Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патофизиологические основы фармако-токсического действия производных цинхониновой и 3-аминоакриловой кислот и аспирамина

5 ОД

»* *■

О V.

J .

На правах рукописи

Коньшина Татьяна Михайловна

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФАРМАКО-ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ цинхониновой и 3-АМИНОАКРИЛОВОЙ КИСЛОТ И АСПИР АМИНА

14.00.16 - патофизиология 14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4

Пермь-1996

Работа выполнена на кафедре фармакологии Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель - доктор медицинских наук.

профессор А.С.Закс

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор И.Ф.Елькин; кандидат медицинских наук, доцент Б.А.Баргтейл

Ведущее учреждение - Московский государственный медицинский университет им.Н.И.Пирогова

Защита состоится " Ь " ШОМ-&- 1996г. в .часов на заседании специализированного совета К 084.09.01 при Пермской государственной медицинской академии (614000, г.Пермь, ул.Куйбышева,39).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии!

Автореферат разослан " № "

Ученый секретарь диссертационного совета К 084.09.01 доцент

Р.С.Кузяев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Воспаление, рассматриваемое как защитно-приспособительная реакция организма на повреждение, вместе с тем как самокатализирующий процесс может быть в определенных условиях несовершенным и относительно целесообразным. Этим определяется необходимость активного вмешательства человека в ход воспалительной реакции (Чернух А.М., 1979).В настоящее время практическая медицина располагает эффективными нестероидными противовоспалительными средствами (НПВС): напроксеном, ортофеном, пироксикамом и др. Обилие существующих противовоспалительных средств вполне оправдано ва-эиабельностью течения воспалительной реакции и ее чувствительностью к различным препаратам у отдельных людей. Очень часто применение НПВС приходится ограничивать из-за присущих им побоч-щх эффектов (Сигидин Я.А. и др.,1988; Тринус Ф.П. и др.,1987; Пварц Г.Я., 1988.; Шварц Г.Я.,Сюбаев Р.Д.,1988; Клебанов 3.М.,1992; Бондарев А.И., Зарудий Ф.С..1994). Учитывая, что воспаление сопровождает 80% всей патологии человека, в целом это оп-эеделяет актуальность дальнейшего поиска НПВС среди производных различных химических классов, а также оптимизацию уже известных зеществ, отличающихся от существующих более высокой активностью, жзкой токсичностью и хорошей переносимостью.

В плане поиска представляют интерес производные хино-гщн-4-карбоковой (т.е. цинхониновой) кислоты, среди которых найдены соединения, проявляющие разнообразную фармакологическую активность, в том числе умеренную анальгетическую, противовоспалительную, жаропонижающую, антигистаминную, противомикробную и др. [Янбориссва O.A. и др..1990,1991; и др.). Кроме того; производив хинолина хлорохин, плаквенил с успехом применяются в терапии фонических воспалительных процессов типа коллагенозов (Бибикова \ И.. Сигидин Я.А.,1974; Харт Ф. и др..1986; Гуцуляк Б.М.,1972).

В плане оптимизации широко применяемого средства со .00-летним "стазкем"-ацетилсалициловой кислоты (АСК) - необходимо юлучение ее водорастворимых форм, характеризующихся меньшей ^астротоксичностью, большей активностью, пригодных для паренте-зального введения (Бондарев А.И. .Зарудий Ф.С.,1994;Хаджай Я.И. и ip., 1988; Shah К. et al., 1986; Рудакова И.П. и др., 1991).

До настоящего времени оригинальная отечественная водораст-

воримая АСК не выпускается. Особое внимание привлекает в эти плане водорастворимый аспирамин, созданный в Иркутске под руководством академика М.Г. Воронкова. Ранее в экспериментах на животных на кафедре фармакологии ПГМИ (Красильников С.А.,1993) было показано активное влияние аспирамина на агрегацию тромбоцитов, состояние свертывающей и противосвертывающей систем, возможность его инъекционного и перорального применения. Остаетс. открытым вопрос выраженности его специфических противовоспалительных, анальгетических свойств, а также исследование его хронической токсичности.

Материалы экспериментального изучения фармакологической ак тивности и токсичности аспирамина войдут в качестве основных пр; представлении вещества в фармкомитет.

Целью настоящего исследования явились поиск противовоспали тельных соединений среди новых производных цинхониновой и 3-ами ноакриловой кислот, вьивление наиболее перспективных для практи ки веществ, установление зависимости активности от химическо: структуры и выработка рекомендаций для дальнейшего синтеза высо коэффективных и малотоксичных веществ, а также изучение фармако логических и патофизиологических свойств оригинальной водораст воримой формы АСК-аспирамина.

К числу конкретных задач относились:

1. Проведение скрининга 70-ти новых производных цинхонино вой и 3-аминоакриловой кислот на наличие среди них соединений обладающих флоголитической активностью.

2. Анализ связи противовоспалительного эффекта исследован ных веществ и их химического строения.

3. Определение анальгетической активности наиболее сильны флоголитиков.

4. Изучение острой токсичности наиболее перспективных и исследованных соединений.

