Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Перекисное окисление липидов при эпилепсии. Антиоксиданты в противосудорожной терапии

.С1

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИОЛОГИИ

НИКУШКИН ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ. АНТИОКСИДАНТЫ В ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ ТЕРАПИИ.

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

УДК 616.853 [616.831+615.7861-008.939.15

Москва - 1991

габота выполнена в лаборатории общей патологии нервной системы Научно-исследовательского института общей патологии и патологической физиологии АМН СССР.

Научный консультант-

доктор медицинских наук, профессор, академик АМН СССР Г. Е Крыжановский

Официальные оппоненты-до1«'ор биологических наук, профессор, член-корреспондент Российской академии , технологических наук К Б. Спиричев доктор медицинских наук, профессор, " член-корреспондент 'АМН СССР 51 Б. Ганнушкина доктор медицинских наук, профессор Ф. 3.' Меерсон

Ведущее, учрежден к е-

Есесоюзный научный центр психического здоровья

АМН СССР.

Г

Защита диссертации состоится _199>'-г.

в часов на заседании Специализированного совета

Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патологической физиологии АМН СССР (125315, Москва, ул. Балтийская, 8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат оагрслан & 1991 г.

Ученый секретарь Специалигированного совета кандидат медицинских наук

Л. Н. Скуратовская

i "л- i а. лмм'.з Отдел

^ССОрТАЦИЙ

j

-3-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. По оценкам ВОЗ, эпилепсией в мире страдает более 30 - 40 миллионов человек. Частота заболеваемости эпилепсией варьирует в широких пределах в зависимости от уровня экономического развития страны и рассматриваемого возрастного диапазона. Так в США она составляет в среднем 48 человек на 100000 населения, с максимумом в возрасте до 5 лет - 152/100000 и снижением до 40/100000 в возрасте 20-70 лет (А.V.Delgado-Escueta et al.,1986). В странах Восточной Европы этот показатель в среднем составляет 117-220 на ЮОООО населения, а в развивающихся странах он нередко превышает 10-20 человек на 1000 населения (В. Г. Ротштейн и др.,1987). В среднем частые и выраженные судорог» встречаются у 3 человек на 1000 населения, нередко вызывая полную утрату трудоспособности и обусловливая высокую смертность.

В связи с этим в различных лабораториях и клиниках мира было направлено много усилий на синтез новых эффективных проти-восудорожных препаратов, на разработку новых методов лечения эпилепсии. Однако, несмотря на то, что арсенал современных про-тивосудорожных средств насчитывает несколько десятков соединений, существующие методы лечения эпилепсии оказываются малоэффективными по крайней мере у 1/4 больных этим заболеванием (А.V.Delgado-Escueta et al.,1986). В значительной степени это обусловлено недостаточно полным пониманием патогенеза эпилепсии и в особенности на клеточно-мембрано-молекулярном уровнях.

В связи с вышесказанным открытие новых звеньев в патогенетических цепях эпилепсии и выяснение их роли, а также поиск на основании этих данных новых противосудорожных средств и разработка эффективных методов терапии эпилепсии являются одной из актуальных задач мировой медицины, решение которой имеет также важное социально-экономическое значение.

Сокращения: АО - антиоксидант!ы), A0A - АО-активность, АОС - АО-система, ГП - глутатионпероксидаза, ГПУВ - генератор патологически усиленного возбуждения, ГР - глутатионредуктаза, ЖК - жир-ная(ы) кислота(ы), ПИК - полиненасыщенные ЖК, СЖК - свободные ЖК, ИИР - интериктальный разряд, ИР - иктальный разряд, 3-ОП -2-этил-6-метил-3-оксипиридин, ПОЛ -перекисное окисление липидов, АЗПОЛ - аскорбат-зависимое ПОЛ, ФП0Л - ферментативное ПОЛ, СМЖ -спинномозговая жидкость, СОД - супероксиддисмугаза, ТБКП - продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой, ТФ - а-токофе-рол, ФГл - фосфолипазный гидролиз липидов, ФСМ - фракция синап-тических мембран, ЦНС - центральная нервная система, ЭКоГ -электрокортикограмиа, ЭпА - эпилептическая активность.

Современные взгляды на патофизиологию эпилепсии базируютс5 на представлении о том, что в основе эпилептических припадко! лежит гиперактивность группы нейронов, обладающих особыми морфологическими, физиологическими, биохимическими и др. свойствами, которые составляют . эпилептический очаг (В.А.Карлов,1390; Г. Н.Крыжановский,1980-1991(.Последний представляет собой частны! случай генератора патологически усиленного возбуждения (ГПУВ) -агрегата синхронно работающих в самоподдерживающем режиме гиперактивных нейронов (Г.Н.Крыжановский, 1980-1991). Поскольку, согласно теории генераторных механизмов (Г.Н.Крыжановский,1980-1991) возникновение и функционирование ГПУВ лежит в основе патогенеза многих невропатологических синдромов (болевых, двигательных, эмоционально-поведенческих, психозоподобных и др.), то изучение механизмов возникновения, развития и подавления эпилептических очагов представляет собой собственную актуальную задачу, выходящую за рамки аналогичных задач в проблеме эпилепсии.

Исходя из представлений, сформированных к концу 70-х годо1 в цитологии и мембранологии, можно прийти к выводу о том, чт< механизм повреждения клеток разных тканей,в том числе и,нервной, включает в себя два типа стадий или этапов: 1) специфические, определяемые видом повреждающего агента или фактора, а также структурно-функциональными особенностями пораженного отдела ил! органа и 2) неспецифические, универсальные, присутствующие независимо от вида повреждающего начала н свойств пораженной мишени, Нарушения регуляции в клетке процесса свободнорадикального пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) наблюдаются, как правило, н; второй этапе повреждения клетки, хотя в ряде случаев процес< повреждения может с них начинаться. Вместе с тем они универсальны, поскольку встречаются при самых разнообразных заболеваниях 1 патологиях. Важными особенностями реакций ПОЛ является их цепно! характер, что обусловливает способность реакций к самоускоретн и их тесная взаимосвязь с множеством других клеточных процессов Благодаря этому вклад нарушений регуляции процесса ПОЛ, их последствий в суммарное повреждение клетки (ткани) может превышав вклад специфических стадий и определять вероятность переход; обратимых изменений клеточного метаболизма и структуры в необратимые.

В экспериментально-клинических исследованиях последней

tS-

десятилетия нарушения регуляции процесса ПОЛ были обнаружены при ишемии (М.В.Биленко,1989; Ф.З.Меерсон и др.,1983) и травме (М.Ш.Промыслов и др.,1991) головного мозга, при шизофрении (Л.Л.Прилипко, Р.Р.Лидеман,1982; А.М.Michelson, 1982), рассеянном склерозе (Н. И. Роговина,А.П.Хохлов,1980; G.2. Mazzella et al.. ,1983), болезнях Паркинсона (J. Clausen, 1984; S.J.Klsh et al., 1985),Альцгеймера и Боттена-Шгейнерта-Куршмана (J.Clausen,1984), а также при стрессе (Ф.З.Меерсон,1979-1991), центральных параличах (M.Kibata et а1.,1977).инфекциях (И.Т.Ильчук,1983), отравлениях тяжелыми металлами tJ,Donaldson et al.,1982) и других поражениях центральной нервной системы (ЦНС). Несомненная важность нарушений в системе регуляции процесса ПОЛ для патогенеза заболеваний ЦНС доказывается тем обстоятельством, что факторы (соединения) предотвращающие или устраняющие дисбаланс, возникающий в системе регуляции ПОЛ, в частности антиокснданты, замедляли развитие патологического процесса и ослабляли его интенсивность вплоть до полного подавления!М.В. Биленко,1989; Г.Н.Крыжановский и др., 1984; Ф.З.Меерсон и др.,1983,1986,1988; С.Л.Няньковский, М.Ф.Тимочко,1386; А.Р. Рахимджанов и др.,1989; С.С.Рыбалова,1981;J.Suzukli et al.,1385; J.Z.Cadet et al.,1989).

Вместе с тем исследований, посвященных изучению состояния ПОЛ в очагах гиперактивности и у больных, эпилепсией, а также выяснению роли возможных нарушений регуляции этого процесса при эпилептогенезе практически не проводилось. Это послужило основанием для выполнения работы, результаты которой изложены в данной диссертации.

Исследования проводились в рамках научно-технической программы ГКНТ СССР 0.69.04 "Разработка и внедрение методов и средств профилактики, лечения и реабилитации больных психическими заболеваниями" и Общесоюзной отраслевой научно-технической программы в области медицины С.01 "Изучение общих закономерностей патологических процессов и разработка принципов и методов их коррекции".

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении состояния процесса ПОЛ при эпилепсии, выяснении патогенетической значимости и механизма нарушений регуляции данного процесса, а также в разработке методов их профилактики и коррекции.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить вид и выраженность нарушений протекания процессг ПОЛ в областях гиперактивности головного мозга лабораторных животных (крыс) при моделировании у них очаговой и первично-генерализованной эпилепсии.

2. Выяснить патогенетическое значение и механизм нарушена регуляции процесса ПОЛ при экспериментальном -эпилептогенезе.

3. Определить возможности профилактики и коррекции нарушений регуляции ПОЛ при эпилептогенезе; разработать методику использования антиоксидантов в экспериментальной противосудорожно{ терапии.

4. Исследовать состояние процесса ПОЛ у взрослых больных с разными формами эпилепсии и у детей с судорожным синдромом.

5. Выявить факторы и клинические признаки эпилепсии,наличие и выраженность которых связана с уровнем продуктов ПОЛ в кровр больных этим заболеванием.

6. Изучить возможность и целесообразность использованш антиоксидантов в комплексной противосудорожной терапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В работе впервые проведено комплексное экспериментально-клиническое исследование состояния процесса ПОЛ у лабораторных животных (крыс) с моделями разных фор» эпилепсии, а также у взрослых больных эпилепсией и детей ( судорожным синдромом.

Установлено, что развитие у крыс, очаговой и первично-генерализованной эпилептической активности (ЭпА) сопровождаете: нарушениями регуляции в . области гиперактивности процесса ПОЛ, приводящими к его некомпенсированной активации. При этом наблюдается значительное повышение уровня продуктов ПОЛ в .спинномозговой жидкости в периферической-крови.

Впервые доказано, что нарушения регуляции ПОЛ являютс: важным звеном в патогенезе ЭпА. Установлено, что антиоксиданты а-токоферол (ТФ), ионол, 2-этил-6-метил-3-оксипиридин и эноме-ланин обладают выраженным противосудорожным действием, а препараты, широко используемые в противосудорожной терапии :фенобарбитал, дифенин, вальпроат натрия и феназепам ингибируют ПОЛ i условиях in vitro.

Показано, что нарушения ПОЛ при эпилептогенезе имеют вто ричный характер и что одним из механизмов, приводящих к неком

пенсированной активации ПОЛ при развитии ЭпА, является активация в области гиперактивности эндогенных фосфолипаз типа А. Установлено, что некомпенсированной активации ПОЛ при развитии ЭпА способствует функциональная недостаточность антиоксидантной системы (ДОС). Увеличение мощности ДОС с помощью введения животным антиоксидантов или препарата супероксиддисмутазы (СОД) существенно замедляло индукцию ЭпА и уменьшало ее интенсивность.

У больных с различными формами эпилепсии и детей с судорожным синдромом впервые обнаружены нарушения регуляции процесса ПОЛ,о чем свидетельствует резкое увеличение содержания продуктов ПОЛ в крови больных. Кроме того в- крови больных эпилепсией, длительное время страдающих заболеванием с высокой частотой припадков, снижена активность антиохсидантных ферментов.

