Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Полиморфизм генов АCE (I/D), AGTR1 (А1166С) и FGA (Thr312Ala) у больных метаболическим синдромом и их связь с лабораторными факторами риска атеросклероза

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИМЕНИ В. А. АЛМАЗОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201 46025'

на правах рукописи

БАРБИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ АСЕ (1/0), АСТШ (А1166С) И Ев А (ТНЯ312АЬА) У БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ И ИХ СВЯЗЬ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ФАКТОРАМИ РИСКА АТЕРОСКЛЕРОЗА

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, доцент В.В. Дорофейков

Санкт-Петербург -2014 год

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1. ПОНЯТИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА 14

1.2. АРТЕРИАЛЬНАЯГИПЕРТЕНЗИЯКАК СОСТАВЛЯЮЩАЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА 16

1.3. ОСОБЕННОСТИ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32

2.1. КЛИНИЧЕСКИЙ МА ТЕРИАЛ 32

2.2. ЛАБОРА ТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34

2.2.1. РЕАКТИВЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 34

2.2.2. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 35

2.2.3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 3 8

2.3. МЕТОДЫ СТА ТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ 45

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ОБЪЕКТИВНОГО СТАТУСА И

АНАМНЕСТИЧЕСКИХ ДАННЫХ 47

ГЛАВА 4. ЛАБОРАТОРНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА АТЕРОСКЛЕРОЗА У

БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 50

4.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПИДНОГО ПРОФИЛЯ. 50

4.2 ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАЧУВСТВИТЕЛЬНОГО С-РЕАКТИВНОГО

БЕЛКА У БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ. 53

4.3. ИЗУЧЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИНСУЛИНА У ПАЦИЕНТОВ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 55

4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯГОМОЦИСТЕНИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ У БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 57

4.5. АНАЛИЗ ФИБРИНООБРАЗОВАНИЯ И ФИБРИНОЛИЗА У ПАЦИЕНТОВ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 59

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ИССЛЕДУЕМЫХ

ГЕНАХ 63

5.1. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНА а-ФИБРИНОГЕНА (FGA) ПО

ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ THR312ALA 63

5.2. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА РЕЦЕПТОРА 1-ГО ТИПА К АНГИОТЕНЗИНОГЕНУII (АвТЫ) ПО ПОЛИМОРФНОМУ

САЙТУ Al 166С 67

ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ВЫБОРОК БОЛЬНЫХ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ И

ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ 70

ГЛАВА 7. АНАЛИЗ ЗАВИСИМОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АТЕРОСКЛЕРОЗА ОТ ГЕНОТИПА АСЕ (I/D), AGTR1

(А1166С) И FGA (Т312А) 73

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ 78

ВЫВОДЫ 87

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 107

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 108

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 109

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент

ATII - ангиотензин II

ДД - диастолическое давление

ДИ - доверительный интервал

ИЛ - интерлейкин

ИМТ - индекс массы тела

КА - коэффициент атерогенности

МС - метаболический синдром

ОБ - объем бедер

ОТ - объем талии

ПАИ -1 - ингибитора активатора плазминогена 1

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РААС - ренин-ангиотензин-альдестероновая система

СД - систолическое давление

СЖК - свободные жирные кислоты

ТГ - триглицериды

ХС - холестерин

ХС-ЛПВП - липопротеиды высокой плотности ХС-ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ХС-ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности АСЕ - ген ангитензин-превращающего фермента AGT - ген ангиотензиногена

AGTR1 - ген рецептора 1-го типа к ангиотензину II CRP - C-reactive protein (С-реактивный белок) FGA - ген фибриногена Аа-цепи HCY - гомоцистеин

hs-CRP - high-sensitivity C-reactive protein (С-реактивный белок определенный ультра чувствительным методом)

1С AM-1 - (intercellular adhesion molecule-1) - молекула межклеточной адгезии 1 типа,

SAH - S-аденозингомоцистеин

UTR - untranslated region (нетранслируемая область)

VCAM-1 - vascular cellular adhesion molecule-1 - молекула адгезии

сосудистого эндотелия 1 типа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние десятилетия массовыми видами патологии стали гипертоническая болезнь, атеросклероз, сахарный диабет 2-го типа и ожирение, вошедшие в группу так называемых «болезней цивилизации». Существенно, что этот комплекс заболеваний обнаруживает взаимосвязь и часто возникает у одного и того же больного. В связи с этим предполагается существование единой этиологии, обуславливающей все вышеуказанные виды патологии. Этот комплекс взаимоотягощающих друг друга заболеваний был объединен под названием метаболический синдром (МС) [3,33, 119].

