Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена

- ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО KPACWW ЗНАМЕНИ ШЛАТОЛОПШСКИИ НАУЧНЫЙ ЦЕ1ГГР

lia правах рукопие«

ЧИРШ.ЕВ Еьгений Александрович

УДК--612.115.3:612.115 Л £

НЕПТИДННЕ ИНГИЫГЮШ КОАШЯЦИОйГОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА

(14.00.¿У- "Гематология и переливание крови", 00.03.04 - "Биояимия"}

Л в т. о р е ф е р a t диссертации на соискание ученой степени

вош'оря биологически^ наук

-, , t-üOí К,i f¡ - lgç0

/ /

Работа выполнена в Тюменским государственном медицинском

институте

Научный консультант - доктор медицинских паук профессор

А.Ш. Бышэвский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук про^осор [I.A. Гороуноьа доктор медицинских наук профессор В.Б. Хватов доктор биологических паук С.М. Струкова

Берущее учреждениеЛенинградский ордена Трудового Красного

Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Защита состоится _" KtOit^tß 3990 г и_ часов на

заседании специализированного Совета (Д 074.08.01) при Всесоюзном гематологическом научном центре МЗ СССР (125]67, Москва, Новозыковский проезд, 4а, тел. 21£-01-92)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного гематологического научного центра МЗ ССОР

Автореферат .разослан " 1.900 г

Ученый секретарь специализир. чанного

Совета д.м.н. Л.А. Жеребцои

ОЩЛЯ ХЛГШШЮТИКЛ тот

Коагултдионное превращение, фибриногена зевертчт многоступенчатый процесс свертывания крови, роль которого - предупреждения крошпотерь' при повреждении сосудов. Если регуляция отопов биохимического каскада, пред-июстпунши* превращению фибриногена, достаточно хорошо изучена /Зубпирор Д.М., 1907; RTnnini, 1985/, то спедешя об оффекто-рах заключительной студии свертмвпния явно не достаточны. Самосборку лимитируют присутствующий в плазме фибриноген, к при патологии - продукты деградации фибриногена и фибрина /Бели-пер П.А. и соант., 1901 ; ¡-"гоЛазпег et al», 1900/, и комплекса гепарина с биологически актирными вец'еетшу/и /Кудряшов В. А,,

•I *

1975/, Однако эти ингибиторы нельзя отнести к физиологическим, ■raie к ни они появляются н заметном количестве только при существенных uapywomnx гемойоягуляпии 'или при патологической гипсргепоринсмии. Меаду содержанием фибриногена в плаома » нродолжигельностьгг самосборки не существует корреляционной зависимости /Тялудинойа С.И., 19П7/.

Коагуляция- фибриногена под действием тромбина в онтогенетическом плане -< од!m из наиболее рало форггнрувшился рла?ший, когда итаноялеииз.других элементов шшаиокоягуялцшг огце продолжается /Мпртюгян А.Л. , 1966/.Аналогичные процессы виляло--ни и h ходе филогенетического развития ятоН систомм /Кудряшов З.А., Ляпииа Л.Д., Т97Р/, Из от or г- слпдует, что филогенетически и онтогенетически ранними могаиизнпми, обеспечивалиями жидко» состояние крови, должны.быть механиамн, ограничивающие непосредственно превращение фдбрипогпиа. Данные,.полученнмо р лаборатории кпфодры ЙИСТИМЯИ Тю!Ч'НСЧС<7ГО И«<)ДИ№1ЦСКОРО ИНСТИТУТ*, • укяэивр«т» что спмосборие фибрин* регулируемый процесс /Ни--

шевский и соавт. , 1Ш5/, что в крови присутствуют вещества, способные избирательно ограничивать самосборку фибрина, но идентичные вышеописанным ингибиторам. Носители антитюлимериэа-циошюй активности (АЛА) продсудвствуют в плазме (т.е. но появляются в процессе взаимодействия гемокоагуляционных ферментов) термостабильш, способны к диализу через полупроницаемые мембраны, следовательно, обладают сравнительно небольшой молекулярной массой ( пт ) /Чирлтьев Б.А., 1901; Бшивпский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1982/. Расшифровка механизма торможения, природы носителей AUA и их биологического значения представляет несомненный интерес.

Актуальна проблема поиска и изучения новых средств направленного воздействия на процесс свертывания крови /Зубаиров Д.М.| 1981; Андрввнко Г.В., 1981/. Внимание исследователей привлекают, в частности, пептиды как эффекторы свертывающей активности крови, в том числе и коагуляционного превращения фибриногена /Струкова С.М. и соавт., 1989/. Отдельные пептиды, модифицирующие свертывания, выделены из плазминовего гидролиза-та фибриногена и фибрина /Takagi, Suzuki, 1979/, из тканей человека п животных /иввупвку, 1979; Кузник Б.И., 1984; ьорпг et; ai„, 1985/ или синтезированы в лабораторных условиях /Пояркова С.А. и соавт., 1979; Bagn.y ot al., 1983/. .

Большинство созданных или находящихся в стадии разработки

в

эффекторов гёмок<?агуляцш модифицируют свертывание на этапах, предшествующих тромбиногеневу, либо ограничивают, активность образующегося фермента. Однако еще нет средств направленного воздействия на процесс коагуляционного превращения фибриногена - реакцию, не имеющую альтернативного, пути, с помощью воздействия йа которую может быть реализована последняя возможность предотвращения образования тромба. Существование в плаз-

-■

ми крови в условиях фнйиологической нормы йеи,ость, ограничивающих еамоссюрку фибрина, указывает на перспектппность научения фармакологически активного средства, воздействующего на ¡заключительный этап св'ергывания нрони, актуальность сосданил которого несомненна.

Ü£i b.JL'ü£21M* О^арйктериасшать антшюлимуриошдюнный потенциал дефпбринированной плазмы (сыворотки) крови, изучить природу и мьхинипм действия кЭД-ектороп самосборни Фибрин», оцзнить биологическое значение и перспективы разработки игц поиска ьи-тикоагулпнтов прямого действия, аффект которых реализуется на уровне заключительной фааы свертывания крови.

