Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Противовоспалительная активность новых производных 2-аминотиазолов и 2-амино-1.3.4-тиадиазолов

На правах рукописи

□0306766 1

САДИКОВА ЗАРИИТУСТАЕВНА

ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 2-АМИНОТИАЗОЛОВ И 2-АМИНО-1.3.4 - ТИАДИАЗОЛОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Старая Купавна 2006

003067661

Работа выполнена в отделе фармакологии Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ и Краснодарского филиала Южного Бюро РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ковалева Виолетта Леонидовна

кандидат медицинских наук, доцент Галенко-Ярошевский Владимир Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович

Ведущая организация; Российский государственный медицинский университет им. Н. А. Семашко

Защита состоится « » 2007 _г. в __ часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01 во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (142450, Московская область, пос. Старая Купавна, ул. Кирова, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте ВНЦБАВ

Автореферат разослан «...»__2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема терапии хронических воспалительных заболеваний различного генеза (в первую очередь, воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата) и сегодня остается одной из самых напряженных и трудноразрешимых проблем практической медицины. Центральное место в базисной терапии указанной патологии по-прежнему занимают нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), которые относятся к группе наиболее широко используемых лекарственных средств [Насонов E.J1., 1996, 2002. 2005]. С 1970 года синтезировано около 40 новых НПВП, но ни один из них не лишен побочных эффектов. Смертность у больных, госпитализированных по поводу НПВП-индуцированных желудочно-кишечных кровотечений, колеблется от 5 до 10% (0,22% в год) [Laporte, Ibanez, Vidal et al., 2004; Шостак Н.А.,Рябкова A.A и др. 2003]. В США, например, 13 миллионов пациентов, страдающих разными формами заболеваний опорно-двигательного аппарата, получают НПВП на регулярной основе. По прогнозу, у 103000 из 13 млн пациентов могут развиться тяжелые требующие госпитализации осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта [Boers, 2003; Насонов E.JL, 2005]. В США смертность от НПВП-индуцированных поражений желудочно-кишечного тракта такая же, как от СПИДА, и занимает 15 место среди самых частых причин смерти. Создание нового поколения НПВП -селективных ингибиторов ЦОГ2 - существенно снизило риск тяжелых поражений ЖЕСТ, однако проблема побочных эффектов НПВП не утратила свой злободневности.

Все вышесказанное стимулирует поиск новых химических соединений с высокой противовоспалительной и анальгетической активностью в других химических классах. Одним из наиболее интересных с точки зрения высокой биологической активности и безопасности является класс 2- аминотиазолов. Исследования, проводимые в последние годы, показали, что соединения этого класса проявляют бронхолитическую противовоспалительную, анальгетическую, антиоксидантную, противовирусную, антибактериальную, гепатопротекторную, антипролиферативную нейропротекторную и другие виды активности, отличаются большой широтой терапевтического действия [Kovaleva V,Geronikaki et al 2004; 2005; Schenone S. et al., 2006; Zhang et al., 2004; Aruna K, Rukkumani R et a., 2004; Shipps et al., 2005; Крылов И.А. 2005.]. Производные 1,3,4 - тиадиазолов также отличаются широким спектром фармакологических свойств. Среди них были обнаружены селективные ингибиторы фосфодиэстеразы (PDE7) [Vergne et al., 2004], анксиолитики и ангидепрессанты [Cierici et al, 2001], соединения с противомикробной активностью [Dogan et al.., 2002; Mamolo et al., 2003]. Разносторонняя биологическая активность, расшифровка молекулярных мишеней для некоторых соединений побудили нас продолжить поиск в рядах 2-аминотиазолов и 1.3.4 -тиадиазолов с целью выявления наиболее активных химических структур и изучения их биологических свойств.

Целью данной работы явилось изучение противовоспалительных и анальгетических свойств новых производных 2-аминотиазолов и 1.3.4-тиадиазолов для выявления наиболее перспективных соединений.

Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать в режиме скрининга противовоспалительную активность новых производных 2-аминотиазолов на моделях острого экссудативного воспаления

2. Исследовать в режиме скрининга противовоспалительную активность новых производных тиадиазолов на моделях острого экссудативного воспаления

3. Выявить в режиме скрининга обезболивающее действие новых производных 2-аминотиазолов в тестах уксусных корчей и горячей пластины

4. Оценить в режиме скрининга обезболивающее действие новых производных тиадиазолов в тестах уксусных корчей и горячей пластины

5. Оценить ульцерогенные свойства наиболее активных из исследованных соединений

6. Исследовать гипотермическую активность наиболее активных соединений

7. Исследовать влияние наиболее активных соединений на хроническое воспаление в условиях модели бронхоальвеолита.

Научння новизна и теоретическая значимость. В представленной работе впервые продемонстрирована противовоспалительная и анальгетическая активность новых оригинальных производных 2-аминотиазолов (1Ч-Гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-онов и 6-Алкокси-2-

аминобеш'отиазолов) и тиадиазолов (2-Амино-1,3,4-тиадиазолы). Наиболее выраженное ингибирующее влияние на острое экссудативное воспаление оказали 2 - аминотиазолиноны. Из этой группы соединений наибольшую активность проявили вещества с лабораторными шифрами А5, А1 и А2, АЗ. Кроме того, показано, что все три соединения, являющиеся по химической структуре 6-алкокси-2-аминобензотиазолами, обладают

противовоспалительной и анальгетической активностью. Наиболее эффективной из этой группы оказалась соль с ацетилцистеином (соединение ЭЗ). Полученные нами экспериментальные данные показали, что производные тиадиазолов в целом уступают по своей активности 2-аминотиазолам. Большинство соединений этой группы мало активно. Наиболее значительную активность проявило соединение под шифром С25.

Установлено, что по противовоспалительной активности соединения А5, А1 и А2, АЗ сопоставимы с индометацином и кетопрофеном, а по широте терапевтического действия сопоставимы с кетопрофеном и значительно превосходят индометацин. Кроме того, важное преимущество перед индометацином состоит в отсутствии у них ульцерогенных свойств. Соединение А5 обнаружило на модели бронхоальвеолита выраженное противовоспалительное действие, не уступающее по степени выраженности мелоксикаму.

