Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск веществ с противовоспалительной и обезболивающей активностью среди новых производных тиадиазола

На правах рукописи

КАЗАИШВИЛИ Юрий Георгиевич

ПОИСК ВЕЩЕСТВ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И ОБЕЗБОЛИВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ СРЕДИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТИАДИАЗОЛА

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ЯНЗ 2015

Старая Купавна — 2014

005557625

005557625

Работа выполнена на кафедре управления и экономики фармации с курсами ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Демидова Марина Александровна Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Скачилова София Яковлевна

Официальные оппоненты:

Покровский Михаил Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», кафедра фармакологии, заведующий кафедрой;

Артюшкова Елена Борисовна, доктор биологических наук, Научно-исследовательский институт экологической медицины Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, директор

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « (О » 2015 года в «]СГ£>> часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01, созданного на базе ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ» и на сайте www.vncbav.ru.

Автореферат разослан «ц» оекСг ор,си 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Воспалительный процесс является ведущим патогенетическим звеном многих заболеваний, которые составляют около 80% всей патологии в практике врача любой специальности. Статистические данные свидетельствуют о том, что во всем мире хроническим болевым синдромом страдают миллионы людей. Так, например, по данным ВОЗ известно, что болевой синдром составляет одну из ведущих причин (от 11,3 до 40 %) обращений к врачу в системе первичной медицинской помощи, а в структуре неврологического приема такие пациенты составляют более половины всех обращений (Noolvi М. N., Patel Н. М., 2010). Хронический болевой синдром изменяет физическое и эмоциональное состояние пациентов, снижает их качество жизни, уменьшает трудоспособность.

В настоящее время в комплексной терапии острых и хронических заболеваний для купирования боли и уменьшения выраженности воспалительной реакции применяют большое число лекарственных препаратов преимущественно из группы нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) и глюкокортикостероидов. Современные НПВС имеют различную химическую структуру. Среди препаратов этой группы имеются производные кислот (индолуксусной, фенилуксусной, пропионовой, салициловой), оксикамов, коксибов, сульфоанилидов. Практически все применяемые НПВС отличаются выраженностью и продолжительностью основного фармакологического эффекта и неблагоприятным профилем безопасности. Известно, что наряду с противовоспалительным и обезболивающим эффектами, многие нестероидные противовоспалительные средства вызывают ряд нежелательных побочных реакций, в том числе эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта, выраженные изменения функции печени, почек и другие нарушения. В связи с этим в настоящее время поиск новых лекарственных веществ, обладающих выраженным противовоспалительным и анальгезирующим действием, направлен на создание препаратов сочетающих высокую эффективность с улучшенной переносимостью (Amir М. et al., 2007).

Одной из перспективных групп для поиска новых обезболивающих средств являются производные тиадиазола. Производные гиадиазола по химической структуре имеют сходство с пиримидином и оксадиазолом. Атом серы тиадиазола придает этим соединениям липофильные свойства, что обеспечивает их проницаемость через биологические мембраны (Abraham D. J., 2003). Вместе с тем известно, что вещества, имеющие в своей

структуре пятичленные гетероциклы, в том числе цикл тиадиазола, обладают широким спектром биологической активности (Bonde C.G. et al., 2003). Среди производных тиадиазола известны соединения с бронхолитической, противовоспалительной, обезболивающей, антиоксидантной,

противовирусной, антибактериальной, гепатопротекторной,

антипролиферативной, нейропротекторной и другими видами активности. Преимуществом известных производных тиадиазола является большая широта терапевтического действия (Yijing Li et al., 2012).

Вышесказанное стимулирует поиск новых химических соединений с высокой противовоспалительной, анальгезирующей активностями и относительной безопасностью применения среди новых производных тиадиазола.

Цель работы - поиск среди новых производных тиадиазола соединений, имеющих невысокий индекс ульцерогенности и обладающих обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и жаропонижающей активностями.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

• Определить значение LD50 новых производных тиадиазола при внутрибрюшинном введении мышам.

• Определить значение индекса ульцерогенности новых производных тиадиазола при внутрижелудочном введении крысам.

• Оценить обезболивающую активность новых производных тиадиазола на моделях химического (при внутрибрюшинном введении уксусной кислоты) и термического (в тесте горячей пластины) болевого раздражения.

• Исследовать влияние новых производных тиадиазола на течение острого экссудативного воспаления у крыс.

• Оценить влияние новых производных тиадиазола на выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей.

• Оценить жаропонижающую активность производных тиадиазола на модели гипертермической реакции у крыс, вызванной введением пирогенала.