5. Выяснение некоторых сторон механизма и спектра противо воспалительного действия наиболее активных антифлогистиков с ха рактеристикой их взаимодействия с медиаторами воспаления.

6. Изучение противовоспалительной активности аспирамина пр различных видах острого и подострого воспаления, изучение ег обезболивающего действия.

7.Исследование хронической 6-месячной токсичности аспирами

Научная новизна

Впервые изучена противовоспалительная активность 70 новых производных шнхониновой и З-аминоакриловой кислот и показано наличие флоголитиков в этом ряду соединений. Выявлена зависимость наблюдаемых эффектов от химической структуры и тем направление дальнейшего целенаправленного синтеза указанных производных. Углубленно исследованы перспективные вещества с ярковыра-женкыми анальгетическими и противовоспалительными свойствами, не уступающие по силе действия вольтарену и напроксену.

Впервые изучена хроническая 6-месячная токсичность, противовоспалительная и анальгетическая активность оригинальной водорастворимой формы АСК-аспирамина.

Теоретическая и практическая ценность

В теоретическом плане ценность работы определяется тем, что она значительно расширяет существующие представления о Фармакологии неизвестных ранее производных хинолина и З-аминоакриловой кислоты и устанавливает дополнительные закономерности по части связи структуры и действия, которые могут быть использованы при дальнейшем целенаправленном поиске соединений с противовоспалительной активностью. Определение особенностей влияния исследуемых веществ при различных методах инициации воспаления и анальгезии может способствовать выяснению механизмов формирования этих экспериментальных патофизиологических моделей.

В практическом отношении значимость работы связана с отбором трех перспективных для практики производных цинхониновой кислоты, нуждающихся в углубленной разработке с целью выяснения как можно более широкого спектра фармакологического действия и, возможно, дальнейшего представления в фармкомитет МЗ России.

Несомненна также практическая ценность исследования аспира-мина, находящегося на последнем этапе доклинического изучения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Производные цинхониновой и З-аминоакриловой кислот обладают противовоспалительной и анальгетической активностью при малой или умеренной токсичности. Активность соединений связана с нормализацией патофизиологических механизмов воспаления.

2. Для развития противовоспалительного действия наиболее благожелательным является наличие в молекуле вещества фрагмента цинхониновой кислоты со свободной или амидированной карбоксиль-

ной группой, а также ароматического заместителя в амидной или аминогрупп(Зе при атоме С2 хинолинового цикла. Введение ароклпиру воильного остатка приводит к значительному усилению противовоспалительной активности (ПВА). Среди амидов 3-аминоакриловой кислоты наиболее сильно ПВА выражена у соединений с пара-толильными радикалами в амидной группе.

3. Аспирамин - оригинальный отечественный препарат АСК, который отличается от последней водорастворимостью, отсутствием гастротоксичности, лучшей переносимостью в условиях 6-месячного экспериментального применения при равной выраженности антизкссу-дативных. антипролиферативных и обезболивающих свойств.

Апробация работы. Фрагменты диссертации доложены на: итоговых научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Пермского фармацевтического института (1993,1994, 1995), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство (Москва,1995), Всероссийской студенческой научной конференции (Москва,1994), I съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград,1995).

Публикации. По фрагментам диссертации опубликовано 12 работ: 4 статьи и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора ли0тературы, описания материалов и методов исследования изложения результатов собственных экспериментов, заключения, содержащего обсуждение результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 179 страниц машинописного текста, иллюстрирована 31 таблицей, 7 рисунками. Библиографический указатель включает 258 источников, из которых 74 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты проведены на 500 белых беспородных крысах и 580 белых беспородных мышах. Объектами исследования являлись 70 производных цинхониновой и 3-аминоакриловой кислот, синтезированных на кафедре биохимии Пермской фармацевтической академии.

В качестве скрининговой модели воспаления использовали артрит, вызванный субплантарным введением в заднюю лапу крыс 0,1 мл 0,5% раствора каррагекина (Winter С.A. et al. ,1962).Все исследуемые вещества в дозе 50 (реже 25) мг/кг вводили внутрибрюшинно за 1 час до воспроизведения воспаления (Метод, рекомендации фарм-комитета МЗ СССР,1989).Наиболее активные соединения были испыта-

ны в меньших дозах: 25,10,5,1 мг/кг, а также при введении per os.

Механизм противоэкссудативного действия перспективных веществ изучали по нескольким моделям острого асептического воспаления. Отек вызывали инъекцией под плантарный апоневроз 0,1 мл 6% раствора декстрана, 0,01% раствора серотонина, 0,1% раствора гистамина. При выборе методов исследования особое внимание уделено способам, раскрывающим не только сам по себе противовоспалительный эффект, но и дающим представление о возможном влиянии исследуемых веществ на разные патофизиологические этапы развития воспалительной реакции. Интенсивность экссудации оценивали по изменению объема воспаленной конечности, проводя онкометрию до начала опыта, через три и пять часов после инъекции каррагени-на; через 15,30,45,90 и 180 минут после введения декстрана,серотонина, гистамина.

Антипролиферативный эффект наиболее перспективных соединений VI116,1Хв и аспирамина изучали на модели "бумажной гранулемы".