Впервые показано, что назначение больным эпилепсией с значительными нарушениями регуляции процесса ПОЛ дополнительно к традиционной п'ротивосудорожной терапии антиоксиданта - а-токо-ферола нормализует биохимические показатели и дает положительный терапевтический эффект.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ. ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволили обнаружить в цепях эпилептогенеза новое звено - нарушения регуляции в области гиперактивности процесса ПОЛ. Установлено, что эти нарушения являются одним из вторичных звеньев. Нарушения регуляции ПОЛ приводят к некомпенсированной активации данного процесса, одной из причин чего является активация эндогенных фосфолипаз типа А. Реализации этой и других причин активации ПОЛ способствует функциональная недостаточность ферментов АОС.

Учитывая то обстоятельство, что очаг ЭпА представляет собой частный случай ГПУВ, можно полагать, что нарушения регуляции ПОЛ являются существенным звеном в патогенезе других нейропатологи-ческих синдромов,' в основе возникновения которых лежит образование в ЦНС ГПУВ.

Обнаружение новых свойств у использованных-антиоксидантов -противосудорожных и новых свойств у примененных противосудорож-ных препаратов - антиоксидантных подтверждает патогенетическую значимость нарушений регуляции ПОЛ для эпилептогенеза и углубляет существующие представления о молекуляркых механизмах действия апробированных соединений.

В результате проведенных исследований сформулировано новое

научное направление, имеющее существенное значение для развития теоретической и практической медицины: изучение роли нарушений регуляции процесса перекисного окисления липидов ЦНС в патогенезе эпилепсии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан в эксперименте и успешно апробирован в клинике метод лечения эпилепсии с помощью включения антиоксиданта - а -токоферола в комплексную противосудо-рожную терапию (Автор, свид. N 1152591 от 3 января 1985 г.).

Результаты исследований по изучению противосудорожного действия антиоксиданта - 2-этил-6-метил-3-оксипиридина вошли в основные материалы по препарату оксипин, представленные в Фармакологический комитет МЗ СССР. Решением Фармакологического комитета МЗ СССР (протокол N 21 от 13 декабря 1985 г. ) оксипин разрешен для изучения в психиатрических клиниках, в том числе и при лечении эпилепсии.

Обнаружение противосудорожных свойств у антиоксидантов: ио-нола, эномеланина, никотинамида позволяет рекомендовать их для дальнейших испытаний с целью получения новых лекарственных препаратов.

Наличие противосудорожного действия у антиоксидантов, относящихся к разным классам химических соединений следует использовать при направленном поиске новых антиэпилептических средств.

Разработанные в диссертации теоретические подходы и методические приемы используются во Всесоюзном научном центре психического здоровья АМН СССР, Институте фармакологии АМН СССР, ■ Институте геронтологии АМН СССР, Одесском медицинском институте им. Н. И.Пирогова, Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. При эпилепсии наблюдаются нарушения регуляции процесса ПОЛ, проявляющиеся его некомпенсированной активацией и являющиеся существенным звеном патогенеза данного заболевания.

2. Актиоксиданты: а-токоферол, ионол, 2-этил-6-метил-3-оксипиридин и эномеланин обладают выраженным противосудорожным действием.

3. Нарушения регуляции ПОЛ при эпилептогенезе имеют вторичный характер.

4. В механизмах нарушения регуляции процесса ПОЛ при эпи-

лептогенезе существенную роль играет активация в области гипер-активностн эндогенных фосфолипаз типа А и функциональная недостаточность АОС.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Структура,биосинтез и превращение липидов в организме человека и животных" (Ленинград, 1978), VIII, IX и X Всесоюзных конференциях по биохимии нервной системы (Минск,1980; Ереван, 1983; Горький, 1987), V Всесоюзном семинаре "Развитие общей теории функциональных систем" (Москва, 1979),II Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Ташкент, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Международном симпозиуме'"Нейрофизиологические механизмы эпилепсии" (Тбилиси, 1982), I, II и III Всесоюзных конференциях "Биоантиоксидант" (Москва, 1983; 198S; 1989), V Всероссийской конференции детских невропатологов и психиатров (Уфа, 1983), IV Всесоюзной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР Х.Ч.Коштоянца (Москва, 1985), V Всесоюзной конференции по медицинской энзимологии (Махачкала, 1988), I Болгаро-советском симпозиуме "Свободные радикалы и биостабилизаторы (Sofia, Bulgaria,. 1987), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1988), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. .Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы с изложением материалов и методов исследования и 5 глав, посвященных изложению результатов собственных исследований и'их обсуждению), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 43 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 350 источников, из которых 136 опубликовано в отечественных и 214 в зарубежных изданиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспериментальная часть работы состоит из двух разделов. В 1-ом разделе приводятся данные, полученные в лабораторных условиях в экспериментах на животных (гл.IV-VI): на белых беспородных крысах - самцах (2Q0 животных) и белых крысах - самцах линии Вистар (1200 животных). Беспородных животных использовали для приготовления гомогенатов головного мозга и выделения из них

субклеточных фракций, которые в дальнейшем'применяли для биохимических исследований в опытах in vitro. Во всех остальных случаях использовали крыс линии Вистар. Животные имели массу тела 160-250 г, их содержали в условиях вивария на стандартном рационе без ограничений в воде и пище с естественной сменой освещенности.

Данные, изложенные во 2-ом разделе, представляют собой результат обследования 140 человек. 70 из них это мужчины в возрасте 23-39 лет, больные различными формами эпилепсии. Их обследование проводилось на' базе Тверской областной психиатрической больницы им. докт. Д.Литвинова (44 больных), кафедры нервных болезней Московского медицинского стоматологического института им. Н.А.Семашко (13 больных) и психоневрологического диспансера N 12 г.Москвы (13 больных). 45 человек из общего числа обследованных - дети с судорожным синдромом в возрасте от нескольких месяцев до 1.5 лет, находившиеся на излечении в отделении патологии нервной системы новорожденных клинической больницы N 1 г.Москвы. 25 обследованных - мужчины в возрасте 20-38 лет, не страдающие ни психическими, ни хроническими соматическими заболеваниями (контроль).

Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования у крыс ЭпА использовали модель очаговой пенициллин-идуцированной ЭпА и модель первично-генерализованной бемегрид-индуцированной ЭпА (D.Purpura et al.,1972; R.Fisher, 1989). Изучение постепенного возрастания чувствительности крыс к действию эпилептогена проводили с помощью коразол-индуцированно-го феномена "раскачки" (коразоловый "киндлинг") (J.Wada,1986; Г.Н.Крыжановский и др.,1988).

Интенсивность очаговой и первично-генерализованной ЭпА оценивали по ЭКоГ. В случае очаговой ЭпА определяли длительность латентных периодов появления 1-ого интериктального разряда (ИИР) и 1-ого иктального разряда (ИР),а также длительность и число ИР, наблвдаемых за время функционирования очага ЭпА. В случае первично-генерализованной ЭпА определяли длительность латентных периодов появления судорожных вздрагиваний и начала клонико-тони-ческих судорог, а также интенсивность судорог и число животных, выживших после введения летальных доз бемегрида. Интенсивность судорог выражали в баллах.

В экспериментах на очаговой модели ЭпА отбирали ткань коры головного мозга из области очага ЭпА и кровь из бифуркации нижней полой вены.Ткань мозга (2-3 мг) отбирали через через 15-30 мин после аппликации пенициллина, то есть на стадии выраженной ЭпА. Кровь отбирали у животного находившегося под легким хлороформным наркозом, через 10-20 мин после окончания функционирования очага ЭпА.

В опытах на модели первично-генерализованной ЭпА исследовали целый головной мозг (без мозжечка), суммарную кору больших полушарии, кровь из сосудов головы и шеи,а также кровь из нижней полой вены. Крыс декапитировали через 2-4 (период начальных судорожных проявлений), 4-6 (на высоте судорожного приступа), 6-8 (сразу же после приступа генерализованных судорог) и через 20 мин после инъекции бемегрида (т.е. через 10-15 мин после генерализованного приступа).

СМЖ (20-40 мкл) отбирали через 20 мни после инъекции бемегрида с помощью цистернальной пункции.

При феномене "раскачки" исследовали целый мозг (без мозжечка) и кровь из сосудов головы и шеи. Крыс декапитировали- на 5,17 и 32-е сутки после первого введения коразола. В день забоя кора-зол животным не вводили.

Целый головной .мозг крысы (без мозжечка), участки его сен-сомоторной коры из области очага ЭпА и суммарную кору больших полушарий гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефло-новым пестиком. Полученные гомогенаты либо непосредственно использовали для биохимического анализа, либо предварительно выделяли из них цитозольную фракцию (И. Р. Тупеев и др. ,1985), фракцию синаптосом (F.Hajos,1975)) и фракцию синаптических мембран (ФСМ) (М.М.Бордюков и др.,1985). Кровь центрифугировали в течение 1620 мин при 3000 об/мин и температуре 0-4°С. Отбирали плазму, добавляли в нее ЭДТА до конечной концентрации - 3-5 мМ и хранили при -20° С до 7 сут. Для получения лизата эритроцитов к 1 мл эритроцитарной взвеси добавляли 1 мл 0.2% раствора детергента -тритон Х-100, содержавшего 2 мМ ЭДТА. В пробах, используемых для определения активности СОД, осаждали гемоглобин.

-Концентрацию белка в исследуемых образцах определяли по методу (O.Lowry et.al.,1951). Концентрацию гемоглобина в лизате эритроцитов определяли по (И.Тодоров,1968).

Кровь у больных эпилепсией, здоровых 'доноров,а также детей с судорожным синдромом брали из локтевой вены (у детей иногда из височных вен кожи головы) утром натощак. СМЖ получали путем люм-бальной пункции также утром натощак. Полученные образцы хранили при -20°С не более 2-7 сут.

Наличие и•величину трансмембранного потенциала синаптосом (ТМПС) определяли с помощью метода флуоресцентных потенциал-чувствительных зондов используя - 3.3-дипропилтиодикарбоцианин - diS-C3-(5) (М.Blaustein,J.Goldring,1975).

Микровязкость липидного бислоя синаптических мембран измеряли по поступательной диффузии флуоресцентного зонда пирена (Ю.А.Владимиров,Г.Е.Добрецов,1980). Аффинность бензодиазепиновых рецепторов определяли методом радиолигандного анализа (Л.Л.При-липко и др.,1983), используя метку - 3Н-И-метил-диазепам.

Длительную деполяризацию синаптосом вызывали тремя способами: 1) электростимуляцией суспензии синаптосом по (H.Bradford, 1970), 2) увеличением концентрации в среде инкубации ионов К+ до 33 мМ, 3) ингибированием Na.K-АТФ-азы синаптических мембран уа-баином.

В гомогенатах, суспензиях синаптосом, ФСМ и липосом индуцировали аскорбат-зависимое ПОЛ (АЗПОЛ) с помощью смеси FeCl ^аскорбиновая кислота (10"5и г'Ю'^М соответственно). В гомогенатах и суспензиях синаптосом индуцировали также ферментативное ПОЛ (ФПОЛ) путем введения в среду инкубации смеси ЕеС1г+НАДФ'Н (Ю-5 и 2'10"4М соответственно).В суспенизиях синаптосом ПОЛ индуцировали также, облучая суспензию УФ-светом.

Липиды экстрагировали с помощью модификации метода (Е.Bligh.W.Dyer,1959).В экстрактах определяли содержание диеновых коньвгагов (J.Bol land,Н. Koch, 1945) и оснований Шиффа (W.Bidlack,^.Tappel,1973).Концентрацию ТБКП измеряли как описано в работе (Е.В.Никушкин и др.,1989).

Состояние АОС (оценивали по активности в тканях супероксид-дисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) и по содержанию ТФ. Активность СОД, ГП и ГР определяли в цитозольных фракциях клеток коры головного мозга и целого мозга (без мозжечка) крыс, а также в эритроцитах крыс и человека (С.Beanchamp,I.Fridovich,1971; В.З.Ланкин, С.М.Гуревич, 1976; Y. Yawata, К. Tanaka,1974). Содержание ТФ измеряли в гомогенатах

коры головного мозга крыс и в плазме крови крыс и человека (D.Taylor,1956). Кроме того, у крыс исследовали перекисную резистентность эритроцитов!М.Clemens,Н.Remmer,1982).

