) 2(2) 13 (100) 133 (100) 24(92) 227(85) 2(8) 39 (15) 26(100) 266(100)

* Первая цифра - количество выявленных генотипов или аллелей, в скобках представлена частота MspI/CYPlAl генотипов и аллелей в процентах

Частота CYP1A1 генотипов и аллелей среди групп ЗД и ПД составила 79 %, 20 % и 1 % для генотипов mlml, mlm2, m2m2 и 89% и 11% для аллелей ml, m2, соответственно. По сравнению с контрольными группами, у пациентов с РЛ наблюдалось снижение частоты гомозиготного генотипа с аллелями дикого типа (mlml) до 73 % и увеличение генотипа mlm2 до 25 %. Частота генотипа m2m2 встречалась у 2 % обследованных с РЛ. Аллели ml и т2 выявлялись в 86 % и 14 % случаев. Статистически достоверных различий в распределении генотипов и аллелей не было найдено как при сравнении больных РЛ с ЗД (Р=0,952; Р=0,275 для генотипов и аллелей, соответственно), так и с ПД (Р=0,956; Р=0,895 для генотипов и аллелей, соответственно).

В связи с морфологической гетерогенностью РЛ был проведен анализ встречаемости дапных генотипов и аллелей у онкологических пациентов в зависимости от гистологического строения опухоли. У больных с аденокарциномой (АК) легкого по сравнению с контрольными группами неблагоприятный аллель т2 наблюдался реже, а его встречаемость у пациентов с мелкоклеточным РЛ (МкРЛ) были сходны с показателями здоровых допоров.

Сравнение распределения гепотипов у больных с плоскоклеточным РЛ (ПлРЛ) и ЗД показало заметную тенденцию к увеличению встречаемости генотипа mlm2 гена CYP1A1 у больных с данным гистологическим вариантом опухоли (Р=0,065). При сравнении частоты аллеля т2 в данных группах различия были статистически достоверными (Р=0,030). При сопоставлении пациентов с плоскоклеточным вариантом рака легкого и группой пожилых индивидуумов наблюдаемые отличия становились еще более очевидными: генотип mlm2 и аллель т2 у больных встречались чаще, а выявляемые различия становились еще более существенными (Р=0,042.. и Р=0,017, для генотипа mlm2 и аллеля т2, соответственно).

Таким образом, в настоящей работе было показано, что аллель т2 гена CYP1A1 ассоциирован с предрасположенностью к плоскоклеточпой форме рака легкого (табл. 2).

Результаты настоящей работы согласуются с большинством данных литературы о более высокой встречаемости аллеля т2 у больных РЛ (Alexandrie A. et al., 1994; Kijohara С. et аЦ 1998; Kawajiri К. et al., 1993; Lin P. et al., 2000; Nan Song et al., 2001; Le Marchand L. et al., 1998). Однако в отличие от работ, выполненных на европейских популяциях, наше исследование показало достоверность таких различий для одного из нозологических вариантов рака легкого - ПлРЛ.

Учитывая низкую представленность Mspl мутантных аллелей гена CYP1A1 в российской популяции и небольшие различия между пациентами с РЛ и контрольными группами, не представляется возможным использовать мутантный аллель MspI/CYPlAl как маркер предрасположенности к раку легкого.

Полиморфизм гена GSTM1 и предрасположенность к раку легкого

ПЦР-генотипирова1ше гена GSTM1 представлено на рисунке 3.

1 2 3 4 5

Рисунок 3. Пример генотипирования гена OSTM1.

Дорожки 1,3, 5 - генотип GSTM1(+). дорожки 2, 4 - генотип GSTMl(-). В качестве маркера молекулярной массы использовалась ДНК, парализованная эндонуклеазой рестрикции Pst I.

В настоящем исследовании частота генотипа GSTMl(-) среди пациентов с РЛ составила 54%, в контрольных группах ЗД - 52%, у ПД - 45%. У больных с ПлРЛ делеция гена GSTM1 наблюдалась у 56% обследованных (рис. 4, табл. 3).

Сопоставление встречаемости генотипа GSTMl(-) у больных РЛ и ЗД не выявило увеличения частоты негативного генотипа у онкологических пациентов (Р=0,931). В то же время, если в качестве контроля использовалась группа ПД, то представленность неблагоприятного генотипа GSTM1 у больных РЛ по сравнению со здоровыми индивидуумами была более заметна (Р=0,131). Анализ частот генотипа GSTMl(-) у пациентов с различными гастологическими типами РЛ показал, что данный генотип у больпых ПлРЛ встречался в 56% случаев, у больных с АК - в 41% и МкРЛ - в 50% случаев (табл. 3).

М

Рисунок 4. Распределение генотипов GSTM1 в группах пожилых доноров, доноров среднего возраста и пациентов с РЛ.

Таблица 3. Распределение GSTM1 генотипов среди групп пожилых допоров, доноров среднего возраста и пациентов с раком легкого в зависимости от пола и анамнеза курения.

Группы СЭТМ1 генотип

СвТМ1(+) СвТМ1(-) Всего 253(100)

Пожнлые доноры (всего) 139 (55)* 114 (45)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 5В (57) 51 (58) 7(54) 43(43) 37 (42) 6(46) 101 (100) 88 (100) 13 (100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 79(54) 19 (48) 59(57) 66(46) 21 (52) 44(43) 145 (100) 40(100) 103 (100)

Всего мужчин Всего женщин 71 (54) 67 (56) 60(46) 53(44) 118(52) 131 (100) 120 (100) 225 (100)

Доноры среднего возраста (всего) 107(48)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 56(42) 33 (48) 23 (36) 76 (58) 35(52) 41(64) 132 (100) 68 (100) 64(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 38 (53) 11 (50) 27(54) 34(47) 11(50) 23(46) 72(100) 22(100) 50(100)

Всего мужчин Всего женщин 52 (52) 55(44) 49 (48) 69 (56) 101 (100) 124 (100)

Пациенты с раком легкого (всего) 67(46) 77(54) 144 (100)

плоскоклеточный адеиокарцинома мелкоклеточный 31 (44) 13 (59) 9(50) 39 (56) 9(41) 9(50)) "ч ч /—> 388

Курящие (всего) Мужчины Женщины 60(48) 59(50) К-) 64(52) 60(50) 4(-) 124(100) 119(100) 5(100)

Некурящие Мужчины Женщины 7(41) 2 (-) 5М 10 (59) 3(-) 7(0 17 (100) 5(-) 12(0

Всего мужчин Всего женщин 6(48) 6(35) 66(52) 11 (65) 127 (100) 17 (-)

Возрастные группы <=50 >50 4(-) 63(48) Ю(-) 67 (52) 14(-) 130(100)

* Первая цифра - катичество выявленных генотипов, в скобках представлена встречаемость генотипов GSTM1 в процентах.