Вещество VI116 было изучено на модели адъюзантного артрита у крыс, который вызывали субплантарной инъекцией в правую заднюю лапу 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда-взвеси 5 мг БЦК КЭМ СССР в 1 мл вазелинового масла (Саратиков А.е.,1983).

А0нальгетическая активность исследована по методике уксусных "корчей" (Cashin С.Н.,1977) на белых мышах. Уксусную кислоту вводили в виде 0,75% водного раствора внутрибрюшинно в объеме 0,25 мл. Подсчет числа "корчей" начинали сразу после этого и проводили в течение 10 минут. Исследуемые вещества вводили за 1 час до альгогена через желудочный зонд, реже в/брюшинно (в другую половину живота) или внутримышечно в дозах 50,25, иногда Юмг/кг. Эффект оценивали по уменьшению в процентах числа "корчей" по сравнению с контрольными животными.

Острую токсичность определяли для соединений, показавших активность при скрининговых исследованиях. Вещества вводили внутрибрюшинно мышам, LD50 подсчитывали по таблицам (Прозоровский В.П.,1980,1992). У этих же соединений расчитывали терапевтический индекс, которым является частное от деления LD50 на ЕД50.

Хроническая токсичность аспирамина исследована с его применением в дозах 1/3 и 1/4 ДЛ-50. По ходу эксперимента характеризовали через 1. 3 и 6 месяцев:

- общ0ее состояние, поведение животных, ориентировочно-исследо-

вательские реакции крыс, динамику массы тела,

- морфологический состав периферической крови, содержание гемоглобина, состояние свертывающей системы крови (методом электроко-агулографии),

- функциональное состояние печени по данным сулемовой, тимоловое проб, по активности в сыворотке крови щелочной фосфатазы .алани-новой и аспарагиновой трансаманаз, по содержанию в сыворотке крови общего белка и общего холестерина*,

- содержание глюкозы в крови, функциональное состояние почек при использовании водной нагрузки с определением суточного диуреза, содержания в моче белка, сахара, креатинина , pH мочи.

По истечении 6 месяцев под эфирным наркозом крыс забивали, внутренние органы исследовали гистологический расчитывали их весовые коэффициенты.

Полученные результаты обрабатывались статистически (р<0,05) с использованием критериев Стьюдента и Вилкоксока-Ман-на-Уитни (Беленький М.Л.,1971; Гублер Е.В, Генкин A.A.,1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Найдено, что противовоспалительной активностью обладают 5G из 70 (76%) исследованных соединений (табл.1). В дозе 50 мг/кг 13 соединений тормозят развитие воспалительного отека на 51-60%, 4- более чем на 60%. Поскольку во всех этих случаях воспаление подавлялось более чем вдвое, условно можно принять эту доз:* по-меньшей мере за среднеэффективную. В таком случае получится, что по-меньшей мере 17 из изученных веществ выдерживают сравнение не только со старыми НПВС типа АСК, бутадиона, амидопирина у анальгина, но и с более современными ибупрофеном и капроксеноь Еще 23 соединения (33%) в дозе 50 мг/кг действуют умеренно, тормозя экссудацию на 36-50%.

В целом, потенциал исследованных веществ достаточно высок. Флоголитическое действие присуще всем 2-ариламиноцинхонино-вым кислотам (I), три из которых тормозят каррагениновый отек не 57-60%. Следует отметить, что у большинства амидов 2-анилиноцин-

*-благодарность д. б.н.В.М.Аксеновой и ст. науч. сотр. Т.Р.Тюленевой

биохимии, отдел ЦНИЛ ПГКА; ** -благодарность д. м.н.,проф.Н.С. Ефимовой, каф.патанатомии ПГМА.

ТАБЛИЦА 1

Распределение соединений но выраженности их противовоспалительной активности

Группа соединений кол- активных активность подавления каррагенинового отека

во ве- веществ (исследованные вещества вводили в/бр в дозе50 мг/кг)

шифр название ществ в груп кол-во % низкая 25-35% умеренная 36-50% достаточная 51-60% высокая >60%

пе кол-во % кол-во % кол-во % кол-во %

1а-д 2-ариламиноцинхониновые кислоты 5 5_ 100 21 40 З1 60

11а-з замещенные амиды 2-оксоцинхониновой кислоты 8 б 75 1 13 2 25 3 38

Ша-в амиды 2-гидразино-иинхониновой кислоты 3 1 33 1 33

1Уа-т амиды 2-|3-ацилгидразиноцинхониновой кислоты 4 3 75 I2 25 2 50

Уа-г амиды 1,2,4-триазоло[4,3-а]-х1шолин-9-карбоновых кислот 4 2 50 1 25 1 25

\1а-в амиды 1,2,3,4-тетразоло[4,3-а]-хинолин-9 карбоновых кислот 3 2 67 1 33 1 33

УИа-д гидразиды 2-арил(пиридил)аминоцинхо-нииовых кислот 5 4 80 3 60 1 20

\'Ша-в гидразиды 2 ариламиноцинхониновых кислот 3 2 67 1 33 1 33

1Ха-г Р-ароилпирувоилгидразиды 2-арилами-ноцинхониновых кислот 4 4 100 21 50 2г 50