Научно-практическая значимость работы. Проведенные нами исследования выявили у оригинальных производных 2-аминотиазолов и 1.3,4 - тиадиазолов (А5, АЗ, ЭЗ и С25) значительную противовоспалительную и обезболивающую активность, что дает возможность рассматривать полученные результаты

экспериментов как основу для дальнейших (фармакодинамических, токсикологических, фармакокинетических) исследований ХС с целью разработки на их основе потенциальных лекарственных препаратов. Новые соединения А5 и AI, являющиеся по структуре 2-аминотиазолинонами, выгодно отличаются от препаратов сравнения - индометацина и кетопрофена - рядом позитивных свойств: большой широтой терапевтического действия и отсутствием ульцерогенных свойств, что является большим преимуществом при лечении хронических заболеваний воспалительного генеза.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на III Международном конгрессе «Экология и дети». - 2006; 2-nd RUSSIAN- CHINESE INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE ON PHARMACOLOGY AND PHARMACY - CLINICAL PRACTICE -2006. - PERM.; докладывались и обсуждались на межлабораторных конференциях отдела фармакологии ВНЦ БАВ 2005-2006 г. и Краснодарского филиала Южного Бюро РАМН.

Публикация результатов исследования

По материалам исследования опубликовано 4 печатных работы. Основные положения, выносимые на защиту:

• Новые производные 2-аминотиазолов (Н-Гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-он и 6-Алкокси-2-аминобензотиазолы) и тиадиазолов (2-Амино-1,3,4-тиадиазолы) проявляют существенную противовоспалительную и анальгетическую активность в условиях моделирования острого и хронического воспаления и гипералгезии.

• Соединение А5 (адамантан-содержащее производное Ы-гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-онов на моделях острого воспаления и гипералгезии оказывает наиболее значительное антиэкссудативное и обезболивающее действие, по выраженности которого оно не уступает референтным препаратам - индометацину и кетопрофену, а по широте терапевтического действия превосходит их.

• Преимуществом нового соединения по сравнению с традиционными НПВП является отсутствие раздражающего влияния на слизистую желудочно-кишечного тракта при длительном использовании в больших дозах ( более 100 мг/кг).

• Новое производное 6-алкокси-2-аминобензотиазолов - соединение Э-3 эффективно ингибирует острое экссудативное воспаление и гипералгезию как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном введении (ЭД50 = 20,7 мг/кг), однако уступает по этим видам активности индометацину и кетопрофену.

• Представитель другого класса соединений - производное 2-амино-1,3,4-тиадиазолов под шифром С25 оказало значительное противовоспалительное и обезболивающее действие. Сравнение его противовоспалительных и анальгезирующих свойств с препаратами НПВП (индометацин и кетопрофен) показало, что это соединение менее активно по уровню ЭД50 = 22,8 мг/кг, но превосходит их по широте терапевтического действия.

• Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на .... Страницах машинописного текста и состоит из

введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов

собственных экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего ... источников. Диссертация иллюстрирована ... рисунками и ... таблицами.

Материалы и методы

В экспериментах были использованы 390 аутбредных белых крыс и 104 крысы породы Вистар самцы массой 250 -350 г., 240 аутбредных белых мышей самцов массой 20 - 25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария ВНЦ БАВ при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к воде и корму.

Все модели и методы, использованные в работе, были выполнены в соответствии с соответствующими Методическими указаниями по изучению фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, ФК РФ, Москва, 2005).

Объектом исследования явились: а) 12 новых производных 2-аминотиазолов, синтезированные под руководством проф. Смирнова Л.Д. (Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН) и проф. Героникаки А.(каф. фармацевтической химии, университет им. Аристотеля, Салоники) и б) 9 новых производных тиадиазолов, синтезированные под руководством проф.Скачиловой С.Я. и к..х..н. Кесарева О.Г. (ВНЦ БАВ). Строение вновь синтезированных соединений подтверждено элементным анализом и спектральными данными (ЯМР- и ИК-спектрами), индивидуальность - данными тонкослойной хроматографии.

Новые химические соединения были использованы в виде субстанций, которые в зависимости от степени их растворимости вводили животным либо в виде растворов, применяя стерильный физиологический раствор (ампулы 0,9%), либо в виде суспензии с твином 80 или 1% крахмалом (в случае внутрижелудочного) введения.

Характеристика исследуемых соединений Структурная формула

1. Al. А2. АЗ.А4, А5.А8. А9

оч

^-N

JTji

j Аг-^s N-Het

Ы-Гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-он _Example:_

б

—N //

И Л

(2-(Benzothiazol-2-yIamino)-5-beпzylidene-thiazol-4-oпe)

2. А6 и А7

Я

-М О

Ы-(замещенный тиазол-2-ил)амид ю-амино-алканкарбоновой

кислоты

3. Г-7. Э-3. Э-7

КО

Я'СООН

6-Алкокси-2-аминобензотиазолы, соли фармацевтически приемлемых кислот

4. ЛБК-1, ЛБК-2. ЛБК-З

N-N

II II

я—„с-к=сн

ои (Ж

С2н5

С-З.С-6.С-11, С-12.С-25

Я = Н, СН3

N-N AAN'R" R" НХ

с2н5 R = Н, СН3,

С-З.С-б. C-ll. С-12.С-25

N-N АЛн-* R" НХ

2-Амино-1,3,4-тиадиазолы, соли фармацевтически приемлемых кислот

Определение ориентировочной острой токсичности показало, что при использовании дозы 1000 мг/кг внутрибрюшинно и 2000 мг/кг внутрижелудочно гибель животных не была зарегистрирована.