Несмотря на преобладание генотипа GSTM1(-) у пациентов с ПлРЛ, наблюдаемые различия между онкологическими пациентами и контрольными группами (ЗД и ПД) были статистически недостоверны. Сделать заключение о связи риска РЛ с АК и МкРЛ не представляется возможным из-за малой

выборки обследованных. Сравнение отрицательного GSTM1 генотипа у курильщиков и некурящих не выявило различий между этими группами.

Данные литературы не выявили заметного увеличения риска РЛ у носителей генотипа GSTMl(-) OR=1,13 (а 1,04-1,25) и OR=1,08 (а 0,98-1,18) (Houlston R.S., 1999; Benhamou S. et а1., 2002), соответственно.

Таким образом, небольшое преобладание делеций в GSTM1 гене у пациентов с РЛ, позволяет предположить влияние этого полиморфизма на риск возникновения рака легкого. Однако небольшие различия, полученные в настоящем исследовании, и литературные данные, касающиеся роли «слабых» генетических факторов в причастности к онкологическому риску, свидетельствуют о необходимости изучения сочетанного действия нескольких полиморфных генов.

Комбинация генотипов CYP1A1 и GSTM1 и риск рака легкого

Результаты распределения комбинаций генотипов GSTM1 и CYP1A1 у ПД, ЗД и пациентов с РЛ представлены в таблицах 4,5.

Частота генотипов GSTM1(+) и CYP1A1 mlml среди групп ПД, ЗД и пациентов с РЛ была сходной и составляла 42%, 39% и 34%, соответственно (Р=0,270). В связи с тем, что в вышеупомянутые группы входили как некурящие, так и курящие индивидуумы была проанализирована каждая из этих групп в отдельности. Исследование некурящих ПД и ЗД показало одинаковую представленность сочетаний генотипов GSTM1(+) и CYP1A1 mlml (40% и 39%, соответственно).

Сопоставление распределения данных генотипов у некурящих в группах ПД и ЗД по сравнению с пациентами с РЛ, хотя и выявило различия между ними (40% и 39% та. 29%), но из-за небольшой выборки онкологических больных (5 из 17) оценить наблюдаемые различия не представлялось возможным. У курящих сочетание генотипов GSTM1(+) и CYP1A1 mlml в группах ЗД и пациентов с РЛ встречалась с одинаковой частотой (37% и 36%, соответственно). В то же время у ПД упомянутые генотипы были выявлены в 48% случаев, и такое распределение генотипов, по сравнению с пацие1ггами с РЛ, предполагает тенденцию к статистически значимым различиям (Р=0,09). Сравнение данных полиморфизмов GSTM1 и CYP1A1 между курящими и некурящими в группах ЗД, ПД и пациентами с РЛ не выявило различий между ними. При изучении генов CYP1A1 или GSTM1 с изменениями в одном из них у курильщиков и некурящих в тех же группах отличий не обнаружено (табл. 4).

Другая картина наблюдалась при изучении встречаемости сочетания двух генотипов с редкими аллелями: СУР1А mlm2 и GSTM1 (-) (табл. 5).

При сравнении выше указанных генотипов между когортами ЗД, ПД и больных с РЛ наблюдалось их увеличение с 7% и 12%, выявляемое у здоровых доноров, до 13% и 20% у больных РЛ и ПлРЛ (Р=0,091 РЛ та. ПД та. ЗД; Р=0,006 ПлРЛ \5. ПД та. ЗД). Встречаемость данных генотипов у больных с МкРЛ (11%) была сходна с уровнем, наблюдаемым у ЗД (Р=0,185 МкРЛ та. ПД и ЗД). У больных с АК такие генотипы не выявили (Р=0,057 АК та. ПД та. ЗД).

Таблица 4. Распределение комбинаций Mspl/CYPl A1 и GSTM1 генотипов среди пожилых и доноров среднего возраста, а также пациентов с раком легкого в зависимости от пола и анамнеза курения

С5ТМ1(+) СЭТМС-) <58ТМ1(+) С8ТМ() СЯТМ1(+) СЯТМ(-) Всего

Группа СУР1А1 СУР1А1 СУР1А1 СУР1А1 СУР1А1 СУР1А1

(т1ш1) (т1т1) (ш1т2) (ш1ш2) (ш2ш2) (ш2т2)

Пожилые доноры (всего) 107 (42)* 94(37) 32 (13) 18(7) 0(-) 2(1) 253(100)

Курящие (всего) 48 (48) 33 (33) 10(10) 10(10) 0(-) 0(.) 101 (100)

Мужчины 41(47) 29 (33) 10(11) 8(9) 0(-) 0(-) 88(100)

Женщины 7(54) 4(31) 0(-) 2 05) 0(-) 0(-) 13(100)

Некурящие (всего) 58(40) 57(39) 21 (15) 8(6) 0(-) 1(1) 145 (100)

Мужчины 14(35) 19(48) 5(13) 2(5) 0(-) 0(-) 40(100)

Женщины 43 (42) 37(36) 16(16) 6(6) О(-) 1(1) 103(100)

Всего мужчин 56(43) 49 (37) 15(12) 10(8) 0(-) 1(1) 131 (100)

Всего женщин 50(42) 44(37) 17(14) 8(7) ОН 1(1) 120(100)

Доноры среднего возраста (всего) 88(39) 89(40) 19(8) 27 (12) 0(0 2(1) 225(100)

Курящие (всего) 49(37) 58(44) 7(5) 17(13) 0(.) 1(1) 132 (100)

Мужчины 29 (43) 25(37) 4(6) 9(13) 0(.) 1(1) 68(100)

Женщины 20(31) 33 (52) 3(5) 8(13) 0(-) 0(-) 64(100)

Некурящие (всего) 28(39) 26 (36) 10 (14) 7(10) 0(.) 1(1) 72(100)

Мужчины 10 (46) 6(27) 1(5) 4(18) 0(.) 1(1) 22 (100)

Женщины 18(36) 20 (40) 9(18) 3(6) 0(-) 0(-) . 50(100)

Всего мужчин 45 (45) 31(31) 7(7) 16(16) 0(-) 2(2) 101(100)