Задачи работы. I. Дать обитую характеристику ДНА гишзыи (сиоорптки) кропи человека и животных, разработать способ еш количественной оценки. 2. Разработать способ выделения и очистки носителей AUA для получения индивидуал!пых продуктом с по-ы.ш:ешйлл содержанием компонента, определяющего AI]А. 3. Установить химическую структуру носителей AUA. 4. Исследовать ме--ханиеш ограничении скорости.ноагуляционного превращения фиб--ршюгена изучаем,ш носителями АПА, 5. Изучить содержание ингибиторов в тканях лабораторшх животных и возможность их перемещения в сосудистое русло, изменение уровня ингибиторов в плазме крови и тканях внутренних органов, скор,ость икскре-пии ингибиторов с мочой при ¡экспериментальной гипер- и гипо-коагулемии. 6. Изучить содержание'ингибиторов в некоторых тканях в зависимости от места животного на эволюционной "лест-пше", а также в постнатальпом онтогенезе у лаборатории* ¡ки-BOTiiu*-. '?. Провести поиск эффекторов коагу;ыг|ионног< превро-тения фибриногена в растительном мат ри^ле, разраОсиim. способ выделения ингибитора иа него, пронести идентификацию хпнипмов действия ингибиторов животного и раститеш ного пр^ис-

хождения. В. Дать иредиарительную оценку достояния гвмокоагу-ляции при внутривенном введении экспериментальным животным аффектора из растений.

Научная цавизщ работы. Вперные установлено, что в крови человека и животных, а также-в тканях внутренних органов содержатся специфические ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена - веществе пептидной природы, ограничивающие ферментативную и неферментатньнуп стадии отого процесса. Установлен аминокислотный состав пептидных ингибиторов на плазм;.: крови человека и некоторых животных, показано, что ингибиторы из разных источников обладают' одинаковым механизмом торможения коагуляционного преврашония фибриногена.

Установлена первичная структура ингибитора см Г 470 Да.

Расшифрован механизм ограничения скорости коагуляционного превращения фибриногена в присутствии исследуемых пептидов.

Показано наличие механизмов, обеспечивающих постоянство содержания ингибиторов в плазме за счет их перераспределении между кровью и тканями. Установлена динамит содержания ингиби торов в крови и тканях экспериментальных животНьгх в ходе филогенетического и онтогенетического развития, что позволило сделать заключение о принадлежности ингибиторов к числу наиболее древних регуляторов коагуллционного превращения фибриногена. .'...■

. Выявлена принципиальная возможность создания нового средст ва фармакологической коррекции свертывающей активности крови с точкой.приложения на заключительном этапе фибринообразова-ния и показано, что источник нового антикоагулянта прямого действия. - сырье растительного происхождения;

Практически г значимость работы. Разработан способ иооляцт гомогенных ингибиторов .пептидной природы из плазмы-крови и

тканей пи,утренник органов живптны* (Л.С. )"' Ю44Й74 от 01,06. 1901 г. и А.С. П22095 от 0(3.07.1ЭД4 г.), что позволяет оценить роль пептидных ингибиторов п ограничении самосборки Фибрина, а также использовать ингибиторы пептидно« природы в качестве средства исследования механизмов процесса самосборки.

Впертою предложен способ выделения гликопептида из сырья растительного происхождения (Положительное решение ВНИИГПЭ по мявке на изобретение) Л* 46П3404/30-14(027773) от 13.10.1909 г), который позволяет получать его в достаточных Для исследовательской работы количествах и может явиться осиплой для промышленного способа,

Материалы работы использованы при написании и издании монографий (в сояьгорстве) "Регуляция коагуЛяциопннх превращений фибриногена", Свердловск, Средне-Уральское кн. мэд-во, 1907.' и "Биохимический компонент свертывания крови", Свердловск, иэд-во Уральского ун-та, 1990.

Полученные материалы исследован) й внедрены в лекционный курс кафедр биохимии и фармакологии Тюменского медицинского института. Кромв этого, материалы работы испольпуются в дальнейших научных исследованиях лабораторий Тюменского медицинского института.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на всесоюзных, республика неких:, региональных съезда*, конференция:': и симпозиумах, укапанных в списке трудов по тем", диссертации. По материалам диссертации опубликовано ?6 работ, 22. - л, центральной печати, Р. монографии (в соавторстве), зарегистрировано '3 изобретения.

ОСпем к струг/ура р«ч»от». Мггериалн работы наложены на 290 страницах мшшноппеного текста, В работе содержатся 67 рисунков и 30 таблиц. Дисо(тонип состоит, из введения, обзора ли-

тературп, главы с описанием материалов и методов исследовании, главы (содержащей 9 подразделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и мыводов. Указатель литературы представлен 184 отечественными и 248 иностранными работами.

содержание работы

Материалы и методы исследований. Мономернда фибрин получали из нефракционированноН бычьей плазмы по U.M. Радзевич, E.JI. Ходоровой /1969/. Препараты мономериого фибрина, используемые в работе, содержали не менее 96% свертываемого белка. Мономерный фибпмн, лишенный фибринопепгидов А, но сохраняющий фибри-нопеитиды В, получали воздействием на. очищенный, фибриноген рептилазоЙ (Boechrire^r Manncheim) б среде мочевины (3,3 М) /Regaпоп et al., J9B4/.

Ингибиторы самосборки фибрина пептидной природы вццоляли из плазмы кропи человека (500 доноров без учета пола и .возраста). Кровь-отбирали при плановом отборе, стабилизатор - 3,Ü/S раствор цитрата натрия (1:9). Способ выделении ингибиторов самосборки фибрина пептидной природы из биологического материала изложен нт&.

Фибриноген выделяли из. бычьей плазмы /Варецкая Т.В., 1977/. Фрагмент I' молекулы фибриногена получали из триптического гид~ ролизата очищенного фибриногена по• Г,В. Мальневой /1969/ и Т.Н. Варенкой /1977/, ориентируясь на ввделение продукта с 85 - 90 кДа, Значение-И получаемого фрагмента о. устанавливали методом гель-фильтрации на колонке (19 х 560 мм) с сефадексом G -ISO,, калиброванной дегсетраном голубы?»: (ЬоЪр Chemical LTD), бычьим гемоглобином .(ероГн), пепсином (Bpoi-o)' и папаином (Spofe)- И 'ингибиторов пептидной природы устанавливали гель-фильтрацией на.колонке (IQ х 300 ыу) с софадексом с; -5Q. Мот-. .

чики - декпран голубой, цнтокрои с ( fjchjjchard Munclien ), ЦИ-анкобчлямии ( !Н'оГп), тироксин и рибофлавин ( Яеяпа! ).