В работе использованы следующие лекарственные препараты и вещества: индометацин - субстанция и таблетки (Берлин-Хеми); кетопрофен -таблетки (Лек); мелоксикам - Берингер Ингельхайм. Полный адъювант Фрейнда (Sigma); каррагенин (Sigma); гистамин гидрохлорид (Sigma), сефадекс G-25 (Sigma). Противовоспалительную активность соединений оценивали с помощью моделей острого экссудативного воспаления: Модель каррагенин-индуцированного отека лапы крыс [Winter et а 1., 1962]; модель ПАФ- и гистамин- индуцированного отека лап крыс [Ezeamuzie a. Umezurike., 1989.]. Влияние ХС на хроническое воспаление изучали, используя модель бронхоальвеолита у крыс Вистар (Kovaleva , Makarova et al., 1995; Макарова, Ковалева и др., 1996).

Оценку антиноцицептивной активности проводили с помощью моделей гипералгезии: теста «горячая пластина» [Woolfe G., cDonald A.D., 1944]; теста «уксусных корчей [Koster R., Anderson М., de Beer Е., 1951].

В работе были использованы следующие методы: гистологические, морфометрические, цитологические и метод оценки ульцерогенного действия веществ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов вариационной статистики, достоверность результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при 5% уровне значимости. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программы Stadia.

Результаты собственных исследований

Изучение противовоспалительной активности новых производных 2-ддш нот и азол о в и 2-амино-1,3,4-тгт&1тзоло8

Па 1 этапе работы в режиме скрининга был исследовано влияние соединений на острый экссудатавный отек лап крыс, вызванный каррагенином. Вещества вводили внутри же лудочко за 1 час либо внутрибрюшинно за 30 минут до введения каррагепина в дозах, эквимолярных 8 мг/кг индометацина

120 т—

1Ш —4

^ 9

$ 2 3 А 5 6 7 8 3 10 11 \t

Рис. 1 Влияние производных 2- амидотиазолов (замещенный бензклиден)-тиазол-4-оны) (в/бр, 10 мг/кг) на величину каррагенинового отека лалыкрыс. I -контроль, 2 -А1, Э -А2, 4 -АЗ, 5-А4, 6- А5. 7- А6, 8 -А7, 9 - А8. ¡0 - А9, 11-иидомегацин. *- р <0,01 по сравнению с контрольной группой

Как показано на рис.1, все тестированные соединения при внутри брюшин ном введении в дозе 8 мг/кг, эквимолярной индометацину, проявляют активность, выраженную в разной степени. Наиболее активным оказалось соединение А5 - торможение каррагенинового отека составило 62%, что близко к показателю индометацина (68%). Близкую к нему активность обнаружило соединение А! (торможение отека 53%),. Антиэкссу дативная активность выядяена также у соединений А2, АЗ и А4 (торможение отека составило 43, 48 и 33%). Остальные производные из этой группы показали низкую эффективность, не превышающую 20%.

Таблица 1 Влияние производных 2-аминобензотиазолов (8 мг/кг) мг/кг на карратшн-индуцированный отек лапы крыс при в н у грибрюш ин н ом

___введении______ _

хс (п = 6) Объем левой папы (здоровой) (мл) М-^ш Объем правой, лапы (с инъекцией фпатогена) (мл) М=ст Величина отека лапы (мл) М±ш

Контроль 0,69±0,01 1,6 5 ¿0,05 1,39±0,26

Г-7 0,67±0,015 1,31 ±0,009 0,95*0,03 * 1

Э-7 0,69*0,01 1,29±0,02 0,85 ±0,04*

Э~3 0,69*0,01 1,11 ±0,01 0,597*0,02+*

- р <0,01 но сравнению с кон трольной труппой

Из новых 2-амикобензотназотв наиболее активным на модели каррагенинового отека оказалось вещество ЭЗ: торможение отека в этой же дозе равно 40% (р< 0.01 (табл 2). Среди производных 2-амино-1,3, 4-тиадиазолов эффективность в условиях данной модели обнаружена у соединений ЛЕЮ, ЛБК2 и ЛБКЗ и С2$. Последнее лидирует по противовоспалительному эффекту с}»еди этих соединений (рис.2)

100 90 ВО 70 60 50 40 30 20 10 О

/

0

>

О

Рис. 2. Влияние новых производных 2-амино-1.3.4- тиадначолов ва каррагеннн-индуцированный огех лапы крыс при внутри брюшинном введении в дозе 8 мг/кг, зквимолярной индометацину, **- р <0,001 по сравнению с контрольной группой

При впутриже лудочном введении в дозах, эквимолярных 10 мг/кг индом еташ! на, новые производные 2-аминотиазолов - замещенные (бен зил идеи )-тиазо л -4- о ны - также инпюируют острое зкссудативное воспаление, вызванное каррагенином. И в этом случае самым активным оказалось соединение А5, ему незначительно уступает соединение А 1. Как и в случае внутрибрющинного введения, по антиэкссудативной активности эти вещества можно расположить следующим образом: Иддометацин = А5> А1> А2 = АЗ = А4 >А6 = А7 = А8 = А9, Из производных 2 аминобензотиазола наибольшую антиэкссудативную активность на модели каррагенинового отека проявляет соединение Э-3 - торможение отека составило 45 %. Два других производных также статистически достоверно тормозили развитие воспалительной реакции, но в меньшей степени, чем Э-3 (торможение 35 и 38%, соответственно). Из ряда 2-ам ино -1,3,4тиэди азо лов активными в условиях данной модели оказались соединения ЛБК1, ЛБК2 и ЛБКЗ и С25: торможение

отека составило 35, 33 , 38 и 42%, соответственно. По активности они существенно уступают диклофенаку и индометацину, которые в эквивалентной дозе тормозили отек на 70 и 71%, соответственно.

Следующей задачей данного раздела работы явилось выяснение вопроса, является ли торможение каррагенинового отека дозозависимым. Для этого активные вещества (соединения А1, А2, АЗ и А5) вводили внутрижелудочно в дозах 5 мг/кг, 10 и 15 мг/кг и определяли среднеэффективную дозу. ЭД 50 составила для данных соединений 20,2 мг/кг; 21,8ммг/кг; 33,8 мг/кг и 15,1 мг/кг, соответственно. Таким образом, из четырех активных соединений самым эффективным является соединение А5, так как по показателю ЭД50 оно не уступает индометацину, а по широте терапевтического действия превосходит его в 15 раз.