Всего женщин 43 (35) 58(47) 12(10) 11(9) 0(-) 0(0 124 (100)

Пациенты с раком легкого (всего) 49(34) 57(40) 17(12) 19(13) »(1) 1(1) 144(100)

немелхоклеточный 31 (30) 40(39) 14(14) 17(16) 1(1) 1(1) 104(100)

плоскоклеточный 20(29) 24(34) 10(14) 14(20) 1(1) 1(1) 70 (100)

аденокарцинома 10 (45) 9(41) 3(14) 0(-) 0 0 0 0 22(100)

мелкоклеточпый 8(44) 7(39) 1(6) 2(11) 0 0 0 0 18(100)

Курящие (всего) 44(36) 47(38) 15(12) 16(13) 1(1) 1(1) 124(100)

Мужчины 43 (36) 44(37) 15(13) 15(13) 1(1) 1(1) 119(100)

Женщины 1(25) 3(50) 0(-) 1(25) 0 0 0 0 5(100)

Некурящие (всего) Мужчины 5(29) 2(40) 8(47) 2(40) 2(12) 0(-) 2(12) 1(20) 00 0 0 00 00 17(100) 5(100)

Женщины 3(25) 6(50) 2(17) 1(8) 0 0 0 0 12(100)

Анамнез курения неизвестен (всего)

Мужчин 3(-) 0 0 0(-) О(-) 0 0 0 0 3 0

Женщин 0(-) 0 0 00 0(-) 0 0 00 00

Всего мужчин 45(35) 48(38) 15(12) 17(13) 1(1) 1(1) 127(100)

Всего женщин 4(24) 9(53) 2(12) 2(12) 0 0 0 0 17(100)

Возрастные группы

<=50 2(14) 10(71) 2(14) 0(-) 0 0 0 0 14(100)

>50 47(36) 47(36) 15(12) 19(15) 1(1) 1(1) 130(100)

• Первые цифры - количество выявленных генотипов или аллелей, в скобках - частота встречаемости генотипов в %.

Сравнение комбинаций двух неблагоприятных генотипов между больными РЛ и ПлРЛ и группами ПД и ЗД (с каждой из групп в отдельности) показало еще большие различия во встречаемости подобных изменений в исследованных генах у ПД (Р=0,068 РЛ га. ПД; Р=О,ОЗ ПлРЛ га. ПД) по сравнению с ЗД (Р=О,859 РЛ ж ЗД; Р=0,126 ПлРЛ ж ЗД).

Таким образом, изучение комбинации CYP1A1 и GSTM1 с неблагоприятными аллелями в обоих генах показало увеличение представленности таких генотипов у больных РЛ, особенно ПлРЛ (табл. 4, 5). Данные сопоставления выявляют также более выраженную предрасположенность к ПлРЛ, чем к РЛ, куда входят разные гистологические типы опухолей. Как известно, повышенная активность АГГ, фермента, кодируемого CYP1A1 геном, наблюдается в мерцательном эпителии бронхов, из клеток которого возникает ПлРЛ.

Таблица 5. Встречаемость комбинаций генотипов CYP1A1 и GSTM1 в различных гистологических типах опухшей легкого, у доноров пожилого и среднего возраста.

Комбинация генотипов Вст >ечаемость генотипов

Здоровые доноры Пациенты с раком легкого

ДД ЗД РЛ ПлРЛ МкРЛ АК

CYP1A1 mlml GSTM1(+) 107 (42)* 88(39) 49 (34) 20 (29) 8(44) 10 (45)

CYP1A1 mlml GSTM1(-) 94 (37) 89 (40) 57 (40) 24 (34) 7(39) 9(41)

CYP1A1 mlm2 GSTM1(+) 32 (13) 19(8) 17 (12) 10(14) 1(6) 3(14)

CYP1A1 mlm2 GSTM1(-) 18 (7)" 27 (12) 19(13) 14 (20)** 2(11) 0С-)

CYP1A1 m2m2 GSTM1(+) ОС-) 0(-) KD 1 (1.4) 0(.) 0С-)

CYP1A1 m2m2 GSTM1(-) 2(1) 2(1) 1(1) 1 (1,4) ос-) ос-)

Всего: 253 (100) 225(100) 144 (100) 70 (100) 18 (100) 22 (100)

* - количество выявленных генотипов, в скобках - % содержание генотипа в группе,

** - отмечено статистически значимое различие между группами (Р=О,ОЗ).

Данные литературы, касающиеся роли неблагоприятных аллелей гена CYP1A1 в сочетании с дефицитным генотипом GSTM1, противоречивы. Приводятся сведения об увеличении риска возникновения РЛ при комбинации GSTM1 нулевого варианта с т2 аллелями CYP1A1 (Rebbeck T.R., 1997; Garcia-

Closas M. et al., 1997; Young S.H et al., 1998; Lin D. et al., 1998; Fryer A.A., Jones P.W., 1999; Dresler C. et al., 2000; Stacker I. et al., 2000; Quinones L. et al., 2001; Chen S. et al., 2001). Представляется показательной работа Garcia-Closas M. et al. (1997), в которой па больших группах (416 человек - пациенты с РЛ, 446 - контрольная группа) изучалось влияние полиморфизма двух генов CYP1A1 и GSTM1 на риск возникновения РЛ. Авторы не обнаруживали такой связи у носителей одного редкого генотипа: mlm2 CYP1A1 присутствовал у 18% больных РЛ и 16% здоровых. Нулевой вариант GSTM1 обнаружили у 52% из группы больных РЛ и у 54% контрольных лиц. Однако у носителей изменений в обоих генах наблюдалось двукратное увеличение риска РЛ. Аналогичные данные о повышении риска РЛ приводятся в работе Tang D.L. et al. (1998). Существуют также данные литературы, отрицающие связь риска РЛ с носитатьством комбинации редкого аллеля гена CYP1A1 и дефшпггного варианта GSTM1 (ВгоскгпбПег J. et al., 1996; To-Figueras J. et al., 1997; Boffetta P. et al., 1998; Smith G.B. et al., 2001; Gsur A. et al., 2001, Hung RJ. et al., 2003).