ЛИД. ингибиторов самосборки, фибриногена и его фрагмента D оценипали но влиянию исследуемого материала m скорость самосборки фибрина в системе: 0,4 ил 0,075 M боратпого буфера с рН 7,6 + 0,1 мл раствора хлорида натрия t- 0,1 мл 1x10 раствора мпцомерного фибрина ( контроль). В опытах хлорид натрия заменяли исследуемым материалом. Результат выражали в значениях П!}фектнннпоти торможения, которое устанавливали по форм.уло i — *1 — у0/\ > где i - эффективность торможения, VQ я V,r - скорость самосборки Fi опыте и контроле соответственно. Со~ дервдиие пептидных ингибиторов выралали в условных единицах активности (Kfà или даль/л, как описано-ниже.

Гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию проводили согласно рекомендациям фирм Fharnaoi п иТоуо Dodo №îi. Со., х'н) используя коммерческие препараты сефадекса п геле!) Toyopearl.

Концентрацию белка в растворах определяли по Wndtinl/1956/, принимая, что F.gjr, - х ^^ ™ концентрация белка, миг/мл. Концентрацию фибриногена, мономерного фибрина и фрагмента 1> определили спектрофотометрически, принимая дли фибриногена и фибришономера eJ^q - 15,67, для'фрагмента V - 20,0 /Угаропа Т.Н., Гелицер В.Л., 197В/.

Гомогенность пептидных ингибиторов самосборки фибрина оценивали е.,помощью хроматографии на бумаге F и-II (Filtrai-.) согласно описанию Т.О. Папхшюй /1904/ и на )!ЯВД (ftltox -324) по кпличестлу пиков оптической .плотности (2!Ю щ) после, обработки индивидуальных продуктов фешштогиоциандтрм (Fiuko A3) /Т.Долепи, Я. Гергей, 1.97(5/-. Полученные ФТК-нрЬиаргушма подвергали хроматографии на колоияз шьгазрЬог« Ci>г> (4,6 yr PS>О мм) - а растворе 0,ОГ.5.М ецетата аммония и. грелмента этанола.-

- а -•

от У до 40/7..

Аминокислотный состав пептидных ингибиторов исследовали но автоматическом аминокислотном анализаторе .Ш) -4101 в трехбу-ферной натриепоП системе на колонке (6 х ЬОО ш), заполненной смолоП Сиг-гит РСбл. Колонка терыоотатироиана при Г>0°0 и капибро-ва.иа стандартной смесью аминокислот ). Гидролиз антиюо-

агулянтов проводили О Н соляной кирлото!! в среде аргонп при 1Ю°С с те«ение РЛ ч в присутствии 0,01% фенола и ¿-меркапто-атанола /Штиль 3-, 1965/.

Гидролиз углеводного компонента ингибитора из растительного сырья проводили 0,1. Н серноИ кислотой при Ю0°С (Ю ч) /Чистякове Л. А. и соавт,, 193?./. Гидролизат нейтрализовали углекислым барием и исследовали хроматографией на бумаге, пластинках БИиГо! в присутствии свидетелей моноеахаров глюкозы, рамнозы, фруктозы, меннозы и сахарозы /ХаПс И., Мпдек К., 1962/, а также да круговом поляриметре СМ-2.

Аминокислотную последовательность определяли в реакции с фенилизэтиопианатси по.Эдмаиу /Деиени Т., Гергей Я., 1976/. ФТГ—производные Н —концевых аминокислот регистрировали поело хроматографии на 1КВД (Мнллихром-1, носитель - Сепарон С-10), фиксируя время удерживания ФТГ-аминокислот на хроматографической колонке. Дополнительно -аминокислоты подвергали разрушению б Н соляной кислотой и свободные аминокислоты хро-

О

матогрофировалн на .бумаге /Девони Т.; Гергей Я., 1976/.

[■^Ь]-ингибиторы получали по В.Ы. Родионову, Ю.П. Решетко /1960/. Радиоактивность препярато» определяла с'помощью радиометра ДП-1Р0 и тресчетногп устройства ПП~16>.

В опытах использовало47Ю беспородных бел},к крыс. В пределах одной экспериментальной группы масса тела отдельного животного отклонялась от -среднего не более, чем на 10Й. Г» окспе-

рими'нтач повтори.) чткл'ИГгГО но использовали.

Определи mi слолумши жжизатоли состояния гемокоагуляцин: время сыщп'Ш'.ънт ретэльцнфицнровйнной нляяш, тромеиновое время, лротромбииоьив время /Болуда В.П. и соавт. , 1Ш0/, время самосборки фибрина в плазме /Сымевский Л.Ш. п епавт., 19135/,

поцшу.о вышеуказанны-,t и«польаоияцц следующие препараты: трок-бич, фибриноген, фиоринолизин и тромооплаечт (Каунас), про-таминсулы^ат > '''»парим, шлолтан (RроГа), аииасол отечественного производства (lionuaroBita)» иолия йодид [^3](Иаотоп).

Ike цифровые материалы подвергли математической обработке методами вариационной статистики /Беленьний Н.Л., Бессмертный ii.C., 1967-, Венецкий И.Г., 1970/.

Обтая уаршсгеристинй и колотестдещшя оценка All А .плаамп крови человека. Установлено, что плазма (сыворотка) крови человека содержит вещества, способные ограничивать самосборку фибрина in vitro. Их епдеркаиме в дефнбринирсвашюй плааме и сыворотке, полученной самопроизвольном свертыванием, одинаково, следовательно, ингибиторы предсуществуют в плазме, а не появляются в процессе взаимодействия гемокоагуляционных ферментов. Ингибиторы термостабилыш, переносят длительное замораживание, имеют относительно невысокую М , т.к. диализуютсн'череа полупроницаемую мембрану, пропускающую вещества о п около Тй кДа, Носители ЛПА не идентичны ранее .иавестнш ингибиторам самосборки фибрина - комплексам гепарина и продуктам деградации фибриногена: ингибиторная активность проявляется п присутствии протамнноул1>фата в количестве, достаточном для омоывпния всего пндогенноро гепарина; диалиоованныо продуктн плалыиново-го протес,лиза фибриногена (фибрина) не обладают иншбиторной активностью,

"^¡фектипность т^рм^уения самосборки вависит от концентра-

■ _ i О -

iwh носители« AilA. Используя разбавленную дьфнбрянирльиннум плаому, полученную от 50 доноров, мы изучили эффект anoraer-ствующих концентраций ингибитора (от 3,1 до 100") и установлении; ошшеиия п^фективиости торможения отложи «и в системе координат как функцию концеш-ралим иш'ибиторо«. Количество ингибиторов, обуолониьшее ^эффективность торможения, равную 0,3, приняли ва условную едимщу актипнооги (НА) и построили график, где содержание ингиСиторои в ЕА ~ Функция оффектишгоети торможения (рис. I).