Содержание СЖК в гомогенатах ткани мозга, суспензиях субклеточных -фракций и в плазме крови определяли по модифицированной методике (В. А. Шатерников, А. А. Савчук,1964). Состав CJKK анализировали методом газо-жидкостной хроматографии.

а-токофероя ацетата вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 0.1-100 мг/кг массы за 1 сут до индукции ЭпА. Больным эпилепсией АО назначали в виде масляного раствора а-токоферол ацетата в капсулах (50 '/. раствор). Препарат давали внутрь по 600 мг ,1 раз в сутки после еды. Продолжительность курса была 1 мес.

Ионол вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 0.1-100 мг/кг массы за 1 сут до индукции ЭпА. Хлорид' 2-этил-6-метил-3-окси-пиридина (3-ОП) вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 25-150 мг/кг массы либо за 45 мин до индукции ЭпА, либо через 15-25 мин после аппликации пенициллина. Эномеланин вводили животным внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг массы через 15-25 мин после индукции ЭпА. СОД вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы за 30 мин до индукции ЭпА.

ЭКоГ крыс регистрировали в помощью полиграфа RM 86 фирмы "Nihon Kohden" (Япония). Спектры оптической плотности растворов регистрировали на спектрофотометре "Hitachi 320" (Япония), а спектры флуоресценции на спектрофлуориметре MPF-4 фирмы "Hitachi". Радиоактивность препаратов измеряли на счетчике фирмы "Beckman" (США). Состав СЖК определяли на хроматографе CHR0M-4 (ЧССР).

В работе были использованы реактивы в основном фирм "Serva" (ФРГ),"Sigma" (США) и "Merck" (Австрия).

Глава IV. ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСН0Г0 ОКИСЛЕНИЯ.

ЛИПИД0В В ЦНС КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

Аппликация - пенициллина, на симметричные участки сенсомо-торной коры головного мозга-крыс приводила к появлению на ЭКоГ, характерного паттерна ЭпА.Через 1-3 мин после аппликации на фоне нормальной ЭКоГ появлялись отдельные ИИР с амплитудой порядка 200-400 мкВ. Амплитуда ИИР быстро возрастала, достигая 800-1200 мкВ, и через 4-8 мин на ЭКоГ регистрировался ИР - "залп" высоко-

частотных колебаний с частотой более 3-х разрядов за 1 с и длительностью 20-30 с. После каждого ИР наблюдался период рефрак-терности продолжительностью 0.2-2.0 мин; затем вновь появлялись ИИР,переходящие через 1-2 мин в очередной ИР. Описанные переходы ИИР в ИР наблюдались в течение 1.5-2.5 ч, после чего ИР прекращались,' а ИИР начинали постепенно "угасать", уменьшаясь по амплитуде и частоте, и через 2.5-3.0 ч исчезали полностью. Это время считали временем жизни очага ЭпА;всего за него регистрировали от 30 до 70 ИР. Электрическая активность была синхронизирована в правом и левом полушариях головного мозга. . 5

Содержание ТБКП в коре головного мозга контрольных крыс, составляло около 0.5 нмоль/мг белка. Уровень ТБКП был одинаков в левом и правой полушариях головного мозга. Развитие в коре головного мозга крыс фокальной ЭпА сопровождалось резким увеличением содержания продуктов ПОЛ в коре области,гиперактивности. Отмечалось возрастание уровня разных типов продуктов ПОЛ: диеновых конъюгатов, ТБКП и оснований Шиффа. Степень прироста не зависела от тестируемого полушария и варьировала в зависимости от типа продуктов с 20 до 150 У. от контроля. Параллельно с накоплением продуктов ПОЛ в коре головного мозга крыс отмечалось примерно такое же возрастание их уровня в плазме периферической крови.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что индукция пенициллином очага ЭпА в кчре головного мозга крыс сопровождается активацией в области гнперактивности процесса ПОЛ. Поскольку обнаруженное усиление ПОЛ могло быть связано с прямым проокси-дантным действием пенициллина, то в условиях in vitro было изучено влияние данного конвульсанта на активность ПОЛ в синаптосо-мах, выделенных из коры головного мозга интактных животных. Установлено, что инкубация синаптосом с пенициллином (от 10"6до 10~3 М> не влияет на содержание в суспензии ТБКП. Следовательно, пенициллин прооксидантного действия не оказывал. Исходя из этого, можно полагать, что зарегистрированная активация ПОЛ была связана непосредственно с развитием у крыс ЭпА. Правильность этого вывода подтверждается результатами двух других серий экспериментов. Из них 1-я серия опытов отличалась от вышеописанной тем, что пенициллин апплицировали на сенсомоторнуи кору только одного полушария головного мозга крысы, а во 2-ой серии

опытов интенсивность процесса ПОЛ определяли в тех областях коры головного мозга крыс, в которых нормальная ЭКоГ регистрировалась и после возникновения очага ЭпА в сенсомоторной коре. В частности нормальная ЗКоГ наблюдалась в зрительной коре.

При аппликации пенициллина на сенсомоторную кору только одного полушария (левого) головного мозга крыс в области воздействия конвульсанта возникал первичный очаг ЭпА, а в симметричном, гомотопическом участке другого полушария возникал вторичный -"зеркальный" очаг ЭпА. Электрическая активность в первичном -детерминантном и в "зеркальном" очагах была полностью синхронизирована. Установлено, что при аппликации конвульсанта только на одно полушарие увеличение уровня продуктов ПОЛ наблюдается в равной степени как в коре области детерминантного, так и в коре области "зеркального" очагов ЭпА. Напротив, содержание продуктов ПОЛ не отличалось от контрольного в области зрительной коры. Итак, развитие в коре головного мозга крыс очаговой ЭпА сопровождалось активацией в области гиперактивности процесса ПОЛ-.

Развитие в коре головного мозга крыс первично-генерализованной ЭпА,вызванной внутримышечным введением животным бемегрида в дозе 17 мг/кг, также сопровождалось резким увеличением содержания продуктов ПОЛ в коре головного мозга. Как и при очаговой ЭпА, увеличивалось содержание разных типов продуктов ПОЛ: диеновых конъюгатов,ТБКП и оснований Шиффа. При этом степень прироста уровня продуктов ПОЛ колебалась в зависимости от их типа в пределах 150-300 '/., от контроля. Параллельно отмечалось 2-х кратное увеличение содержания оснований Шиффа в СМЖ и 3-х кратное возрастание уровня диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в плазме периферической крови.

Ежедневное введение крысам коразола в подпороговых дозах (30 мг/кг внутримышечно) вызывало постепенное нарастание у них судорожной готовности. .Первые судорожные проявления развивались у животных после 7-й инъекции конвульсанта - сначала менее, чем у 10 V. крыс, а через 2 нед - у 80 'А. Интенсивность судорог к этому сроку достигала 1.5 балла. Затем число животных с судорогами и интенсивность последних сохранялись на практически неизменном уровне до 21-22-х суток, после чего величина обоих показателен резко увеличивалась й к 25-м суткам инъекция коразола вызывала интенсивные (3 балла) судороги у всех крыс. В это время

клонические судороги всего туловища сменялись выраженными клонико-тоническими судорогами, и на 30-е' сутки у половины крыс регистрировались клонико-тонические судороги с падением животного на. бок и четкой фазой тонической экстензии - 4 балла.

Содержание ТБКП определяли в гомогенатах головного мозга у животных, разделенных на 3 группы, которые отличались длительностью введения конвульсанта (5,17 и 32-е сутки) и соответственно степенью судорожной готовности.

Установлено, что содержание ТБКП в головном мозге крыс не изменялось по сравнению с соответствующим контролем ни в одной из обследованных групп. По-видимому, индуцируемая коразолом предрасположенность к ЭпЛ„ нарастающая при хроническом введении конвульсанта, формируется'за счет механизмов, не,связанных со свободнорадикальным ПОЛ в нервной системе. Это позволяет думать о том, что активация ПОЛ при развитии ЭпА имеет вторичный характер.

До проведения настоящих исследований активацию процесса ПОЛ в ЦНС животных (крыс) наблюдали при 3-х способах индукции генерализованных судорог, а именно: 1) судорогах, вызванных гипербарической оксигенацией (Р.Лоаппу е1 а1.,1970; А.И.Лукаш и др., 1977), 2) судорогах, индуцированных подкожным введением камфоры (Ю.Е.Вагин и др.,1975), н 3) аудпогенных миоклонических судорогах, возникающих у крыс с генетической к ним предрасположенностью ( линия Крушинского - Молодкиноп ) ( Р.Н.Копаладзе и др.,1976 ). Результаты, описанные в разделах 1-3 настоящей главы, отличаются от ранее полученных данных рядом преимуществ, к которым относится следующее. 1. Исследования активности процессов ПОЛ проводились с обязательным электрофизиологическим контролем. 2. Установлено, что ПОЛ активируется в области ЦНС, где развивается ЭпА и сохраняется на прежнем уровне в области головного мозга, где гиперактивность отсутствует. 3. Показано, что использованные конвульсанты сами, по себе не влияют на- активность ПОЛ в нервной ткани. 4. Активность ПОЛ была обнаружена при очаговой ЭпА, при которой в значительно меньшей степени, чем при генерализованных судорогах,выражены изменения со стороны других систем и органов. 5. В проведенных опытах об активности ПОЛ в нервной ткани судили одновременно по уровню продуктов переокисления трех типов, что практически исключает возможность методических артефактов.

6. Наряду с активацией ПОЛ в коре головного мозга было обнаружено увеличение уровня продуктов ПОЛ в СИ и в периферической крови. 7. Показано, что активация ПОЛ при развитии ЭпА имеет вторичный характер.

В последующем другими авторами были получены новые подтверждения активации процесса ПОЛ в ЦНС при развитии у животных ЭпА.Это прежде всего исследования Willemore и Rubin (1980-1984), продемонстрировавших наличие данного эффекта при очаговой ЭпА, вызванной внутрикорковой инъекцией растворов 2-х и 3-х валентного железа.

Анализируя совокупность полученных данных, можно прийти к трем выводам. 1. Развитие у животных разных форм ЭпА, индуцированных различными конвульсантами, сопровождается некомпенсированным усилием в области гпперактивносги процесса ПОЛ. 2. Активация ПОЛ в ЦНС при развитии ЭпА является вторичной, не связанной с повреждением механизмов нейроналыюй регуляции, предшествующим появлении сиперактивности. 3. Параллельно с активацией ПОЛ в ЦНС при ЭпА наблюдается увеличение уровня, продуктов ПОЛ в крови животных.

Глава V. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НЕКОМПЕНСИРОВАННОМ АКТИВАЦИИ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ. ПРОТИ-В0СУД0РОИЮЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИОКСИДАНТОВ.

Наиболее адекватным способом выяснения патогенетической роли усиления процесса ПОЛ при возникновении ЭпА является, очевидно, исследование степени и вида зависимости ЭпА от данного эффекта. Прямым способом воздействия на выраженность эффекта активации ПОЛ является введение в организм животного ингибиторов данного процесса - АО. Исходя из этого, было изучено влияние АО на интенсивность ПОЛ в коре головного мозга крыс при ЭпА и интенсивность развивающейся ЭпА. Были применены 4 АО, относящиеся к разным классам химических соединений: жирорастворимые - ТФ и ионол, а также водорастворимые - 3-ОП н эномеланин (смесь полимерных соединений - мёланиновых пигментов).

Предварительное введение крысам ТФ в дозе 100 мг/кг приводило через 1 сут после инъекции к повышению содержания этого АО на 25 "/. в ткани головного мозга и на 50 % в плазме крови. При этом предотвращалась активация ПОЛ в коре головного мозга, наб-

людавшаяся при индукции у животных очаговой и первично-генерализованной ЭпА. Аналогичные результаты получены и при введении ионола в дозе 100 мг/кг до индукции очаговой ЭпА.