Научная новизна

Впервые в экспериментах на животных в ряду новых оригинальных производных тиадиазола выявлены соединения с обезболивающей, жаропонижающей, противоаллергической и противовоспалительной активностью. Наиболее перспективными были соединения JIXT3.I0 (новое

производное амида тиадиазола) и ЛХТ 10.ю (новое производное тиадиазола в виде комплексной соли). Бьшо показано, что новые производные тиадиазола относятся к малотоксичным веществам (3 класса токсичности). Установлено, что ЛХТ3.10 и ЛХТ]о-ш при внутрижелудочном введении в дозе 10% ЬБ50 имеют меньший индекс ульцерогенности, чем при использовании индометацина. Обезболивающая активность новых производных тиадиазола при термическом и химическом болевом раздражении была сопоставима с эффектами диклофенака натрия. Впервые было показано наличие у новых производных тиадиазола ЛХТ3_ю и ЛХТ10.ю жаропонижающей и умеренной противоаллергической активности.

Научно-практическая значимость

Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Показана перспективность поиска обезболивающих и противовоспалительных средств, отличающихся низкой ульцерогенностью, среди производных тиадиазола.

Результаты данного исследования являются основанием для дальнейшего расширенного экспериментального изучения

противовоспалительного, анальгезирующего и жаропонижающего действия производных тиадиазола (ЛХТ3_10, ЛХТ]о-1 о) С целью создания эффективных лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наличие анальгезирующей активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.ю и ЛХТ10.ю-

2. Наличие противовоспалительной активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТ10-ю.

3. Наличие противоаллергической активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТю-ю-

4. Наличие жаропонижающей активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТ10.10.

5. Менее выраженные ульцерогенные свойства новых производных тиадиазола ЛХТ 3.10 и ЛХТ10.1о по сравнению с индометацином.

Внедрение в практику

Результаты, полученные при исследовании фармакологической активности новых производных тиадиазола, были внедрены в научно-исследовательскую работу кафедры управления и экономики фармации с курсами ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Связь темы диссертационного исследования с планом научных работ

учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава России. Номер государственной регистрации 01201374523.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуждены на I Российской конференции по медицинской химии (9-12 сентября 2013 г., Москва), на международной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке» (30 сентября 2013 г., Тамбов), на Международной научно-практической конференции «Наука, образование, общество: проблемы и перспективы развития» (28 февраля 2014 г., Тамбов), на расширенном заседании кафедры управления и экономики фармации с курсами ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии Тверской государственной медицинской академии (26 декабря 2013 г., Тверь).

Личное участие автора в получении результатов

Личный вклад автора состоит в анализе отечественных и зарубежных источников по теме диссертационного исследования и в непосредственном выполнении всех экспериментальных исследований по оценке безопасности, фармакологической активности новых производных тиадиазола.

Автор лично участвовал в анализе полученных данных, их статистической обработке и интерпретации, формулировке выводов. Публикации по результатам работы подготовлены при активном участии автора (авторский вклад составляет 85%).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 — в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 135 источников, в том числе 54 иностранных. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 31 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования выполнены на 150 мышах (белых неинбредных) обоего пола массой 20,1±0,9 г и 170 белых неинбредных крысах обоего пола массой 234,4±4,9 г. Подопытных животных содержали в условиях вивария Тверской государственной медицинской академии (с естественным режимом освещения; при температуре 22-24 °С; относительной влажности воздуха 40-50%) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 53434-2009). Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N 708н), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 10-14 дней.

Все исследования выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва, 2005 и Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Москва, 2012).

Основными объектами исследования явились новые производные тиадиазола в виде амидов (ЛХТ,.ю; ЛХТ3.Ш) и солей с органическими кислотами (ЛХТ10.ю; ЛХТ12.ю; ЛХТ14.10), синтезированные в ОАО «ВНЦ БАВ» (Старая Купавна) проф. С.Я. Скачиловой. Общие структурные формулы новых производных тиадиазола представлены на рисунках 1 и 2.

Рис. 1 - Структурная формула новых производных амидов тиадиазола.

N-N

N-N

, где X - органическая кислота

Рис. 2 - Структурная формула солей новых производных тиадиазола с органическими кислотами.

Строение синтезированных соединений подтверждено элементным анализом и спектральными данными (ЯМР- и ИК-спектрами), индивидуальность - данными тонкослойной хроматографии.

Новые химические соединения были использованы в виде субстанций, которые в зависимости от степени их растворимости вводили животным либо в виде растворов, применяя в качестве растворителя изотонический раствор натрия хлорида (ИР ЫаС1), либо в виде суспензии с твином 80 или 1% крахмалом (в случае внутрижелудочного введения).

В качестве препаратов сравнения использовали нестероидные противовоспалительные средства - диклофенак натрия (Диклофенак, ОАО Мосхимфармпрепараты им Н.А.Семашко, РФ, таблетки 50 мг, серия 1181212); кетопрофен (Кетонал, ЗАО «Лек», Словения, раствор для в/в и в/м введения 50 мг/мл 2 мл, серия СУ3500), индометацин (Индометацин, ОАО «Биосинтез», РФ, таблетки 25 мг, серия 30410), преднизолон (Преднизолон, ООО «Такеда», раствор для в/в и в/м введения 25 мг/мл 1 мл № 25, серия 10416952). Животные контрольной группы получали ИР ЫаС1.

