Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Показатели активности ряда защитных функций организма при серозных и гнойных менингитах у детей

На правах рукописи

Ботерашвили Нина Михайловна

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ РЯДА ЗАЩИТНЫХ ФУНКЦИЙ ОРГАНИЗМА ПРИ СЕРОЗНЫХ И ГНОЙНЫХ МЕНИНГИТАХ У ДЕТЕЙ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук» и Санкт-Петербургском Научно-исследовательском институте детских инфекций Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук Рыбакина Елена Георгиевна

Научный консультант: доктор медицинских наук

член-корреспондент РАМН, профессор Иванова Вера Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Петрищев Николай Николаевич доктор биологических наук Суховская Ольга Анатольевна

Ведущая организация: Российская Военно-Медицинская Академия (Санкт-Петербург)

Защита состоится «.Уу....» 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д001.022.02 при ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова Е.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

По современным представлениям, устойчивость организма к инфекционным и другим • воздействиям обеспечивается с участием врожденных и приобретенных механизмов защиты; развитие любого заболевания, возникающего в результате снижения устойчивости организма к патогенным факторам, связано с нарушением этих механизмов Выявление природы этих нарушений открывает новые пути и возможности для адресного воздействия на них, диагностики и прогнозирования развития болезней, в том числе и нейроинфекций

Нейроинфекции у детей - менингиты и менингоэнцефалиты - до настоящего времени продолжают оставаться достаточно- распространенными и тяжелыми заболеваниями детей дошкольного и младшего школьного возраста, прежде всего, как осложнения гриппа и других вирусных и бактериальных инфекций. Хотя патофизиологические аспекты патогенеза развития менингитов подвергаются систематическому изучению в нашей стране и за рубежом, тем не менее, особенности развития защитных реакций при этих заболеваниях требуют дальнейшего изучения

Одним из актуальных вопросов в изучении механизмов иммунопатологических процессов при менингитах у детей является определение специфики развития серозной и гнойной форм этого заболевания, а также поиск чувствительных маркеров, позволяющих оценить риск развития бактериальных менингитов.

В течение последнего десятилетия в литературе накопились данные об изменениях при менингитах концентраций в крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) иммуномодулирующих цитокинов - интерлейкинов (ИЛ)-1, 6, 8, 10, 12; фактора некроза опухолей интерферонов; и других биологически

активных веществ (8 I. Шлепай Ы аЦ 1995; Р.В.Тащ Ы а1, 1997; В А. Исаков и соавт.. 1998, 2002; С: ВоИиоп е! а1, 1998, Б. Оепёге1 е! а1, 1999; А. Уеяе, Т.О. Кояпиш, 1999) Тем не менее, определения показателей содержания цитокинов при развитии нейроинфекционных процессов недостаточно для оценки состояния защитных функций при этих заболеваниях. Представляется целесообразным и перспективным комплексное исследование изменений концентраций эндогенных регуляторов в биологических жидкостях больных и содержания в них популяций клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма - количественных характеристик, ц анализ изменения активности этих клеток -

■«швйги

УЗЕЗй !

Одними из значимых показателей являются изменение продукции моноцитами крови лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ), важнейшим компонентом которых является цитокин интерлейкин 1 (ИЛ-1), уровня ИЛ-lp в плазме крови и ЦСЖ, а также его комитогенного действия на пролиферацию лимфоцитов периферической крови.

ИЛ-1 является одним из ключевых регуляторов защитных функций организма и медиаторов взаимодействия нервной и иммунной систем (С. A. Dinarello, 1984, 1999; Н. Besedovsky et al., 1986; A.V. Turnbull, C.I. Rivier, 1999; EA Корнева и соавт., 2000; Е.Г. Рыбакина, EA Корнева., 2002; Р.Н. Black, 2002; MA Lynch, 2002). Он синтезируется многими клетками организма, в том числе нейронами и астроцитами головного мозга, (S.J. Hopkins, N.J. Rothwell, 1995; RJ. Tushinski, J.J. Mule, 1995; J. Licino , M.-L. Wong, 2001 ), но его основной клеточный источник - моноциты и макрофаги (CA Dinarello, 1991, 1999). Повышение концентрации ИЛ-1 в плазме крови и ЦСЖ происходит в результате усиления его выделения клетками-продуцентами (в том числе в составе ЛАФ) или изменения его утилизации при патологии (C.A. Dinarello, 1999).

Особенность ИЛ-1 заключается в том, что он инициирует развитие реакций защиты, действуя как центрально < (вызывая лихорадку, стимулируя гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальную систему), так и периферически (являясь иммуномодулятором, стимулируя синтез остро-фазовых белков.печенью и гемопоэз) (С.А. Dinarello 1991Т1999; A_V. Turnbull, C.I. Rivier, 1999; J. Licino, M.-L. Wong, 2001).

Решающим для функционирования иммунной системы является свойство ИЛ-1 усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную. лектинами.; Оценка; комитогенного действия ИЛ-1 - одной из ключевых его функций, также позволяет получить значимую информацию о состоянии защитных реакций при патологии.

Важнейшей составляющей, комплекса, ответных реакций организма- на бактериальную и вирусную инфекцию являются реакции врожденного: иммунитета. Особое внимание в этой проблеме привлекают антимикробные катионные белки и пептиды нейтрофилов, которые можно рассматривать как антибиотики животного происхождения (В.Н. Кокряков, 1999). Катионные белки, и пептиды, к которым относятся дефенсины, лизоцим, эластаза, катепсин G, лактоферрин (ЛФ), миелопероксидаза (МПО), обеспечивают антимикробный потенциал нейтрофилов, оказывая комплексное воздействие на структуру и обменные процессы в микроорганизмах и тем самым вызывая их умерщвление. Определение в крови и ЦСЖ больных ЛФ и МПО является информативным тестом, которое может способствовать

раскрытию механизмов нарушений защитных реакций организма, приводящих к развитию инфекционной патологии, в том числе и нейроинфекций у детей.

Комплекс таких тестов используется в Отделе общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИЭМ РАМН» (руководитель - академик РАМН, профессор ЕА Корнева) для оценки уровня активности защитных функций организма; он апробирован на экспериментальных моделях и наблюдениях на людях.

Кроме того, информационно значимым представляется проведение корреляционного анализа показателей развития защитных реакций организма при менингитах у детей и клинико-лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. До настоящего времени подобные сведения в литературе отсутствуют. 1.2. Цель и задачи исследования

Целью работы является комплексное изучение изменений ряда показателей активности защитных функций организма при бактериальных и гнойных менингитах у детей, а также исследование корреляционных взаимоотношений между изученными показателями и клинико-лабораторными данными, полученными при обследовании госпитализированных пациентов. В задачи работы входило:

1. Исследование изменения концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови = и ЦСЖ, продукции ЛАФ моноцитами периферической крови и комитогенного действия ИЛ-1|3 на лимфоциты крови при серозных и гнойных менингитах у детей.

2. Изучение изменения концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных серозным и гнойным менингитом.

3. Определение корреляционных взаимосвязей между исследованными в работе показателями функциональной активности иммунокомпетентных клеток и клинико-лабораторными данными, полученными при обследовании госпитализированных детей.

1.2. Научная иовизна исследования

Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при серозных и гнойных менингитах у детей, а также при респираторных вирусных инфекциях.