Исследование в динамике антиэкссудативных свойств соединения А5 (15 мг/кг) показало, что торможение отека составляет через час после индукции отека 23%, в последующие 2-3 часа этот эффект нарастает до 41%, а через 4-5 часов он снижается и составляет 18%. Аналогичная динамика антиэкссудативного действия наблюдается и у референтного препарата кетопрофена (10 мг/кг). Но в отличие от А5 действие кетопрофена более длительное и составляет 32% и через 5 часов после индукции отека. Совместное внутрижелудочное применение кетопрофена и А5 в дозах в 2 раза меньших, чем при раздельном введении, вызвало отчетливое усиление торможение отека через 2, 3 и 5 часов на 23%, 18 и 13 % (р< 0,01) . Такой эффект от совместного применения в дозах, составляющих от ЭД50 можно расценивать как потенцирование действия кетопрофена.

Таким образом, при изучении антиэкссудативных свойств на модели каррагенин-индуцированного отека лапы крыс новых производных 2 аминотиазолов было выявлено значительное противовоспалительное действие 2 аминотиазолинонов - А1, А2, АЗ, А5 , наиболее выраженное у соединения А5. По уровню противовоспалительной эффективности А5 не уступает индометацину и кетопрофену, но по широте терапевтического действия превосходит индометацин в 15 раз, кетопрофен - в 1,1 раза. Из других испытанных новых веществ существенную противовоспалительную активность проявило производное 2-аминобензотиазола - соединение Э - 3 и тиадиазола -соединение С-25. Однако по уровню активности они уступали как референтным препаратом, так и соединению А5.

Изучение противовоспалительной активности новых производных 2 -аминотиазолов на модели ПАФ-иидуцированного отека лапы крыс

Для понимания механизмов противовоспалительного действия новых производных 2-аминотиазолов представлялось целесообразным использовать и другие модели острого экссудативного воспаления, а именно модели отеков, индуцированных полным адьювантом Фрейнда и одним из основных медиаторов воспаления - гистамином. Показано, что в патогенезе ПАФ-отека доминирующую роль играет усиление под влиянием адъюванта метаболизма арахидоновой кислоты, сопряженное с повышением активности фосфолипазы А2 и синтеза лейкотриенов, особенно лейкотриена В4 . Поэтому дальнейшим этапом исследования новых ХС было изучение их антиэкссудативного действия на модели ПАФ-индуцированкого отека лапы крыс.

100-1

Контроль

90

70

во

50

40-

20-

10^

А8

А4

А6 А7

М_А2_

АЗ

А5

АЭ

£

Рис. 3. Влияние соединений А1, А2, АЗ, А4, А5, А6, А7, А8, А9 (в/ар) в сравнении с индометацином на величину отека лапы крыс, индуцированного ПАФ

Из данных, представ ленных на рис.3, следует, что большинство исследованных производных 2-аминотиазолов ингибировало развитие ЛАФ-отека как при парентеральном, так и внутри желудочном введении в дозе, изоэффективной индометацину. Торможение отека для самых активных соединений - А1, А2, А5, АЗ (в/бр) - составило 53, 52, 66 и 60 %, соответственно, тогда как индомегашш подавлял развитие ПАФ-отека на 68%, Следовательно, можно говорить, что соединение А5 ингибирует ПАФ-отек на уровне икдометацина. А1 и АЗ оказались слабее Соединения А6, А7, А8, А9, а также производные 2-аминобензотиазолов - Г7, Э7 проявили существенно меньшую активность: торможение отека колебалось от 28% до 14-15% (р< 0,01). Соединения А2 и А4 заняли промежуточное положение по уровню активности.

Среди 2 - ам ино-1.3,4-тиади аз 0 ло в активными оказались соединения с азомстиновой структурой - ЛБК-2 и ЛБК-3 и С25: торможение ПАФ-отека составило соединения 58, 50 и 60%, соответственно. По этому виду активности они уступали индометацину и диклофенаку, но соответствовали уровню активных тиазолинонов. Аналогичные результаты были получены при внутрижелудочном введении данных веществ.

Исследование наиболее активных из новых производных 2-аминотиазолов в условиях данной модели в различи ых дозах позволило выявить дозозависимый эффект и определить ЭД ¡одля них (рис,4).

Al A5 ЭЗ C25

Рис. 4. Дозозаиисимое торможение ПАФ- индуцированного отека лапы крыс под влиянием соединений AÎ, А5, ЭЗ, С25

ЭД se составила для Al, А5, ЭЗ, С25 - 18,84 мг/кг, 15 ,43 мг/кг. 20,7 мг/кг, 22.8 мг/кг, соответственно Очевидно, что показатель среднеэффективной дозы для соединения А5 практически не отличается от такового, полученного на модели каррагенинового отека. Следовательно, можно полагать, что данное соединение рая неэффективно ингибирует как циююоксигеназу, играющую ключевую роль в случае образования простагландинов, так и фосфолипазу А2, определяющую синтез лейкотриенов. Об участии этих же механизмов можно думать и применительно к другим производным, испытал пых на данных моделях - AI, ЭЗ и С25, имеющих достаточно близкие показатели ЭД î<j. Итак, изучение антиэкссудативного действия новых производных 2- аминотиазолов на модели ПАФ-индуцированного отека пап крыс показало, что некоторые из этих веществ обладают выраженной противовоспалительной активностью, при этом наибольшей - А5. Этому соединению уступали по выраженности эффекта А), ЭЗ и С25. Обращает на себя внимание тот факт, что соединения азо мет и но вой структуры - ЛБК-2 и ЛБК -3 - также проявили в условиях этой модели значительную противовоспалительную активность, что свидетельствует о сложном механизме их антиэкссудативного действия.

Исследование влияния действия новых производных 2 аминотиазола на слизистую желудка крыс

Как хорошо известно, основным побочным эффектом нестероид! 1ых противовоспалительных препаратов является гастротоксическое действие. В экспериментальных исследованиях показано, что наиболее опасными с -згой точки зрения являются иняометацин, нифлумовая, мефенамовая кислота и бутадиен [ Laudanno et al.,2000], Это обстоятельство диктует необходимость исследования влияния новых веществ с противовоспалительной активностью на слизистую ЖКТ. С этой целью из тестируемых веществ были выбраны наиболее активные в плане воздействия на экссудативное воспаление: А5, Al, Л2, A3 . ЭЗ, С 25.