Наряду с антмоксидантным действием, предварительное внутри-брюшинное введение ТФ пли ионола оказывало на модели очаговой ЭпА и выраженное противосудорожное действие. В 2.5-3.5 раза увеличивалась длительность латентного периода возникновения первого ИИР; в 3-3.5 раза возрастала длительность латентного периода появления первого ИР и значительно в 5-6 раз уменьшалось число ИР, регистрируемых за время жизни очага ЭпА. Частота ИИР и длительность ИР после введения АО не изменялись. Противосудорожное действие ТФ и ионола зависело от их дозы. Максимальный антиконвульсивный эффект был отмечен при дозе АО - 100 мг/кг.Увеличение дозы АО более 120 мг/кг приводило к снижению их противосудорож-ной активности.

На модели первично-генерализованной ЭпА противосудорожное действие ТФ проявлялось при низких дозах конвульсанта (порядка 10/мг/кг). При дозах бемегрнда 15 мг/кг и более предварительное ■ введение ТФ на клиническую картину судорог практически не влияло. Вместе с тем при судорогах, вызванных такими дозами конвульсанта, ТФ заметно усиливал противосудорожное действие диазепама. При инъекции животным летальных доз конвульсанта АО снижал процент летальных исходов. Так при дозе бемегрида 20 мг/кг предварительное введение ТФ в дозе 100 мг/кг увеличивало выживаемость крыс в 3 раза (Р<0.02).

Водорастворимые соединения, относящиеся к классу 3-оксипи-ридинов, обладают высокой A0A (Т.А.Воронина и др.,1984;1988). Введение крысам 3-0П на фоне уже развившейся очаговой ЭпА вызывало ее ослабление. Противосудорожное действие З-ОП начинало проявляться при дозах АО порядка 50 мг/кг массы и было максимально выражено при введении З-ОП в дозе - 150 мг/кг. Через 1-3 мин после введения З-ОП в этой дозе на стадии выраженной судорожной активности ИР прекращались, а амплитуда и частота ИИР постепенно уменьшались. У 2/3 животных ИР больше не возобновлялись, у остальных крыс они появлялись вновь только через 40-60 мин после инъекции АО.

Предварительное, за 40 мин до аппликации пенициллина, введение З-ОП в дозе 150 мг/кг массы предотвращало появление у

животных ИР. Длительность латентного периода появления первого ИИР увеличивалась при этом с 89 7 с в контроле до 224 + 37 с в группе крыс, которым предварительно был введен 3-0П. Предварительное введение 3-ОП было эффективно и при бемегрид-индуциро-ванной первично-генерализованной ЭпА, в случае использования средних доз конвульсанта!до 20 мг/кг). При инъекции крысам летальных доз бемегрида, 3-ОП существенно увеличивал выживаемость животных.

Введение эномеланина в дозе 100 мг/кг на стадии выраженной очаговой ЭпА аналогично 3-ОП вызывало быстрое угнетение икталь-ной активности. После инъекции АО на ЭКоГ регистрировалось не более 1-2 ИР, а спустя 8-10 мин прекращались и ИИР, после чего ЭКоГ в течение 40-90 мин практически не отличалась от нормальной.

Способность АО - замедлять развитие различных видов ЭпА, а также существенно ослаблять ее интенсивность была подтверждена в работах других авторов. Так Rubin и Willemore (1980; 1981) показали, что введение крысам ТФ в дозе 100 мг/кг массы защищает животного от развития ЭпА, индуцированной внутрикорковой инъекцией растворов железа. Е.Б.Бурлакова и др. (1981) описали противосу-дорожное действие АО из класса 3-окснпиридинов, а Т.В.Архипова и др.(1986) - понола на модели аудпогенных миоклонических судорог. Работы по изучению психотропного действия 3-оксипиридинов, выполненные Т.А.Ворониной, Л. Д. Смирновым и др. (1990), показали, что 3-0П в значительной степени подавляет или предупреждает судороги, вызываемые кобальтом, тносемикарбазидом, коразолом, стрихнином, ареколином и электрическим током.

Эксперименты, проведенные с АО, позволили установить по крайней мере 4 факта, важных для последующих выводов. 1. С помощь» предварительного введения АО можно предотвратить активацию ПОЛ в ЦНС,наблюдавшуюся при развитии различных еидов ЭпА. 2. АО, относящиеся к разным классам химических соединений, обладают-ярко выраженным противосудоромым действием. 3. Несмотря на предотвращение антиоксидантамп активации ПОЛ в ЦНС,воздействие конвульсанта все же вызывает развитие у животных ЭпА, которая впрочем заметно ослаблена и развитие ее существенно отсрочено. 4. Ингибирующее влияние АО на ЭпА в большей степени выражено для иктальной активности, чем для пнтерпктлльнои.

Первые два, из установленных фактов, свидетельствуют о важной роли некомпенсированном активации ПОЛ в генезе ЭпА. 3-й факт подтверждает вывод о вторичности активации ПОЛ при развитии ЭпА. И наконец, на основании 4-го можно говорить о том, что активация ПОЛ, по-видимому, более существенна для генерализации гиперактивности, чем для ее возникновения. Хотя увеличение длительности латентного периода появления на ЭКоГ 1-го ИИР, наблюдаемого после введения крысам жирорастворимых АО, также как и подавление интериктальной активности водорастворимыми АО свидетельствует об участии активированного ПОЛ и в структурно-функциональных перестройках нейрона, приводящих к его гиперактивности.

Следующая серия экспериментов была посвящена изучению влияния противосудорохных препаратов, относящихся к разным классам химических соединении на ПОЛ в модельных биологических системах. Были отобраны 4 соединения, из числа наиболее часто используемых в практике мирового здравоохранения: фенобарбитал, дифенин, фе-назепам и вальпроат натрия. Исследовали их влияние на активность процесса ПОЛ в двух различных по своей метаболической активности системах: 1) лппосомах, сформированных из яичного лецитина, и 2) гомогенатах, приготовленных из ткани головного мозга крыс. В липосомах изучали кинетику накопления ТБКП в ходе АЗПОЛ, в гомогенатах головного мозга - кинетику накопления ТБКП в процессе АЗПОЛ и ФПОЛ.

Установлено,что фенобарбитал в диапазоне концентраций 10~°-10~3М не влияет на АЗПОЛ в липосомах и на ФПОЛ в гомогенате мозга. В то же время в гомогенате мозга фенобарбитал на 20 V. ингибировал АЗПОЛ. Дифенин в концентрациях 10~6- 10~4 М не влиял на АЗПОЛ в липосомах и ингибировал оба типа процесса ПОЛ в гомогенате головного мозга: на 20 7. - АЗПОЛ и на 40'/. - ФПОЛ. Феназе-пам при концентрациях 10~5- 10~3 М подобно дифенину не влиял на АЗПОЛ в яичном лецитине и ингибировал АЗПОЛ и ФПОЛ в гомогенате мозга, соответственно на 30 и 50 У., Наконец, вальпроат натрия в концентрации до 10~4М не влиял на АЗПОЛ в липосомах и гомогенате и ингнбировал на 257. ФПОЛ в гомогенате головного мозга.

Итак, из 4-х апробированных соединений, по всей вероятности, ни одно не является истинным АО, поскольку на АЗПОЛ в, простой не иетаболизирующей системе - в липосомах не влияет. Вместе с тем фенобарбитал и вальпроат натрия ингибировали соответствен-

но АЗПОЛ и ФПОЛ в гомогенате головного мозга, а днфенин и фена-зепам ингибировалн в гомогенате оба типа ПОЛ. Ранее ингибирующее влияние других барбитуратов, в частности тиопентала, на ПОЛ в гомогенате головного мозга обнаружили Smith et al. (1979). По-видимому, влияние данных препаратов на скорость накопления ТБКП в гомогенатах нервной-ткани обусловлено их влиянием на определенные компоненты в системе регуляции процесса ПОЛ в нервной системе, причем это влияние может быть непрямым. Выяснить конкретные мишени для исследованных препаратов, связанные с системой регуляции ПОЛ, пока не удалось. Можно лишь полагать, что для фенобарбитала, дифенина и феназепама, и вальпроата натрия они различны.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об ин-гибирующем влиянии фармакологических препаратов, широко используемых в протнвосудорожнон терапии, на активность ПОЛ в нервной ткани.Возможно, это усиливает или даже в определенной степени обусловливает их антиэпилептическое действие. В любом случае результаты этих исследований подтверждают важность некомпенсированной активации ПОЛ в ЦНС для патогенеза ЭпА.

Глава VI. МЕХАНИЗМ НАРУШЕНИИ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИИ ЛИПМДОВ ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

Принципиальными причинами некомпенсированной активации ПОЛ в тканях организма животного п человека могут быть недостаточность АОС при нормальном, неизменном уровне инициирования ПОЛ и активация реакций инициирования л/лли разветвления свободноради-кальных цепей при сохраненной, сниженной или недостаточно увеличенной для новой ситуации активности АОС. Изучение причин дисбаланса в системе регуляции ПОЛ, обнаруженного при развитии ЭпА, было начато нами с исследования состояния АОС.

Состояние АОС в ЦНС к рыси и в ее организме в целом оценивали по величине параметров этой системы соответственно в ткани головного мозга и в периферической крови животного. В качестве параметров АОС определяли активность основных "антиоксидантных" ферментов: СОД,ГП и ГР, а также измеряли содержание главного антиоксиданта организма животных п человека - ТФ.

В 1-ой серии опытов тибрили значения параметров АОС при постепенном увеличении у ьрис с/доромюп готовности, наолюдаю-

щемся в процессе кораэолового "кнндлинга". Как и в случае с определением ТБКП, животные по степени судорожной готовности были разделены на 3 группьг.1) крысы без судорожной активности (5-е сутки"киндлинга"); 2) животные с повторными клоническими судорогами всего туловища (17-е сутки) и 3) крысы с клонико-тонически-ми судорогами (32-е сутки). Установлено, что в головном мозге и крови крыс, которым вводили субпороговые дозы конвульсанта, активность "антиоксидантных" ферментов и уровень ТФ не изменяются по сравнению с контролем. Это свидетельствует о неизменности активности ДОС в ЦНС кнеотиых при постепенном повышении чувствительности их головного мозга к воздействию эпилептогена. Данный факт хорошо согласуется с отсутствием при "киндлинге" изменений уровня в головном мозге крыс ТБКП п подтверждает справедливость вывода о вторпчности нарушений регуляции процесса ПОЛ при генезе ЭпА.

Во 2-ой серии экспериментов величину параметров ДОС в ЦНС и крови крыс определяли в динамике развития у животных первично-генерализованной ЭпА.Исследования проводили в три периода развития ЭпА: 1) период начальных судорожных проявлений, 2) через 1-2 мин после приступа генерализованных судорог; 3) через 13-15 мин после приступа генерализованных судорог. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в динамике развития первично-генерализованной ЭпА активность ферментов АОС в головном мозге крыс и содержание в нем ТФ не изменяется. В крови крыс через 13-15 мин после приступа судорог активность ГП и ГР, а также содержание ТФ сохранялись на неизменном уровне. Вместе с тем в крови животных на этой стадии было обнаружено существенное снижение активности СОД, которое составило 20-30У. от контроля. Через 13-15 мин после приступа генерализованных судорог уменьшалась и лерекнсная резистентность эритроцитов. Поскольку перекисная резистентность эритроцитов зависит и от уровня в крови продуктов ПОЛ, и от активности АОС эритроцитов, то вполне возможно, что снижение перекисной резистентности эритроцитов обусловлено действием двух причин одновременно. С одной стороны, увеличением уровня продуктов ПОЛ в крови, обнаруженным после приступа генерализованных судорог, и понижением активности эритроцитарной СОД, с другой стороны.