Впервые для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма. Использованная функциональная тест-система включала оценку содержания в крови и ЦСЖ больных детей ключевого

регулятора защитных функций организма и маркеров активности нейтрофилов -

МПО и ЛФ, а также продукции моноцитами периферической крови ЛАФ, включающих ряд иммуномодулирующих цитокинов, в том числе ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, и комитогенного действия препарата на пролиферацию лимфоцитов. Впервые

показаны особенности изменения концентраций цитокина и антимикробных

белков нейтрофилов в исследованных биологических жидкостях, содержание в них клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма (количественные показатели) и изменения активности клеток, продуцирующих ИЛ-1 и реагирующих на него (функциональные показатели). Таким образом, проведена комплексная оценка количества и активности ряда клеточных популяций, участвующих в реализации защитных реакций при менингитах у детей.

Приоритетный характер носят результаты корреляционного анализа исследованных показателей и клинико-лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. Они подтвердили выявленное при проведении исследования значительное сходство в изменениях показателей активности защитных функций при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите. Впервые показано, что при ОРВИ и серозном менингите корреляционные взаимосвязи выявляются в основном между изменением количества нейтрофильных белков и классических показателей клинического анализа крови и ликвора. При гнойном менингите проявляется корреляция клинико-лабораторных данных с показателями функциональной активности моноцитарно-лимфоцитарного звена защиты организма - ЛАФ и РБТЛ. 1.4. Теоретическая и практическая значимость работы

Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей активности защитных функций организма при серозных и гнойных менингитах у детей, носит фундаментально-прикладной характер. Результаты исследования расширяют сложившееся представление об особенностях нарушений защитных реакций организма, приводящих к формированию и развитию инфекционной патологии - менингитов у детей Основное теоретическое значение работы состоит в установлении корреляции изменений показателей функциональной активности клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма, с характером заболеваний и степенью его тяжести: ОРВИ и серозного менингита, как заболеваний вирусной природы, и гнойного менингита, вызванного бактериальным возбудителем.

Комплекс проведенных исследований позволяет предложить новые критерии для дифференциальной диагностики и прогнозирования течения менингитов у детей: величину концентраций нейтрофильных гранулярных белков - МПО и ЛФ - в сыворотке крови и ЦСЖ и отношения их концентрации в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ, а также интенсивность стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами периферической крови детей в первые дни заболевания, что может быть рекомендовано для использования в клинической практике. 1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1. В сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных как ОРВИ, так и серозной формой менингита, ИЛ-ip определяется у 70-90% больных в первые дни заболевания и остается на том же уровне к 5-14-му дню лечения и наблюдения. Концентрация ИЛ-ip в крови и ЦСЖ 97-100 % детей, больных гнойным менингитом, в начале заболевания выше, чем при ОРВИ и серозной форме менингита. Через 12-14 дней лечения эта разница сохраняется только для уровня в сыворотке, но не в ЦСЖ, в которой концентрация резко снижается.

2. Для обеих исследованных форм менингита в первые дни заболевания характерно подавление стимулированной ЛПС продукции ЛАФ моноцитами крови по сравнению с реакцией клеток здоровых детей, чего не наблюдается у пациентов, больных ОРВИ. Спонтанная продукция ЛАФ моноцитами крови в первые 1-2 дня после госпитализации выявлена у детей, больных ОРВИ, тенденция к ней - у больных серозным менингитом; при гнойном менингите она не наблюдается.

3. Лимфоциты периферической крови детей, страдающих ОРВИ и серозной формой менингита, реагируют на инфекционный процесс снижением пролиферативной активности лимфоцитов, индуцированной чего не происходит при гнойном менингите. При гнойном менингите в первые и, особенно, 12-14-е сутки после госпитализации усилена исходная пролиферативная активность лимфоцитов.

4. В первые 1-2 дня после госпитализации наблюдается повышение средней концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех трех групп; через 5-14 дней величина этих показателей снижается до значений, характерных для здоровых детей. В ЦСЖ 82-х % больных серозным менингитом и 94-х % больных гнойным менингитом. содержится МПО и ЛФ (или один из двух белков); ЦСЖ 82-х % больных ОРВИ не содержит ни ЛФ, ни МПО. У всех исследованных больных с серозным менингитом величина отношения концентрации МПО в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ

превышает 7,4, в то время как у 72-х % больных гнойным менингитом это значение ниже 2,6. Такая же, но менее выраженная закономерность, наблюдается и для ЛФ. 5. Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона г подтвердил сходство в изменениях исследованных показателей активности защитных функций при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите. Выявлена корреляция изменений исследованных показателей с характером и степенью тяжести заболевания.

1.6. Струтура и объем диссертации

Диссертация изложена на ^^^ страницах машинописного текста, построена традиционным образом и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (в трех подглавах), материалы и методы, результаты собственных исследований (в трех подглавах), обсуждение полученных результатов и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 152 источника, большинство которых - работы последнего десятилетия. Текст иллюстрирован 12 рисунками и 12 таблицами -

1.7. Апробация работы >

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ в отечественных и международных журналах, а также в сборниках по материалам Всероссийских и Международных конференций. Материалы работы докладывались и обсуждались на заседаниях Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИЭМ РАМН» совместно с Клиникой нейроинфекций НИИ детских инфекций МЗ РФ (С. Петербург) в 2000, 2001, 2002 и 2003 гт, а также на Российских и Международных научных конференциях: 4-м Международном Конгрессе Международного общества по нейроиммуномодуляции (Лугано, Швейцария, 1999), 3-м Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, Россия, 2000), Научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию Института экспериментальной медицины (Санкт Петербург, 2000).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общие условия работы

Необходимым условием работы было тщательное соблюдение стерильности и принятие строгих мер, предотвращающих возможность бактериального загрязнения препаратов и растворов.

2.2. Условия получения образцов крови и цереброспинальной жидкости детей

В работе использована венозная кровь и цереброспинальная жидкость (ЦСЖ) 62

детей в возрасте 1-12 лет, больных серозной и гнойной формами менингита (24 и 18 детей соответственно), острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ, 20 детей), а также кровь 8 здоровых детей Все пациенты проходили обследование и лечение в Клинике нейроинфекций (руководитель - д м н, проф | М Н Сорокина |) Научно-исследовательского института детских инфекций МЗ РФ (директор - член-корр РАМН, проф В В Иванова) Клинический анализ крови и ЦСЖ детей проводился в лаборатории НИИ детских инфекций

Забор крови и ЦСЖ проводили дважды первый раз - при поступлении больного в течение первых двух дней, второй раз - через 12-14 дней (при ОРВИ - через 5-7 дней) после госпитализации Кровь и ЦСЖ собирали в 3 пробирки №1 - ЦСЖ; №2 - 1,5 мл крови без антикоагулянтов для получения сыворотки, №3 - 1,5 мл крови + 1,5 мл среды Хенкса с 30 ЕД гепарина (Гедеон Рихтер, Венгрия) для последующего выделения моноцитов и лимфоцитов. После формирования сгустка крови в пробирке №2, эту пробирку и пробирку №1 центрифугировали в течение 20 мин при 1500 g Полученные супернатанты, содержащие соответственно сыворотку крови и ЦСЖ (без клеточных элементов), хранили при -20° С до определения содержания в них ИЛ-ip, МПО и ЛФ 23. Выделение и инкубация лимфоцитов и моноцитов крови