Значение ЬО50 для новых производных тиадиазола определяли при внутрибрюшинном введении мышам методом В.Б. Прозоровского и М.П. Прозоровской (1980). Оценку класса токсичности соединений осуществляли по ГОСТ 12.1.007-76. (И.В.Березовская, 2003).

Для определения ориентировочной дозы для крыс осуществляли межвидовой пересчет доз по формуле:

доза для мыши х коэффициент мыши

Доза для крысы =-—-

коэффициент крысы

В дальнейших исследованиях все новые производные тиадиазола вводили подопытным животным в дозе 1/20 ЬВ50.

Ульцерогенность новых производных тиадиазола оценивали при внутрижелудочном введении (в виде водных суспензий с 1% слизью крахмала) крысам в течение 4-х дней. На 5-й день животных забивали (под легким эфирным наркозом), извлекали желудки, рассекали их по малой кривизне и промывали в изотоническом растворе натрия хлорида для удаления содержимого. Проводили визуальную оценку состояния слизистой оболочки желудка с использованием лупы, определяя степень деструктивного поражения (количество кровоизлияний и эрозий на одно животное). Ульцерогенность новых соединений оценивали по значению индекса Паулса. Индекс Паулса (ИП) - интегральный показатель масштабов деструкции в желудке, определяли по формуле:

ИП= СДхЫ/ЮО (%); где,

С Д - степень деструкции

N — количество крыс с поражениями (%).

Кроме того, подсчитывали суммарную протяженность деструкций (точечных геморрагий, эрозий, полосовидных поражений) (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

Оценку обезболивающей активности новых производных тиадиазола проводили с использованием модели горячей пластины у мышей (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000). Болевую реакцию вызывали помещением животного на горячую пластину температурой 55еС. Регистрировали время от начала воздействия термического фактора до достижения порога болевой чувствительности (проявления признаков боли у подопытных животных -подпрыгивание, облизывание и отдергивание задних лап, писк).

Эксперименты по моделированию химического раздражения брюшины проводили на белых беспородных крысах массой 234,4±4,9 г. Болевую реакцию индуцировали внутрибрюшинным введением крысам 3% раствора уксусной кислоты в дозе 300 мг/кг (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000). Наблюдение за подопытными животными проводили в течение 1 часа после введения уксусной кислоты. Крыс, у которых не возникала реакция «корчения» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины), в экспериментах не использовали. В дальнейших экспериментах использовали животных с положительной реакцией «корчения». Исследуемые соединения вводили подопытным крысам внутрибрюшинно за 30 минут до введения уксусной кислоты. Каждое подопытное животное помещали в стеклянный контейнер, регистрировали общее число приступов экстензорных судорог («корчей») в течение 15 минут.

Противовоспалительную активность новых производных тиадиазола оценивали на модели формалинового отека лапы у крыс. Острый воспалительный отек вызывали субплантарным введением (под подошвенный апоневроз) в заднюю правую лапу крысы 0,1 мл 2 % водного раствора формалина. Выраженность отека оценивали, измеряя толщину лапки подопытного животного с помощью инженерного электронного штангенциркуля Уоге1 15240 (Польша) до и через 2, 4, 6 часов, а также в динамике через 24 и 48 часов после введения раствора формалина. Противовоспалительную активность исследуемых соединений выражали в процентах угнетения отека.

П = (0-И)/Их 100%,

где П - прирост отека,

О — величина объема лапы после введения формалина, И — величина объема лапы до введения формалина.

Исследуемые соединения и препараты сравнения вводили подопытным животным внутрижелудочно за 1 час до индукции отека формалином.

Изучение противоаллергической активности новых производных тиадиазола проводили на модели активной кожной анафилаксии у мышей. Активную кожную анафилаксию у мышей моделировали по Г. Фримелю (1987) в модификации М.А. Демидовой и соавт. (2006). В качестве препарата сравнения использовали глюкокортикостероид преднизолон.

Изучение жаропонижающей активности новых производных тиадиазола проводили на модели гипертермической реакции у крыс. Повышение температуры тела вызывали путем внутривенного введения пирогенала в дозе 500 минимальных пирогенных доз/кг (МПД/кг). У всех подопытных животных измеряли ректальную температуру термометром Citizen СТ461С до начала опыта и в течение 24 часов после введения пирогенала. Первые 6 часов измерение температуры тела осуществляли через 1 час.