Итак, проведенные опыты показали, что острое развитие

первично-генерализованной ЭпА не сопровождается какими-либо изменениями компонентов ДОС в ННС животных. Следовательно, некомпенсированная активация ПОЛ, возникающая при индукции быстро развивающейся ЭпА не связана с ослаблением функционирования АОС. Однако это не означает, что сохранение активности АОС в ЦНС на неизменном уровне при развитии ЭпА оказывается достаточным для контролирования процесса ПОЛ. Более того, накопление в ЦНС при ЭпА продуктов ПОЛ указывает на функциональную недостаточность АОС. Проверить справедливость данного вывода можно, исследуя влияние увеличения мощности АОС на эффективность действия кон-вульсанта и активность в нервной ткани процесса ПОЛ.

Увеличить мощность (активность) в тканях АОС можно различными способами, в том числе и с помощью введения животным АО или препаратов антиоксидантных ферментов. В предыдущей главе было показано, что введение крысам разных АО и в первую очередь ТФ и ионола, проникающих через гематоэнцефалпческий барьер, предупреждает активацию в ЦНС процесса ПОЛ, вызываемую введением кон-вульсантов, и резко уменьшает эффективность их действия. Следовательно, исходная мощность АОС оказывается недостаточной для поддержания гомеостаза в системе регуляции ПОЛ после воздействия конвульсантов. Об этом же свидетельствуют и результаты изучения влияния введения препарата СОД на очаговую ЭпА,а также на интенсивность в области очага ЭпА процесса ПОЛ. Предварительно было установлено, что сам пенициллин на активность СОД не влияет.

Введение СОД в дозе 1 иг/кг массы не влияло на активность данного фермента в коре головного мозга интактных крыс. Судя по этим данным, СОД в нормальных условиях не проникает через гема-тоэнцефалическии барьер. Однако при развитии ЭпА проницаемость гематоэнцефалического барьера для СОД может возрастать как это имеет место для других макромолекулярных соединений. Оценить влияние введения экзогенной СОД на активность данного фермента в очаге ЭпА сложно из-за недостаточности количества отбираемой из очага ткани. Вместе с тем, этой ткани достаточно для определения в очаге ЭпА уровня ТБКП.. Воспользовавшись этим, мы установили, что предварительное введение крысам препарата СОД приводит к уменьшению содержания ТБКП в коре головного мозга (область очага ЭпА) животных с ЭпА, то есть ослабляет эффект активации ПОЛ. вызываемый конвульсантом. Это свидетельствует о проницаемости

гематоэнцефалического барьера для СОД при судорогах, а также о том, что введение препарата СОД увеличивает мощность АОС коры головного мозга животных с ЭпА.

Одновременно с ослаблением ПОЛ в ЦНС предварительное введение крысам СОД вызывало существенное уменьшение эффективности действия на' них конвульсанта (пенициллина). Увеличивалась длительность латентных периодов появления первого НИР и первого ИР, а также резко снижалось число ИР, регистрируемых за время жизни очага ЭпА. Это свидетельствует о перспективности использования препаратов СОД в терапии заболеваний, связанных с нарушениями регуляции ПОЛ, проявляющимися некомпенсированной активацией данного процесса. Так как в этом случае даже при отсутствии "структурной" недостаточности АОС, очевидно, имеет место ее функциональная недостаточность.

Итак, по всей вероятности, исходной причиной активации процесса ПОЛ в ЦНС при развитии ЭпА является интенсификация реакций инициирования и разветвления свободнорадикальных цепей при сохраненной (по крайней мере на первых этапах эпилептогенеза) активности АОС. Можно предположить несколько путей, способных привести к активации реакций инициирования и разветвления ПОЛ. Это, во-первых, увеличение содержания в нервной ткани окислителя - 02 ;во-вторых, увеличение содержания субстрата переокисления - ПНЖК или его доступности инициаторам и катализаторам; в третьих, усиление образования инициаторов ПОЛ в ферментативных процессах, в частности активация генерации 0" , Н202 и ОН" в электронпереносящих цепях; и в четвертых, возрастание уровня или активности катализаторов ПОЛ, например, ионов железа. Рассмотрим вероятность этих вариантов.

Имеются данные, свидетельствующие о значительном возрастании локального кровотока в головном мозге животных уже в первые минуты после воздействия конвульсанта, что говорит об усилении снабжения нервной ткани кислородом! В. Ме1с1гит, 1983; В^ез^, Т.У1е1осЬ, 1986). Однако этот эффект наблюдается одновременно с резкой активацией в нейронах кислород-зависимых метаболических процессов, так что возникает относительная недостаточность поступающего 02 для нужд клеточного метаболизма, перешедшего на новый,значительно более высокий уровень. Следовательно, значимое для ПОЛ увеличение в нервной ткани концентрации свободного кис-

лорода при возникновении ЭпА вряд ли возможно.

Маловероятно и то, что причиной активации ПОЛ при ЭпА явля-.я увеличение содержания в ЦНС субстрата переокисления, то ,'сть ПИК. Как показали исследования (B.Siesjo et al.,1980), суммарный уровень в головном мозге ПНИ остается неизменным в течении 1 ч периодической ЭпА.

Вопрос об изменении при ЭпА доступности ПНЖК инициаторам и катализаторам ПОЛ более сложен. В нервной ткани ПНИ находятся в основном во фракции фосфолипидов, причем, как правило, во 2-ом положении молекулы фосфолипида (М. But1ег,С.Abood,1982). Поэтому увеличение доступности ПНЖК инициаторам и катализаторам ПОЛ потенциально возможно либо при гидролизе молекул фосфолипидов с помощью фосфолипазы Аг, в результате чего образуются СЖ, полиненасыщенные связи которых более доступны активаторам ПОЛ, либо при общем "разрыхлении" нейрональных мембран.Если это заключение справедливо, то активность ПОЛ в нервной ткани должна находиться в прямой зависимости от активности в ней фосфолипазного гидролиза липидов (ФГЛ). Чтобы установить существует ли такая зависимость на самом деле, мы исследовали взаимосвязь процессов ПОЛ и ФГЛ в нативных синаптосомах, а также в синаптосомах предварительно обработанных инициаторами и ингибиторами данных процессов. При этом об активности ПОЛ и ФГЛ судили по уровню в суспензии синаптосом ТБКП и СЖК соответственно. Результаты этих опытов свидетельствуют о существовании выраженной прямой зависимости интенсивности ПОЛ в нервных окончаниях от активности в них ФГЛ. Это хорошо согласуется с данными J.Beckman с соавт. (1987), наблюдавшими аналогичный эффект в микросомах печени. По всей вероятности, механизм этого эффекта следующий. Активация фосфо-липаз типа А приводит к накоплению в мембранах СИ и лизоформ ФЛ, что сопровождается вследствие хаотропного действия продуктов гидролиза уменьшением вязкости липидного бислоя мембран. В результате увеличивается доступность субстрата окисления - двойных связей ПНЖК для инициаторов и прооксидантов. Другая причина -увеличение содержания ПНЖК в свободном состоянии, в котором они окисляются с существенно большей скоростью, чем эстерифицирован-ные ЖК (М.Н. Мерзляк и др,19751.

Итак, активация ФГЛ в нервной.ткани в принципе может быть причиной активации в ней процесса ПОЛ. Далее следовало выяснить,

сохраняется ли зависимость интенсивности ПОЛ в нервных клетках от интенсивности в них ФГЛ в естественных условиях и в условиях воздействия на ЦНС эпилептогена. Для получения ответа на этот вопрос была изучена активность ПОЛ в сннаптосомах при разных способах их деполяризации. Целесообразность проведения этих опытов диктовалась тем, что, во-первых, стойкая деполяризация нейрональной мембраны является одним из наиболее характерных признаков изменения ее свойств при эпилептогенезе. Во-вторых, тем, что деполяризация синаптосом приводит, как известно (В.Bradford,1983; D. Birkle,N.Bazan,1984), к активации в этих образованиях эндогенных фосфолипаз и в первую очередь фосфолипа-зы Использовали три способа деполяризации синаптосом:

1) электростимуляцию суспензии синаптосом, 2) увеличение концентрации в среде инкубации синаптосом ионов К* и 3) ингибирова-ние Na.K-дТФазы синаптосом добавлением к ним уабаина.Обнаружено, что три разных способа деполяризации изолированных нервных окончаний, вызывающие активацию внутрисинаптосомальной фосфолипазы А2 , приводят к активации процесса ПОЛ.

В следующей серии экспериментов было изучено состояние ФГЛ в коре головного мозга крыс при развитии у животных первично-генерализованной и очаговой ЗпА. Интенсивность ФГЛ оценивали по уровню СЖК в гомогенатах сенсомоторной коры головного мозга, взятой из области генерирующей ЭпА. В случае генерализованной ЭпА кору головного мозга отбирали через 15-20 мин после приступа клонико-тонических судорог, в случае очаговой ЭпА - на стадии выраженной ЭпА.

Оказалось, что уровень СЖК в гомогенатах головного мозга контрольных крыс составляет 14»3 мкг/мг белка. Развитие генерализованной ЭпА приводило к увеличению содержания СЖК в гомогенатах коры до 35+4 икг/.мг белка. Образование коркового очага ЭпА также сопровождалось двукратным возрастанием содержания СЖК в коре головного мозга крыс.Итак, развитие первично-генерализованной и очаговой ЭпА приводит к значительному увеличению содержания СЖК в коре головного мозга крыс. Сравнительно быстрое возрастание уровня СЖК позволяет исключить из числа возможных причин этого эффекта синтез ЖК de novo. Другими причинами увеличения содержания СЖК при ЭпА могли быть активация одного, или одновременно нескольких ферментов, участвующих в гидролизе мемб-

ршшых ФЛ, а именно: а) фосфолипазы А^ б) фосфолипазы А2, в-д) фосфолипазы С, диацилглицерид- и моноацилглицерид-липаз; а тлкже активация процесса ПОЛ.

Результатом активации эндогенной фосфолипазы А^ учитывая что этот фермент "атакует" эфирную связь, расположенную в молекуле фосфолипида в 1-ом положении, где преимущественно эстери-фицируется стеариновая кислота (в меньшей степени - пальмитиновая) , должно явиться накопление последней и увеличение уровня соответствующих лизоформ. Активация фосфолипазы А2 , катализирующей гидролиз эфирной связи во 2-ом положении, должна привести к аккумуляции арахидоновой кислоты (в меньшей степени - докоза-гексаеновой) и также лизоформ. Активирование трехстадийного гидролиза фосфолипидов, осуществляемого последовательно фосфоли-пазой- С, диацилглицерид- и моноацилглицеридлипазами, должно сопровождаться увеличением уровня диацилглицеридов, моноацилгли-церидов и примерно в равной степени содержания стеариновой (пальмитиновой) и арахидоновой (докозагексаеновой) СЖК.Активация ПОЛ, наблюдаемая при развитии ЭпА, должна приводить к изменению спектра СЖК, эстернфпцированных в ФЛ, в сторону снижения относительного содержания в фосфолипидах ПНЖК и к увеличению в спектре СЖК доли короткоцепочечных ЖК. Исходя из этих соображений, уточнить метаболические пути накопления в нервной ткани СЖК можно с помощью изучения при ЭпА изменений спектра отдельных липидных фракций, их ЖК-состава и спектра фракций СЖК.