Из гепаринизированной крови, содержащейся в пробирке №3, выделяли моноядерные клетки в градиенте плотности смеси фиколла-400 - верографина по методу A. Boyum et al (1968) Полученные клетки (смесь моноцитов и лимфоцитов) суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки (Sigma), пенициллин (100 ЕД/мл), 2 мМ глугамина (1 млн клеток/мл) и преинкубировали в планшете в течение 2 ч при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа и 100% влажности для прилипания клеток Не прилипшие к пластику клетки (лимфоциты) использовали для оценки реакции бластгрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

Для индукции образования лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ) к прилипшим моноцитами добавляли ЛПС в концентрации 50 мкг/мл. Активированные in vitro и неактивированные мононуклеарные фагоциты инкубировали в течение 18 ч при тех же условиях По окончании инкубации клетки удаляли центрифугированием, а супернатанты хранили при -20° С до измерения активности ЛАФ

2.4. Определение активности лимфоцит-активирующих факторов в инкубатах моноцитов периферической крови детей

Лимфоцит-активирующие свойства инкубатов моноцитов оценивали по их способности оказывать комитогенное действие на пролиферацию тимоцитов мышей,

стимулированных субоптимальными дозами лектинов (L G Rosenwasser, С А Dinarello, 1981) Радиоактивность проб, являющуюся результатом включения 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток, сравнивали со значениями калибровочной кривой, при построении которой в качестве стандарта использовались препараты ИЛ-13 Таким образом, биологический тест оценки активности ЛАФ, включающих активность ряда иммуномодулирующих цитокинов, в том числе ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-ос, в примененной тест-системе отражает активность ИЛ-1 в супернатантах культивируемых клеток

За единицу активности ЛАФ принималась такая его концентрация (в мл), при которой происходило усиление пролиферации тимоцитов, равное 50% от значения ее максимальной стимуляции при действии Конканавалина А (Кон А) в субоптимальной дозе в данной тест-системе

2.5. Оценка реакции бласттрансформации лимфоцитов периферической крови

Для оценки РБТЛ, выделенные лимфоциты периферической крови детей культивировали с Кон А (0,75 мкг/мл) и рекомбинантным препаратом ИЛ-lß человека (Stockholm University, Sweden) в конечной концентрации 250 пг/мл Реакцию учитывали количественно по включению метки в ДНК лимфоцитов в течение 1 мин

2.6. Определение концентрации ИЛ-lp в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости детей.

Концентрацию ИЛ-ip в сыворотке крови и ЦСЖ определяли иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов Human lnterleukin-lß ELISA kit (Genzyme, USA)

2.7. Выделение и очистка лактоферринов и миелопероксидаз из нейтрофильных гранулоцитов человека

Лейкоцитарную массу, обогащенную нейтрофилами, получали из цельной крови доноров Экстракцию белков из лейкоцитарных клеток осуществляли после их гомогенизирования в 0,3% растворе бромистого цетилтриметиламмония (ЦТАБ) в 0,02 М Na-ацетатном буфере, рН 4,5 Полученные ЦТАБ-экстракты использовали для выделения лактоферрина (ЛФ) и миелопероксидазы (МПО)

После нанесения ЦТАБ-экстракта на колонку КМ-целлюлозы СМ-32 (Whatman, UK) и элюции связавшихся белков 0,02 М Na-ацетатным буфером, рН 4,5 с 0,1 М -0,2 М NaCl, полуочищенный препарат ЛФ фракционировали на колонке сефадекса G-100 (Pharmacia, Sweden) для выделения чистого ЛФ Оставшиеся белки снимали с КМ-целлюлозы 0,02 М Na-ацетатным буфером с 0,2 М-1,2 М NaCl Фракции, содержащие

пероксидазную активность, хроматографировали на колонке КМ-целлюлозы СМ-32, а затем фракционировали на колонке сефадекса G-200 для получения чистой МПО.

Антисыворотки к МПО и ЛФ получали по методу P. Venge et al (1984). Фракцию гамма-глобулинов из иммунной сыворотки получали высаливанием насыщенным раствором (NH4)2SO4 и фракционировали на колонках ДЭАЭ-целлюлозы и Сефарозы с пришитыми МПО или ЛФ. Полученные анти-МПО и анти-ЛФ использовали в качестве первичных антител в иммуноферментном анализе и для получения конъюгатов анти-МПО, анти-ЛФ и пероксидазы хрена (ПХ) по методу Д. Кэтти, Ч. Райкундалиа (1991).

2.8. Иммуноферментное определение миелолероксидазы и лактоферрипа в

сыворотке крови и цереброспинальной жидкости детей

Концентрацию МПО и ЛФ в биологических жидкостях определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, основанного на принципе «сэндвича», с использованием конъюгатов анти-МПО-ПХ и анти-ЛФ-ПХ.

2.9. Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов проведена по. критерию t Стьюдента. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± ошибка средней величины. Различия считались достоверными при р < 0,05.

Корреляционный анализ полученных данных выполнен с помощью компьютерной программы Statistica V.5.5A.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Концентрация в крови и цереброспинальной - жидкости интерлейкина-ip, продукция лимфоцит-активирующих факторов и биологическое действие интерлейкина-1 при серозных и гнойных менингитах у детей -

Задачей первого раздела работы явилось изучение содержания ИЛ-ip в сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных ОРВИ, серозным и гнойным менингитом, продукции ЛАФ моноцитами крови детей, а также комитогенного действия ИЛ-ip на пролиферацию лимфоцитов периферической крови, стимулированных лектинами. 3.1.1. Содержание ИЛ-ip в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости детей В сыворотке крови здоровых детей концентрация ИЛ-ip не превышала 15-20 пг/мл. У детей, заболевших как ОРВИ, так и серозным менингитом, в первые 1-2 дня после госпитализации сывороточный ИЛ-ip определялся у 70-90 % больных, составляя в среднем 40-60 пг/мл; при гнойном менингите у 97% пациентов он повышался в

Рис. 1. Схематическое изображение изменений исследованных показателен в первые дни заболевания

Цифровые значения на оси графика отражают величину любого из исследованных показателей в соответствующих единицах измерений ШИШ - здоровые

Г ■ - больные серозным менингитом » ' - Сольные гнойным менингитом

"""¡¡-больные ОРВИ

а я я я •

среднем до 130-160 пг/мл (Рис 1) Через 5-7 дней лечения и наблюдения концентрация ИЛ-1(3 в крови у детей, больных ОРВИ, и через 12-14 дней - больных серозным и гнойным менингитом, оставалась на том же уровне (Рис 2)

В ЦСЖ в начале заболевания ИЛ-1р при ОРВИ определялся у 75% больных и составлял в среднем 30-40 пг/мл (Рис.1), при серозном менингите - в 90% проб (40-60 пг/мл) Снижение уровня ИЛ-1Р до15-30 пг/мл через 5-14 дней лечения больных ОРВИ и серозным менингитом не было достоверным (Рис 2) При гнойном менингите

концентрация ИЛ-1р в ЦСЖ, составляющая на 1-2-й день заболевания в среднем 180230 пг/мл, достоверно снижалась до 20-40 пг/мл на 12-14-й день (Рис. 2).