Результаты исследования обработаны статистически с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2003. Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцессы. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка острой токсичности и ульцерогенности новых производных тиадиазола

Отсутствие выраженной токсичности - одно из основных требований, предъявляемых к синтетическим соединениям, которые рассматриваются как потенциальные лекарственные средства. Выявление границ токсичности позволяет сориентироваться в диапазоне доз химических соединений для изучения их специфических свойств. Оценку острой токсичности новых производных тиадиазола осуществляли в диапазоне доз 320 мг/кг - 5120 мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам, определяя значение LD50 по

таблице средних эффективных доз и их ошибок при разных последовательностях реакций (В.Б. Прозоровский, 2007).

Результаты эксперимента показали, что значение 1Л}50 при внутрибрюшинном введении мышам для ЛХТыо составило 898±71 мг/кг, для ЛХТз.ю - 900±108 мг/кг, для ЛХТ1(Мо - 834±81 мг/кг, для ЛХТ12.ю -977±92 мг/кг, для ЛХТ14.10 - 898±71 мг/кг. Полученные данные позволили отнести новые производные тиадиазола к малотоксичным веществам (3 класс токсичности) в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При оценке фармакологической активности исследуемые соединения использовали в терапевтических дозах, составляющих 1/20 значения ЬБ50 (для ЛХТыо терапевтическая доза 5% ЬБ50 при внутрибрюшинном введении мышам составила 44,9 мг/кг, для ЛХТ3.10 - 45 мг/кг, для ЛХТ10.ю - 41,7 мг/кг, для ЛХТ12.ю - 48,9 мг/кг, для ЛХТ14.10 - 44,9 мг/кг). Ориентировочные дозы для крыс определяли по формуле межвидового пересчета доз (для ЛХТМ0 терапевтическая доза 5% ЬО50 при внутрибрюшинном введении крысам составила 20,6 мг/кг, для ЛХТ3.10 - 20,7 мг/кг, для ЛХТю-ю - 19,2 мг/кг, для ЛХТп-ю - 22,5 мг/кг, для ЛХТН-1о - 20,6 мг/кг).

Учитывая тот факт, что основным негативным свойством большинства НПВС является высокий риск развития нежелательных реакций со стороны желудочно-кишечного тракта (НПВС-гастродуоденопатии), на следующем этапе экспериментального исследования оценивали состояние желудка у крыс при ежедневном внутрижелудочном введении новых производных тиадиазола в дозе 10% 1ЛЭ50 в течение 4-х дней. В качестве препарата сравнения использовали производное индолуксусной кислоты - индометацин (входит в группу НПВС, характеризующихся наиболее выраженной ульцерогенностью) в ульцерогенной дозе (50 мг/кг при внутрижелудочном введении крысам).

Проведенные эксперименты подтвердили выраженную ульцерогенность индометацина. При макроскопическом морфологическом исследовании желудка подопытных крыс, получавших внутрижелудочно индометацин (50 мг/кг), были выявлены выраженные изменения со стороны слизистой и серозной оболочек. Слизистая оболочка желудка была серо-белой, отечной со сглаженными складками и единичными глубокими дефектами, заполненными тканевым детритом. Кроме того, отмечались множественные пристеночные сгустки крови, а также петехиальные кровоизлияния диаметром от 0,1 до 0,3 см (рис. 3). Серозная оболочка желудка была гиперемирована, с выраженным сосудистым рисунком. Индекс Паулса при внутрижелудочном введении индометацина подопытным крысам составил 11,2.

Рис. 3 - Слизистая оболочка желудка крыс на 5-й день после ежедневного внутрижелудочного введения индомегацина в дозе 50 мг/кг.

Одновременно было отмечено, что среди новых производных тиадиазола имеются соединения с меньшей ульцерогенной активностью, чем у индометацина. Так, например, было выявлено, что значение индекса Паулса при внутрижелудочном введении соединений ЛХТ3.10 (41,40 мг/кг), ЛХТ10.10 (38,36 мг/кг) и ЛХТ12-Ю (44,94 мг/кг) было соответственно в 3,5 раза (р <0,05), 2,3 раза (р<0,05) и 1,8 раза (р<0,05) меньше, чем при использовании индометацина. При введении соединений ЛХТ,.,0 и ЛХТ14.10 выраженного снижения ульцерогенности отмечено не было (табл. 1).

Таблица 1

Ульцерогенность новых производных тиадиазола и индометацина _при внутрижелудочном введении у крыс

Серия опыта (доза) Число наблюдений Индекс Паулса

Индометацин (50 мг/кг) 10 11,2

ЛХТЫ0 (41,30 мг/кг) 10 9,6

ЛХТз.ю (41,40 мг/кг) 10 3,2

ЛХТ10.ю (38,36 мг/кг) 10 4,8

ЛХТ12.Ш (44,94 мг/кг) 10 6,4

ЛХТ)4_10 (41,36 мг/кг) 10 10,4

Результаты макроскопических морфологических исследований показали, что в сериях опытов с использованием ЛХТ3_10 и ЛХТ1(Ыо слизистая оболочка желудка была серо-розовой, складки хорошо

контурировались, эрозивные дефекты не выявлялись, отмечалась незначительная очаговая гиперемия. Со стороны серозной оболочки отклонений от нормы выявлено не было (рис. 4).