Рассмотрим данные, полученные при анализе спектра СЖК, экстрагированных из коры головного мозга крыс, проведенного с помощью метода газо-жидкостной хроматографии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при развитии у крыс бемегрид-индуцнрованной первично-генерализованной ЭпА в нервной ткани преимущественно накапливается стеариновая кислота и имеется выраженная тенденция к увеличению содержания арахидоновой кислоты; одновременно отмечается значительное снижение в суммарном уровне СЖК доли короткоцепочечных ЖК. Исходя из этих результатов, а также данных (В.^ез.р е1 а 1. , 1980), показавших, что развитие бикукуллин-индуцированных судорог не сопровождается изменением доли в фосфолипидах фракций эстерифицированных ПНЖК, можно заключить, что активация ПОЛ маловероятна в качестве значимой причины повышения уровня СЖК при ЭпА. Наиболее вероятными процесса-

ми, активация которых обусловливает обнаруженное увеличение уровня СЖК и изменения в их спектре доли отдельных фракции ЖК -стеариновой и арахидоновой - является,. по-видимому, гидролиз фосфолипидов фосфолипазами Aj и ; вполне возможно такие его сочетание с трехстадийным гидролизом фосфолипидов,осуществляемым последовательно фосфолипазой С, диацилглицерид- и моноацилглице-рид-липазами.

Обнаруженный эффект - увеличение содержания СЖК в коре головного мозга крыс при развитии у них ЭпА - хорошо согласуется с данными других исследователей. Наиболее подробно этот феномен был описан при бикукуллпн-индуцпрованных судорогах в работах N.Bazan et al. (1970-1991) н A.Chapman et al.(1980;1981).

Основной причиной активации ФГЛ в нейронах является очевидно, резкое увеличение при возникновении гиперактивности концентрации внутринейронального Са2* (Н. Bradford, D. Peterson, 1987; E.Speckmann et al.,1989; Siesjo, 1989). Другой причиной может быть накопление при ЭпА в нейронах аденозина. Это происходит из-за вызванных гиперактивацией больших энергетических затрат, приводящих к расщепление АТФ до АДФ и АЫФ и активации в этих условиях 5--нуклеотидазы (N.Bazan et al.,1986). Накопленный аденозин активирует аденилатциклазу, что сопровождается значительным повышением концентрации цАМФ и как следствие этого активацией фос-фолипазы А2 (J.Chang et al.,1987). Возможна также гормональная или медиаторная активация фосфолипазы А2 , через влияние этих соединений на уровень цАМФ или через систему вторичных мессенд-жеров ' (N.Bazan et al.,1986). Кроме того, активность фосфолипазы А2 зависит от структурного состояния мембраны, поскольку от него зависит конформацпя этого мембраносвязанного фермента и доступность его активного центра для активаторов.

Следовательно, при гиперактивации нейронов активность

фосфолипазы А может увеличиваться благодаря действию различных

2 +

факторов, таких как: возросшая концентрация Са внутри нервных клеток, увеличение уровня цАМФ вследствие "перегрузки" 'нейрона аденозином или активации мембранных рецепторов, изменения "текучести" мембраны. Возможно, по-видимому, включение и других механизмов.

Итак, при индукции ЭпА происходит активация эндогенных фос-фолипаз н липаз, причем в наибольшей степени фосфолипаз типа А.

В свою очередь активация фосфолипаэ может привести к активации процесса ПОЛ. Если при эпилептогенезе это действительно имеет место, то предупреждение активации ФГЛ также должно приводить к предупреждению и ослаблению ЭпА.Проверяя выполнение этого требования, мы изучали влияние ингибитора фосфолипаэ типа А - нико-тшгамида на очаговую пеницнллнн-нндуцированную и первично-генерализованную бемегрид-индуцированную ЭпА. В результате было установлено, что никотинамид оказывает ингибирующее действие на очаговую ЭпА и защищает животных от гибели при генерализованной ЭпА.

Подводя итоги анализу факторов и предположений, касающихся взаимосвязи процессов ПОЛ и ФГЛ при эпилептогенезе, можно заключить, что есть веские основания считать активацию эндогенного ФГЛ одной из основных причин некомпенсированной активации ПОЛ, наблюдающейся при развитии ЭпА.

Некомпенсированная активация процесса ПОЛ приводит к структурно-функциональным повреждениям различных клеточных мембран, в том числе и возбудимых (Л. Л. Прилипко, Р. Р. Лидеман, 1982; А.А.Шведова и др.,1982; М.Braughler, 1985; Т. Pellmer,1987). Можно полагать, что по крайней мере, часть нарушений проницаемости возбудимых мембран и работы мембракосвязанных ферментных и рецептор-ных комплексов, наблюдающихся при эпилептогенезе, обусловлена активацией в нейронах процесса ПОЛ. С целью выяснения возможных последствий некомпенсированной активации ПОЛ в нейронах было изучено влияние прооксндантов на проницаемость синаптических мембран для потенциал-образующих нонов, вязкость мембран и аффинность их бензодиазепиновых рецепторов. Действие активаторов ПОЛ на проницаемость мембран синаптосом и вязкость синаптических мембран исследовали в опытах in vitro. Аффинность бензодиазепиновых рецепторов изучали в экспериментах in vivo. При этом сравнивали параметры связывания эН-диазепама с синаптическими мембранами, выделенными из коры головного мозга нативных крыс и крыс, у которых предварительно индуцировали первично-генерализованную ЭпА (бемегрид - 24 мг/кг массы). Животных декапитировали через 10-15 мин после приступа клонико-тонических судорог. В этот период времени уровень продуктов ПОЛ увеличивался в коре головного мозга крыс в 1.5-3.0 раза, свидетельствуя об активации в нервных клетках данного процесса.

0 проницаемости мембран синаптосом для потенциал-образующих ионов ( ионов К* и Ма+) судили по величине ТМПС. Изменения ТМПС регистрировали с помощью флуоресцентного зонда - сИ5-С3-(5). ПОЛ в синаптосомах индуцировали тремя способами: 1) добавляя к суспензии синаптосом смесь ГеБ04 + аскорбиновая кислота, или 2) смесь - РеБ04 + НАДФ'Н, а также 3) облучая суспензию синаптосом УФ-светом. Исходный уровень ТБКП в суспензии синаптосом был равен 2-4 нмоль/мг белка. Добавление к суспензии синаптосом активаторов АЗПОЛ или ФПОЛ приводило через 30 мин инкубации при 37°С к увеличению в суспензии уровня ТБКП в 2.5-3.0 раза.Степень увеличения содержания продуктов ПОЛ в нервных окончаниях соответствовала таковой, наблюдавшейся в нервной ткани (коре головного мозга) при развитии в ней ЭпА. Вместе с тем, несмотря на выраженную активацию в синаптосомах процесса ПОЛ изменений их ТМП в этих условиях не наблюдалось. По всей вероятности, в структуре синаптических мембран предусмотрены специальные приспособления, обеспечивающие их защиту от факторов, способных изменить проницаемость мембраны и тем самым сделать ее функционально непригодной. Причем успешной реализации действия защитных механизмов в нашем случае способствует равномерность воздействия на мембрану повреждающего фактора - активаторов ПОЛ. Следует, вероятно, ожидать большей повреждающей эффективности действия активаторов ПОЛ, если это воздействие сконцентрировано на определенные участки мембраны н в первую очередь на ее ионные каналы.

Учитывая то обстоятельство, что в состав ионных каналов си-наптической мембраны входят интегральные белки, содержащие ароматические аминокислотные остатки, можно попытаться индуцировать ПОЛ не равномерно в плоскости синаптической мембраны, а локально в месте расположения ионных каналов. Сделать это можно с помощью облучения суспензии синаптосом УФ-светом в диапазоне длин волн -260 - 320 нм, соответствующем диапазону поглощения ароматических аминокислот мембранных белков. В этом случае происходит фотоокисление ПИК, входящих в состав липидов, окружающих интегральные белки, причем ароматические группы белков выступают в роли фотосенсибилизаторов. Проверяя это, было обнаружено, что даже кратковременное облучение суспензии синаптосом УФ-светом в диапазоне 260-300 нм вызывает резкое уменьшение ТМПС.

В следующей серии1экспериментов было изучено влияние активации АЗПОЛ на мпкровязкость липидного бислоя синаптических мембран. О вязкости мембранных липидов судили по степени зксиме-ризацин в них флуоресцентного зонда - пирена. Добавление смеси FeSO^ + аскорбиновая кислота приводило к активации в мембранах процесса АЗПОЛ, что проявлялось увеличением содержания в мембранах ТБКП в 3-4 раза через 30 мин после введения прооксиданта. В результате активации АЗПОЛ в синаптических мембранах величина вязкости их липидов увеличивалась в 1.7 раза.

Изучение влияния ПОЛ на свойства бензодиазепиновых рецепторов (БДР) синаптических мембран показало, что зависимость количества 3Н-диазепама, связанного с ФСМ, выделенной из головного мозга интактных крыс, от концентрации метки в среде инкубации имеет в координатах Скэтчарда линейный характер. Это свидетельствует о существовании только одного типа мест связывания, параметры которого равны: константа диссоциации - Кд=4.4 +

0.05 нМ и максимальное число мест связывания В.,„„=410 + 35

макс -

фмоль/мг белка.

Развитие у крыс первично-генерализованной ЭпА не изменяло линейности данной зависимости. Однако через 10-15 мин после судорожного приступа, максимальное число связывания для 3Н-диа-зепама возрастало до 550 + 12 фмоль/мг. Наряду с этим наблюдалось увеличение и Кд до 6.7 + 0.75 нМ.

Вся совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что часть нарушений функционирования нейрональных мембран, наблюдаемых при возникновении ЭпА, может быть обусловлена некомпенсированной активацией в нервной ткани процесса ПОЛ. Это относится к увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны для ионов К+, способному привести к ее стойкой деполяризации, и к уменьшению аффинности бензодиазепиновых рецепторов, вызывающему снижение "тормозного" контроля за активностью нейрона.

Глава VII. СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У БОЛЬНЫХ ЭПИЛЕПСИЕИ.

Данные, полученные при моделировании парциальной и первичной генерализованной -эпилепсии на животных, свидетельствуют о важной роли некомпенсированной активации процесса ПОЛ, в патогенезе ЭпА. На их основании можно предположить'следующее: 1). В

организме больных с парциальной и генерализованными формами эпилепсии могут иметь место нарушения протекания процесса ПОЛ. 2). Эти нарушения имеют патогенетическое значение. 3). Нарушения в системе регуляции процесса ПОЛ у больных эпилепсией, выражающиеся некомпенсированной активацией данного процесса, можно компенсировать с помощью назначения больным антиоксидантов.4).Включение АО в комплексную противосудорожную терапию больных с нарушениями регуляции ПОЛ должно способствовать увеличению эффективности лечения.

Состояние процесса ПОЛ в организме больных с различными формами эпилепсии изучали путем определения содержания продуктов ПОЛ в плазме крови и в СМЖ.Исследовали плазму крови у 57 больных с различными формами эпилепсии и у 15 доноров, не страдающих психическими или хроническими соматическими заболеваниями (контроль). Группу больных эпилепсией составили мужчины в возрасте 23-39 лет, у которых преобладали судорожные генерализованные пароксизмы, простые и сложные абсансы и психосенсорные абсансы. Все больные получали традиционную противосудорожную терапию. Группу здоровых доноров составили мужчины в возрасте 20-38 лет, Кроме плазмы крови у 11 больных из общего числа исследовали СМЖ.

В -результате проведенного обследования у больных обнаружено значительное увеличение содержания в плазме крови первичных (диеновые коньюгаты) и вторичных (основания Шиффа) продуктов ПОЛ. Так уровень диеновых конъюгатов в крови больных почти в 2 раза превышал нормальные значения, а уровень оснований Шиффа превышал их в 2.5 раза. Корреляционный анализ показал, что между содержанием в плазме- крови больных эпилепсией диеновых конъюгатов и оснований Шиффа существует прямая корреляция. Коэффициент корреляции - г был равен 0.57.

Результаты, полученные нами при обследовании больных эпилепсией, были подтверждены данными, опубликованными в работах В.Г.Мхитаряна и др. (1983), А.А.Меграбяна и др.(1986), а также Р.Р.Шакаришвили (1987).

С целью выяснения состояния процесса ПОЛ у детей с судорожным синдромом было изучено содержание у них продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в плазме крови и СМЖ.