Таким образом, концентрация ИЛ-1р в крови и ЦСЖ детей, больных гнойным менингитом, в начале заболевания была выше, чем в при ОРВИ и серозной форме менингита. Через 12-14 дней лечения эта разница сохранялась только для уровня ИЛ-1 р в сыворотке, но не в ЦСЖ.

3.1.2. Продукция лимфоцит-актвирующих факторов моноцитами периферической крови детей

Моноциты крови здоровых детей при культивировании in vitro в 80-ти % случаев не продуцировали ЛАФ без дополнительной стимуляции, инкубаты клеток 20-ти % здоровых детей содержали невысокую ЛАФ-активность. При стимуляции моноцитов крови здоровых детей липополисахаридом (ЛПС), они продуцировали ЛАФ (Рис.1).

Дополнительно не стимулированные клетки крови детей с ОРВИ в первые дни заболевания продуцировали ЛАФ; при серозном менингите наблюдалась тенденция к спонтанной продукции ЛАФ. При гнойном менингите такой реакции не наблюдалось.

При серозном и гнойном менингите происходило подавление стимулированной ЛПС продукции ЛАФ в первые дни заболевания, в то время как реакция на ЛПС моноцитов крови детей, больных ОРВИ, не отличалась от таковой у здоровых детей (Рис.1). На 5-14-е сутки спонтанная и стимулированная продукции ЛАФ моноцитами крови детей с ОРВИ и с серозным менингитом, была такой же, как у здоровых детей, а у больных гнойным менингитом - усиливалась по сравнению с реакцией клеток крови детей в 1-2-й день после госпитализации (Рис. 2).

Выявленные в работе изменения продукции ЛАФ моноцитами крови детей, больных серозным и гнойным менингитом, не связаны с изменением количества этих клеток в крови, которое не отличалось от числа моноцитов в крови здоровых детей.

Таким образом, в первые дни заболевания при стимуляции ЛПС моноцитов крови детей больных как серозной, так и гнойной формами менингита, продукция клетками ЛАФ, отражающая в использованной тест-системе преимущественно образование ИЛ-1, была подавлена. Это свидетельствует о снижении функциональной •. активности мононуклеарных фагоцитов и их способности продуцировать факторы, активирующие лимфоциты, в том числе и ИЛ-1, у детей, больных как серозным, так и гнойным менингитом, но не у детей, больных ОРВИ. Подавление стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами крови в первые дни \ заболевания может служить дополнительным диагностическим критерием развития менингитов у детей. 3.13. Пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови детей на действие Конканавалина А и Интерлейкина-1 р

Пролиферативный ответ лимфоцитов крови детей, больных ОРВИ и серозным менингитом, на действие Кон А в субоптимальной дозе был сопоставимым с реакцией клеток крови здоровых детей, а реакция лимфоцитов на комитогенное действие ИЛ-1р в присутствии Кон А была подавлена в первый день поступления больного (Рис.1). К

12-14-у дню наблюдения пролиферативная активность лимфоцитов крови детей, больных ОРВИ и серозным менингитом, в ответ на стимуляцию ИЛ-1Р возрастала и не отличалась от РБТЛ здоровых детей (Рис. 2). При гнойном менингите в первые и, особенно, 12-14-е сутки после госпитализации происходило усиление исходной пролиферативной активности лимфоцитов (очень низкой в норме, у здоровых детей), а реакция на комитогенное действие ИЛ-1Р не превышала таковую у здоровых детей.

Абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови у детей всех групп наблюдения не отличалось от возрастной нормы.

Таким образом, лимфоциты крови детей, страдающих ОРВИ и серозной (но не гнойной) формой менингита, реагируют на инфекционный процесс снижением пролиферативной активности лимфоцитов, индуцированной ИЛ-1 р. 3.2. Изменение концентрации миелопероксидазы и лактоферрина в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости детей, больных серозным и гнойным менингитом

Одним из актуальных вопросов в изучении менингитов у детей является поиск чувствительных маркеров, позволяющих проводить раннюю дифференциальную диагностику этих заболеваний. В качестве таких маркеров целесообразно использовать гранулярные белки нейтрофилов, в том числе миелопероксидазу (МПО) и лактоферрин (ЛФ), изменение концентрации которых в биологических жидкостях может иметь как диагностическое, так и прогностическое значение. С этой целью в работе было исследовано содержание этих белков нейтрофильных гранулоцитов в сыворотке крови и ЦСЖ у детей с серозной и гнойной формами менингита.

3.2.1. Изменение концентрации лактоферрина и миелопероксидазы в сыворотке крови больных

Средняя концентрация ЛФ и МПО в сыворотке крови больных ОРВИ, серозным и гнойным менингитом в первые 1-2 дня после госпитализации повышалась по сравнению с теми же показателями у здоровых детей и составляла в среднем 4300 нг/мл, 2945 нг/мл и 4955 нг/мл, соответственно, для ЛФ и 790 нг/мл, 638 нг/мл и 1100 нг/мл для МПО (Рис.1). Через 5-14 дней концентрация ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех групп снижалась до значений, характерных для здоровых детей (Рис. 2)

Количество нейтрофилов в крови изменялось в зависимости от этиологии заболевания. При вирусном заражении (ОРВИ и серозном менингите) отмечалось увеличение содержания сегментоядерных форм нейтрофилов, при серозном менингите

обнаружено увеличение и абсолютного числа нейтрофилов по сравнению с тем же показателем у здоровых детей. При гнойном менингите увеличивались абсолютное и относительное число нейтрофилов, наблюдался сдвиг лейкоцитарной формулы Б1еео. 3.2.2. Изменение концентрации лактоферрина и миелопероксидазы в цереброспинальной жидкости больных Определение ЛФ и МПО в ЦСЖ пациентов выявило существенную разницу между их содержанием в ЦСЖ больных ОРВИ, серозным и гнойным менингитами (Рис. 1). Значения концентрации ЛФ у больных ОРВИ варьировали в пределах 4-81 нг/мл (в среднем - 14 нг/мл), серозным менингитом 5-1300 нг/мл (в среднем - 138 нг/мл), а у больных гнойным менингитом 30-22000 нг/мл (в среднем - 5384 нг/мл). Определение МПО в ЦСЖ обнаружило более существенные различия этого показателя у больных различными формами менингита и ОРВИ, чем при определении ЛФ (Рис. 1)

Различия между уровнями нейтрофильных гранулярных белков в ЦСЖ больных серозной и гнойной формами менингита соответствовали резкому увеличению цитоза и количества нейтрофилов в ЦСЖ при гнойном менингите.

Существенно, что ЦСЖ 82-х % больных серозным менингитом и 94-х % больных гнойным менингитом содержала или МПО, или ЛФ, или оба эти белка, в то время как ликвор 82-х % больных ОРВИ не содержал ни МПО, ни ЛФ. Полученные данные демонстрируют целесообразность одновременного определения концентраций ЛФ и МПО в сыворотке крови и ЦСЖ больных, что может быть использовано в клинической практике для диагностики ОРВИ и менингитов различной этиологии.