2,5

гис. !. Ьависимость содержания ингибитора (ЕЛ) от оффектишюсти торможения. Абсцисса - концентрация ингибитора, ЕЛ; ордината 5 0 КА ~ ¡^Фиктивность торможе-' ПИЯ.

Эгот калибровочный трафик использовали для оценки содержания ингибиторов » снворотке, дефибрииироеанной плазме нее фракциях, а также в опытах по выделению ингибиторов.

Способ >ищвлета- ингибиторов самосборки фибрина. Основываясь на установленных нами некоторых физико-химических сиойс вах ингибиторов самосборки (термостабильность, низкая м , спо собность к хромагографичеокому обмену на ашонитях), мы остановились на следующем способе выделения ингибиторов самосборки на биологического материала, Плазму крови (или иной биологически П материал) днализопали через мембрану гидратцеллюлоз-ную для гемодиализа марки "Купрофан" против дистиллированной воды'до полного истощения ингибиторов, Дналиплру^щую жидкост! концентрировали на ротационном- испарителе до объема, равного

- II -

объему исходного материала и смешивали п соотношении 1:1 (объем:объем) t; голом /1ЭЛЭ сефвдаксп А-25, набухшего в 0,05 М аммонийно-ацотатном буфере, е-рН 7,6. После 30 мин зкспокиро- ' вштп при комнатной температуре гель переносили в хромйтогра-фичпакую колонку и проводили ступенчатое хроиатографированиа аммониАно-йцетатним. буфером (от 0,05 до 0,15 ftt, контролируя

при атом ЛПД, Активные фракции объединяли, удаляли летучий

■ /

буфер импоривонием, сухой остаток растворяли в дистиллированной воде и от нерасгпоригшихел частиц освобождались центрифугированием. Все операции проводили о присутствии 0,001% мертио-лпта натрия.

В вышеописанных условиях ингибитор хроматографировалсл в (i

виде симметричного одиночного пика АЛА, "Хроматография на бумаге аити'внш фракций шля ила ряд свободдак minio кислот и ним-гидринпсложителыюо пятно, отлИчтщееса. от. аминокислот по форме и характеру окраски. Свободные аминокислот« т обладают янтиполимеризационной активностью, a экстракт, из зоны нингид-ринположительного пятна проявляет, выраженную,способность"ограничивать самосборку фибрина..

Для.получения продукта, свободного от ara нокнелот, концентрированные и растворенные в воде активные фракции подвергали 2-х кратной голь-фильтрации на сефпдексй о~15. При хроматографии полученного продуйте на бумаге обнаруживалось лимь ттгид~ римпояожителыюе пятно, содержащее ингибитор. Потери ингибитора при этпм составляли в среднем около 26%.

Применение для диализа вместо целлофана марки■ "Купрофпи". пленки т'идратцоллплоон.о!! Т-К<), вмегвую сначителкио меньший" размер лор; сущестпенно повысило степень очистки•ингибиторов - в среднем, на- этом этапе, в 14,5 раз, (расчет производился по содержания белка "поело равновесного диаянза)-.- Это nónnnjnijjo,

- 12 -

минуя предварительную ионообменную хроматографию, применить для дальнейшей очистки ингибитора гель-фильтрпцип на сефадек-се г,-15, используя в качество ¡агента 0,05 М аммонийно-аце» татный буфер. Собирая олю.от фракциями, и определяя и катедоЛ из тк ЛИЛ,'мн обнаружили три пики, содеркнит ингибитор, AJJA при отом составляет 98$ от исходной. При хроматографии на бумаге каждому иа пикон ЛПЛ соответствует нингидршпталожнтелыюе пятно и pun, опободн!,гс аминокислот. Гомогенные препараты ингибиторов получали, подвергал рохремятографии носителей ЛПЛ на ДЭ/1Э сефадевсе h-У.Ъ в условиях, описанных ныше.

Природе ингибитороп самосборки фибрина. Нише мы показали, что препараты ингибиторов дают позитивную реакцию с нингидри-новым реактивом. Ого навело на мысль о пептидном характере носителей ЛПЛ, что косвенно подтвердилось при определении и . методом гель-фильтрации'носителя ип первого пива - 1 750ij00 Да. Не имея п виду на атом этапе работы изучить аминокислотный состав ингибитора.(допуская, что в нем присутствуют примеси аминокислот, совпадающие по величине н^ с ингибитором) препарат ингибитора'ПОДВврГ'ЛИ основному И КИСЛОТНОМУ ГИДролИЗу, ГИДфО-

лиа&ты исследовали методом бумажной хроматографии. В обоих случаях носитель АПА .распадается на ряд шшгидринполотатель-. них соединений, идентифицированных как аминокислоты, m'n подтверждает предположение о- пептидном характере ингибитороп.

Убедишшсь. в гомогенности носителей ftl'IA (как описано п раздело "Материалы и методы"), индивидуальные пептиды подвергли кислотному гидролизу. Гидролизет исследовали на автоматическом амино]:налотнпи анализаторе Ю -4101 по одноиолоночному метод-/ в трехбуферной натриевой системе (табл.-]').

Суммируя Мп аминокислотнпх остатков, аа вычетом, массы висво-бождатоейся -воды, 'полутени следующие значения ¡1, лэпг.теддай

ЛП/t: i 4'Л), 1 ШЗ и 695 Да о.оотьегс-гятио для I, к и 3 пиков.

Обращает на себя внима-

ТЛЗЛИЦЛ 1 . Аминокислотный uiuvüd пептидных ингибитороп самосборки, шделонны^ из плазм» чолопька

I 470 Г 1ПГЗ 095

Л£ф Л.чр Дар

'ihr ТЬт -

Яг; г Пег

ü'ln (Р.) G)u (П) (Яи (?)

l'l'O Pro 1'го

«1,у (?) fiiy Oly

'] а 61а

VY, 1 _

Не - _

Leu Leu -

Т/у я 1ув . irrt Ьуз

fri% Ars

нле то, что яо всех трех пептидах глутаминовая кислота понторявтсг! двождн. Нромо того, п среднем н коныием по величина пептидах "вырезаны" одни и то же вмииокислотныЕ) остатки - глицин, палин и тюлей-imii. Треонин, сорнн п лей-пин присутствуют в пептидах с Ii I 470 и 1 Ю!3 Да, отсутствуют 'в пептиде с; массой ROß Да. Возникшее предположение, что пептиды си происходят ип обтго предшественника - пептида с 11 I 470 ,11а путем ограниченного протеолиза подтверждено рас-шифринкой первичной структуры пептида с массой I 470 Да, про-вольной методом Эдмана D реакции с фешитзотпоцианатом и регистрацией 'МТ-проиэйодиш -n -концевых аминокислот после хроматографии па носителе Сепарон С—ИЗ ОйХВД,- Миллнхром-1) и хроматографии свободн!« аминокислот на. бумаге после разрушения ФТГ-