Ха-ж этиловые эфиры и нитрилы М-замещенных (4-карбамилхинолин-2-илиден)циануксусной кислоты 7 5 71 4 57 1 14

Х1а-з амиды-З-гетериламино-2-этокси-карбонил-акриловой кислоты 8 7 88 1 13 5 62 1 13

ХПа-л амиды З-ациламино-2-этоксикарбонияакрияовой кислоты 11 8 73 3 27 4 36 1 9

ХШа-д ариламиды 2-ацетил-и 2-ариламинокарбонил-З-гетериламиноакриловой кислоты 5 4 80 1 20 2 40 1 20

всего: 70 53 76 13 19 23 33 13 19 4 6

'-соединения 16,в,д изучены в дозе 100 мг/кг ; г-соединения 1Уб и 1Ха,б,в,г изучены в дозе 25 мг/кг

хониновой кислоты флоголитический эффект проявлялся умереннс (Янборисова 0.А.,1990). Это согласуется с известными представлениями о значении свободной карбоксильной группы для противовоспалительного эффекта (Тринус Ф.П.,1987).

Аналогичное влияние проявилось при введении свободной карбоксильной группы в производные гидразидов 2-ариламиноцинхонино-вых кислот, т.к. было получено высокоактивное соединение (УШб;

Все 4 исследованные нами ¡3-ароилпирувоилгидразида 2-арила-миноцинхониновых кислот (IX) умеренно или сильно подавляли кар-рагениновое воспаление. Ранее амиды 2-ариламиноцикхониновых и 2-бензоилгидразиноцинхониновых кислот (Янборисова 0.А. и др., 1990-91) действовали противовоспалительно умеренно, нами обнаружена хорошая флоголитическая активность среди амидов 2р-ароилпи-рувоилгидразиноцинхониновой кислоты (IV),причем два из последню соединений предотвращают воспаление более чем на 60%.

Таким образом,введение ароилпирувоильного остатка в гидра-зинную группу амидов 2- гидразиноцинхониновой кислоты (соединения Пб-г) или в гкдразидный остаток гидразидов 2-ариламиноцин-хониновой кислоты (соединения 1Ха-г) сопровождается значительны} ростом антиэксоудативного эффекта. Возможно, это определяете наличием внутримолекулярных водородных связей, что характернс для многих НПВС.

Высок процент эффективных веществ среди амидов 2-оксоцинхо-ниновой кислоты (II), 63% из которых действовали сильно или умеренно.

Обращает внимание наличие у них фрагмента 2-хинолона, коте рый из-за полярности и электростатического притяжения может реагировать с белками, рецепторами, оказывая биологическое действие

Известно участие кининогеназь; и всей калликреин-кининово! системы в генезе воспаления. Ингибиция кининогеназы является одним из вероятных механизмов действия противовоспалительных веществ (Г.Я.Шварц,1988). У обнаруженных нами высокоактивных веществ типа Ив, г, 1X6, в, Х1д, ХПе, ХШа налицо гидразидные, амидные и сложноэфирные группы, структурно схожие с пептидно! связью белков, что открывает возможность их взаимодействия с активными центрами протеиназ.в частности, с кининогеназами и конкурентное ингибирование последних. Косвенным подтверждением такого предположения служит обнаруженная нами потеря противовоспа-

- и -

лительной активности соединений Ив и IX б при их пероральном введении крысам.Не исключена вероятность связывания этих веществ с активными центрами протеиназ желудочно-кишечного тракта животных, приводящая к гидролитическому расщеплению соединений и исчезновению их фармакологических эффектов.

Среди амидов триазоло- и тетразоло- хинолин-Э карбоновых кислот относительно высокая флоголитическая активность присуща лишь соединениям Уа и ¥16,т.е. подобного рода сочленения молекулы амидов цинхониновой кислоты не обязательно определяют появление противовоспалительных свойств.

Соединения групп III,VII,X лишь слабо угнетали воспалительный отек. Амиды 3-аминоакриловой кислоты действовали умеренно, лишь 3 из них (Х1д, ХШа, ХПе) активнее амидопирина ослабляли воспаление, хотя все они, в т.ч. и более слабые содержали по две внутримолекулярные водородные связи, что считается перспективным в отношении противовоспалительной активности.

Полученные результаты вскрыли малую перспективность поиска противовоспалительных веществ среди соединений с карбамильнкми, этоксикарбамильными остатками, а также ацильных производных 3-аминоакриловой кислоты.

Из 70 исследованных веществ 20 было отобрано для углубленного изучения. У 6 соединений ЕД50 равняется 20-30 мг/кг, а еще у трех- 4-10 мг/кг, это последнее соответствует активности нап-роксена и вольтарена (табл.2).

О специфичности полученного эффекта свидетельствует, в первую очередь, его зависимость от дозы изучаемого вещества. Она, одноко, установлена лишь у 16 соединений. Внутркбрюшинное введение 9 из них выявляло прямолинейную зависимость "доза-эффект".