Анализ литературных источников показывает, что, несмотря на очевидные успехи в изучении МС, до сих пор существуют значительные разногласия во взглядах на возможные причины и механизмы формирования этого феномена. Изначально понятие МС объединяло комплекс заболеваний с единой этиологией, связанных с инсулинорезистентностью - и объяснялось двумя гипотезами. По одной из них первопричиной возникновения невосприимчивости к инсулину могли быть индивидуальные особенности углеводного обмена, по другой - топографические и метаболические особенности висцеральной жировой ткани [9, 78]. В последнее время МС рассматривают, как мультифакторное заболевание с множественной этиологией. Считается, что в развитии МС могут принимать участие такие факторы, как воспаление, нарушение деятельности эндокринной и кровеносной систем и др. [113, 125, 146]. Кроме того, предполагается, что большинство компонентов синдрома генетически детерминированы, хотя генов, ответственных за возникновение данного симптомокомплекса, пока не выявлено [99].

Нарушения системы гемостаза часто встречаются при МС, что делает диагностику патологий подобного рода чрезвычайно актуальной. Одним из ключевых событий в процессе гемостаза является фибринообразование — конечный этап всего каскада свертывания крови. Именно фибриноген и его

концентрация в крови является одним из наиболее доказанных факторов риска осложнений атеросклероза, в том числе острый инфаркт миокарда. Не менее важным является и процесс лизиса фибрина (фибринолиз) под действием плазмина, который обеспечивает восстановление проходимости сосуда и локализацию процессов свертывания. Свойства фибринового сгустка, его молекулярная архитектура является одним из важнейших факторов, определяющих эффективность фибринолиза. Однако в литературе практически не встречается данных о концентрации плазминогена в крови и его функциональной активности. Трудности диагностики нарушений гемостаза обусловлены многочисленностью его компонентов, а также их сложными взаимосвязями. На сегодняшний день не существует общепринятых методов, позволяющих оценить свойства фибринового сгустка и его доступность лизису плазмином. Так же неоднозначна роль генетических полиморфизмов в гене фибриногена Аа-цепи (БОА), ассоциированных с особенностями молекулярной организации сгустка [45, 58, 130].

Наряду с повышением коагулирующего потенциала крови при МС наблюдается увеличение артериального давления. Установлено, что ключевую роль в регуляции функции сердечно-сосудистой системы и почек занимает ренин-ангиотензин-альдестероновая система (РААС). Активация РААС приводит к повышению артериального давления за счет возрастания объема циркулирующей крови и увеличения активности других вазоконстрикторных факторов. В функционировании РААС важнейшая роль принадлежит ангиотензин-превращающему ферменту (АПФ). Он в значительной степени контролирует функциональное состояние сосудов, воздействуя на их тонус через генерацию ангиотензина II (АТII) и разрушая активные компоненты калликреин-кининовой системы, обладающей сосудорасширяющим действием. Известно, что ген, кодирующий АПФ (АСЕ), имеет структурный инсерционно-делеционный полиморфизм, который ассоциирован с более высоким уровнем циркулирующего АПФ и

более высокой активностью фермента в крови. [98]. Несмотря на то, что в ряде работ встречается множество данных об ассоциации этого полиморфизма с инфарктом миокарда, гипертонией, гипертрофией левого желудочка, гипертрофической кардиомиопатией, заболеваниями почек и другими роль его остается не однозначной [112, 143, 107].

Другим не менее важным компонентом РААС является АТ II, образующийся из ангиотензиногена последовательно под действием ферментов ренина и АПФ. АТ II воздействует на специфические рецепторы в сосудах и надпочечниках, приводя к повышению артериального давления. Большинство известных эффектов АТН реализуются через рецепторы 1-го типа. Ген АвТЮ, кодирующий рецепторы этого типа, также характеризуется наличием структурного полиморфизма, который сказывается на функциональной активности рецептора и осуществлении эффектов АТ II в клетке [46, 47, 140, 142]. Роль всех упомянутых полиморфизмов в развитии МС, а также их связь с лабораторными факторами риска развития атеросклероза (концентрация гомоцистеина, липидов, фибриногена и т.д.) достаточно неоднозначна. Кроме того в рутинной практике клинических лабораторных исследований не существует доступных методов их идентификации.

Степень разработанности темы

В последнее время всё больше внимания исследователи уделяют изучению молекулярно-генетических факторов развития МС, поиску генов предрасположенности и анализу ассоциации их полиморфизмов с различными компонентами синдрома. Выявленные этнические особенности предрасположенности к развитию МС подтверждают роль генетических факторов. Имеются данные об ассоциации МС с полиморфизмом некоторых генов, продукты которых контролируют различные аспекты гемостаза и артериального давления, но вклад их в возникновение МС требует дальнейшего изучения [10, 11]. Вероятно, механизмы возникновения МС разнородны, и в основе генетической составляющей синдрома лежит

сочетанный характер полиморфизма целого ряда генов [99]. Более того, мутации генов в сочетании с резистентностью к инсулину неодинаково проявляют себя в различных популяциях в зависимости от пола, возраста, этнической принадлежности их носителей. Кроме того, в рутинной практике клинических лабораторий используют методы идентификации указанных генов, которые достаточно трудоемки и дорогостоящи, что существенно сдерживает их клиническое применение. Использование молекулярно-генетических, клинико-биохимических подходов позволит оценить функциональную значимость полиморфных вариантов генов и полученных ассоциаций между генотипами и проявлениями МС.

Цель исследования.