3.23. Отношение концентраций лактоферрина и миелопероксидазы в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости детей, больных серозной и гнойной формами менингита

Особый интерес для дифференциальной диагностики серозного и гнойного менингита может представлять также и соотношение концентраций нейтрофильных белков в сыворотке крови и ЦСЖ. Установлено, что у всех исследованных больных с серозной формой менингита, величина отношения концентрации МПО в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ была не ниже 7,43, в то время как у 72-х % больных гнойной формой менингита это значение было от 2,63 и ниже. Такая же, но менее выраженная закономерность наблюдалась и для отношения концентраций ЛФ в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ.. Определение величины соотношения концентраций нейтрофильных гранулярных белков в сыворотке крови и ЦСЖ,

коррелирующей с характером заболевания, может быть также рекомендовано для использования в клинической практике в качестве дополнительного диагностического критерия развития серозной либо гнойной формы менингита.

33. Корреляционные взаимоотношения между исследованными показателями функциональной активности клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма, и клинико-лабораторными данными, полученными при обследовании госпитализированных детей

Для корреляционного анализа изученных показателей и клинико-лабораторных данных, отраженных в историях болезни пациентов и включающих диагноз и продолжительность заболевания, характеристику ЦСЖ: цитоз, содержание нейтрофильных гранулоцитов и общего белка в ЦСЖ, а также формулу крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), вычислялся коэффициент корреляции Пирсона г.

Сравнение корреляционных отношений между анализируемыми показателями в начале лечения и при повторном обследовании через 12-14 дней позволило заключить, что показатели функциональной активности нейтрофилов - величины концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови и ЦСЖ, более информативны и коррелятивно связаны с клинико-лабораторными показателями в начале заболевания (особенно при гнойном менингите), тогда как активность моноцитарно-лимфоцитарного звена защитных функций более выражена через 12-14 дней после госпитализации.

Корреляционный анализ подтвердил сходство в изменениях показателей активности защитных функций организма при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите: выявлена корреляция изменений исследованных показателей с характером заболевания - при сравнении заболеваний вирусной природы (ОРВИ и серозный менингит) и бактериальной природы (гнойный менингит).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее десятилетие все большую актуальность приобретает исследование защитных функций организма при разтачных видах патологии. Особенностью этих исследований на современном этапе является, с одной стороны, >глубление изучения тонких клеточно-молекулярных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, в отличие от оценки количественных показателей (концентрации в биологических жидкостях цитокинов, гормонов и других биорегуляторов, содержания

в них отдельных популяций и с>бпопуляций иммунокомпетентных клеток), а с другой - получение информации на основе анализа функциональной активности этих клеток

Выбор в настоящей работе в качестве исследуемых показателей ИЛ-1 и ЛАФ -комплексного показателя, включающего активность ряда иммуномодулирующих цитокинов, в том числе ИЛ-1, изучение продукции ЛАФ моноцитами крови, уровня ИЛ-1Р в крови и ЦСЖ, а также комитогенной активности ИЛ-1р, обусловлен его функциями ключевого регулятора защитных реакций организма и медиатора взаимодействия нервной и иммунной систем (Н Вевеёоувку е! а1, 1986, С А, БшагеИо, 1991, 1999, А V ТитЪиЦ, С1 Ишег, 1999, Е А Корнева и соавт, 2001, Е Г Рыбакина, Е А. Корнева, 2002) Концентрация нейтрофильных гранулярных белков, в том числе МПО и ЛФ, в биологических жидкостях является показателем активности нейтрофилов, их определение в клинике может иметь как диагностическое, так и прогностическое значение (О М А1е8Ишае1а1, 1998, В Н Кокряков, 1999)

Тест-система оценки уровня активности защитных реакций, включающая показатели продукции и биологической активности ИЛ-1, а также величину концентрации МПО и ЛФ в сыворотке крови и ЦСЖ, в настоящей работе использована для оценки изменения активности защитных функций организма при серозных и гнойных менингитах, а также респираторных вирусных инфекциях у детей 1-12 лет, проходящих курс лечения в Клинике нейроинфекций НИИ детских инфекций МЗ РФ В литературе нет сведений об использовании подобной функциональной тест-системы для анализа развития защитных реакций при менингитах у детей

Поскольку возрастной диапазон больных детей был достаточно широким, для исследования возможных возрастных особенностей представлялось целесообразным сравнить исследуемые показатели, а также клинико-лабораторные данные, полученные при обследовании госпитализированных детей двух возрастных групп до 5-ти лет и старше 5-ти лет Установлено, что в проведенной работе возраст ребенка не оказывал статистически значимого влияния на исследованные показатели, поэтому полученные результаты были объединены в группы по нозологическим формам заболевания независимо от принадлежности к возрастной группе обследованных детей

Полученные результаты позволяют сделать заключение об однотипном характере изменения концентраций в сыворотке крови и ЦСЖ,

пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови на действие Кон А и ИЛ-

10 и спонтанной продукции ЛАФ моноцитами крови детей, больных ОРВИ и серозной формой менингита, а также их отличия от тех же показателей при гнойном менингите

В работе выявлены также сходные признаки изменения функциональной активности моноцитов крови при серозном и гнойном менингите: для обеих форм заболевания в первые дни характерно подавление стимулированной ЛПС продукции ЛАФ, в то время как реакция на ЛПС моноцитов крови детей, больных ОРВИ, не отличалась от таковой у здоровых детей Такие данные в литературе отсутствуют.

Средняя концентрация ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех трех групп повышается в первые 1-2 дня после госпитализации по сравнению с теми же показателями у здоровых детей. При этом концентрация МПО в сыворотке крови у больных гнойным менингитом в 1-2-й день выше, чем у больных серозным менингитом и ОРВИ. Определение ЛФ и МПО в ЦСЖ больных также выявило существенную разницу между содержанием гранулярных белков нейтрофилов в ЦСЖ у больных гнойным и серозным менингитом

Корреляционный анализ, результаты которого имеют приоритетный характер, подтвердил установленное в работе значительное сходство в изменениях активности защитных функций при ОРВИ и серозном менингите При этих нозологических формах корреляционные взаимосвязи выявляются в основном между изменением количества, нейтрофильных белков и классических показателей клинического, анализа крови и ликвора. При гнойном менингите нарушаются линейные взаимные зависимости между количеством нейтрофильных белков в сыворотке крови и ЦСЖ и проявляется корреляция клинико-лабораторных данных с показателями функциональной активности моноцитарно-лимфоцитарного звена защиты организма - ЛАФ и РБТЛ.

Таким образом, в работе проведена комплексная оценка количества и активности ряда клеточных популяций, участвующих а реализации реакции организма на развитие инфекционных процессов. Тестирование различных показателей, характеризующих функциональную активность клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма, а также проведение корреляционного анализа, позволило выявить корреляцию полученных изменений с характером заболеваний и степенью его тяжести (при сравнении заболеваний вирусной природы - ОРВИ и серозного менингита, и бактериальной природы - гнойного менингита)

Комплекс полученных данных позволил выявить ряд информативных показателей, изменение которых имеет диагностическую и прогностическую ценность, а именно интенсивность стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами

периферической крови детей в первые дни заболевания и величину концентрации нейтрофильных гранулярных белков - МПО и ЛФ - в сыворотке крови и ЦСЖ, а также отношения их концентрации в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ.