Из трех апробированных соединений (Г/в, \'Шб и 1X6) лишь у 1/П16 активность сохранялась и при введении через рот. Это дополнительный показатель специфичности эффекта, тем более, что сопровождается четкой закономерностью зависимости действия от дозы для УШб. Впрочем, сама по себе выраженность фармакологической активности при введении веществ в желудок еще не является строгим доказательством специфичности этого действия, поскольку его исчезновение может быть связано с разрушением вещества.

Известно,что перспективность новых соединений во многом определяется их преимуществами перед существующими. В связи с этим

ТАБЛИЦА;

- 13 -

_ТАБЛИЦА2 (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

1 2 3 4 5 6

10 Уа соыс0^5 I С2н5 М н СОЫНС6Н3С12-2'4 30 43< 200

11 VI б 1 1 70 >250

12 УШб СОЫНМ-^С(СНз)СООН II 1 н - —сн3 10 42' 30" 100

13 1Ха С СОЫНЫНСОСОСН2СОС6Н4С1-4 М55^МН2С6Н4ОСН3-4 «25 67 523 >400

14 1X6 С СО(\1Н1\1НСОСОСН2СОС6Н5 ^^Ы^^МНгСбНлОСНз-г СОМНЫНСОСОСН2СОС6Н4СН3-4 10 79 >800

15 1Хв с N 74НС6Н5 20 90 >400

16 1Хг с СОЫНМНСОСОСН2СОС6ЩСН3-4 л »3 0 56 703 >400

17 Хв С^Хг 7 сы н >400

18 Х1д N =\ СООС2Н5 )>-N Н С Н —С ^ —у С О N НС 6Нз-4 =50 25г 300

13 XI 1е с -^снсоынсн—с-'СООЕ' _1| ОН СОЫНС6Н3СНз-4 4 40 40г >400

20 ХШа < —N. СООЫНС6Н4СНэ —мнение' ^ СОМНСбН4СН3-4 «54 - -

з/бр, в дозе 25 мг/кт; 3-п/к; 2-рег 05, в дозе 50 мг/кг; 4-рег ов, в дозе 25 мг/кг

принципиально, что апробированные вещества обладают малой токсичностью. ЬВ50 большинства наиболее эффективных соединений превышает 400-800 мг/кг. Исключение составляет самое активное соединение УШб, Ь050 которого 100 мг/кг, оно принадлежит к умеренно токсичным.Соответственно,терапевтические индексы некоторых веществ выше идентичных показателей существующих НПВС (рис.1).

Для общего действия изучаемых соединений в высоких дозах характерно угнетение центральной нервной системы, развитие дремотного состояния или даже наркотического сна, миорелаксация и вестибулярные нарушения, т.е. признаки интоксикации НПВС. Для отдельных веществ (Хг,д) характерно противосудорожное действие, обнаруженное в экспериментах на мышах по методу максимального электрошока. Некоторые, напротив, вызывают тремор, повышение мышечной ригидности.

На основании вычисления среднеэффективных по каррагенинозо-му отеку доз определены 3 вещества (Ив, ИП6, 1X6) для более углубленного исследования, выяснения спектра и механизма противовоспалительного действия.

Широко известно отсутствие какой-либо единой модели воспалительной реакции, применение которой могло бы ограничить отбор противовоспалительных средств. Известно, что основными медиаторами каррагенинового воспаления являются РС, особенно на пике отека, т.е. начиная с 3-го часа после введения флогогена. Способность апробированных нами соединений подавлять эту фазу воспаления дает возможность предполагать их антипростагландиновый эффект.

Определенное представление о возможных механизмах действия обнаруженных противовоспалительных средств было получено путем их апробации на моделях различного хорошо изученного генеза. Поскольку известно, что генез декстранового воспаления связан с дегрануляцией тучных клеток и базофилов с выбросом оттуда гиста-мина, серотонина и других медиаторов воспалительной реакции, способность соединения 1X6 значительно, подавлять отек на субп-лантарное введение декстрана отражает его стабилизирующее влияние на мембраны указанных клеток и свидетельствует об антиальте-ративном эффекте. Несколько слабее (на 30-40%) подавляло это соединение воспаление, вызванное инъекцией гистамина или серотонина, что говорит о возможном блокирующем его действии на соот-

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

16

16

5 5 °

-О.,

& а

46

>16

>20

>100 жМ

16

>16

1

ifi

>80

Рис 1. Терапевтические индексы (ЛД5о/ЕД5о по ПВА) наиболее активных веществ и препаратов-эталонов

Рис. 2. Терапевтические индексы (ЛД5о/ЕД5о по "уксусным корчам") наиболее активных соединений и препаратов-эталонов

ветствующие рецепторы. Это, в свою очередь, расширяет представления о патофизиологии каррагенинового воспаления, создавая базу для предположений об участии гистамина и серотонина в его генезе Антисеротониновый эффект как компонент флоголитического действия исследуемых веществ имеет, однако, ограниченный характер с учетом незначительной роли серотонина как медиатора воспаления у людей. 3 целом же все эти факторы достаточно иллюстративны для утверждения наличия у изучаемых соединений четкого антиэкссуда-тивного эффекта.