Сет a'hr

проивВ'уинм: NH2-41y-n&-Val-,itir-Xöu-ßet--Aap-ftla'-Glu-01u-riyfi-- а rij-i'po-Uly-CCiOji. Укапанная структура согласуете« с данными, полученными при анализе аминокислотного состава пептидов: в пептиде с Н ! 1вЗ Даотсутствуют аминокислота глицин, изо-леГтин и-валин, а в пептиде с массой 095,11а дополнительно отсутствуют серии, лейцин и треонин. Следовательно, i.pn отщеплении от пептида с Mm I 470 Да N-KoHnenoil последопатол! цостн

«ly-He-Vai образуется- пептид сн_ i. Да, а при елшр.плйнии"

. йег Vi)г ' '

фрагмент«G^y-IiG-Vsl-'i'hr-Iieu-öer войннкопг пептид с. массой

)1а,- чго ейидоте'льстдует h пр/чи.'хождении «лпиги» по масса

~ 14 - .

пептидов на своего более крупного нрццшественичка.

tiot'o превращения фибриногена. Прежде, чем приступить к постановке) дальнейших- внепериш/ггои, следюляло уточнить способ количественного определения ингибиторов. Приведенный выше способ ориентирован на торможение самосборки дефибршшрованной плазмой боа учета того, что носители АИЛ - три различающиеся по аминокислотному составу и и ингибитора. Возникает вопрос о равноценности вклада каждого ингибитора в общую ЛПА плазм,., кропи и соотношении эффективности торможении ими самосборки .при совместном и раздельном воздействии.

При совместном введении ингибиторов в спетому самосоорки не зависимо от производимого аффекта кйлсднм ия них, объективность торможения смеси является результатом суммации ¡эффектов каждого из мигиоиторов порознь. Это означает, что независимо от измененный содержания и плазме того или иного пептида, общий шштолимеризаципнный эффект дефибридаровшшой штамп будет результатом суммации их аффектов.. Следовательно, определение количества ингибиторов в дефибринированной плазме предложенным методом правомочно. Однако нет уверенности, что одина-.новые истинный концентрации ингибиторов будут проявлять ранний ингибируюший еффект. Для ответа на этот вопрос висскоочищеннпе индивидуальные пептиды подвергли автоматическому аминокислотному анализу, что позволило рясчнтать их молярную концентрацию. Параллельно изучили зависимость объективности торможепщ от различных концентраций ингибиторов (их получали, разбавляя аликпоты растворов пептидов, взятых для аминокислотного анализа) и построили гра{'ик- sai неныпети оффективпости торможения oí .KOHiJOHTpajiiii!.иоГ'ПСиторои (ряс. 2). .

Дон bufliii на ри«$. 2 одни и ve *-е концентрации nuriiávfopon '

(оа «склонениям пеитндоп с н 1 ЮЗ и 895 Да) оказывают. различный !!игчбиру!«1'1и:'1 эффект будучи одинаково чурстгительнм к рпоцедетю. Следопятельно, и елучога," когда мы исследуем ДЛА дефнбрииированной пляямн или экстрактов из гогюгонатов ткеней, количеетпенно АЛА мм доданы внрвжать в ЕА. Если же исследование подвергаются индивидуальные носители АИД для сравнения их между собой не:г - \!',имо пользопять показатель молярноП концентрации •

1

0,8

0,4

2,3

V

/

У''

Рис. 2. Зависимость оффек-тйвностл торможения от концентрами ингибиторов (I -I 470. 2 - I 183, 3 -895

__ Да). лбсцисса - концентрации

' ингибиторов, ммоль/л; ордк-[0 2 0 ната - эффективность тормо-

' ' ' 'К0НИЯ.

В экспериментах по изучению механизма торможения самосборки мы использовали один йз Ингибиторов - пептид с молекулярной массой I 470 Да, поскольку он содержит вез аминокислотные остатки, присущие и Другим пептидам.

Окапалось, что ингибитор не потребляется а процессе самосборки мономерного фибрина: независимо от использовавшейся концентр- .нш последнего (от 0,1 до 3 иг) по завершении свмосборйй весь ингибитор -обнаруживается в надосадке. В то же время, ли самосборку прерывать череэ различные интервалы времени После ее инициации, то на ранних отапах самосборки после отдёлй-Нйя белка Количество ингибитора ё среде реакций снижается; Но ное.16 «брайоЬйНйЯ фн'бриНоМпго <Ггустк& ВеёЬ. йнгйййтор' ЬЙ'^гфу-

«шадгев в рап^^ич! ётёппш.

вопия ингибитора с фибрином неодинакова по мере продолжительности самосборки, т.е. по мере рос га полимеров фибрина.

Чтобы установить, какие этапы самосборки тормооит ингибитор, мономерный фибрин для провокации самосборки разбавляли

* г

боратннм буфером, содержащим -ингибитор (2,1 ммоль/л,

3 500 нмп/мин в Г мл). В отдельных пробах самосборку прерывали добавлением 15$ раствора ТКУ и после отделении белка исследовали радиоактивность нздосадка, т.е. содержание ингибитора в ном (рис. 3).

имп/мин х 100 в 1 мл

30

т » г Рис. 3. Связывание ингибито-

\ / ра с фибрином н оавимости от

времени, прошедшего с момента провокации самосборки. Абсцисса - время от момента провокации самосборки, с; 000 ь с ордината - радиоактивность '' (¡адоеадка.

Отделение белка на ранних этапам самосборки заметно снижает радиоактивность надосодка, в последующем удаление ингибитора (начиная с 1/6 всей- продолжительности- самосборки) с фибрином уменьшается,.а после образования сгустка весь ингибитор определяется' в■ надосадкет.е. вытесняется®из сгустка. Следовательно, ингибитор взаимодействует с промежуточными продуктами самосборки, но по мере созрования протофибрилл активность образования ассоцяатов сникаетсл, и, в конечном счете, ингибитор вытесняется из-фибринового сгустка..