Полученные результаты позволяют оценить и сравнить определенные механизмы нарушений защитных функций организма, приводящих к формированию и развитию инфекционной патологии - ОРВИ и менингитов у детей. Они расширяют диагностически значимые критерии оценки активности защитных функций и могут применяться в практике клинических и лечебных учреждений, а также создают предпосылки для прогнозирования развития этих заболеваний и разработки способов их направленной коррекции.

ВЫВОДЫ

1. В сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных ОРВИ и серозной формой менипгита, в первые дни заболевания ИЛ-1Р определяется у 70-90% больных, при гнойном менингите у 97% детей наблюдается значительное возрастание концентрации ИЛ-1р, более выраженное, чем при ОРВИ и серозном менингите. Через 5-14 дней лечения средняя концентрация в сыворотке крови детей, больных ОРВИ, серозным и гнойным менингитом, и в ЦСЖ детей, больных ОРВИ и серозным менингитом, остается такой же, как в первые дни заболевания, а в ЦСЖ детей,

' больных гнойным менингитом, снижается до значений, характерных для ОРВИ и серозного менингита.

2. Определен дополнительный диагностический критерий развития менингитов у детей: для обеих исследованных форм менингита в первые дня заболевания характерно подавление стимулированной ЛПС продукции ЛАФ моноцитами крови по сравнению с реакцией клеток здоровых детей, чего не наблюдается у пациентов, больных ОРВИ. Спонтанная продукция ЛАФ моноцитами крови в первые 1-2 дня после госпитализации выявлена у детей, больных ОРВИ, тенденция к ней - у больных серозным менингитом; при гнойном менингите она не наблюдается.

3. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови детей, больных ОРВИ и серозной формой менингита, в ответ на комитогенное действие в первые дни после госпитализации подавлена по сравнению с реакцией клеток здоровых детей и нормализуется к 5-14-у дню заболевания; при гнойном менингите она не отличается от того же показателя у здоровых детей. При гнойном менингите

в первые и, особенно, 12-14-е сутки после госпитализации усилена исходная пролиферативная активность лимфоцитов

4 В первые 1-2 дня после госпитализации наблюдается повышение средней концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех трех групп по сравнению с теми же показателями у здоровых детей Концентрация МПО в сыворотке крови у больных гнойным менингитом в 1-2-й день выше, чем у больных серозным менингитом и ОРВИ Через 5-14 дней средняя концентрация ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех групп снижается до значений, характерных для здоровых детей

5 В ЦСЖ 82-х % больных серозным менингитом и 94-х % больных гнойным менингитом определяется МПО и ЛФ (или один из двух белков), ЦСЖ 82-х % больных ОРВИ не содержит ни одного из этих белков У детей, больных серозным менингитом, величина отношения концентрации МПО в сыворотке крови к концентрации МПО в ЦСЖ превышает 7,43, в то время как у 72-х % детей, больных гнойным менингитом, это значение от 2,63 и ниже, что может быть использовано в клинической практике в качестве дифференциального диагностического критерия развития серозной либо гнойной формы менингита

6 Выявлена корреляция изменений- исследованных показателей с характером заболевания - при сравнении заболеваний вирусной природы (ОРВИ и серозный менингит) и бактериальной природы (гнойный менингит) Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции-Пирсона г подтвердил сходство в изменениях показателей активности защитных функций организма при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите

7 Комплекс проведенных исследований позволяет предложить ряд новых, диагностически значимых критериев оценки активности защитных функций организма при менингитах у детей, а именно интенсивность стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами периферической крови в первые дни заболевания, величину концентрации МПО и ЛФ в сыворотке крови и ЦСЖ, а также отношения их концентрации в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ботерашвили Н.М., Шанин С.Н., Козинец ИА, Рыбакина Е.Г. Продукции и эффекты действия интерлейкина-1 при бактериальных менингитах у детей // Int. J. Immunorehabilitation. - 1999. -№12.-P.'52.

2. Boterashvili N.M., Shanin S.N., Kozinets I.A., Rybakina E.G. Intedeukin-1 pгoduction and action in infants with bacterial meningitis // Int. J. Immunorehabilitation. - 1999. -Ml2.-Suppl. l.-P. 81.

3. Boterashvili N.M., Rybakina E.G., Shanin S.N., Kozinets I.A., Aleshina G.M., Sorokina M.N., Ivanova V.V. Intedeukin-1 and antibacterial proteins from - neutrophils as bioregulatens of host resistance during bacterial meningitis in infants // NeuroImmunoModulation. - 1999. - Vol. 6. - № 6 -P. 442-443.

4. Ботерашвили Н.М., Рыбакина Е.Г., Шанин С.Н., Козинец И.А., Сорокина М.Н., Иванова ВВ. Продукция и эффекты действия интерлейкина-1 при серозных и гнойных менингитах у детей // Медицинская иммунология. - 2000. - T. 2. - № 3. - С. 321-328.

5. Ботерашбили Н.М., Шанин С.Н., Козинец И.А., Рыбакина Е.Г., Сорокина М.Н., Иванова В.В. Интерлейкин-1 в мобилизации защитных реакции организма при серозных и гнойных менингитах у детей // Int. J. Immunorehabilitation. - 2000. - № 5. -P. 82.

6. Рыбакина Е.Г., Ботерашвили Н.М., Шанин С.Н., Козинец ИА, Алешина Г.М., Сорокина М.Н., Иванова В.В. Интерлейкин-1 и антибактериальные белки нейтрофйлов как регуляторы защитных реакций организма при бактериальных менингитах у детей // Научная конференция «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященная 110-летию ИЭМ. - СПб.: Наука, 2000. - С. 152.

7. Ботерашвили Н.М., Алешина Г.М. Миелопероксидаза и лактоферрин в сыворотке крови и ликворе детей, больных менингитом // Аллергология и иммунология. -2000.-T. 1.-№ 2.-С. 165-166.

8. Boterashvili N.M., Rybakina E.G., Shanin S.N., Kozinets I.A., Aleshina G.M., Sorokina M.N., Ivanova V.V. Intedeukin-1 and antibacterial proteins from neutrophils in infants with serous and pumlent meningitis // Int. J. Immunorehabilitation. - 2001. - № 2. - P. 71.

9. Ботерашвили Н.М., Алешина Г.М., Сорокина M.H., Иванова В.В., Корнева Е.А Миелопероксидаза и лактоферрин в сыворотке крови и ликворе детей, больных менингитом //Медицинская иммунология. - 2002. - T. 4. - № 4-5. - С. 565-572.

ЗАО «Издательско-редакционное предприятие «ЭХО» Санкт-Петербург, ул.Восстания, 19, тел.: 279-4360 Объем 1 усл л. л. Отпечатано на ризографе. Тираж 80 экз. Заказ 315.

И- 5320

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

По современным представлениям, устойчивость организма к инфекционным и другим воздействиям обеспечивается с участием врожденных и приобретенных механизмов защиты; развитие любого заболевания, возникающего в результате снижения устойчивости организма к патогенным факторам, связано с нарушением этих механизмов. Выявление природы этих нарушений открывает новые пути и возможности для адресного воздействия на них, диагностики и прогнозирования развития болезней, в том числе и нейроинфекций.