При моделировании хронического воспаления оказалось,что ан~ типролиферативный эффект присущ лишь соединению УШб, тогда как 1Хв его лишено. Принципиально важно, что УШб действовало при пероральном пути введения.

Таким образом,с помощью разных моделей воспаления ориентировочно установлено,что механизм противовоспалительного эффекта исследованных веществ на примере наиболее активных, соединений включает: актипростагландиновое действие, противодействие кини-нам, антагонизм с медиаторами ранних фаз воспаления (гнетами-ном, серотонином), влияние на биологические мембраны, веществу УШб присуще антипролиферативное действие.

Суждение об антипростаглакдиновом механизме действия подтверждают результаты изучения анальгетической активности по тесту "уксусных корчей", генез которых связывают именно с высвобождением и действием простагландинов (Либина 3.В.,1988). 22 из 28 апробированных соединений в дозе 50 мг/кг уменьшают число корчей более чем на 30%, причем у 14 из них наблюдается параллелизм противовоспалительного и анальгетического эффектов (табл.2). Последний развивался как при в/брюшинном так и при пероральном применении.

4 соединения (Пг, УШб, ХПе в дозе 50 и Уа в дозе 25 мг/кг) при применении через рот, а соединение 16 в дозе 50 мг/кг при внутрибрюшинном введении уменьшают уксусные "корчи" у белых мышей на 40-49%, т.е. не уступают по силе болеутоляющего действия амидопирину, АСК, бутадиону, ибупрофену.

Сильнее действовали еще 9 соединений: 1д,1Уб-г,Па-г при в/брюш., а Не при в/желуд. введении. В дозе 50мг/кг они снижали число корчей на 56-90% т.е. по выраженности эффекта превосходя такие эталоны как анальгин и напроксен, приближаясь к ортофену.

Таблица 3

Соединения, проявившие хорошую анальгетическую активность,

но не показавшие достаточной ПВА

оеди- 16НИЯ Формула % торможения "уксусных корчей" (рег ов 50 мг/кг) Ы>50, мг/кг % подавления карраг. воспаления (в/бр. 50 мг/кг)

116 г-О ^ /к ^ N О 1 н 44 16; 13

Ив СОКНСбНп-ЦИХЛо N О I н 54 27; 27

Из СОЫН—антипирил N О I Н 40; 50« 17; 26

Шв СОЫНС6Н3(СН3)2-24 59 >400 26; 36

/На СОГ\1НЫНг гЛ __ —У у— Вг 393) 49; 49

К1а /=\ СООС2Н5 *—N СОЫНС6Н4СНэ-2 65 >800 41

К1б /=\ хсоос2н5 £ ынсн-с ^—N СОШС6Н4СНз-4 532; 35 >800 32; 322> и 40")

Шл ,СООЕ1 Ж2СОМНСН—С СОЖСеН4СН3-4 41 >800 32; 344

"-в/брюш; 2)-25 мг/кг; 3>-в/м; 4>-10 мг/кг

В пользу этого заключения говорит и величина терапевтических индексов, особенно соединений IV и IX, отражающая безопасность веществ. Она превышает таковую напроксена, ибупрофена, приближаясь к ортофену (рис.2).

Интересной особенностью веществ IV и IX является наличие у них ароилшрувоильного заместителя, который, с учетом сказанного выше, определяет развитие не только противовоспалительного, но и анальгетического эффекта.

В доступной литературе неоднократно обсуждался вопрос о связи анальгетического эффекта НПВС не только с периферическим, но и центральным их действием. В пользу этого говорит и то, что в наших опытах обезболивающая активность обнаружена у соединений, не только обладающих высокой ПВА, но и у не проявляющих ее или умеренно активных флоголитиков (табл.3). Так среди производных цинхонкновой кислоты наибольшую анальгетическую активность наблюдали у амидов 2-оксо-цинхониновой кислоты (116, в, з), а также у 2,4-ксилидида -2-гидразино-(Шв) и гидразида 2-броманилино (Vila) цинхониновых кислот. Соединения 116,в, з и Шв уменьшали-уксусные "корчи" на 44-59% при пероральком, а VI- 1а-на 39% при внутримышечном введении. Среди производных амидов 3-аминоакрило-вой кислоты достаточно сильное болеутоляющее действие оказывают соединения Х1а,б и Х11л. У всех веществ этого ряда (Х1а-в,д,е, ХПл, ХШа), проявляющих анальгетический эффект, имеется орто-или пара-толильный заместители в амидной части молекулы. Изменение характера радикала при аминогруппе, а также замена сложноэ-фирной группы при атоме С2 на амидную существенно не сказывается на обезболивающей активности. Особенно ценно, что ориентировочные терапевтические индексы 4-х соединений (Шв, Х1а, б, ХПл) выше, чем у АСК и индометацина (рис.2).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что вещества IVb, VIII6, 1X6, обладающие сочетан-ной высокой обезболивающей и противовоспалительной активностью и низкой токсичностью, являются перспективными для дальнейшего изучения и могут пополнить группу НПВС.