Следует отметить, что наряду с матекулярно-эпидемиаюгическими исследованиями, целый ряд работ посвящен выяснению вопроса, каким образом полиморфизм генов приводит к функциональным изменениям в ткани-мжшени. С этой целью изучали содержание аддукгов ДНК в легочной ткани здоровых и больных РЛ. Было показано, что уровень аддуктов ДНК у больных был: в 2,5 раза выше, чем у здоровых, и не зависел от того, были ли они носоглями неблагоприятных изменений в одном из генов (CYP1A1 или GSTM1) или же при их сочетании. Также не изменял этот уровень ни статус курильщиэса, ни качество потребляемых сигарет (Cheng Y. et al., 2000). В другом исследовании была предпринята попытка определить, как влияют генотипы CYP1 Al, GSTM1 и мутации в рецепторе АГГ на активность арилгидрокарбопгидроксатазы в ткани легкого (Smith G.B. et al., 2001). Авторы показали, что активность исследуемого энзима не зависела от мутаций в CYP1A1, GSTM1 генах или рецепторе АГГ. На основании этих данных авторы пришли к заключению об отсутствии связи между полиморфизмом CYP1A1 и GSTM1 генов и риском возникновения РЛ.

Исследователи пытались также найти связь между повышенной экспрессией мутантного гена р53 и полиморфизмом GSTM1, CYP1A1, CYP2D6 генов у больных с немелкоклеточным РЛ. Корреляции между наличием мутацией в гене р53 и полиморфизмом выше перечисленных генов не было обнаружено (Rusin M. et al., 1999).

Различные результаты, полученные при изучении связи полиморфизма генов CYP1A1 и GSTM1 с риском онкологических заболеваний легкого, могли быть связаны с расовыми и этническими отличиями в представлеЕНОСти неблагоприятных вариантов данных генов в здоровых популяциях (Kihara M. et al., 1995; Young S.H et al., 1998; Dresler С et al., 2000; Gsur F. et al., 2001; Quinones L. et al., 2001).

Таким образом, несмотря на неоднозначность результатов, полученных разными исследователями, в целом, создается впечатление, что рнос РЛ увеличивается у носителей генотипа GSTM1 (-) в сочетании с неблагоприятным аллелем т2 гена CYP1A1.

Полиморфизм CYP2E1 и предрасположенность к раку легкого

Примеры генотипирования Рза1- и Dral-папиморфизмов гена CYP2E1 представлены на рисунках 5 и 6, соответственно.

М 1 2 3

Рисунок 5. Пример генотипирования CYP2E1 гена (Rsa 1-полиморфизм). Дорожки 1,3- генотип cl/cl, дорожка 2 - генотип cl/c2. ДНК фага лямбда, гидролизованная PstI рестриктазой, использовалась в качестве маркера молекулярной массы.

При исследовании распределения генотипов и аллелей гена CYP2E1 (Rsal-полиморфизм) гомозиготный генотип с2с2 гена CYP2E1 не был выявлен (табл. 6). Генотипы clcl и clc2 в группе ЗД встречались в 93% и 7%, частота аллелей cl и с2 составила 97% и 3%, соответственно. Сходное распределение данных генотипов и аллелей наблюдались в группе ПД (95%, 5% и 97%, 3%, соответственно). У больных РЛ гомозиготный генотип с аллелями дикого типа и аллель cl встречались несколько чаще (98% и 99%), а гетерозиготный генотип clc2 и аллели с2 - реже (2% и 1%), чем в контрольных группах. Однако статистическая обработка не подтвердила значимость наблюдаемых различий в распределении генотипов и аллелей между группой пациентов с РЛ и контрольными группами ЗД и ПД(Р=0,442 и Р=0,464). Не выявлено различий в распределении генотипов Rsal/CYP2E1 у больных с разными гистологическими типами опухшей, курящими и некурящими, мужчинами и женщинами между контрольными группами и пациентами с РЛ.

Рисунок 6. Пример генотипирования СУР2Е1 гена ^га1-полиморфизм). Дорожка I - генотип DC, дорожка 2 - генотип С С, дорожка 3 - генотип DD. ДНК фага лямбда, гидролизованная эндонуклеазой Рй1, использовалась в качестве маркера молекулярной массы.

м 1 2 3

Таблица 6. Распределение генотипов и аллелей гена CYP2E1 (К881-полиморфизм) у доноров пожилого и среднего возраста, а также больных раком легкого в зависимости от пола и анамнеза курения

Группы Генотипы Аллели

с1с! 149* (95) с1с2 Всего с1 с2 Всего

Пожилые доноры (всего) 8(5) 157 (100) 306(97) 8(3) 314 (100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 78 (94) 71 (95) 7(88) 5(6) 4(5) 1(12) 83 (100) 75 (100) 8(100) 161(97) 146(97) 15 (94) 5(3) 4(3) 1(6) 166 (100) 150 (100) 16 (100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 71 (96) 30(97) 41 (95) 3(4) 1(3) 2(5) 74(100) 31 (100). 43 (100) 145(97) 61 (98) 84(98) 3(3) 1(2) 2(2) 148(100) 62 (100) 86(100)

Всего мужчин Всего женщин 101 (95) 48 (94) 5(5) 3(6) 106(100) 51 (100) 207(97) 99(97) 5(3) 3(3) 8(3) 212(100) 102(100)

Допоры среднего возраста (всего) 110(93) 8(7) 118 (100) 228(97) 236(100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 81 (93) 44(92) 37(95) 6(7) 4(8) 2(5) 87 (100) 48 (100) 39 (100) 168(96) 92(96) 76(97) 6(4) 4(4) 2(3) 174(100) 96(100) 78(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 29(94) 10 (90) 19 (95) 2(6) 1(10) 45) 31 (100) 11(100) 20 (100) 60(97) 21 (96) 39 (98) 2(3) 1(4) 1(2) 62(100) 22(100) 40(100)

Всего мужчин Всего женщин 54(92) 56(95) 5(8) 3(5) 59 (100) 59 (100) 113(96) 115(97) 5(4) 3(3) 118(100) 118(100)

Пациенты с раком легкого (всего) 49(98) 1(2) 50(100) 97(99) 1(1) 100(100)

плоскоклеточный аденокарцинома мелкоклеточный крупноклеточный 25 (96) 8(100) И (100) 1(100) 1(4) 0(0 0(-) 0(-) 26 (100) 8(100) И (100) 1(100) 51 (98) 16(100) 22(100) 0(-) 1(2) 0(-) 0(-) 0(-) 52 (100) 16(10) 22(100) 0(-)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 45(98) 44(98) 1(100) 1(2) 1(2) 0(-) 46(100) 45(100) 1(100) 90(98) 89 (98) 2(100) 2(2) 1(2) 0(-) 46(100) 90(100) 2 (100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 4(100) 0(-) 4(100) 0(-) 0(-) 0(-) 4(100) 0(-) 4(100) 0(-) 0(-) 0(-) 0(-) 0(-) 0(-) 4(100) 0(-) 4 (100)

Всего мужчин Всего женщин 44(98) 5(100) 1(2) 0(-) 45 (100) 5(100) 89 (99) 10(100) 1(1) 0(-) 90(100) 100(100)

* Первые цифры - количество выявленных генотипов или аллелей, в скобках -встречаемость генотипов в процентах.