То же наблюдается и при использовании метода "тестировании' .стадий",. предложенного 8. А., Ее лидером и Т.В. Варенкой /1975/ я которой ингибитор вносится о- .реакционную смесь черер кратнна

О

интернаш щодкмм <>т начала самосборки 11 ваишйодопотнуьт с по-лпмораш! |)ij;î.nii4iiuiï степени зрелости (рис. 4).

00

«зависимость паи; нения

t J с •

! 1.4)

v

I

*

2 чувствительности к ингибитору

44 —i— j- семосборип при внесении пептида

^ а различите интервалы времени после инициации реакции, t -теоретическая, 2 - окспери-■ сантальная иривие. Лбсиисса -время, прошедшее от инициации

--——--——-—- реакции до момента внесения

«зО oOf.c- ингибитора, с; ордината - время

самоогЗоркй, с.

Нисходящая часть зкспернменталыюй кривой отклоняется вниз от теоретической, характеризующей одинаног-у» чувствительность всех зтапов самосборки к ингибитору. Однако чем больше продолжительность самосборки в отсутствие ингибитора, тем мопои чувствителен процесс сборки к вносимому ингибитору.

Эти данные хорошо согласуются с результатами аксперимента, представленными на рисунке 3 - период наибольшей чувствительности процесса самосборки совпадает с периодом наиболее интенсивного взаимодействия моцомерного фибрина с ним и близок к определенному с помощью радиометрии. Следовательно, торможение является результатом взаимодействия ингибитора с мономер -кш фибрином, ослабляющимся по мере усложнения полимеров. В период агрегации, ведущей к образование сгустка фибрина, молекулы ингибитора вш'еснпются из комплекса.

По данным Э.В, Луговского, Н./l. Келинера /Г9V1'/, В,A, fie-лнцера, Т.В. Варецкой /1975/ факторами, ¡шшвщимн на кродоласи-тельностъ самосборки и её торможение известными ингибиторами, являются изменения ионной силы, pli, темперитури среди и наличие выиеств, конкурирующих за водородные взаимодействия.

m

Научение мшисшости'эффективности торможений от ы.шюнере-численных факторов показало, что наиболее вероятно вааиыодвй-отвие ингибитора с монамернш фибрином обусловлено образованием электростатически;« связей. Об ¡¡том свидетельствует зависимо« 'ь скорости реакции самосборки фоОрина от рН среди самосборки в отсутствие и в присутствия ингибитора (рис. 5): скорость самосборки в контроле нарастает с повышением pli, достигай максимума при значении, близком к 7,5, крути снижаясь в дальнейшем. В присутствии ингиоитора с ростом рН, начинав с 7,0, скорость самосборки существьнно ограничиваете«. При рН 6,8 ингибитор не изменяет скорости реакции, а'при ешше-ши рН до 6,3 выявляется противоположный аффект - в присутствии ииги битора скорость самосборки повышается.

-1.

х ЛОО

100

50

Рис. 5. Зависимость скоро ти самосборки от рН в ото. ствие СП и в присутствии (2) ингибитора. Абсцисса ^ н и значения рИ," ордината -° ° г" скорость решении.

Подтверждением роля электростатических взаимодействий ней ся равновесный диализ мономерного фибрина и пептидного ингибитора через мембрану Т-100,■проницаемую для пептида и не фильтрутощую.монойерннЙ фибрин: после установлении равноеесш ингибитора (2.4. ч) по мере шв мнения рН в среда мономера (4,( мг белка),, содержанс-о мочевины,, от 5,5 до &,0, 6,5, ?,( 7,5 и 8,0 наблюдается прогрессивное снижение количества инп Ритора от 00й±1,5 до 750^18, 600*Я4, 4Н0*13> 4.С2--Г5 и 408*26

- 19 -

Характерная особенность ипучпемда пептидов - наличие боль-" шого числа аминокислот с ионогеппым радикалом..Так, в меньшем по масса пептиде б ( л яр, (?lu (2 остатка) , Pro, Axg, I/ja) иэ 0 амтюнислотнга. остатков способны находиться в ионном состоянии при Фипиологи-чэских услонидх, т.я. способен к электростатическим вяаимодействияи.

Характер зависимости скорости езмое.борки от значения рН-реакционной среди и .рёаультптн равновесного диализа иозволятт : предположить, что пептидные ингибиторы являются донорами отрицательно заряженных- функциональных: групп' для образования связи с мон'омерннм. фибрином - уменьшение ¡экранирований отрицательных эарядэа (повышение' рН) в одет к росту янтшюяимернэапионноП. активности, <16 этом же ■ свидетельствует "изменение эффекта на прямо противрположшй при рН.6,3 - пептид приобретает свойство активировать самосборку' при существенной- блокада способности к ионизации отрицательно заряженных- функциональных-групп. ".

Тромбинпависимое образование мономерного фибрину можно рассматривать traif актииацип фибриногена, обусловлен¡ryro абнаженк- -. ем центров самосборки, взаимодействуют!* по принципу компле- .. ментарнести. Число открыть» центров убивает по мере аутополй-мерияацин мономера, они исчезает ро'завершении фибринеобрйэо-вания./Яутовской Э.В. „..1982/. Способность, ингибитора образовывать ассоциатн ' преинфицественно с -продуиташ раншх. стадий самосборки позволяет допустить, что ввж in .ад условней этого.взаимодействия является наличие активных' центров самосборки. Это подтверждается тем, что комплекеробраэо'вгшия ингибитора, меченного .'радиойодом,' с фибриногеном lie:выявляется'^ а при собмэст*' ном внесении их. в систему самосборки т ,аав»«'.(шо' ог':«рнцеит]рА-■ цик. проявляется синергизм, в среднем.на.П,Ь%. ' . Д опус кап, что ,п- нативной модвкуле. 'фибриногена -иЦейгся сте- (

рическис «}Ю11Птствия, патрудияшие «ли нсключвкщие озануодей-птсие пептида с участками молекул; фибриногена, но уст ран пю-. и,нося при активации фибриногена, мы изучили вопможнистъ .взаимодействия пегггидо с изолированным. ф|жгментом и фибриногена, испольвуп для этой цели метод голь-фильтрации смеси радиоактивного ингибитора (I,!3 ммолъ/л, М 330 имп/мин в I мл) и' фрагмента С (1,5 иг/т) на аефадексе О -15. Выход продуктов регистрировали по-'АИЛ, радиоактивности и оптической плотности. При этом произошло перераспределение. активности ингибитора и радиоактивности и в злюатак, соответствующих фрагменту и , сСдару- • жен ингибитор в количестве 48,4% от введенного (ряс. 6). Лс

0,4

0,2

ими/мин в 1 мл

.1

л

> V

/ V

А

л

у

1.