Изучение активности и токсичности аспирамина

Исследовано влияние аспирамина на развитие отеков лап крыс, вызываемых каррагенином, серотонином, декстраном. Каррагениновая модель воспаления использована для установления зависимости эф-

фекта от дозы, определения среднеэффективной дозы, сравнения активности аспирамина и АСК. Аспирамин применялся перорально в дозах 200, 300, 400, 500, 800, 1000 мг/кг. Установлено, что ЕД50 аспирамина по каррагекиновой модели составляет 400 кг/кг. Сравнивая эту величину со среднеэффективной дозой АСК равной, 450 мг/кг, необходимо учитывать, что в аспирамине на долю АСК приходится лишь 67% вещества. Зто свидетельствует, что противовоспалительная активность аспирамина несколько превосходит или равна таковой традиционного лекарстза. Аспирамин, как к АСК, способен противодействовать провоспалителыюму влиянию серотоника. На модели 10-дневной "бумажной гранулемы" противовоспалительный эффект аспирамина в суточной дозе 400 мг/кг выражался в снижении экссудации на 39% и в уменьшении массы грануляционно-фиброзной ткани на 49%.

Обезболивающая активность аспирамина в дозе 300 и 400 мг/кг, обнаруженная на модели "уксусных корчей" идентична таковой АСК, учитывая содержание последней в аспирамине (ЕД50 аспирамина 400, а АСК 290 мг/кг).

Пероральное ежедневное введение аспирамина в течение 6 месяцев в дозах 100 и 300 мг/кг, не вызывало отрицательного воздействия на общее состояние, поведение, аппетит, функцию органов и систем, исследованных фармакологически и биохимически. Не повлиял аспирамин и на значение весовых коэффициентов внутренних органов и их гистологическую структуру. Поскольку одним из нежелательных эффектов аспирннотерапии является ульцерогенное действие, несомненным достоинством аспирамина является отсутствие у него гастротоксичности, подтвержденное гистологически.

Идентичность специфических свойств аспирамина и АСК, выявленная в экспериментах на животных, водорастворимость и отсутствие гастротоксичности аспирамина, наличие его оригинального способа синтеза, разработанного в Иркутске, подчеркивают целесообразность завершения доклинических исследований вещества для создания на его основе отечественного водорастворимого препарата АСК, пригодного для внутривенного и внутримышечного введения.

ВЫВОДЫ

1. Производные цинхониновой и 3-аминоакриловой кислот являются биологически активными веществами, с выраженным анальгетнческим и противовоспалительным действиями.

2. 53 из 70 изученных соединений- (т.е.76%) обладают противовес палительной активностью по каррагенинозому тесту, причем 1 выдерживают сравнение с ибупрофеном и напроксеном, а 3 вещест ва - с индометацином и ортофеном (1Ув, УШб, 1X6}.

3. Механизм противовоспалительного действия включает: антипрос, тагландиновый эффект, противодействие кининам, антагонизм медиаторами ранних фаз воспаления (гистамином. серотонином), влияние на биологические мембраны. Наиболее эффективному ве ществу (УШб) присуще антипролиферативное действие.

4. Обезболивающее действие обнаружено у 22 веществ, причем у 7 и них анальгетическая активность высока и проявляется уменьшени ем болевой реакции на 56-90%, что сравнимо с эффектом ортофе на, напроксена, индометацина. У 14 соединений наблюдается па раллелизм между ПВА и анальгезией, что характерно для НПВС.

5. Большинсто эффективных веществ обладают малой токсичностью, : терапевтические индексы по противовоспалительной и анальгети ческой активности сравнимы с таковыми у лекарственных препара тов-эталонов.

6. При изучении зависимости между ПВА и структурой веществ най дено что:

- все наиболее активные соединения содержат фрагмент цинхони-новой кислоты со свободной или амидированной карбоксильно: группой, а также ароматические заместители в амидной или аминогруппе при атоме Сй хинолинового цикла;

- введение ароилпирувоильного остатка в амиды 2-гидразиноцинхо-ниновой кислоты или в гидразиды 2-ариламиноцинхониновых кислот приводит к появлению или значительному повышению ПВА;

- ПВА амидов з-аминоакриловой кислоты, наиболее сильно выражен у соединений с пара-толильным радикалом в амидной части моле кулы при наличии различных заместителей при атоме С2 и 2-ши 4-пиридильного остатков или остатка миндальной кислоты прз аминогруппе.

7. Для дальнейшего углубленного фармакологического изучения рекомендуются соединения № (ортоанизидид 2-(¡5-бензоилпируво-илгидразино)цинхонинозой кислоты); УШб (1-карбоксиэтили-ден)гидразид 2-(п-толуидино)цинхониновой кислоты) и IX; ((3- (пара-толуоилпирувоил) гидразид 2- (орто-анизидино) цинхони-новой кислоты, обладающие высокой противовоспалительной ]

анальгетической активность® при низкой токсичности.