Было обследовано 45 детей с судорожным синдромом (39 с перинатальной энцефалопатией, 3 с фебрнльными припадками, 2 с

наследственной патологией, отягощенной судорогами,и 1 с судорожным синдромом невыясненной этиологии) в возрасте от нескольких месяцев до 1.5 лет и 13 взрослых доноров в возрасте 20-30 лет, не страдающих ни психическими, ни хроническими соматическими заболеваниями.

В результате исследований у детей с судорожным синдромом обнаружено повышенное содержание продуктов ПОЛ в плазме крови по сравнению с контролем. Так концентрация диеновых коньюгатов была увеличена в 5 раз и оснований Шиффа - в 2 раза. Содержание продуктов ПОЛ в СМЖ больных детей в 2-5 раз превышало таковое , в крови. Итак, результаты этих исследований свидетельствуют о значительной активности процесса ПОЛ в организме детей с судорожным синдромом. Это хорошо согласуется с данными, полученными при обследовании взрослых больных эпилепсией.

В связи с тем, что группа обследованных больных эпилепсией была неоднородной по возрасту, длительности и клиническим формам заболевания, а также по ряду других признаков, то для выделения факторов и клинических признаков, оказывающих наибольшее влияние на определяемый в крови больных эпилепсией уровень продуктов ПОЛ, была оценена значимость нехоторых из этих признаков и факторов. В качестве последних были выбраны возраст больного, длительность заболевания, нозологическая форма, наличие генерализованных судорожных пароксизмов, наличие эпилептических психозов, степень изменения личности. Изменения личности у больных были представлены эмоционально-волевыми расстройствами, проявляющимися в угнетении эмоциональных реакций и адекватной волевой активности. Установлено, что уровень продуктов ПОЛ в крови взрослых больных эпилепсией коррелирует в первую очередь с длительностью заболевания, наличием у больных выраженных изменений личности и с наличием у больных генерализованных судорожных пароксизмов. В крови детей с судорожным синдромом уровень продуктов ПОЛ коррелирует в основном с длительностью и формой судорожных приступов,, а также с наличием на ЭЭГ характерных эпилептиформ-ных изменений.

Как было продемонстрировано выше даже острое возникновение у животных ЭпА сопровождается функциональной недостаточностью со стороны ДОС, что выражается накоплением в нервной ткани, СМЖ и крови продуктов ПОЛ. Было также показано, что недостаточность

АОС имеет существенное патогенетическое значение для развития ЭпА. Совокупность этих факторов, дополненная данными, полученными при исследовании уровня продуктов ПОЛ в крови больных эпилепсией, позволяет предположить существование недостаточности АОС и в организме больных эпилепсией. Проверяя состояние АОС у больных эпилепсией (13 мужчин в возрасте 23-39 лет)с давностью заболевания 7-18 лет и высокой частотой припадков - от ежедневных до 116 раз в месяц, мы исследовали содержание в их крови ТФ и активность СОД, ГП и ГР. Все обследованные больные получали традиционную противосудорожную терапию. В качестве контроля использовали кровь 10 доноров-добровольцев, не страдающих психическими или хроническими соматическими заоолеЕанпями. Все доноры были также мужчины в возрасте 23-37 лет. Исследование крови больных эпилепсией показало, что концентрация ТФ не изменена по сравнению с контролем. Активность СОД и ГП в крови больных эпилепсией была на 20-25 '/. ниже, чем у здоровых доноров, активность ГР от нормы не отличалась.

Итак результаты исследования' состояния АОС в организме больных эпилепсией свидетельствуют о значительной недостаточности ферментов этой системы, в частности СОД и ГП. Очевидно, это вносит свой вклад в существующий дисбаланс в системе регуляции процесса ПОЛ у больных, прпводя к еще большей активации данного процесса. Результатом является резкое увеличение уровня продуктов ПОЛ в крови больных эпилепсией. Учитывая факты, полученные в экспериментах на животных, которые свидетельствуют о положительном 'эффекте включения в противосудорожную терапию антиоксидан-тов,' можно расчитывать на то, что включение антиоксидантов в комплексную противосудорожную терапию больных эпилепсией с выраженными нарушениями регуляции ПОЛ также увеличит эффективность их лечения.

Глава VIII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИ0Ш1ДАНТА - ВИТАМИНА Е В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЭПИЛЕПСИИ.

Настоящая глава посвящена изложению результатов, полученных при изучении влияния ТФ на интенсивность ПОЛ, состояние АОС, клиническую картину и биоэлектрическую активность головного мозга у больных эпилепсией, у которых традиционная терапия противосудо-рожными и психотропными средствами не дала достаточного эффекта.

Работа проводилась в два этапа. На 1-ом этапе было обследо-

-зн-

вано 17 больных эпилепсией, находившихся на стационарном лечении в психиатрической клинике. У 10 из них была травматическая эпилепсия, у 3 - инфекционного гепеза и у 4 - невыясненной этиологии. Все больные были мужчины в возрасте 16-55 лет с давностью заболевания от 3 до 40 лет. У всех больных отмечались изменения личности разной степени выраженности: от отчетливого эпилептического слабоумия до легких специфических изменений мышления, эмоций и воли. 7 больных были инвалидами 2 группы, 1 -инвалидом 3 группы. Все больные длительное время принимали в стационаре противосудорожные, а при наличии психотической симптоматики - и психотропные средства без выраженного терапевтического эффекта. У 13 больных преобладали полиморфные припадки (генерализованные судорожные, простые и сложные абсансы, припадки с психопатологическими феноменами или их сочетания!. У 6 больных аффективные синдромы занимали главное место в клинической картине. Частота пароксизмов была от 1-2 в месяц до 2-3 в сутки. У 2 обследованных наблюдались затяжные эпилептические психозы с параноидным синдромом.

У 4 больных полиморфизм припадков отсутствовал. У 1 больного были простые абсансы 1-2 раза в неделю, у 1 - вегетативно-висцеральные пароксизмы без потери сознания и судорог 3-4 раза в неделю; у 2 больных 4-5 раз в неделю возникали серийные фокальные припадки, иногда с вторичной генерализацией.

Пробы крови у больных брали до назначения ТФ на фоне проводящейся терапии и через 1 мес. после назначения препарата. В эти же сроки проводили ЭЭГ-исследования с использованием функциональных нагрузок (фотостимуляции, гипервентиляции). ТФ ( а-то-коферола ацетат, 50°/ масляный раствор в капсулах, по 0.2 г) давали внутрь по 600 мг 1 раз в сутки после еды.

У всех больных до применения ТФ было обнаружено повышенное содержание продуктов ПОЛ - оснований Шиффа в плазме крови от 30 до 330 отн.ед. при норме - 20 + 0.5 отн.ед. Различные изменения электрогенеза выявлялись у всех больных. Прием ТФ оказывал положительное терапевтическое действие. Оно выражалось в снижении в крови больных уровня оснований Шиффа в среднем со 103 отн.ед. до 58 отн.ед. (Р<0.05). У 11 больных уменьшение содержания в крови продуктов ПОЛ сочеталось с положительными изменениями на ЭЭГ. У этих больных первым клиническим признаком терапевтического

действия ТФ была активация адекватной эмоционально-волевой деятельности. Она появлялась через 2-3 недели после начала приема ТФ и характеризовалась более активным участием больных в жизни отделения. В последствии отмечалось уменьшение числа припадков. В наблюдениях N 7 и 9 у больных с серийными фокальными припадками после приема ТФ пароксизмы стали единичными (до 3 в неделю). В наблюдениях N 5, 10, 13 у больных с генерализованными судорожными припадками и дисфорией судорожные пароксизмы прекратились, дисфория в наблюдениях N 10 и 11 стала менее выраженной, а в наблюдениях N 5, 13 регрессировала. Простые абсансы в наблюдении N 17 остались прежними, но их частота уменьшилась с 1-2 раз в > неделю до 1 раза в 1-2 мес. ■

У 1 больного с эпилепсией неясного генеза (М 1) в начале заболевания (в возрасте 2 лет) наблюдались миоклонические припадки, которые с течением времени трансформировались в большие судорожные пароксизмы, возникающие в последние годы 2-3 раза в месяц. После применения ТФ припадки у этого больного приобрели характер соматосенсорных пароксизмов. У 2 больных наряду с редкими развернутыми судорожными припадками и генерализованной судорожной, активностью на ЭЭГ, наблюдались затяжные эпилептические психозы с галлюцинаторно-параноидным синдромом, которые не купировались психотропными препаратами (галоперидол, трифтазин, аминазин). После назначения больным ТФ у одного из них Ш 3) продуктивная психическая симптоматика исчезла,а у другого (№ 15) психопатологические переживания стали менее выраженными.

Особый интерес представляет наблюдение N 8. У больного первый генерализованный судорожный припадок возник в возрасте 16 лет во время послепрививочноН лихорадки. Несмотря на проводившуюся противосудорожную терапию, на протяжении 4 лет припадки возникали 1-2 раза в месяц;За 2-месяца до госпитализации больной самовольно прервал лечение. После чего частота припадков увеличилась до 4-5 в месяц. В этом случае была возможность, не опасаясь связанного с отменой протпвосудорожных препаратов учащения припадков, начать лечение только ТФ без назначения противосудо-рожных средств. В результате приема больным ТФ в его крови нормализовался уровень основании Шиффа, эпилептические припадки прекратились, а на ЭЭГ наблюдалась положительная динамика как диффузных изменений, так и эпилептиформных признаков. На фоновой

- л-

ЭЭГ уменьшились дезорганизация и дизритмня, снизилась амплитуда колебаний, диффузная патологическая активность стала менее выраженной. Сенсорные раздражители (фотостимуляция) перестали вызывать пароксизмальные разряды генерализованных медленных волн. У остальных больных этой группы также наблюдались положительные изменения на ЭЭГ: появлялся более регулярный ритм, снижалась активность синхронизирующих процессов. ЭпА хотя и осталась, но уменьшилась продолжительность к частота лароксизмальных разрядов, снижалась амплитуда составляющих их колебаний.

На 2-ом этапе работы были отобраны 9 больных эпилепсией, получавших лечение амбулаторно (в психо-неврологическом диспансере). Эту группу составили мужчины в возрасте 23-39 лет с давностью заболевания 7-18 лет и высокой частотой генерализованных судорожных припадков - от ежедневных до 1-16 раз в месяц. Предварительно у всех больных было исследовано состояние ДОС, в результате чего было обнаружено снижение в их крови активности СОД и ГП на 20-25 '/.. За 1-2 дня до назначения этим больным дополнительно к традиционным противосудорожным средствам, которые были малоэффективны, ТФ в суточной дозе - 600 мг, они проходили обследование. У больных регистрировали эндогенную биоэлектрическую активность головного мозга и ЗЭГ после фотостимуляции. Кроме того, в крови больных определяли уровень ТФ и активность СОД, ГП и ГР. При этом у всех больных на фоновой ЭЭГ наблюдались характерные эпллептиформные изменения, которые были значительно более выражены после фотостимуляции. Уровень ТФ в крови не отличался от нормы, а активность СОД и ГП была снижена на 30 У,.

Прием больными препарата ТФ сопровождался возрастанием уровня данного АО в крови на 70Й через 2 нед после начала курса антиоксидантного лечения. В это время в крови больных возрастала также активность СОД - на 11 У,. Активность ГП и ГР оставались без изменения. У всех больных отмечалось субъективное улучшение общего самочувствия: улучшение сна, исчезновение головных болей, уменьшение утомляемости, ослабление чувства тревоги, возрастание работоспособности. На фоновой ЭЭГ и ЭЭГ записанной после фотостимуляции существенных изменении не наблюдалось.