N

ООО

'Юи

0,0

О ,.4

4

О

.12.

16

■ 20 v '

Рис. 6. Хрокатогвафтшский профиль стой фрагмент В -яоптид-ннй ингибитор. Аосцисса - объем влюата, мл; ордината слова - •■ оптическая плотность, справа - радиоактивность (иии/мин п I мл и эффективность торможения, I, Й и 3— оптическая плотность, . радиоактивность и оффегегияпость торможения соответственно..

.. о

Это указало на взаимодействие пептидного ингибитора, с фрагментом ]) , что подтвердили дополнительноизучив влиднно этих ингибиторов на самасборку совместно и порознь при различи:« концентрациях ингибитора (от 0,95 до .1,55шоль'/л) и фрагменте О (от 0,34 до.I<38 мг/мл).'При воег исследованных концепт' рациях. обнаружен нырсженний антагонизм ингибиторов: экспериментальная кйектирноот'ь торможения, ниже расчетной /УобГг Л.,

И766/ в среднем па 41Это также мояно объяснить ой'раяово-нием коыплаиса пептид-*4рпгмгнт и . Не. исключено', что именно в зтсм ^рягненто мономерпого фибрина лптлипапаны участки, помп-лешнтйрн.ме пептидным ингибиторам.

При изучении влияния пептидного ингибитора на реакцию тромбина о-фибриногеном мы инкубировали раствор фибриногена (0,9%) с тромбшгоы (I мг/мл, активность 7 с)'в присутствии 3,3 Ы ио-чепиш. Череп равные интервалы времени. отбирали аликаотн смеси, провоцировали в них свиопборку фибрина- раонедением ыедииа-ловш буфером (0,03 I, рН 7,6) и фикспротали. момент образования сгустка. В части опытов пептидный ингибитор (1,6 ммоль/л) добавляли в реакционную смесь одновременно с тромбином (оцени™ внетея его суммарное влияние на ферментативную и. нефермвШ'а-типьую фазы превращений фибриногена), а части опытов ингибитор (0 ,76 шодь/л) вносили в момент провокации самосборки - в ат-им случае он влияет- только на полимеризацию моноыерного фисрина

(рис, 7). : '. '■■•

* ' х -100 '••.-.

Рис, 7. Зависимость скорости самосборки фибрина от продолжительности инкубации смеси фибриноген-тромбин, Абсцисса -продолжительность инкубации, мин; ордината - скорость реакции. .1- ингибитор отсутствует в реакционной смеси, 2 -ингибитор внесен li реакционную смесь одновременно с гром-■ бином, 3 - ингибитор внесен • .'301-,мин .одновременно с провокацией сн-мосборкц..-

Криная скорости суммарной реакции превращения фибриногена науодцтея ниже кривой скорости реанц.,л, протекающей при йоа-•дейервии ингибитора только на отап самосборки фибрина, Если п/.пустить, 11то пептндныА йнгибит а оказнвает йякяние на какой

- -

либо одни из ом'йгк/в ноагулщионного превращения фибриногена, обсуждаемые кривые совпадали 6м..

Можно предположить, что.-торможение ферментативного »тала, преврвюаний фибриногена может реализоваться путем образования аоооцивтоь ингибитора либо с фергюнтом, что сюпровокдается онкшшем его активности, либо с суботрагим j,е-акпия - фибриноген;!?.!, 'что аа очот конформащюшой модификании замедляет его расу.ь-нлеиив ферментом.

тш» ш сказали, wo между титидыд к фибриногеном кгиадож-опобрааоиание • отсутствует, При гель-фильтрации через сефидькс <; -Iii снеси радпо№Ченноро ингиоитор&. и тр-.мбнна 'иродукти злм-ИрОвВИН В puctifljx обтсынх (f; и 17 Ш «OGVReTCTU- Ши>) , слодоья-TCiii.no, я с 'грам^иивд • пептид но образует ассоцнатс.в.

'Таким образом, нет оснований предподги'&тъ, что в ириоутет-' 1ши шо'пйнтора каким либо путем мо«ет -ц'ргншчийатьсн висвосяэде-и1."? фибрИнопептнда А, ота^адяющегоси первоначально под. действием тромбина. В то -«а время наиоптно, что воашка»«ше при от-цвялопйи фибрйнонаптидоа А конформацйокные изменения шлекулн фибриногена и образований "аатравочиого" количостьл олйгоме-ров создамт предпошлют для высвобождения фпбринопептида В. Отшиял;.;ние (¡ибринопептидов А и El. является последоватблшм и »яновромвйиш процессом,- регламентируемым скоростью висвобоздинш фибрииопептида А, и, как следствие, формированием ранних- про-тофибрилл /Лутвекой Э.П., 1970/.

Чгобн -установить, торшоит ли пептид скорость высиобседеиип фчерцнонепгида П иод ^ойстииом тромбина, во фибриногена первоначальна ■ были уи/гясни абринопентиди Л ( воядьйс-тйИб рентилаз.ы) t п дс-а/.А-имкийдр инкубировали с /раствором тромбина. Во время нпкуоаипд чс};«- Jipnriii^r и втерший; чрвшци г^Сирали алпквет »»шеи, гр>-»опир.>ваг|И в них оамосе орку и учвтпнали время о(>раэо-

- ;гз •• -

иажш огуспс« ('контроль), Н пньггз реакционная смась ciinep.Ji5i.rra 1г«-тн1йиый ингибктс.р (!,>"' ииоль/л) 1'р«е. В).