Нейроинфекции у детей - менингиты и менингоэпцефалиты - до настоящего времени продолжают оставаться достаточно распространенными и тяжелыми заболеваниями детей до 1-го года, дошкольного и младшего школьного возраста, прежде всего, как осложнения гриппа и других вирусных и бактериальных инфекций. Хотя патофизиологические и иммунологические аспекты патогенеза развития менингитов подвергаются систематическому изучению в нашей стране и за рубежом, а их этиология хорошо известна, тем не менее, особенности развития защитных реакций организма при этих заболеваниях требуют дальнейшего изучения.

Одним из актуальных вопросов в изучении механизмов иммунопатологических процессов при менингитах у детей является определение специфики развития серозной и гнойной форм этого заболевания, а также поиск чувствительных маркеров, позволяющих оценить риск развития бактериальных менингитов.

В течение последнего десятилетия в литературе накопились данные об изменениях при менингитах концентраций в крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) иммуномодулируюгцих цитокинов - интерлейкинов (ИЛ)-1, 6, 8, 10, 12; фактора некроза опухолей-а (ФНО-а); а-, р- и у-интерферонов; колониестимулирующих факторов (КСФ) и других биологически активных веществ (F-. Rusconi et al, 1991; Т. Seki et al, 1993; S.J. Dulkerian et al, 1995; F.B.Tang et al, 1997; B.A. Исаков и соавт. 1998, 2002; С. Bohuon et al, 1998; D. Gendrei et al, 1999; A. Vege, Т.О. Rognum, 1999). Тем не менее, определения количественных показателей содержания цитокинов при развитии нейроинфекционных процессов недостаточно для оценки состояния защитных функций при этих заболеваниях. Представляется целесообразным и перспективным комплексное исследование изменений концентраций эндогенных регуляторов в биологических жидкостях больных и содержания в них определенных популяций клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма - количественных характеристик, и анализ изменения активности этих клеток - функциональных характеристик.

Одними из значимых показателей являются изменение продукции моноцитами крови лимфоцит-активируюгцих факторов (ЛАФ), важнейшим компонентом которых является цитокин интерлейкин 1 (ИЛ-1), уровня ИЛ-1 в плазме крови и ЦСЖ, а также его комитогенного действия на пролиферацию лимфоцитов периферической крови.

ИЛ-1 является одним из ключевых регуляторов защитных функций организма и медиаторов взаимодействия нервной и иммунной систем (С.A. Dinarello, 1991, 1999; Н.

Besedovsky et al., 1986; A. Bateman et al, 1989; A.V. Turnbull, C.I. Rivier, 1999; A.J. Dunn,

2000; E.A. Корнева и соавт., 2000; Е.Г. Рыбакина, Е.А. Корнева., 2002; Р.Н. Black, 2002;

М.А. Lynch, 2002). Он синтезируется многими клетками организма, в том числе нейронами и астроцитами головного мозга, (S.J. Hopkins, N.J. " Rothwell, 1995; R.J. Tushinski, J.J. Mule, 1995; J. Licino , М.-Ц Wong, 2001 ), ip его основной клеточный источник - моноциты и макрофаги (С.А. Dinarello, 1991, 1999). Повышение концентрации ИЛ-1 в плазме крови и ЦСЖ происходит в результате усиления его выделения клетками-продуцентами (в том числе в составе ЛАФ) или изменения его утилизации при патологии (C.A.Dinarello, 1999).

Особенностью ИЛ-1 является то, что он инициирует развитие реакций защиты, действуя как центрально (вызывая лихорадку, стимулируя гипорталамо-гипофизарно-адренокортикальную систему, влияя на аппетит и медленно-волновый сон), так и периферически (являясь иммуномодулятором, стимулируя синтез остро-фазовых белков печенью и гемопоэз) (С.A. Dinarello 1991, 1999; A.V. Turnbull, C.I. Rivier, 1999; J. Licino , M.-L. Wong, 2001).

Решающим для функционирования иммунной системы является свойство ИЛ-1 усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную лектинами. Оценка комитогенного действия ИЛ-1 - одной из ключевых его функций, также позволяет получить значимую информацию о состоянии защитных реакций организма при патологии.

Важнейшей составляющей комплекса ответных реакций организма на бактериальную и вирусную инфекцию являются реакции врожденного иммунитета. В настоящее время особое внимание в этой проблеме привлекают антимикробные катионные белки и пептиды нейтрофилов, которые можно рассматривать как антибиотики животного происхождения (В.Н. Кокряков, 1999). Катионные белки и пептиды, к которым относятся дефенсины, лизоцим, эластаза, катепсин G, лактоферрин (ЛФ), миелопероксидаза (МПО), обеспечивают антимикробный потенциал нейтрофилов, оказывая комплексное воздействие на структуру и обменные процессы в микроорганизмах и тем самым вызывая их умерщвление. Определение в крови и ЦСЖ больных ЛФ и МПО является информативным тестом, которое может способствовать раскрытию механизмов нарушений защитных реакций организма, приводящих к формированию и развитию инфекционной патологии, в том числе и нейроинфекций у детей.

Комплекс таких тестов используется в Отделе общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИЭМ РАМН» (руководитель - академик РАМН, профессор Е.А. Корнева) для оценки уровня активности защитных функций организма; в последние годы он апробирован на экспериментальных моделях и наблюдениях на людях.

Кроме того, информационно значимым представляется проведение корреляционного анализа показателей развития защитных реакций организма при менингитах у детей и клинико-лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. До настоящего времени подобные сведения в литературе отсутствуют.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы является комплексное изучение изменений ряда показателей активности защитных функций организма при бактериальных и гнойных менингитах у детей, а также исследование корреляционных взаимоотношений между изученными показателями и клинико-лабораторными данными, полученными при обследовании госпитализированных пациентов.

В задачи работы входило: 1

1. Исследование изменения концентрации ИЛ-1Р в сыворотке крови и ЦСЖ, продукции ЛАФ моноцитами периферической крови и комитогенного действия ИЛ-1Р на лимфоциты крови при серозных и гнойных менингитах у детей.

2. Изучение изменения концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных серозным и гнойным менингитом.

3. Определение корреляционных взаимосвязей между исследованными в работе показателями функциональной активности иммупокомпетентных клеток и клинико-лабораторными данными, полученными при обследовании госпитализированных детей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при серозных и гнойных менингитах у детей, а также при респираторных вирусных инфекциях.

Впервые для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма. Использованная функциональная тест-система включала оценку содержания в крови и ЦСЖ больных детей ключевого регулятора защитных функций организма ИЛ-1(3 и маркеров активности нейтрофилов - МПО и ЛФ, а также продукции моноцитами периферической крови ЛАФ, включающих ряд иммуномодулирующих цитокинов, в том числе ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, и комитогенного действия препарата ИЛ-1(3 на пролиферацию лимфоцитов. Впервые показаны особенности изменения концентраций цитокина ИЛ-1(3 и антимикробных белков нейтрофилов в исследованных биологических жидкостях, содержание в них клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма (количественные показатели) и изменения активности клеток, продуцирующих ИЛ-1 и реагирующих на него (функциональные показатели). Таким образом, проведена комплексная оценка количества и активности ряда клеточных популяций, участвующих в реализации защитных реакций при менингитах у детей.