Результаты распределения генотипов и аллелей гена CYP2E1 ^гаЬ полиморфизм) у здоровых доноров и пациентов с РЛ представлены в таблице 7.

Частота генотипов и аллелей гена Dral/CYP2E1 в группе ЗД составила 81%, 18%, 1% для генотипов DD, DC и СС и 90% и 10% для аллелей D и С, у ПД и пациентов с РЛ величины были одинаковы - 88%, 11%, 1% и 94%, 6%, соответственно. Однако выявленные различия не достигали статистической достоверности (Р=0,198 для генотипов; Р=0,286 для аллелей).

Таблица 7. Распределение генотипов и аллелей гена CYP2E1 фгаЬ полиморфизм) у доноров пожилого и среднего возраста, а также больных раком легкого в зависимости от пола и анампеза курения.

Группы Генотипы Всего Аллели Всего

ОБ ВС СС Б С

Пожилые доноры (всего) 143* (88) 17(11) 2(1) 162(100) 303(94) 21(6) 324(100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 75 (88) 68(89) 7(78) 9(11) 8(11) 1(11) Ю) 0(-) 1(11) 85 (100) 76 (100) 9(100) 159(94) 144 (95) 15 (83) 11(6) 8(5) 3(17) 170(100) 152(100) 18 (100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 68 (88) 31 (94) 37(84) 8(11) 2(6) 6(14) 1(1) 0(.) 1(2) 77(100) 33 (100) 44(100) 144(94) 64(97) 80(91) 10(6) 2(3) 8(9) 154(100) 66(100) 88 (100)

Всего мужчин Всего женщин 99(91) 44(83) 10(9) 7(13) 0(-) 2(4) 1(1) 109 (100) 53 (100) 208 (95) 95(90) 10(5) 11 (Ю) 218(100) 106 (100)

Доноры среднего возраста (всего) 83(81) 18(18) 102 (100) 184(90) 20(10) 204 (100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 58(87) 32(97) 26 (79) 7(11) 0(-) 7(21) 1(2) 1(3) 0(-) 66(100) 33 (100) 33 (100) 123 (93) 64(97) 59 (89) 9(7) 2(3) 7(11) 132(100) 66(100) 66(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 25 (69) 11(61) 14 (78) 11(31) 7(39) 4(22) 0(-) 0(-) 0(-) 36 (100) 18(100) 18(100) 61 (85) 29(81) 32 (89) 11 (15) 7(19) 4(11) 72 (100) 36 (100) 36(100)

Всего мужчин Всего женщин 43(84) 40 (78) 7(14) 11 (22) 1(2) 0(-) 51 (100) 51 (100) 93 (91) 91 (89) 9(9) 11(11) 102 (100) 102 (100)

Пациенты с раком легкого (всего) 110(88) 14(11) 1(1) 125 (100) 234 (94) 16(6) 250(100)

плоскокпеточный аденокарцинома мелкоклеточный немелкоклеточный 57 (86) 28(91) 19 (95) 6(75) 9(14) 2(6) 1(5) 2(25) 0(-) 1(3) 0 0 0(-) 66(100) 31 (100) 20 (100) 8(100) 123 (93) 58 (94) 39 (98) 14 (88) 9(7) 4(6) 1(2) 2(12) 132 (100) 62 (100) 40(100) 16(100)

Курящие (всего) Мужчины Женщины 97(87) 94(88) 3(75) 13 (12) 12(11) 1(25) 1(1) 1(1) 0(.) 111(100) 107(100) 4(100) 207(93) 200(93) 6(75) 15(7) 14(7) 2(25) 222 (100) 214(100) 8(100)

Некурящие (всего) Мужчины Женщины 13 (93) 2(67) 11(100) 1(7) 1(33) 0(-) 0(-) 0 0 0 0 14 (100) 3 (100) И (100) 27(97) 4(67) 22 (100) 1(3) 2(33) 00 28 (100) 6(100) 22(100)

Всего мужчин Всего женщин 96(87) 14 (93) 13 (12) 1(7) 1(1) 0 0 110(100) 15 (100) 205 (93) 29(97) 15(7) 1(3) 220 (100) 30 (100)

* Первые цифры - количество выявленных генотипов или аллелей, в скобках -встречаемость генотипов в %.

Встречаемость генотипов Dral/CYP2E1 у больных с различными гистологическими типами опухолей легкого и сопоставление этих частот с аналогичными данными ЗД и ПД показало, что генотип CD выявляется у здорового контроля (ПД и ЗД), пациентов с РЛ и ПлРЛ с частотой 11%, 18%, 11% и 14%, соответственно. В то же время у больных с АК и МкРЛ этот гепотип обнаруживается значительно реже: в 6% и 5% случаях, хотя следует обратить внимание на то, что число больных с АК и МкРЛ по сравнению с другими группами было значительно меньше (в - 2-3 - раза). Отличия между контрольными группами и различными гистологическими типами рака легкого не достигали уровня статистической достоверности (Р=0,249 ПлРЛ; Р=0,129 АК; Р=О,133 МлРЛ vs. ЗД и ПД). В нашем исследовании также не было обнаружено разницы в распределении генотипов и аллелей Dral/CYP2E1 между курящими ПД и пациентами с РЛ. Не выявлено различий среди курильщиков и некурящих у ПД. В группу некурящих больных РЛ входило 14 человек, 13 из них были носителями DD генотипа и только 1 - DC. Малочисленность некурящих пациентов не позволила сравнивать полученные результаты с данными других групп. Среди курящих ЗД генотипы DD, DC, CC были выявлены в 87%, 11% и 2% случаев. Значительная разница наблюдалась при сравнении некурящих мужчин среди ЗД: генотип DD встречаля у 61%, DC - у 39%, СС - отсутствовал. Сравнение курящих и некурящих ЗД показало статистически значимое отличие (Р=0,043). Причина полученных результатов неясна.