8. Аспирамин будучи производным ацетилсалициловой кислоты, обладает всеми особенностями ее действия, в частности совокупностью антиэкссудативных (каррагениновый, серс-тониновый отеки), антипролиферативных ("бумажная гранулема") и обезболивающих ("уксусные корчи") свойств. Среднеэффективные дозы аспи-рамина по каррагениновому тесту и по методам "бумажной гранулемы" и " уксусным корчам" совпадают и равны 4.00 мг/кг, что соответствует или несколько превышает активность АСК.

9. В условиях ежедневного введения через рот в дозах равных 1/3 и 1/4 DL50 в течение 6 месяцев аспирамин не оказал неблагоприятного влияния на функцию и морфологию органов и систем животных. Положительным отличием аспирамина от АСК является отсутствие гастротоксичности, что объединяет аспирамин с зарубежными водорастворимыми производными АСК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Михалев А.И.,Суслина М.Л., Коныяина Т.М.,Закс А.С.,Коньшин М. Е. Синтез,противовоспалительная и анальгетическая активность амидов З-гетериламино-2-этоксикарбонилакриловой и 4-оксопиридо [1,2-а]пиримидин-3-карбоновой кислоты//Хим.-фармац.журн.-1995. - N5.-С.39-40.

2. Янборисова O.A., Коньшина Т.М., Работников Ю.М., Закс A.C., Коньшин М.Е. Синтез и противовоспалительная активность 2-арила-миноцинхснинозых кислот и амидов 1,2-дигидро-2-оксоцинхонино-вой кислоты //Хим.фармац. журн.-1995.-N6.-С. 32-33.

3. Михалев А.И., Суслина М.Л., Коньшина Т.М., Закс A.C., Коньшин М.Е. Синтез и биологическая активность N-ацильных производных амидов 2-карбэтоксиакриловой кислоты //Актуальные вопросы фармации. Межвузовский сборник научных трудов и материалы 51-й науч. -практич.конфер. Пермского фарминститута. -Пермь,1995.-С.13.

4. Михалев А.И., Коньшин М.Е., Коньшина Т.М., Закс A.C. Синтез и биологическая активность замещенных амидов 2-оксоцинхокиновой кислоты //Актуальные вопросы фармации.Межвузовский сборник научных трудов и материалы 51-й научно-практической конференции Пермского фарминститута.-Пермь, 1995.-С.12

5.Милютин А.В., Коньшина Т.М., Никифорова Т.В., Закс A.C., Чес-ноков В.П. Поиск биологически активных соединений в ряду амидов и гидразидов цинхониновой кислоты // Материалы докладов

50-ой научн.-практич. конфер. профессорско-преподавательского состава. -Пермь,1994.-С.15-16.

6. Михалев А.И., Ухов C.B., Коньшин М.Е., Суслина М. Л., Коньшина Т.М., Закс A.C. Синтез и противовоспалительная активность амидов 3-(2-пиридиламино)-2-карбэтоксиакриловой кислоты и амидов 4-оксопиридо [1,2-а]пиримидин-3-карбоновой кислоты //Материалы докладов 50-ой научн.-практич. конфер. профессорско-преподавательского состава. -Пермь., 1994. -С. 17.

7. Михалев А.И., Суслина М.Л., Коньшина Т.М., Закс А.С.,Коньшин М.Е., Оводенко Л.А., Янборисова O.A. Синтез, анальгетическая и противовоспалительная активность конденсированых производных пиридина, содержащих мостиковый атом азота //Тезисы докладов II Российского национального конгресса "Человек и лекарство". -М, 1995. -С. 18.

8. ЗакировМ.Р., Зуева М. В., Михалев А.И., Коньшина Т.М., Голдо-бина Г.В. Синтез и противовоспалительная активность N-(2,6-ди-метокси-4-пиридил)производных енаминокарбонильных соединений// Тезисы докладов Всероссийской студенческой конференции.-М., 1994. -ч. 1. -С. 128.

9. Михалев А.И., Закс A.C., Терехова H.М.,Коньшина Т.М. Синтез и биологическая активность З-гетериламино-2-цианакриламидов и амидов З-аминопиразол-4-карбоновых кислот //Сборник тезисов 49-ой научно-практич.конфер. профессорско-преподавательского состава.-Пермь.1993.-С. 104.

10. Коньшина Т.М..Болотская Н. В. Зуева М.В. Изучение противовос-палительой активности и хронической токсичности аскамина -новой водорастворимой формы ацетилсалициловой кислоты//Фун-даментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Тезисы докладов 1-го съезда Российского научного общества фармакологов. Волгоград, 1995. -Москва, 1995. -С. 202.

11. Михалев А.И., Суслина М.Л., Коньшина Т.М., Закса A.C., Коньшин М.Е. Синтез и биологическая активность N-ацильных производных 3-амино-2-этоксикарбонилакриламидов//Хим.фармац. журн. -1996. -Ni. -С.34-35.

12. Янборисова 0. А., КоньшинаТ. М., ЗаксА. С.,МихалевА.И.,КоньшинМ.Е Синтез и биологическая активность амидов 2-гидразиноцинхонино вой.1,2,4-триазоло[4,3-а] и 1, 2,3,4-тетразоло[4,3-а] хинолин-карбоновых кислот кислоты//Хим. фармац.журн.-1996.-N3.-С. 52-53