Результаты показали, что соединения А5, А1, А2, АЗ, ЭЗ и С25 в диапазоне доз 10-50 мг/кг как при однократном, так и многократном введении не вызывали повреждения слизистой желудка у крыс. Индометацин вызывал повреждение слизистой в виде гиперемии, эрозий и язв. Это эффект был дозозависим. С увеличением дозы до 50 мг/кг количество дефектов слизистой достигало 260 мм2.

В последние годы сформировалась новая точка зрения на механизмы повреждения слизистой ЖКТ. Многие исследователи считают, что этот механизм комплексный и обусловлен не только торможением нестероидными противовоспалительными препаратами синтеза простагландинов и нарушением синтеза мукополисахаридов, но и снижением разности трансмукозного потенциала в желудке и повышением обратной диффузии ионов Н+ а в кислой среде - увеличением проницаемости апикальных мембран слизистой желудка [Бондарев А.И.., Зарудий Ф.С., 1994]. Так, отмечено, что ингибирование ЦОГ в слизистой желудка может быть только предпосылкой для формирования повреждений, но одного этого механизма недостаточно для развития повреждений, вызываемых ацетилсалициловой кислотой [1л£дтзку е1 а1, 1993; ЬаисЗаппо е1 а1., 2001]. В механизме ульцерогенного действия НПВП определенную роль играет и повышение интенсивности перекисного окисления липидов и образующиеся в результате действия НПВП продукты свободно-радикального окисления.

Наши данные показывали отчетливый дозозависимый ульцерогенный эффект индометацина, что полностью соответствует наблюдениям других исследователей [Ьаис1аппо е1 а1., 1998; 2001]. Новые производные 2-аминотиазолов А5 и А1 - в испытанных терапевтических дозах, в которых они проявляли противовоспалительное действие на моделях острых отеков, не вызывали повреждения слизистой желудка крыс при внутрижелудочном введении. Важно отметить, что в случае совместного применения индометацина и А5 либо А1 площадь поражения слизистой была статистически значимо меньше, чем в группе животных, получавших только индометацин. Это свидетельствует о том, что новые производные 2 аминотиазола не только не повреждают слизистую ЖКТ, но и проявляют гастропротекторные свойства и. следовательно, при совместном применении их с НПВП можно ожидать менее выраженные гастротоксические эффекты, чем в случае нестероидных противовоспалительных средств.

Исследование анальгетического действия новых производных 2-аминотиазола

Неотъемлемой частью любого воспалительного процесса является боль. Исходя из современных представлений о патогенезе соматогенных болевых синдромов, можно считать обоснованным применение средств, которые, во-первых, ограничивают поступление ноцицептивной импульсации из зоны повреждения в ЦНС, во-вторых, подавляют синтез и секрецию альгогенов ив-третьих, активируют антиноцицептивные системы. Именно этими механизмами действия обладают ненаркотические анальгетики и НПВП. Как уже было сказано выше, важнейшими параметрами, определяющими различие конкретных противовоспалительных средств, являются способность в терапевтических дозах оказывать преимущественно анальгетическое и/или противовоспалительное действие, скорость наступления и длительность

эффекта. Поэтому задача данного раздела работы состояла в выяснении вопроса, обладают ли новые производные 2-аминотиазола обезболивающей активностью. Для этого в режиме скрининга были использованы основные модели гиперальгезии - модель «уксусных корчей» и модель «горячей пластины».

Изучение влияния ХС на болевые реакции в тесте «уксусные корчи»

Наши результаты показали., что соединения А1, А2, АЗ, А4 и А5 при в'нутрибрюшинном введении в дозе, изоэффективной индометацину (8 мг/кг) значительно уменьшают количество корчей у мышей, вызванных уксусной кислотой: ингибирующий эффект составил 32 - 47% . Соединения А8, А7, А9 обнаружили небольшое анальгезирующее действие 14,8, 16,5 и 19%, соответственно. У соединения А6 эффект не был статистически значимым. При внутрижелудочном введении в условиях данной модели изучаемые ХС показали аналогичный результат (табл. 2.)

Таблица 2. Анальгетическая активность новых производных 2-аминотиазола (8 мг/кг) в тесте «уксусные корчи» при внутрижелудочном введении

Группы животных N=12 Количество корчей за 15 мин (М ± ш) Анальгетический эффект,%

Контроль 33,7 ±,7

А1 20,5 ±2,1* 39,2

А2 21,6 ±2,3* 36

АЗ 24,3 ± 1 ,7* 27,9

А 4 23,2 ±1 ,9* 31,2

А 5 16,8 ± 1,3* 50,2

А 6 31,3 ±1,7 7,2

А 7 26,2 ± 1,4* 22,3

А 8 26,4 ± 2,8* 21,7

А 9 27,3 ± 1,7* 19

Диклофенак 17,4 ±1,8* 48,4

Индометацин 16,1 ±1,9* 52,3

**р - <0,01 относительно контроля

Как показывают данные таблицы 2, наибольший эффект выявлен у А5 -показатель уменьшения корчей составил 50,2% и соответствовал показателю референтных препаратов - диклофенаку и индометацину (48,4 и 52.3%,

соответственно). Al, А2 и А4 также проявили существенную активность на данной модели (анальгетический эффект составил 39, 36 и 31,2%, соответственно), но уступали А5. У остальных соединений эффект не превышал 22%. Среди производных 2-аминобензотиазолов наиболее значимый эффект выявлен у Г7 и ЭЗ: торможение гипералгезии составило 38 и 35,9%, соответственно. Несколько менее активно оказалось Э-7 (анальгетический эффект 26,1%). В ряду 2-амино-1,3,4-тиадиазолов наиболее значительное обезболивающее действие проявило соединение С25: его эффективность как при парентеральном, так и внутрижелудочном введении в тесте уксусные корчи составила 30,5%, что однако достоверно меньше, чем у референтных препаратов - диклофенака и индометацина. Полученные данные в отношении указанных препаратов вполне соответствуют данным литературы: анальгетический эффект индометацина составляет 57%, а диклофенака - 49%.