А Б

Рис. 4 - Слизистая оболочка желудка крыс на 5-й день после ежедневного внутрижелудочного введения ЛХТ3.10 в дозе 41,40 мг/кг (А) и ЛХТю-ю в дозе 38,36 мг/кг (Б).

Вероятно, низкая ульцерогенность новых производных тиадиазола ЛХТз.ю и ЛХТю-ю обусловлена наличием в их структуре фрагментов органических кислот с антиоксидантной активностью. Предполагается, что гастропротективный эффект этих соединений связан с уменьшением свободнорадикальных реакций и повышением антиоксидантного потенциала тканевых структур слизистой оболочки желудка.

Наибольшей ульцерогенной активностью среди исследованных новых производных тиадиазола обладали соединения ЛХТз.ю (41,36 мг/кг) и ЛХТмо (41,30 мг/кг). При морфологическом исследовании желудка подопытных крыс, получавших эти соединения, были отмечены выраженная гиперемия слизистой оболочки, множественные эрозивные дефекты диаметром от 0,3 до 1,0 см, заполненные тканевым детритом. Также определялись петехиальные кровоизлияния диаметром от 0,1 до 0,3 см. Со

стороны серозной оболочки — гиперемия и выраженный сосудистый рисунок (рис. 5).

А Б

Рис. 5 - Слизистая оболочка желудка крыс на 5-й день после ежедневного внутрижелудочного введения ЛХТ^ю в дозе 41,30 мг/кг (А) и ЛХТм.ю в дозе 41,36 мг/кг (Б).

2. Оценка обезболивающей, противовоспалительной и жаропонижающей активности новых производных тиадиазола

Оценку обезболивающей активности новых производных тиадиазола проводили в экспериментах на белых неинбредных мышах с использованием теста горячей пластины. Было обнаружено, что при помещении подопытных животных на горячую пластину температурой 55°С порог болевой чувствительности (время до появления оборонительного рефлекса) составил 14,5±0,2 с. В сериях опытов с внутрибрюшинным введением диклофенака натрия (50 мг/кг) порог болевой чувствительности при тестировании через 30 мин, 1 час и 2 часа был соответственно в 1,5 раза (р<0,05), в 1,9 раза (р<0,05) и 2,2 раза (р<0,05) выше, чем в контроле (подопытные животные, получавшие ИР 1ЧаС1).

Среди новых производных тиадиазола также были обнаружены соединения, обладающие способностью повышать порог болевой чувствительности при термическом раздражении у мышей (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение порога болевой чувствительности у мышей в тесте горячей пластины при внутрибрюшинном введении новых производных тиадиазола и

диклофенака

Серия опыта (доза) Число наблюдений Порог болевой чувствительности, с

До опыта 30 мин 60 мин 120 мин

Контроль -ИРЫаС1 (0,25 мл) 10 14,5±0,2 14,3±0,5 14,3±0,5 14,0±0,5

Диклофенак (50 мг/кг) 10 14,5±0,2 21,7±0,7* 27,6±1,7* 30,8±1,7*

ЛХТ ,.10 (44,9 мг/кг) 10 14,5±0,2 14,5±0,49 14,6±0,49 14,6±0,5

ЛХТз.ю (45 мг/кг) 10 14,5±0,2 19,5±1,5* 24,8±1,5* 25,4±1,3*

ЛХТ ю-ю (48,9 мг/кг) 10 14,5±0,2 19,8±1,4* 31,26±1,9* 28,2±1,7*

ЛХТ 12.10 (41,7 мг/кг) 10 14,5±0,2 14,6±0,5 24,6±0,5* 24,5±0,5*

ЛХТ 14.10 (44,9 мг/кг) 10 14,5±0,2 14,5±0,5 18,5±0,5* 24,6±0,5*

Примечание: * — различия с контролем достоверны (р<0,05)

Так, было выявлено, что наибольшей обезболивающей активностью при термическом раздражении у мышей обладало соединение ЛХТ10.ю. Отмечено, что порог болевой чувствительности у подопытных мышей, получавших внутрибрюшинно ЛХТ10.т, при тестировании через 30 мин, 1 час и 2 часа был соответственно в 1,4 раза (р<0,05), в 2,2 раза (р<0,05) и 2,0 раза (р<0,05) выше, чем в контроле. При этом достоверных отличий в обезболивающей активности диклофенака натрия (50 мг/кг) и ЛХТю-ю (48,9 мг/кг) в тесте горячей пластины при внутрибрюшинном введении мышам выявлено не было. Несколько слабее действовал ЛХТ3_ю. При внутрибрюшинном введении этого соединения порог болевой чувствительности у подопытных мышей при тестировании через 30 мин, 1 час и 2 часа был соответственно в 1,4 раза (р<0,05), в 1,7 раза (р<0,05) и 1,8 раза (р<0,05) выше, чем в контроле.