При сравнении частот аллелей Dral/CYP2E1 у мужчин и женщин было замечено, что С аллель у мужчин встречался реже, чем у женщин в контрольных группах (ПД и ЗД) и был найден у 5% и 9% обследованных мужчин и у 10% и 11% обследованных женщин, однако различия не были статистически достоверны.Данные о распределении мутантпых аллелей согласуются с результатами, полученными при тишровании других европейских популяций (Hirvonen A. et al., 1993; Bartsch Н. et al., 2000). Выявленное в данной работе отсутствие достоверных различий в частотах аллелей и генотипов Rsal-полиморфизма между пациентами и контрольными группами соответствует выводам ряда исследователей (Kato S. et al., 1992,1994; Watanabe J. et al., 1995; London S. et al., 1996). В то же время в работе Le Marchand L. показано уменьшение риска РЛ при наличии у носителей вариантных аллелей данного гена (Le Marchand L. et aL, 1998). Другие исследователи сообщают о существовании связи мутаций как в Dral-, так и Rsal- сайтах CYP2E1 гена с повышенным риском РЛ (Uematsu F. et al., 1992) и приводят данные об ассоциации с2 аллеля с определенным гистологическим типом опухоли.

При сравнении частот аллелей Rsal- и Dral-полиморфизмов мы наблюдали сходные тенденции, что объясняется их генетической сцепленностью.

Таким образом, результаты нашего исследования не обнаружили связи между мутантными CYP2E1 генотипами (Rsal-и Dral/CYP2E1-полиморфизм) и риском РЛ.

Пожилые доноры как контроль в молекулярно-эпидемиологическпх

исследованиях

Молекулярно-генетнческие исследования по выявлению полиморфных генов, ассоциированных с риском неопластических заболеваний, основаны на сравнении распределения генотипов у онкологических больных и в контрольных группах. Если мутантный аллель встречается у больных по сравнению с контролем чаще, то делается предположение об онкоассоциированности изучаемого полиморфизма. Однако нормальные генные полиморфизмы обладают низкой пенетрантностью (Имянитов Е.Н., 1999; Imymiitov E.N. et al., 2003; Shields P.G., Harris C.C., 2000). Встречаемость таких аллелей иногда не превышает 1% (Tefre Т. et al, 1991; Hirvonen A. et al, 1993; Alexandrie A. et al, 1994; Garcia-Closas M. et al, 1997), в то время как отличия между контрольной группой и онкологическими больными часто составляет несколько процентов. Низкая встречаемость мутантных генотипов создает трудности в оценке связи онкоассоциированных аллелей с риском PJL В то же время изучение данных полиморфизмов представляется важным, так как подобные гены встречаются в популяциях в десятки раз чаще, чем гены семейных раковых синдромов. В то асе время очень часто в исследованиях такого рода результаты, получаемые разными авторами, расходятся. Расхождение результатов может быть связано как с отсутствием биологического эффекта, так и с несбалансированностью групп по пату, возрасту, этническому происхождению, неодинаковой оценкой собираемого анамнеза курения, низкой пенетрантностью нормальных генных полиморфизмов, присутствием среди здоровых допоров «потенциальных» онкологических больных (Ries L.A., Kosary C.L., Hankey B.F., et al., 1996). В связи с тем, что существуют незначительные отлкчия в распределении онкоассоциированных аллелей у онкологических больных и здоровых доноров, для получения достоверных результатов требуется рандомизация сравниваемых групп.

Чтобы повысить достоверность результатов молекулярно-эпидемиологических исследований, в лаборатории молекулярной онкологии НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова было предложено использовать в качестве дополнительного контроля лиц пожилого возраста, не имеющих онкологических заболеваний - «онкотогически-татерантная» группа. Это предложение было проверено при изучении связи полиморфизма GSTM гена и риска возникновения РЛ (Белогубова КВ. и соавт., 2000; Belogubova Е. V. et al., 2000). Оказалось, что показатели у ЗД, обычно используемые в мировой практике в магекулярно-эпидемиологаческих исследованиях как контроль, мало отличаются от таковых в группе онкологических больных: частота встречаемости генотипа GSTM(-) у ЗД равна 45%, а у больных с РЛ - 41%. Использование в качестве контроля ПД показало, что данный генотип у них выявляется у 55% обследованных, увеличивая различия, наблюдаемые между онкологически-тотерантной группой н пациентами со злокачественными заболеваниями легкого.

Настоящее исследование также подтвердило правильность выбранной стратегии. Сопоставление распределения гепатитов GSTMl(-) и CYP1A1 m2m2

в отдельности, а также их сочетание обнаружило, что показатели ЗД занимают промежуточное положение между онкологически-толерантной группой ПД и онкологически-предрасположенной группой больных РЛ. Также видно, что при сравнении каждого отдельного генотипа или их сочетание наиболее выраженные различия наблюдаются при использовании в качестве контроля ПД, чем ЗД (табл. 8).

Таблица 8. Относительный риск и доверительные границы для групп пожилых доноров, доноров среднего возраста, больных раком легкого и плоскоклеточным раком легкого

Генотип Исследуемые труппы ОН Р

Контроль Больные РЛ

СУР1А1 ш1т2 ПД РЛ 1,40 (0,84 - 2,35) 0,212

ПД ПлРЛ 2,12(1,14-3,94) 0,016

ЗД РЛ 1,35 (0,80 - 2,27) 0,294

ЗД ПлРЛ 2,03 (1,09 - 3,82) 0,027

СБТМК-) ПД РЛ 1,40(0,91-2,16) 0,131

ПД ПлРЛ 1,53 (0,87 - 2,71) 0,148

ЗД РЛ 1,04 (0,67 - 1,62) 0,931

ЗД ПлРЛ 1,14 (0,64 -2,03) 0,733

СУР1А1 ш1ш2/ СБТМЦ-) ПД РЛ 1,98(0,96-4,13) 0,068

ПД ПлРЛ 3,26 (1,43 - 7,40) 0,003

ЗД РЛ 1,11(0,57-2,18) 0,859

ЗД ПлРЛ 1,83 (0,85 - 3,93) 0,136

Сравнение комбинаций исследуемых генов в группах ПД и ЗД у мужчин, являющихся группой риска для возникновения РЛ показало, что у ПД мутации в СУР1Л1 гене при нулевом генотипе 08ТМ1 встречались в 8%, а у ЗД - в 16% случаев, т.е. в 2 раза чаще, что позволило сделать вывод о существовании между изучаемыми группами различий, достигающих статистически значимой тенденции (Р=0,079). Сопоставление аналогичных показателей среди женщин тех же групп не выявило отличий. Этот факт также может служить дополнительным доводом в пользу использования ПД как онкатогически-толерантную группу в мшекулярнскшидемиологических исследованиях.