У наиболее активных соединений из группы 2-аминотиазолинонов и бензотиазолов мы исследовали зависимость обезболивающего действия от величины использованной дозы. Результаты показывают, что в диапазоне использованных доз 10 мг/кг - 30 мг/кг выявляется та же закономерность, что и в тестах на антиэкссудативную активность: ЭД50 близка к среднеэффективной дозе, в которой изучаемые соединения ингибировали развитие каррагенинового и ПАФ-отеков и составила для Al, А5. ЭЗ и С25 - 25; 16,4;, 28 и 30 мг/кг. Нами исследована длительность анальгетического эффекта А5 и А1 в тесте уксусные корчи в сравнении кетопрофеном. Показано, что длительность обезболивания у новых веществ сохраняется в течение часа, как и у референтного препарата кетопрофена

Изучение влияния ХС на болевые реакции в тесте «горячая тастинка» Для решения вопроса о том, влияют ли новые производные 2-аминотиазолов на механизмы центральной сенситизации, был использован тест» горячая пластина».

Результаты показали, что производные 2-аминотиазолинонов Al, А2, A3, А4, А5 при внутрижелудочном введении в ЭД 50 увеличивают латентное время порога болевой чувствительности на 55,7%; 55.5%; 24,6%; 34,6%; 70%, соответственно. При этом длительность обезболивающего действия сохранялась в течение двух часов. Наибольшую активность проявило вещество А5 -показатель ПБЧ составил 70%, что соответствовало уровню активности препарата сравнения, в качестве которого был использован анальгин. Другие соединения этого ряда (А6, А7, А8, А9) были малоактивны в условиях данной модели.

Среди производных 2-амино-1,3,4-тиадиазолов активность обнаружило соединение С25. Оно увеличивало латентное время порога болевой чувствительности на 54,7 %, уступая препарату сравнения анальгину, который значительно удлиняет ПБЧ через 60 минут на 84 % и через 120 минут на 72,5 %.

В отдельной серии исследований мы провели сравнение активности соединений А5, С25 и кетопрофена. Исследование латентного периода болевой чувствительности у мышей, которым внутримышечно вводили А5 и С25, показало, что ХС существенно удлиняет латентный период порога болевой чувствительности в течение 60-120 минут. При более длительном наблюдении (180- 240 минут) латентный периоду соединений укорачивался в отличие от кетопрофена, что свидетельствует о снижении анальгетического эффекта

изучаемых соединений. Кетопрофен сохранял свое антиноцицентивное действие в течение этого периода наблюдения.

120мин 24D мин 360 мин

□ С 25 ПА5 Р кетопрофен

Рис. 5. Влияние А5, С25 и кетопрофен а на латентный период порогов болевой чувствительности в тесте «горячей пластины» у мышей (внутримышечное введение). *- Р< 0,05; ** - Р< 0,01 относительно фоновых показателей

На рис.5 представлены данные, показывающие, что соединения Л5 и С 25 при внутримышечном введении вызывали существенное дозо зависимое удлинение латентного периода ПБЧ через 120 -360 мин. наблюдения, однако через 120 минут этот эффект снижался. Кетопрофен в терапевтической дозе 10 мг/кг вызывал более значительное и более длительное обезболивающее действие.

Таблица 3. Раздельное и комбинированное влияние А5 и анальгина на латентный период порогов болевой чувствительности в тесте «горячая пластина» у мышей (внутрижелудочное введение)______

Группы животных N=12 Латентный период порога болевой чувствительности, сек (М±ш)

Время после введения ХС, мин

Фон (через 30) ЗОмкн бОмин 120 мин

А5 25 мг/кг 5,5±0,4 5,9+0,3 6,7+0,7 6,8+0,3*

100% 107,3% 121,8% 123,6%

А25 5,4+0,4 7,8+0,8* 8,3+1,0* 8,9+0,5

+анальгин # 100% 132,2% 140,7% 164,8%

.Анальгин, 100 мг/кг 5,1 ±0,4 8,1+0,9* 9,4±0,9** 8,8+0,5**

100% 158,8% 184,3% 172,5%

# А. 5 12,5 мг/кг, анальгин 50 мг/кг

* -Р-<0,05 **- <0,01 относительно фоновых показателей,

К'ак показано в таблице 3, соединение А5 при внутрижелудочном введении в доз?; 25 мг/кг не вызвало увеличения латентного периода порога болевой чувствительности: через 30, 60 и 120 минут наблюдения латентный период ПБЧ увеличился на 7, 21,8 и 23,6%, соответственно. Анальгин в эти же сроки наблюд ения проявил значительный анальгетический эффект: латентный период ПБЧ увеличился на 58,8%. 84,3% и 72,5% , соответственно. Но комбинация анальгина и А5 в дозах, составляющих 'Л от ЭД50, вызвала статистически значимый эффект - латентный период ПБЧ через 30 и 60 минут наблюдения удлинился да 32% и 40,7%, соответственно.

Таким образом, исследования показали, что некоторые новые производные 2-аминотиазола при парентеральном и внутрижелудочном введении оказывают отчетливый анальгетический эффект в тесте горячей пластинки, существенно увеличивая латентный период двигательной реакции животного на термическое раздражение, статистически достоверно повышая порог болевой чувствительности. Наиболее выраженную анальгетическую активность проявило соединение А5. Эффект обезболивания, который изучаемые вещества проявляют в условиях обеих моделей гипералгезии, свидетельствует об участии в его реализации механизмов как центральной, так и периферической сенситизации.

Исследование влияния производного 2-аминотиазолов на сефадекс-индуцированное воспаление легких крыс

В данном разделе работы мы исследовали влияние наиболее активного производного Ы-Гетарил-амино-5-(замещенный бензюшден)-тиазол-4-онов А5 - на сефадекс-индуцированное воспаление легких у крыс Вистар. Основанием выбора явились результаты предыдущих экспериментов, полученные на моделях острого воспаления, продемонстрировавшие выраженную противовоспалительную активность этого соединения.