Обращает на себя внимание тот факт, что при внутрибрюшинном введении ЛХТп-ю и ЛХТ14.10 обезболивающая активность при термическом раздражении у мышей проявлялась через 1 час после их применения, тогда как при использовании диклофенака натрия, ЛХТ3.10 и ЛХТ10.ю повышение порога болевой чувствительности отмечалось уже через 30 минут. Через 2 часа после введения ЛХТ 12.10 и ЛХТ 14.10 порог болевой чувствительности у подопытных животных был в среднем в 1,7 раза (р<0,05) выше исходного уровня, но в среднем в 1,3 раза (р<0,05) ниже, чем при использовании диклофенака натрия. Обезболивающая активность ЛХТ 12_10 и ЛХТ 14.10, вероятно, связана с наличием в их структуре фенильных и алкильных фрагментов. В сериях опытов с использованием ЛХТ мо обезболивающей активности обнаружено не было.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что среди новых производных тиадиазола имеются соединения с обезболивающей активностью (ЛХТ3.ю, ЛХТ 10.ю, ЛХТ 12.10 и ЛХТ 14.10). Наиболее перспективным среди новых производных амидов тиадиазола представлялось соединение ЛХТ3.10, а среди новых солей тиадиазола -соединение ЛХТю-ю. При проведении скрининговых исследований эти вещества наряду с выраженной обезболивающей активностью продемонстрировали низкую ульцерогенность, в связи с чем были выбраны для дальнейших углубленных исследований. Существенным недостатком новых производных солей тиадиазола ЛХТ12_10 и ЛХТ14.10 явилась ульцерогенность, характерная для большинства нестероидных противовоспалительных средств.

Наличие выраженной обезболивающей активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.ю и ЛХТю-ю подтвердили результаты экспериментов с моделированием химического раздражения брюшины у крыс. Было выявлено, что при внутрибрюшинном введении 3% раствора уксусной кислоты (300 мг/кг) у подопытных животных развивались специфические ноцицептивные ответы - «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины). У животных группы контроля число специфических ноцицептивных ответов при химическом раздражении брюшины составило 34,9±0,4 в час. В сериях опытов с использованием нестероидного противовоспалительного средства из группы производных пропионовой кислоты — кетопрофена (23 мг/кг) число специфических ноцицептивных ответов на внутрибрюшинное введение уксусной кислоты было в среднем в 1,2 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле. Вместе с тем было отмечено, что обезболивающая активность

новых производных тиадиазола ЛХТ3.10 (20,7 мг/кг) и ЛХТю-ю (19,2 мг/кг) при химическом раздражении брюшины у крыс соответствовала эффектам кетопрофена в этом отношении (табл. 3).

Таблица 3.

Число специфических ноцицептивных ответов («корчей») на химическое раздражение брюшины у крыс при введении кетопрофена и новых производных тиадиазола

Серия опыта (доза) Число наблюдений Число специфических ноцицептивных ответов в течение 1 часа

Контроль - ИР ЫаС1 (0,5 мл) 10 34,9±0,4

Кетопрофен (23,0 мг/кг) 10 29,2±0,5*

ЛХТ3.ю (20,7 мг/кг) 10 29,3±0,3*

ЛХТю-ю (19,2 мг/кг) 10 28,5±0,3*

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р<0,05)

Противовоспалительную активность новых производных тиадиазола оценивали на модели формалинового отека лапы у крыс. Было выявлено, что при субплантарном введении 0,1 мл 2 % раствора формалина у подопытных крыс развивается выраженный отек лапы, о чем свидетельствует достоверное увеличение ее объема. Отмечено, что максимальный отёк лапы (пик воспаления) развивался через 2 часа после введения формалина, при этом объем лапы у подопытных животных контрольной группы увеличивался в среднем на 26,5 % (р<0,05). Следует отметить, что и через 24 часа после введения формалина объем лапы у подопытных животных контрольной группы был в среднем на 13,5% больше, чем до введения флогогенного фактора (табл. 4).

В сериях опытов с использованием кетопрофена (23 мг/кг) выраженность формалин-индуцированного отека лапы крыс была в среднем на 14% меньше, чем в контроле. Новые производные тиадиазола ЛХТ3.10 (20,7 мг/кг) и ЛХТю-ю (19,2 мг/кг) при формалиновом отеке лапы у крыс действовали несколько слабее, чем кетопрофен (23 мг/кг). В сериях опытов с введением этих соединений выраженность воспалительной реакции была в среднем на 8% меньше, чем в контроле (у подопытных крыс с формалиновым отеком лапы, получавших изотонический раствор натрия хлорида). Достоверных различий в эффектах ЛХТ3.10 и ЛХТю-ш при формалиновом отеке лапы у крыс обнаружено не было.