Данная работа продемонстрировала, что исследуемые показатели в стандартной группе, обычно используемой в матекулярпо-эпидемиологических исследованиях в мировой практике - ЗД, мало отличаются от таковых у онкологических больных. Использование ПД в качестве онкологически-толерантной группы увеличивает различия между контрольной группой и пациентами с РЛ.

выводы

1. Носительство редкого аллеля т2 гена СУР1Л1 достоверно ассоциировано с увеличенным риском плоскоклеточного рака легкого: аллель т2 выявляется у 26/140 (19%) больных плоскоклеточным РЛ, в то время как его частота у здоровых доноров и у пожилых контрольных индивидуумов составляет 51/460 (11%) и 55/518 (11%), соответственно.

2. «Дефицитный» генотип 08ТМ1 (-) демонстрирует тенденцию к преобладанию у больных раком легкого (77/144 (54%) по сравнению с пожилыми лицами контрольной группы (114/253 (45%).

3. Нежелательный эффект аллельных вариантов СУР1Л1 и 08ТМ1 проявляется преимущественно за счет увеличения риска плоскоклеточного рака легкого; носительство СУР1Л1 т2 и 08ТМ1 (-) не сопряжено с достоверным повышением предрасположенности к другим гастологическим типам РЛ.

4. Комбинация т2-содержащего генотипа СУР1Л1 и «дефицитного» варианта 08ТМ1 увеличивает риск рака легкого в большей степени, чем каждый из перечисленных полиморфизмов по отдельности.

5. Показано отсутствие взаимосвязи между полиморфизмом гена СУР2Е1 и предраспатоженностью к РЛ а) встречаемость полиморфного аллеля с2 гена СУР2Е1 ^а1-полиморфизм) у пациентов с раком легкого редка (1/100 (1%) и незначительно отличается от таковой в контрольных группах (здоровые доноры: 8/236(3%); пожилые индивидуумы: 8/314(3%); б) не выявлено достоверных отличий при анализе частоты аллеля С гена СУР2Е1 (Бга1-полим орфизм) в вышеупомянутых контрольных группах (20/204(10%) и 21/324(6%), соответствепно) по сравнению с больными РЛ (16/250 (6%).

6. Включение в исследование пожилых индивидуумов без онкологических заболеваний в анамнезе в качестве дополнительной контрольной группы повышает информативность молекулярно-эпидемиологического анализа онкоассоциированных генных полиморфизмов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белогубова Е.В., Имянитов Е.Н, Хансон К.П., Того А.В., Суворова И.К. Полиморфизм гена СУР1А1 и риск возникновения рака легкого. // Российская оториноларингология. -2003. -Т. 2.-№5.-С. 213-215.

2. Белогубова Е.В., Того А.В., Суворова И.К.. Карпова М.Б., Улыбина Ю.М, Зайцева О.А., Яцук О.С., Шуткин В.А., Рябоконь С.А., Соколенко А.П., Иевлева А.Г., Чекмарёва Е.В., Лемехов В.Г., Колосков А.В., Кучинский А.П., Хансон К.П., Имянитов Е.Н Распределение аллелей гена СУР1А1 у больных раком легкого, доноров среднего возраста и пожилых онкологически-здоровых индивидуумов. // Вопр. Онкологии.-2004.-Т. 50.-№2.-С. 165-168.

3. Белогубова Е.В., Того А.В., Суворова И.К.. Карпова МБ., Улыбина Ю.М., Зайцева О.А., Яцук О.С., Шуткин В.А., Рябоконь С.А., Лемехов В.Г., Колосков А.В., Кучинский А.П., Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Роль полиморфизма гена СУР1А1 в формировании предрасположенности к раку лёгкого. // Сборник «Медико-биологические проблемы Приднестровья». -Выпуск 5.-Молдова. - г. Тирасполь.-2004.-С. 155-164.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность научным руководителям диссертационной работы академику РАМН, д.м.н., проф. Кайдо Пауловичу Хансону и д.м.н. Евгению Наумовичу Имянитову за постоянное внимание и ценные рекомендации при обсуждении работы. Приношу глубокую благодарность к.б.н. КВ. Белогубовой за помощь в выполнении работы.

Выражаю искреннюю признательность руководителю хирургического отделения, дм.н., проф. А.С. Барчуку, проф. ВТ. Лемехову и сотрудникам отделения, заведующей КАПО ГБ №31 Г.Н. Кастовой, заместителю главного врача по хирургии Госпиталя для Ветеранов Войн Д.М. Кулибабе, заведующему 3-им хирургическим отделением Госпиталя для Ветеранов Войн О.А. Чурзину и сотрудникам отделения за помощь в сборе клинического материала.

Также выражаю глубокую благодарность за помощь в выполнении работы коллегам к.б.н. А.В. Того, к.б.н. Е.Ш. Кулигиной, к.м.н. Е.Н. Суспицыну, М.Б. Карповой, КГ. Буслову, О А Зайцевой, О.С. Яцук, Л.В. Рикуновой, Ю М. Улыбиной.

На правахрукописи

СУВОРОВА Ирина Константиновна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ CYP1A1, GSTM1 и CYP2E1 У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО

Специальность: 14.00.14-онкология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано в печать 24.03.2004.

_Тираж 100. Заказ 501.__

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевпгческая академия. Издательство СПХФА—член Издагсяьско-патюрафичссвэй ассоциации вузов Санкт-Петербурга, 197376, С-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

Рак легкого (PJI) - одно из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований. PJI является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний у мужчин и занимает второе место (после рака молочной железы) у женщин (Hung R.J. et al., 2003). В разных географических регионах у мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев PJI на 100000 человек в год, заболеваемость женщин - в 6-10 раз ниже. В России ежегодно от РЛ погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. В Санкт-Петербурге РЛ сохраняет первое место в структуре смертности от новообразований (Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000; Барчук А.С., Мерабишвили В.М., Кисельникова И.В., 2001).