Для этих исследований была использована одна из моделей субхронического воспалительного процесса - нейтрофильное сефадекс-индуцированное воспаление легких у крыс Вистар, поскольку указанная модель вполне адекватно воспроизводит те патологические изменения в легких, которые наблюдаются на определенной стадии развития болезни при хронических воспалительных заболеваниях дыхательных путей. ( Ковалева В.Л., Макарова О.В. и др 1995; Ковалева В..Л. 2005).

Результаты проведенных опытов показали, что у крыс, которым ингалировали сефадекс (модель) показатель объемной плотности эмфиземы (острой обструктивной), был в 5,12 раз выше, чем у интактных животных. Относительная объемная плотность альвеолита составила через 7 суток -19,6±2,5% от общей площади легкого (табл.4). Кроме того, были выявлены отек паренхимы легкого и выраженная диффузная инфильтрация её нейтрофилами. Количество нейтрофилов в межальвеолярных перегородках было максимально

высоким - в 9,6 раза выше, чем в интактном контроле (р<0,01). При цитологическом исследовании БАС отмечены достоверное нарастание цитоза, увеличение относительного количества многоядерных макрофагов, лимфоцитов и резко повышенное содержание нейтрофилов. Реакция бронхоассоциированной лимфоидной ткани на введение сефадекса также динамично нарастала.

А5 при внутрижелудочном введении в средней терапевтической дозе 15 мг/кг (в течение 7 суток, однократно в сутки) вызывал значительное уменьшение распространенности альвеолита и эмфиземы по сравнению с нелечеными животными ( в 3 и 7 раз, соответственно) (табл. 4). В БАС существенно снижалось содержания лимфоцитов и нейтрофилов (табл. 5). Морфометрический анализ показал, что достоверно снижалось количество нейтрофилов не только в БАС, но и в паренхиме легкого, а также снижался показатель объемной плотности бронхоассоциированной лимфоидной ткани (табл.6.).

Мелоксикам в среднеэффективной дозе 10 мг/кг также оказывал противовоспалительное действие, но менее выраженное в сравнении с предыдущими результатами. Терапевтический эффект мелоксикама выражался в уменьшении альвеолита, эмфиземы (табл 4).. Те же закономерности выявлены и при цитологическом изучении БАС: достоверно снижалось содержание лимфоцитов и нейтрофилов (табл 5). Уменьшению содержания лимфоцитов в БАС соответствовало снижение показателя объемной плотности бронхоассоциированной лимфоидной ткани (табл.6).

Таблица 4. Морфометрическая характеристика легочной паренхимы крыс после лечения А5 и мелоксикамом (М ±т)

№ Группа Объемная плотность, %

П/п Наблюдений п=8 Альвеолит Эмфизема

1 Контроль интактный — 3,3±0,7

2 Модель(сефадекс) 19,4±3,7 16,9+3,0

3 А5 5 мг/кг 7,9±2,4 * 3,7±0,8*

4 А5 15 мг/кг 5,7±1,5* 2,3+0,8*

5 Мелоксикам 5 мг/кг 7,8±2,8* 9,3±2,6*

6 Мелоксикам 10 мг/кг 5,4±1,4* 12,6±5,0

• - р<0,01 по отношению к контролю

Таблица 5. Показатели цитоза и клеточного состава бронхоальвеолярного

смыва крыс Вистар после лечения А5 и мелоксикамом (М ± т)

№ Группа Наблюдений N=8 Цитоз (абсол. к-во Кл. в 1 мл) Эндопульмональная цитограмма в %

Макрофаги Лимфоциты Нейтрофилы

1 Контроль 0,890±0,109 92,3±1,5 5,9±2,2 1,3±0,06

(интактные животные)

2 Модель(сефадекс) 0,82010,060 66,4±2,4 18,6±1,7 15,4±2,6

3 А5 5 мг/кг 0,840±0,071 70,7±3,0 19,0±5,7 16,2±3,4

4 А5 15 мг/кг 0,900±0,110 85,5±4,86 8,0+1,02* 2,410,6**

5 Мелоксикам 5 мг/кг 0,910±0,213 64,3 ±6,7 12,3±1,1* 17,3 ±5,4

6 Мелоксикам 10 мг/кг 0,600±0,147 79,4+5,3 9,4±2,3* 8,4±1,6*

• -р<0,05; ** <0,01 к контролю (сефад.)

Таблица 6. Морфометрическая характеристика бронхоассоциированной лимфоидной ткани у крыс Вистар после воздействия ХС А5 и мелоксикамом (М ± т)__

№ п/п Группа наблюдений N=8 Объемная плотность Лимфоидных фолликулов, в %

1 Контроль Интактные животные 42,6 ±3,7

2 Сефадекс 68,6 ±4,5*

3 А5 5 мг/кг 51,3 ±3,0

4 А 15 мг/кг 40,8 ±4,3**

5 Мелоксикам 5 мг/кг 41,2±0,9** .

6 Мелоксикам 10 мг/кг 43,1±0,8**

Достоверность различий показателей: *-р<0,05; ** <0,01 по отношению: -к контролю с сефадексом

Следовательно, соединение А5 при курсовом внутрижелудочном введении оказало существенное противовоспалительное действие на индуцированный воспалительный процесс в дыхательных путях крыс. Важно подчеркнуть, что при лечении веществом А5 уменьшается такой решающий показатель воспаления, как количество нейтрофилов, инфильтрирующих межальвеолярные перегородки, с одной стороны, и появляющихся в БАС в результате хемотаксиса, с другой стороны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментов выявили в рядах 1Я-Гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден) - тиазол-4-онов, алкокси-2-минобензотиазолов и 2-амино-1,3,4-тиадиазолов активные соединения - А5, А1, ЭЗ, С25, обладающие значительной противовоспалительной активностью в условиях моделирования острого экссудативного воспаления. Важно подчеркнуть, что высокий уровень активности, проявляемый как на модели каррагенинового отека, так и отека, индуцированного полным адъювантом Фрейнда, свидетельствует о двойном механизме противовоспалительного действия, реализуемого через подавление активности и циклооксигеназы и фосфолипазьй. Определение среднеэффективной дозы на обеих моделях отеков показало, что уровни доз для соединений А1, А5, ЭЗ и С25 при внутрижелудочном введении достаточно близки и составляют 20,2 мг/кг; 15,1 мг/кг , 21,8 мг/кг; 33,8 мг/кг (каррагениновый отек), и - 18,84 мг/кг, 15 ,43 мг/кг. 20,7 мг/кг, 22.8 мг/кг ( ПАФ-отек), соответственно. Из этих данных следует, что наиболее значительную активность среди всех исследованных соединений проявило соединение А5, отличающееся от остальных менее активных соединений этого ряда наличием адамантана в качестве заместителя. По уровню