Таблица 4.

Выраженность формалинового отека лапы у крыс при внутрибрюшинном введении кетопрофена и новых производных тиадиазола

Серия опыта Число наблюдений Толщина лапы крыс, %

до опыта 2 часа 4 часа 6 часов 24 часов 48 часов

Контроль ИР№С1 (0,5 мл) 10 100 ±2,1 129,4 ±1,8* 126,5 ±1,9* 120,7 ±2,0* 113,5 ±2,1* 101,6 ±2,3

Кетопроф ен 23мг/кг 10 100 ±2,2 113,7 ±1,9*# 110,6 ±2,0*# 105,0 ±2,14 103,2 ±1,8 101,6 ±2,2

ЛХТ 3_ю 20,7 мг/кг 10 100 ±2,3 119,1 ±2,0*# 117,8 ±1,9*# 111,4 ±2,1*# 105,0 ±2,4*# 102,1 ±1,8

ЛХТ ю-10 22,5 мг/кг 10 100 ±2,4 120,95 ±2,1*# 118,56 ±2,2*# 114,32 ±2,3 *# 106,10 ±2,3*# 101,85 ±2,2

* - различия толщины лапы со значениями до опыта (р<0,05)

# - различия толщины лапы с контролем (р<0,05)

Анализ результатов экспериментов по оценке противоаллергической активности показал, что производные тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТ10_ю обладают способностью уменьшать выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей. Было выявлено, что у подопытных мышей, сенсибилизированных овальбумином, при внутрикожном введении антигена (овальбумина) на 21-й день латентного периода сенсибилизации развивалась местная аллергическая реакция. Визуально кожная анафилаксия проявлялась окрашиванием участка кожи в синий цвет, что было связано с выходом красителя (Эванса синего) из кровеносного русла в очаг аллергического поражения (в месте внутрикожного ведения аллергена - овальбумина). В сериях опытов с использованием глюкокортикостероида преднизолона (0,5 мг/кг) выраженность реакции активной кожной анафилаксии была в среднем на 93% меньше, чем в контроле. Новые производные тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТю-ю уменьшали выраженность кожной анафилаксии соответственно в 1,2 раза (р<0,05) и в 1,5 раза (р<0,05) менее, чем преднизолон (рис. 6).

90

80

о

.= ^ 70

О «

в 3

= I

« Е

= в

Я" я

Я « 1140

в Я 30

В X

« «

С 20

10

50

Г

Преднизолон 0,5 мг/кг ЛХТ 3-10 45 мг/кг ЛХТ 10-10 48,9 мг/кг * - различия толщины лапы со значениями до опыта (р<0,05)

Рис. 6 - Выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей при введении новых производных тиадиазола и преднизолона.

Оценку жаропонижающей активности новых производных тиадиазола осуществляли на модели гипертермической реакции у крыс, вызванной введением пирогенала. Было отмечено, что при внутрибрюшинном введении пирогенала (500 МПД/кг) ректальная температура тела крыс постепенно увеличивалась и достигла максимума (в среднем на 1,9°С выше исходного уровня) через 4 часа после введения пирогенного фактора.

В серии опытов с введением кетопрофена (23 мг/кг) достоверного повышения температуры тела у подопытных животных после введения пирогенала отмечено не было. Было выявлено, что новые производные тиадиазола ЛХТз_10 и ЛХТ10.т при пероральном применении до введения пирогенного фактора также предупреждали повышение температуры тела у подопытных крыс. Выраженность жаропонижающей активности исследуемых соединений соответствовала эффектам кетопрофена (табл. 5).

Таблица 5.

Температура тела крыс, получавших кетопрофен и производные тиадиазола на фоне введения пирогенала (500 МПД/кг)

Серия опыта (доза) Число наблю дений Температура тела, °С

До опыта После введения пирогенала

1ч 2ч Зч 4ч 5ч 24 ч

Контроль -ИР№С1 (0,5 мл) 10 36,1 ±0,12 36,3 ±0,34 36,9 ±0,14# 37,5 ±0,13# 38,0 ±0,05# 37,8 ±0,11# 35,9 ±0,12

Кетопрофен (23 мг/кг) 10 36,1 ±0,33 36,1 ±0,56 36,7 ±0,35 36,4 ±0,26* 36,6 ±0,16* 36,3 ±0,16* 35,8 ±0,32

ЛХТ3.10 (20,7 мг/кг) 10 35,9 ±0,5 35,9 ±0,2 36,8 ±0,2 36,9 ±0,1* 36,5 ±0,1* 36,0 ±0,1* 36,0 ±0,3

ЛХТю-ю (22,5 мг/кг) 10 35,9 ±0,1 36,3 ±0,4 36,6 ±0,3 36,4 ±0,2* 35,9 ±0,2* 36,2 ±0,2* 36,1 ±0,1

* - различия с контролем достоверны (р<0,05)

# - различия с температурой тела до опыта достоверны (р<0,05)

Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволили выявить среди новых производных тиадиазола соединения ЛХТ3.10 и ЛХТю-ю, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и жаропонижающей активностью и имеющие в отличие от индометацина низкий индекс ульцерогенности.