80-90% случаев рака легкого вызвано курением (Худолей В.В., 1999; Заридзе Д.Г., 2000). В то же время известно, что РЛ возникает не у всех курильщиков, и этот факт позволяет предполагать существование генетических факторов риска. В настоящее время наибольший интерес в молекулярно-генетических исследованиях РЛ вызывают онкоассоциированные генные полиморфизмы. Установлено, что присутствие в генотипе «неблагоприятных» аллелей генов HRAS-1 и L-MYC может повышать риск возникновения РЛ (Weston A. et al., 1992,1994; Tamai S. et al., 1990; Fong K.M. et al., 1996; Zborovskaya I. et al., 1996). Предполагается, что индивидуальная предрасположенность к развитию РЛ также связана с полиморфизмом генов, продукты которых принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма (Bartsch Н. et al., 2000; Benhamou S. et al., 2002; Garcia-Closas M. et al., 1997). Следует учитывать, что сведения о влиянии «неблагоприятных» полиморфных аллелей и их сочетаний на риск РЛ противоречивы. Невысокая воспроизводимость результатов работ, выполненных в разных лабораториях, по крайней мере, отчасти объясняется низкой пенетрантностью нормальных генных полиморфизмов (Shields P.G.,

Harris C.C., 2000; Imyanitov E.N. et al., 2003).

В связи с тем, что вероятность развития онкологических заболеваний в течение жизни для женщин составляет 38%, а для мужчин - 48%, в традиционных контрольных выборках, представленных лицами среднего возраста, присутствует значительное количество потенциальных онкологических пациентов (Ries L.A. et al., 1996). В целях увеличения демонстративности молекулярно-эпидемиологического анализа в настоящей работе использовалась дополнительная группа сравнения, состоящая из пожилых онкологически-здоровых лиц. Как показали предыдущие эксперименты, подобный нетрадиционный подход может существенно увеличить эффективность изучения генных полиморфизмов (Белогубова Е.В. и соавт., 2000; Того А.В. и соавт., 1999).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить причастность некоторых полиморфных генов, продукты которых принимают участие в метаболизме канцерогенов табачного дыма, к риску возникновения РЛ. В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать распределение аллелей ключевых генов метаболизма ксенобиотиков полиморфных генов CYP1A1, GSTM1, CYP2E1 у здоровых жителей Санкт-Петербурга.

2. Сравнить распределение аллелей данных генов в группах здоровых доноров и больных РЛ. Выявить полиморфные варианты, ассоциированные с риском возникновения рака легкого.

3. Установить, наблюдается ли связь между наличием определенных аллелей генов и гистологическим типом опухолей.

4. Изучить влияние комбинаций неблагоприятных аллелей перечисленных генов на риск возникновения рака легкого.

5. Оценить перспективность использования пожилых индивидуумов без онкологических заболеваний в анамнезе в качестве дополнительной контрольной группы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Носительство аллеля ш2 гена CYP1A1 ассоциировано с повышением риска плоскоклеточного РЛ.

2. «Дефицитный» генотип GSTM1 проявляет тенденцию к преобладанию у больных РЛ по сравнению с пожилыми лицами контрольной группы.

3. Комбинация ш2-содержащего генотипа CYP1A1 и «дефицитного» варианта GSTM1 увеличивает риск РЛ в большей степени, чем каждый из перечисленных полиморфизмов по отдельности.

Научная новизна полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования были получены следующие приоритетные данные:

1. Обнаружено, что замена Т С в аллеле гена CYP1A1 ассоциирована с повышенным риском возникновения плоскоклеточного рака легкого.

2. Показано, что генотип GSTMl(-) ассоциирован с незначительным увеличением риска рака легкого.

3. Выявлено, что неблагоприятная значимость аллеля с заменой т6235С гена CYP1A1 усиливается при условии сочетания с дефицитным генотипом GSTM1.

4. Показано отсутствие взаимосвязи между полиморфизмом гена CYP2E1 и предрасположенностью к РЛ.

5 Продемонстрировано, что включение в исследование пожилых доноров в качестве дополнительной контрольной группы увеличивает демонстративность исследований онкоассоциированных полиморфизмов.

Практическая значимость. Диссертация имеет научно-практический характер.

В частности, данные об ассоциации полиморфизма генов GSTM1 и CYP1A1 и их сочетаний с предрасположенностью к РЛ, могут быть использованы для оценки индивидуального риска развития данного заболевания. Это позволит выделить группу людей, которым особенно противопоказано как курение, так и работа, связанная с канцерогенными воздействиями. Усиленное медицинское наблюдение за подобными индивидуумами увеличит возможность ранней диагностики, что, в свою очередь, должно положительно влиять на результаты лечения.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на объединенной научной конференции отдела биологии опухолевого роста НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова и лаборатории молекулярной генетики ГБ № 31 (январь, 2004), а также на заседании кафедры оториноларингологии с клиникой Санкт-Петербургского Государственного Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова (февраль, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 122 публикации на русском и английском языках.

выводы

1. Носительство редкого аллеля ш2 гена CYP1A1 достоверно ассоциировано с увеличенным риском плоскоклеточного рака легкого: аллель ш2 выявляется у 26/140 (19%) больных плоскоклеточным PJI, в то время как его частота у здоровых доноров и у пожилых контрольных индивидуумов составляет 51/460 (11%) и 55/518 (11%), соответственно.

2. «Дефицитный» генотип GSTM1 (-) демонстрирует тенденцию к преобладанию у больных раком легкого (77/144 (54%) по сравнению с пожилыми лицами контрольной группы (114/253 (45 %).

3. Нежелательный эффект аллельных вариантов CYP1A1 и GSTM1 проявляется преимущественно за счет увеличения риска плоскоклеточного рака легкого и носительство CYP1A1 ш2 и GSTM1 (-) не сопряжено с достоверным повышением предрасположенности к другим гистологическим типам PJI.

4. Комбинация ш2-содержащего генотипа CYP1A1 и «дефицитного» варианта GSTM1 увеличивает риск рака легкого в большей степени, чем каждый из перечисленных полиморфизмов по отдельности.

5. Показано отсутствие взаимосвязи между полиморфизмом гена CYP2E1 и предрасположенностью к PJI: а) встречаемость полиморфного аллеля с2 гена CYP2E1 (Rsal-полиморфизм) у пациентов с раком легкого редка (1/100(1%) и незначительно отличается от таковой в контрольных группах (здоровые доноры: 8/236 (3 %); пожилые индивидуумы: 8/314 (3%). б) не выявлено достоверных отличий при анализе частоты аллеля С гена CYP2E1 (Dral-полиморфизм) в вышеупомянутых контрольных группах (20/204 (10%) и 21/324 (6%), соответственно) по сравнению с больными РЛ (16/250 (6%).

6. Включение в исследование пожилых индивидуумов без онкологических заболеваний в анамнезе в качестве дополнительной контрольной группы повышает информативность молекулярно-эпидемиологического анализа онкоассоциированных генных полиморфизмов.