противовоспалительной активности это соединение близко к индометацину и кетопрофену, а по широте терапевтического индекса в 15 раз превосходит индометацин. Важным преимуществом новых производных 2-аминотиазола является их низкая токсичность и отсутствие раздражающего действия на слизистую желудка крыс. Кроме того, эти же производные 2-аминотиазолов показали существенную обезболивающую активность как на модели» уксусных корчей», так и модели» горячей пластины», что свидетельствует об участии в реализации алгезии ХС механизмов как центральной, так и периферической сенситизации. Эффекты комбинированного применения соединения А5 с ненаркотическим анальгетиком - анальгином - или НПВП кетопрофеном дают основание считать, что соединение А5 потенцирует обезболивающее действие референтных препаратов. Использование модели сефадекс-индуцированного бронхоальвеолита показало способность соединения А5 ингибировать хронический воспалительный процесс в бронхолегочной системе.

Таким образом, полученные экспериментальные данные позволяют рассматривать производные М-гетарш1-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-онов, б-Алкокси-2-аминобензотиазолов и 2-амино-1,3,4-тиадиазолов как перспективные с точки зрения дальнейшего поиска высокоэффективных веществ с противовоспалительной и анальгетической активностью, а соединение А5 следует рекомендовать для расширенного изучения с целью разработки на его основе нового средства с противовоспалительными и анальгетическими свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Новые производные 2-аминотиазолов (Ы-Гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-оны и 6-Алкокси-2-аминобензотиазолы) и тиадиазолов (2-Амино-1,3,4-тиадиазолы) проявляют существенную противовоспалительную и анальгетическую активность в условиях моделирования острого и хронического воспаления и гипералгезии.

2. Из производных К-гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-онов наиболее активным оказалось соединение А5, имеющее в качестве заместителя адамантан. В условиях моделирования острого экссудативного воспаления по противовоспалительной активности это соединение не уступало референтным препаратам - индометацину и кетопрофену, а по широте терапевтического действия превосходило их.

3. Соединение А5 оказывает выраженное обезболивающее действие как на модели уксусных корчей, так и в тесте «горячая пластина» на уровне традиционных НПВП (диклофенак, кетопрофен) и по широте терапевтического действия не уступает им. Преимуществом нового соединения по сравнению с традиционными НПВП является отсутствие раздражающего влияния на слизистую желудочно-кишечного тракта при длительном использовании в больших дозах (более 100 мк/кг).

4. На модели бронхоальвеолита у крыс соединение А5 по всем показателям (уровню цитоза, выраженности альвеолита и бронхита, реакции бронхоассоциированной лимфоидной ткани) оказывало существенное инибирующее действие на субхронический воспалительный процесс в

дыхательных путях, что свидетельствует о различных мишенях тералевтического действия данного соединения.

5. Из группы б-алкокси-2-аминобензотиазолов наиболее активным оказалось соединение Э-3 (соль ацетилцистеина), которое ингибировало острое экссудативное воспаление и гипералгезию как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном введении, однако уступало по этим видам активности индометацину и кетопрофену.

6. Из исследованных производных 2-амино-1,3,4-гиадиазолов наиболее значительное противовоспалительное и обезболивающее действие оказало соединение С25. Сравнение его противовоспалительных и анальгезирующих свойств с препаратами НПВП показало, что это соединение менее активно по уровню ЭД50, но превосходит их по широте терапевтического действия.

7. Подученные результаты позволяют расценивать исследованные химические классы как перспективные с точки зрения дальнейшего поиска и изучения биологически активных веществ с противовоспалительными и обезболивающими свойствами. Производное М-гетарил-амино-5-(замещенный бензилиден)-тиазол-4-она (соединение AS) и производное 2-амино-1,3,4-тиадиазолов (соединение С25) представляют интерес для дальнейшего углубленного изучения противовоспалительных свойств с целью разработки на их основе новых нестероидных противовоспалительных препаратов.

Список опубликованных работ:

1. З.У. Садикова., В. П. Галенко-Ярошевский , Н .С., Мосесова., B.JI. Ковалева .Влияние оригинальных производных азометинового ряда, пиридина и тиазола на острое и хроническое воспаление // Третий Международный конгресс «Экология и дети» ( рубрика «Новое в медицине») - 2006. - Анапа - С. 160-161.

2. З.У. Садикова., В. П. Галенко-Ярошевский, В.Л. Ковалева, С.Я Скачилова, Л.Д. Смирнов. Сравнительное изучение противовоспалительной и анальгетической активности новых производных 2-аминотиазолов и тнадиазолов// III Международный конгресс «Экология и дети», рубрика «Новое в медицине» -2006. -Анапа-С. 164- 165.

3. V.L. Kovaleva, Z.U. Sadikova., A.Geronikaki, V.P.Galenko-Yaroschevsky, L.D.Smimov //Antiinflammatory activity of new derivatives of 2-aminobenzothiazoles// 2-nd RUSSIAN- CHINESE INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE ON PHARMACOLOGY AND PHARMACY - CLINICAL PRACTICE -2006. - PERM. - P.85 -86.

4. B.JI. Ковалева, И.А.Крылов, З.У. Садикова., А.Героникаки, В. П. Галенко-Ярошевский, Л.Д. Смирнов. Противовоспалительные и анальгетические свойства новых производных 2-аминотиазолов // Экология. Приложение4/2 - 2006. - № 12. - С. 154 - 157.