Разработать методы определения аллельных вариантов полиморфных генов АвТЮ (А1166С), БвА (ТЬг312А1а) на основе аллельспецифической ПЦР, и изучить ассоциации полиморфизма указанных генов, а также гена АСЕ (1ЛЗ) с лабораторными факторами риска атеросклероза у пациентов с метаболическим синдромом для установления их диагностической и прогностической ценности.

Задачи исследования.

• Разработать методику выявления полиморфизма А/С в промотерной области гена АОТШ в положении 1166 п. н. от точки начала транскрипции.

• Разработать методику выявления полиморфизма гена БОА, приводящего на уровне полипептида к замене в 312 положении треонина на аланин (ТЪг312А1а).

• Изучить лабораторные факторы риска атеросклероза и некоторые компоненты плазменного звена гемостаза у пациентов с метаболическим синдромом.

• Проанализировать возможную связь лабораторных риск-факторов атеросклероза с аллельными вариантами полиморфных генов АСЕ (1Я)), АвТЮ (А1166С) и ¥вА (ТЗ12А) у пациентов с МС и в контроле.

Научная новизна исследования. Разработанные методики определения полиморфизма АОТЮ (А1166С) и БвА (Т11г312А1а) обеспечивают надежное, быстрое и точное получение результатов генотипирования пациентов.

Показана зависимость факторов риска тромбозов (концентрации фибриногена и активности системы фибринолиза) от генотипа БОА (ТЬг312А1а). Выявлено существенное повышение концентрации инсулина на фоне гипергликемии у больных метаболическим синдромом с генотипом II гена АСЕ по сравнению с генотипом БЭ.

Обнаружена зависимость индекса массы тела и концентрации ХС ЛПВП от генотипа АОТШ (А1166С), что говорит о влиянии генетического полиморфизма данного гена на риск возникновения МС.

Впервые среди пациентов с МС показано превалирование особого типа дислипидемии - повышение уровня холестерина низкой плотности в сочетании с гипо-а-холестеринемией. Для этих же пациентов характерно повышение концентрации высокочувствительного С-реактивного белка и инсулина в плазме крови.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты расширяют научные представления о функциональной значимости полиморфизма генов АСТШ (А1166С) и БОА (ТЬг312А1а). Выявление аллельных вариантов полиморфных маркёров генов-кандидатов, обусловливающих повышенный генетический риск развития метаболического синдрома, создаёт базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания. Результаты медико-генетического исследования позволяют разработать мероприятия по профилактике метаболического синдрома, являющегося состоянием высокого риска сердечно-сосудистых осложнений.

Разработанные в ходе работы новые методы ПЦР-диагностики двух ключевых полиморфизмов генов фибриногена и рецептора ангиотезиногена II, могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий.

Определение генетических вариантов может рассматриваться в качестве дополнительного диагностического критерия вероятности возникновения МС и его осложнений.

Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может применяться в клинической практике для диагностики нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно для динамического наблюдения пациентов с нестабильным состоянием системы гемостаза. Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики.

Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы анализ литературы, лабораторные, молекулярно-генетические методы и методы статистической обработки данных.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Разработаны новые методики идентификации аллельных вариантов генов АвТЕИ (А1166С) и БвА (ТЬгЗ 12А1а)

• У пациентов с МС обнаружена связь генотипов АвТЮ (А1166С) с концентрацией холестерина ЛПВП и коэффициентом атерогенности. Носители генотипа СС АвТШ (А1166С) характеризовались самыми низкими значениями ИМТ, тогда как носителя генотипа АА АОТШ (А1166С) имели пониженную концентрацию ЛПВП и повышенный индекс атерогенности.

• Достоверно более высокая концентрация инсулина обнаружена у больных МС с генотипом II АСЕ (1/Е>) по сравнению с гомозиготами ББ АСЕ (Щ).

• В группе здоровых людей представители с генотипом АА БОА (ТЬг312А1а) имеют достоверно более низкую концентрацию фибриногена плазмы крови по сравнению с генотипами АТ и ТТ.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом

проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.

Результаты диссертационного исследования были представлены в виде докладов на XI Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, Москва 2007 г, II и III Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург 2010-2011 гг. По результатам исследований получен патент Российской Федерации №2331671 «Способ определения аллелей гена а-фибриногена (FGA) по полиморфному сайту Thr312Ala» и подана заявка на Изобретение «Способ определения аллелей гена рецептора 1 типа к ангиотензиногену II (AGTR1) по полиморфному сайту AI 166С» № 2011153122 с приоритетом от 23.12.2011г.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования используются в практической работе ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова», а также в Межрайонной Централизованной клинико-диагностической лаборатории (СПб ГБУЗ "Николаевская больница").

Личный вклад соискателя. Диссертант самостоятельно разработал новые методики диагностики аллельных вариантов интересующих генов и выполнил все молекулярно-генетические исследования, участвовал в проведении биохимических исследований. Автором обоснованы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость исследования, сформулированы основные положения, выносимые на защиту и выводы, проведена статистическая обработка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в их числе 6 - в научных изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследованных больных и методов исследования, 4 глав собственных наблюдений и и