ВЫВОДЫ

1. Среди новых производных тиадиазола выявлены соединения ЛХТ3_10 и ЛХТ.смо, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и жаропонижающей активностью и имеющие в отличие от индометацина низкий индекс ульцерогенности.

2. Установлено, что новые производные тиадиазола являются малотоксичными соединениями (3 класс токсичности по ГОСТ 12.1.007-76).

3. Обезболивающая активность новых производных тиадиазола ЛХТ3.ю и ЛХТю-ю при внутрибрюшинном введении в дозе 5% LD50 при термическом раздражении у мышей в тесте горячей пластины и при химическом раздражении брюшины у крыс была соответственно на уровне диклофенака натрия и кетопрофена.

4. Наличие противовоспалительной активности у новых производных тиадиазола ЛХТ3.]0 и ЛХТ10-ю было подтверждено на модели острого экссудативного воспаления у крыс. Эффективность соединений была на уровне препарата сравнения кетопрофена.

5. Новые производные тиадиазола ЛХТ3.ю и ЛХТю-ю при внутрибрюшинном введении мышам в дозе 5% LD50 проявили противоаллергическую активность, уменьшая выраженность реакции активной кожной анафилаксии соответственно в 1,8 раза и 1,7 раза по сравнению с контролем.

6. Жаропонижающая активность новых производных тиадиазола ЛХТ3.10 и ЛХТю-ю при гипертермической реакции у крыс соответствовала эффектам кетопрофена.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования позволяют рекомендовать новые производные тиадиазола ЛХТ3.10 и JIXT1(Mo для дальнейших доклинических и клинических испытаний с целью создания лекарственных средств с противовоспалительной, анальгезирующей, противоаллергической и жаропонижающей активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казаишвили, Ю.Г. Исследование анальгетической активности новых производных тиадиазола [Текст] / Ю.Г. Казаишвили, М.А. Демидова // Современные проблемы науки и образования. — 2012. — № 6, URL: www.science-education.ru/106-7306.

2. Казаишвили, Ю.Г., Исследование противовоспалительной активности новых производных тиадиазола при формалиновом отеке лапы у

крыс [Текст] / Ю.Г. Казаишвили, Н.С. Попов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 3, URL: www.science-education.ru/109-

3. Казаишвили, Ю.Г. Исследование анальгетической активности новых производных тиадиазола при химическом раздражении брюшины у крыс [Текст] / Ю.Г. Казаишвили // Врач-аспирант. - 2013. - Вып. 3.2 (58). - С. 275-279.

4. Казаишвили, Ю.Г. Исследование противоаллергической активности новых производных тиадиазола [Текст] / Ю.Г. Казаишвили // Врач-аспирант. -2013. -Вып. 1 (56). -С. 39-46.

5. Казаишвили, Ю.Г. Изучение фармакологической активности новых производных тиадиазола [Текст] / Ю.Г. Казаишвили, М.А. Демидова, Н.С. Попов // Материалы I Российской конференции по медицинской химии с международным участием (MedChem Russia-2013, 8-12 сентября 2013, Москва).-2013.-С. 220.

6. Казаишвили, Ю.Г. Исследование противоаллергической, анальгетической и противовоспалительной активности новых производных тиадиазола [Текст] / Казаишвили Ю.Г., Малыгин A.C., Попов Н.С. // Материалы международной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке» (30 сентября 2013, Тамбов). - 2013. - Т. 1. - С. 8183.

7. Казаишвили, Ю.Г. Исследование жаропонижающей активности новых производных тиадиазола [Текст] / Казаишвили Ю.Г., Попов Н.С. // Материалы международной научно-практической конференции «Наука, образование, общество: проблемы и перспективы развития» (28 февраля 2014, Тамбов). -2014. - Т. 3. - С. 54-56.

9598.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

нпвс

HPNaCl МПД

- нестероидное противовоспалительное средство

- изотонический раствор натрия хлорида

- минимальная пирогенная доза

Подписано в печать 18.11.2014 г. Формат 60x90 '/16. Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 97.

Отпечатано в ГОУ НПО ПЛ № 12 170023, г. Тверь, Ремесленный пр-д, 5