Спустя 4 нед после начала приема АО его содержание в крови больных превышало исходный уровень на 50 У.. Активность СОД была увеличена по сравнению с исходной на 15 '/,. Активность ГП и ГР

сохранялась на прежнем уровне. Клинически на фоне более выраженного улучшения общего самочувствия наблюдалось снижение частот! припадков. На фоновой ЭЭГ у всех больных отмечалось уменьшение выраженности диффузной ЭпА со снижением частоты высокоамплитуд ных разрядов. Аналогичные позитивные изменения наблюдались н. ЭЭГ и после фотостимуляции. Результаты включения АО - а-токофе рола в комплексную терапию больных эпилепсией хорошо согласуете с данными других авторов (В. Г, Мхитарян и др. , 1983; А.А.Меграбя и др.,1986).

Таким образом, назначение больным различными формами эпи лепсии, лечение которых традиционными противосудорожными препа ратами было малоэффективным, а в крови которых было резко увели чено содержание продуктов ПОЛ и снижена активность ферменто АОС, назначение таким больным антиоксиданта-ТФ дополнительно обычной терапии дало существенный положительный эффект.Последни выражался в нормализации состояния системы регуляции ПОЛ, улуч шении общего самочувствия больных, активации адекватной эмоцио нально-волевой деятельности, уменьшении частоты припадков психопатологическими феноменами и генерализацией, а также позитивных изменениях на ЭЭГ.

ВЫВОДЫ

1. Развитие в коре головного мозга животных (крыс) очаговс или первично-генерализованной ЭпА сопровождается нарушениями ре гуляции в области гиперактивности процесса ПОЛ, приводящими его некомпенсированной активации. При этом наряду с увеличение содержания продуктов ПОЛ в ЦНС наблюдается значительное повыше ние их уровня в периферической крови животных.

2. Нарушения регуляции ПОЛ являются важным звеном в патоге незе ЭпА. Предупреждение некомпенсированной активации ПОЛ помощью введения животным антиоксндантов значительно замедляе развитие ЭпА и ослабляет ее интенсивность.

3. Антиоксиданты: жирорастворимые - «-токоферол и ионол, также водорастворимые - 2-этил-6-метил-3-оксипиридин и эномел; нин обладают выраженным противосудорожным действием.

4. Противосудорожные препараты-, фенобарбитал, дифенин, вал! проат натрия и феназепам в условиях Н1 vit.ro ингибируют процес ПОЛ.

- 5. Нарушения регуляции ПОЛ при эпилептогенезе имеют втори'

иый характер.

6. Одним из механизмов, приводящим к некомпенсированной л' ■ ■ тми процесса ПОЛ при развитии ЭпЛ, является актйвация в и гиперактнвности эндогенных фосфолипаз типа А. . Острое возникновение у животных ЭпА сопровождается раз-< у них функциональной недостаточности АОС. Предварительное

ув тченне мощности АОС путем введения животным антноксидантов или препарата СОД существенно замедляет индукцию ЭпА и уменьшает ее интенсивность.

8. У больных с различными формами эпилепсии и детей с судорожным синдромом нарушена регуляция процесса ПОЛ, о чем свидетельствует резкое увеличение содержания продуктов ПОЛ в крови больных. Наибольшее увеличение уровня продуктов ПОЛ отмечено в крови больных эпилепсией, длительное время страдающих данным заболеванием, а также больных с генерализованными судорожными припадками и больных с выраженными изменениями личности.

9. Нарушения регуляции процесса ПОЛ у больных эпилепсией, длительное время страдающих данным заболеванием, с высокой частотой припадков сопровождаются снижением активности АОС. Это проявляется уменьшением активности в крови больных ферментов АОС: супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. ■

10. Назначение больным эпилепсией с значительными нарушениями регуляции ПОЛ дополнительно к традиционным противосудорожным препаратам антноксиданта - а-токоферола дает положительный терапевтический эффект. Протнвосудорожное действие й-токоферола проявлялось нормализацией в крови больных уровня продуктов ПОЛ и увеличением активности СОД, а также улучшением общего самочувствия, активацией адекватной чмошюналъно-волевои деятельности, уменьшением частоты припадкоЕ и позитивными изменениями биоэлектрической активности головного мозга.

11. Проведенные экспериментально-клинические исследования свидетельствуют о том, что при эпилепсии наблюдаются нарушения регуляции процесса перекнсного окисления липидов, проявляющиеся его некомпенсированной активацией, что является существенным звеном патогенеза данного заболевания. Имеющийся у больных эпилепсией дисбаланс в системе регуляции ПОЛ может быть устранен с помощью включения в комплексную противосудорожную терапию антноксидантов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перекисное окисление липидов в очаге гиперактивности в коре головного мозга крыс.//Билл.эксперим. биол. и мед. - 1980.-т.89,М 1. -С.14-16. Соавт. Г.Н.Крыжановский, Е.В.Браславский, Р.Н.Глебов.

2. Противосудорожный эффект антиоксиданта ионола.// Бгал. эксперим.биол. и мед. -1980.-т.90,N 12.-С.696-698. Соавт. В. Е.Браславский, Г.Н.Крыжановский.

3. 0 роли перекисного окисления липидов в молекулярных механизмах развития эпилептической активности в коре головного мозга.// Актуальные проблемы заболевания и выздоровления'. -М., 1981.-С.96-98. Соавт.В.Е. Браславский.

4. Усиление перекисного окисления липидов нейрональных мембран'- один из патогенетических механизмов эпилептической активности. // Ж. невропатол. п психиатр.-1981.-Т. 81,.N 6.-С. 810815. Соавт. В.Е.Браславский, Г.Н.Крыжановский.

5. Антиэпилептические эффекты комплексной терапии витаминными и противосудорожными препаратами. // Ж.невропатол. и психиатр.-1982.-Т.82,N 6.-С.84-30. Соавт. Г.Н.Крыжановский, А. А.Шандра.

Б. Влияние никотинамида на очаговую и генерализованную эпилептическую активность в коре головного мозга. // Бюлл. эксперим.биол. и мед.-1982.-Т. 94,N 8.-С.39-42. Соавт. В.Е.Браславский, В. А.Щавелев,Г.Н. Крыжановский,С.Б.Германов.

7. Влияние пантогама, никотинамида и феназепама на судорожную активность. // Бюлл.эксперим.биол. и мед.-1982.-Т.94,N 9.-С. 61-64. Соавт. Г.Н.Крыжановский, А.А. Шандра,Л. С. Годлевский.

8. Эндогенный фосфолипазный гидролиз в коре головного мозга при развитии эпилептической активности. // Бюлл.эксперим.биол. и мед.-1982.-Т. 94,N ^-с/гв-ЗО. Соавт. В. А. Воронко, Г. Н. Крыжановский, С.Б.Германов.

9. Влияние нейротропных соединений на трансмембранный потенциал синаптосом. // Бюлл.эксперим.биол.и мед.-1983.-Т.96, N9:-С.51-55. Соавт. Г. Н. Крыжановский, Р.Н.Глебов, О.Ю.Малолет-нева, А. . Каплун, Н.И.Маисов, Е.М.Ганкина, Е.А.Сюткин.

10. Сравнительный анализ содержания продуктов перекисного окисления липидов в коре головного мозга, спинномозговой жидкости и периферической крови при эпилептической активности. //

Бюлл. эксперим.биол. и пел.-1983.-Т.96,М 11.-С.36-38. Соавт. Г. Н.Крыжановский, В.А.Воронко, В.Е. Браславскпй.

11. Исследование уровня продуктов перекисного окисления липидов и свободных жирных кислот в плазме крови и спинномозговой жидкости больных различными формами эпилепсии. // Актуальные проблемы заболевания и выздоровления.-М.,1983.-С.72-75. Соавт. В. А. Воронко, В.М.Коваленко, И. Г. Пронина, Л.В.Китаева.

12. Содержание продуктов перекисного окисления липидов и свободных жирных кислот в плазме крови и спинномозговой жидкости у больных эпилепсией. // Ж.нееропатоп. и психиатр.-1984.-Т.84, N 6.-С. 806-809. Соавт. Г. 11. Крыжановский, В. А. Воронко, В.М.Коваленко, И. Г. Пронина, Л.В.Китаева.

13. Альфа-токоферол в комплексной терапии некоторых форм эпилепсии. // Ж.невропатол. и психиатр.-1984.-Т.84, N 6.-С.892-897. Соавт. В.Н.Коваленко, Г.Н.Крыжановский, В.С.Коваленко, И.Г.Пронина.

14. Способ лечения судорожного синдрома. // Автор, свид. N 1152591.-1985. Соавт. Г. Н. Крыжановский, А.А.Шандра, Л.С.Годлевский, В. Е. Браславскпй.

15. Состояние антиоксндантной системы при индукции у крыс первично-генерализованной эпилептической активности. // Билл, эксперим.биол. и мед.-1985.-Т. 100, N 11.-С.538-541. Соавт. И. Р. Тупеев. М. М. Бордюков, Г. Н. КрыжаноЕский.

16. Связывание 3Н-диазепама с синаптическими мембранами мозга при развитии генерализованной эпилептической активности. // Бюлл.эксперим.биол. и мед.- 1985. -Т. 100, N 12.-С.686-688. Соавт. М. М. Бордюков, Г. Н. Крыжановский, Е.Д.Богданова, Л. Л. Прилипко.

17. Изучение противосудорожных свойств эномеланина. // Бюлл. эксперим.биол. и мед.-1986.-Т.101, N 2.-С,174-177. Соавт. Г.Н.Крыжановский, Л. Б. Борцевич, Б. А. Лобасюк, Ю. Л.Жеребин, Л. А. Осипова, К.В.Москети, В. Е. Браславский.

18. Об электрофизиологических и биохимических механизмах противосудорожного действия антпоксиданта из класса 3-оксипири-динов. // Бюлл.эксперим.биол. и мед.-1986.-Т.102,N 12.-С.663-665. Соавт. Л. Н. Неробкова, Т. А. Воронина, М.Н.Алиев, Л.Д.Смирнов, Г. Н. Крыжановский, В. Е. БраславскшЧ.

19. Антиоксидантные ферменты крови при эпилептической активности. // Бюлл.эксперим.биол. н мед.-1987.-Т.103,N 3.-С.297-299.

Соавт. Г.H.Крыжановский, И, Р. Тупеев,- M. М. Бордюков, ' С. М. Юзефова.

20. Протпвосудорожное действие супероксиддисмутазы. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.-1987.-Т.103,N 4.-С.396-398. Соавт. Г. Н.Крыжановский, И.Р.Тупеев, Б.Е.Браславскпй.

21. Базисные нервные процессы и их регуляция в механизмах формирования и ликвидации генераторов патологически усиленного возбуждения. // Патология нервной регуляции функций.-М.,1987. -С. 53-73. Соавт.Г.Н.Крыжановский, В.Н.Графова, С.И.Игонькина, В.К.Луценко, А.А.Полгар.

22. Состояние антиоксидантной системы при коразоловом киндлинге у крыс. // Бюлл.эксперим. биол. и мед.-1987.-Т. 104,N 8. -С.167-169. Соавт. И. Р.Тупеев, В.Е.Браславский,Г.Н.Крыжановский.

23. Перекисное окисление липидов при развитии эпилептической активности. // Патол. фпзиол. и эксперим. терапия.-1987. -N В.-С.19-

24. Соавт. Г. Н. Крыжановский.

24. Содержание продуктов перекнсного окисления липидов . и свободных жирных кислот в плазме крови и спинномозговой жидкости у детей с судорожным синдромом. // Педиатрия.-1988.-N 7.-С.22-

25. Соавт. Г. Н. Крыжановский, В. С. Перминов, В.А.Воронко, Ю.А.Якунин, А.С.Буркова.

25. Взаимосвязь процессов перекисного окисления и фосфоли-пазного гидролиза липидов в синаптосомах. // Бюлл.эксперим. биол. и мед.-1989.-Т.107,N 2.-С.174-177. Соавт. • Г.Н.Крыжановский, Л.И.Михалева, M. М. Бордюков, А. П. Каплун.

26. Перекисное окисление липидов в ЦНС в норме и при патологии. // Нейрохимия.-1989.-T.8,N 1.-С.124-145.