Приоритетный характер носят результаты корреляционного анализа исследованных показателей и клинико-лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. Они подтвердили выявленное при проведении исследования значительное сходство в изменениях показателей активности защитных функций при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите. Впервые показано, что при ОРВИ и серозном менингите корреляционные взаимосвязи выявляются в основном между изменением количества нейтрофильных белков и классических показателей клинического анализа крови и ликвора. При гнойном менингите проявляется корреляция клинико-лабораторных данных с показателями функциональной активности моноцитарно-лимфоцитарного звена защиты организма - ЛАФ и РБТЛ.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей активности защитных функций организма при серозных и гнойных менингитах у детей, носит фундаментально-прикладной характер. Результаты исследования расширяют и дополняют сложившееся в настоящее время представление об особенностях нарушений защитных реакций организма, приводящих к формированию и развитию инфекционной патологии - менингитов у детей. Основное теоретическое значение работы состоит в установлении корреляции изменений исследованных показателей функциональной активности клеток, участвующих в обеспечении защитных функций организма, с характером заболеваний и степенью его тяжести: ОРВИ и серозного менингита, как заболеваний вирусной природы, и гнойного менингита, вызванного бактериальным возбудителем.

Комплекс проведенных исследований позволяет предложить новые критерии для дифференциальной диагностики и прогнозирования течения менингитов у детей: величину концентраций нейтрофильных гранулярных белков - МПО и ЛФ - в сыворотке крови и ЦСЖ и отношения их концентрации в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ, а также интенсивность стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами периферической крови детей в первые дни заболевания, что может быть рекомендовано для использования в клинической практике.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных как ОРВИ, так и серозной формой менингита, ИЛ-1 р определяется у 70 - 90% больных в первые дни заболевания и остается на том же уровне к 5-14-му дню лечения и наблюдения. Концентрация ИЛ-1р в крови и ЦСЖ 97-100 % детей, больных гнойным менингитом, в начале заболевания выше, чем при ОРВИ и серозной форме менингита. Через 12-14 дней лечения эта разница сохраняется только для уровня ИЛ-1Р в сыворотке, но не в ЦСЖ, в которой концентрация ИЛ-1р резко снижается.

2. Для обеих исследованных форм менингита в первые дни заболевания характерно подавление стимулированной ЛГТС продукции ЛАФ моноцитами крови по сравнению с реакцией клеток здоровых детей, чего не наблюдается у пациентов, больных ОРВИ. Спонтанная продукция ЛАФ моноцитами крови в первые 1-2 дня после госпитализации выявлена у детей, больных ОРВИ, тенденция к ней - у больных серозным менингитом; при гнойном менингите она не наблюдается.

3. Лимфоциты периферической крови детей, страдающих ОРВИ и серозной формой менингита, реагируют на инфекционный процесс снижением пролиферативной активности лимфоцитов, индуцированной ИЛ-ф, чего не происходит при гнойном менингите. При гнойном менингите в первые и, особенно, 12-14-е сутки после госпитализации усилена исходная пролиферативная активность лимфоцитов.

4. В первые 1-2 дня после госпитализации наблюдается повышение средней концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови больных вссх трех групп; через 5-14 дней величина этих показателей снижается до значений, характерных для здоровых детей. В ЦСЖ 82-х % больных серозным менингитом и 94-х % больных гнойным менингитом содержится МПО и ЛФ (или один из двух белков); ЦСЖ 82-х % больных ОРВИ не содержит ни ЛФ, ни МПО. У всех исследованных больных с серозным менингитом величина отношения концентрации МПО в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ превышает 7,4, в то время как у 72-х % больных гнойным менингитом это значение ниже 2,6. Такая же, но менее выраженная закономерность, наблюдается и для ЛФ.

5. Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона г подтвердил сходство в изменениях исследованных показателей активности защитных функций при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите. Выявлена корреляция изменений исследованных показателей с характером и степенью тяжести заболевания.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

выводы

1. В сыворотке крови и ЦСЖ детей, больных ОРВИ и серозной формой менингита, в первые дни заболевания ИЛ-lp определяется у 70-90% больных, при гнойном менингите у 97% детей наблюдается значительное возрастание концентрации ИЛ-1(3, более выраженное, чем при ОРВИ и серозном менингите. Через 5-14 дней лечения средняя концентрация ИЛ-1 р в сыворотке крови детей, больных ОРВИ, серозным и гнойным менингитом, и в ЦСЖ детей, больных ОРВИ и серозным менингитом, остается такой же, как в первые дни заболевания, а в ЦСЖ детей, больных гнойным менингитом, снижается до значений, характерных для ОРВИ и серозного менингита.

2. Определен дополнительный диагностический критерий развития менингитов у детей: для обеих исследованных форм менингита в первые дни заболевания характерно подавление стимулированной ЛПС продукции ЛАФ моноцитами крови по сравнению с реакцией клеток здоровых детей, чего не наблюдается у пациентов, больных ОРВИ. Спонтанная продукция ЛАФ моноцитами крови в первые 1-2 дня I после госпитализации выявлена у детей, больных ОРВИ, тенденция к ней — у больных серозным менингитом; при гнойном менингите она не наблюдается.

3. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови детей, больных ОРВИ и серозной формой менингита, в ответ на комитогеиное действие ИЛ-1р, в первые дни после госпитализации подавлена по сравнению с реакцией клеток здоровых детей и нормализуется к 5-14-у дню заболевания; при гнойном менингите она не отличается от того же показателя у здоровых детей. При гнойном менингите в первые и, особенно, 12—14-е сутки после госпитализации усилена исходная пролиферативная активность лимфоцитов.

4. В первые 1-2 дня после госпитализации наблюдается повышение средней концентрации ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех трех групп по сравнению с теми же показателями у здоровых детей. Концентрация МПО в сыворотке крови у больных гнойным менингитом в 1-2-й день выше, чем у больных серозным менингитом и ОРВИ. Через 5-14 дней средняя концентрация ЛФ и МПО в сыворотке крови больных всех групп снижается до значений, характерных для здоровых детей.

5. В ЦСЖ 82-х % больных серозным менингитом и 94-х % больных гнойным менингитом определяется МПО и ЛФ (или один из двух белков); ЦСЖ 82-х % больных ОРВИ не содержит ни одного из этих белков. У детей, больных серозным менингитом, величина отношения концентрации МПО в сыворотке крови к концентрации МПО в ЦСЖ превышает 7,43, в то время как у 72-х % детей, больных гнойным менингитом, это значение от 2,63 и ниже, что может быть использовано в клинической практике в качестве дифференциального диагностического критерия развития серозной либо гнойной формы менингита.

6. Выявлена корреляция изменений исследованных показателей с характером заболевания - при сравнении заболеваний вирусной природы (ОРВИ и серозный менингит) и бактериальной природы (гнойный менингит). Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона г подтвердил сходство в изменениях показателей активности защитных функций организма при ОРВИ и серозном менингите и их отличие от тех же показателей при гнойном менингите.

7. Комплекс проведенных исследований позволяет предложить ряд новых, диагностически значимых критериев оценки активности защитных функций организма при менингитах у детей, а именно интенсивность стимулированной in vitro продукции ЛАФ моноцитами периферической крови в первые дни заболевания, величину концентрации МПО и ЛФ в сыворотке крови и ЦСЖ, а также отношения их концентрации в сыворотке крови к концентрации в ЦСЖ.