V, с х П'О

Гпс. о. 1Л1(1»С11(ЛС.С,ТЬ

сятсйг.рки .{.И(5р1гнн ог лроцол-ш№кл1.ноетк пнк,уб£ч\ш) смеси дйаАА~Ь!01гг,мерный фибрин с громбшкя. АВсцнооа -- продол-»итслььрпч'ь инкубации, шш; ордината - скорости реакции. У - шнчкмтор Гутсутстнус'1 я реакционной смеси> й - ингибитор пнпенн олнопромэнно с

Роо.ул стати акстрииенти уяыпюдог, что Уфисутсть.; итшоп--пора угпотаит гогйо*ю;«д«1тс ^ийринопептида Ь, а ил мора нарн«--т:пжя конионтрации м'пногирпого фиНри»ы скорость сныосоорнм .'рш'чпшизгел ¡г кс.!ггролцт.!/ ипачотаи,

•спий В пвгем «ос{'«нй иоедкдоваччзйьностгь >'Ъ , торис»-

■^п' тронскшапиоинсо. пайртьтание фибрж^ичяю, шимбаруи шой.;~ бьнпопие фибринопеитида 13 / Т*зиз./зел к!., чс"3.о; ос ы'1 /.,

Ксхойл но наших окопоримезнтов и длпних литерь^ури, ш.-янл кред» полагать, что исследуемый пептид, являясь более МОЩННМ ингибитором пачашлнгч стадий, нолимермищцн, гфепитстиуег париипному .-.брааонании олигот.шров, и что м'1'0 сопропомдпетси авдерлкой ьгенобожления фибрииопептидов В,

Тип лррвуия пвптидних нигибиторий •' в ткачих дчб.ра и с «дс ш; •; ИПТЩДС. Поит I! ¡1,1,1 - ИНГпб|т;рц КГ,агулт?:МШН''ГО ПрОНр-'исОНП!! <(,яй~ ркпогонг» содержатся но юяъко н нлпамо ¡'роин чйлоПсчси: АЛЛ обладает и дофибриниров6 ш ¡ая плюша яри>н рлзотиж . АИД дер.пори-

ниропйин.'Л ;¿ялами доноров ( п.- ол>) гн- офф^октинн.-оти тораслй-ния г и «днем 1:«"-С1 аиила О ,<»»* при кра/ии»; агдачкиип.ч 0,241 и

_ 24 ~ .

0,66, пла&мы сына (£5 наблюдений) - ü,h?£0,üíí6, гшгомы крыс . (IP.G наблюдений) -0,60^3,005, что соответствует 31-.fi, 33,8 и 37,0 ЕЛ/Ш1. '

Для 'кгзучвнча биологической роли пат идеи - ингйбимреш самосборки 'ш использовали бадтх крмс. .Ингибиторы самосборки выделяли из гомогенатоа тканей головного мозга, легких, сердца, печени, оедеаеини, почки и понбречко-но^осаэ'ой мышцы белых крыс после нарфуаш сосудистой састылн нагретым до 37°С 0,14 У раствором хлорида натрия. При галь-фильтрации дтишсштси а колонка с гелей сефадикса 0 -15 обнаружилось, что хроыатографи-чвекий профиль АЛА одинакои для ¡экстрактов из вейх исследошнг-нш органов и близок я таковому при голь-^ильтр вддои диализата пдаамн крови. ~ MÍA злюГфувтся в виде трех. пикой, кок н АЛА' плаомы крови человека. Ото позволяет утверждать, что в тканях и крови белых крыс тшосв содержатся три носителя АЛЛ. ■

Хроматография носителя из пэриого пика' ДНА на бумаге иона-аала, что илдивидуа.чвниа.носители на..разных объектов обладают одинаковым значением R^ . Хрдаатбграфичаскоо исследование кис-яотнш гидролиаатав тех м'е носителей выявило одинаковое число . нингидринположительных пятен и одинаковое значение Rj. для каждого ии ни* .-'При исследования гидролиаатов объединенных препаратов ингибитора, полученных из равных тканей, не найдено различий мезАду' числом пятен и их подвижностью. Зто свидетельсгау-йт о том, что во всех тканях ингибиторы, ш--крайней мере, первого, пика АПЛ, предот&ьлени,одним соединением.

Мы изучили содержание ингибиторов в тканях варослых крыс, в тканях нов-орокдеьмьк жиьбтних и в тканях двухмесячных, т.е. достигших половой, арелостг (табл. 2). Во. всех без .иекдочедия - ' исследованных Гтзгинах -. уровень ингибитора изменяете« в онтогенетическом •ряйрозе - с увеличением возраста жкштяк содержа- ■

пио ингибитора,падает, что-ошдетельетнует о его биологической роли. ' ТАБЛИЦА Содержание ингибиторов (ЕЛ/г) п тканях белых крыс-

Ткань Возраст животных

ноноро?кдс-1шне 1 п 30) 10 недоль ( г, = 4.0) 35 подал ь .( п- 40)

Монг Легкие Сердце Ночеиь - Почка Мнпа.ш Иласип 415Й,6 4o;?.te,o ■ 381j?И ■ 4()2j6,4 370-7,I ЗУ I¿7.1 . • 24«г'1,4 ; 249т7,5 - gooilg.fi ■ 269*3,У ■ 37±t,-2 222Й.З I75&f7 • 16?Й,3 ' 204*9.1 139ilI.Z - за±1,з

При сравнании содержания ингибиторов самосборки в-тканях филогенетически.различающихся животных (крыса,'лягушка, карась, прудовик) обнТфужена/следующая закономерность (рис.-9): содержании ингибиторов у неплотных, стошрцх на равных 'уровнях опо-люцномиого ропвития, изменяется о .оавиоишети от. места животного на "эволюционной лестницу": ищ жипотное древнее, том ште содержание ингибитора н тканях. Это-ото одно свидетельство биологической эця-чнмости пептиднык ингибиторов .самосборки."

КА/г

500'

ЛОГ) 100 '

—

pi

У-

я! ii

« j

£ <г.

Рис. 9. Содержание ингибитора в мщ-ечной ткани у рази-,ж ви-■доя животных. Абсцисса - виды животных, ордината - содержа— . ние ингибиторов, ЕА/г ткани..

Далее ми сравнили.аминокислотный состав ингибиторов'самосборки у животных раотк/пидоа. 'Нижа .приведен аминокислотный

состав наиболее тяжелых пептидов из мышечной ткани лягушки,

пла&ми.крови"крысы, бша и челове/л (табл. 3).

ТАБЛИЦА 3. Аминокислотный состад пептидных ингибнторол опмос-борки фибрина, аыдёленнык ИЗ разных ист опии кон ....................

Лягушка Крыса Вын Человек.

Лаг (2) Двр (2) Авр (?) Аео

ЧЬг ■ты ТНг ТПг

-В9Г Пег . Зег Пр.г

с;хи (?)' саи .(г) ' С-1и 0.1 и {?.)

1:го V V о 1'го I го

ОЗу (2): ■ . С,1у (2} «у •12} Ч"1у ('!)

«к и« (г; '. ДХа

Уа1 . Ш ' Ув1 Ч я 7.

Но Ив. - Не Не ■

Ьеи Ь«и Той

1/ув - Ьуе-

Дге Лге

. Исследуемые пептиды имеют не только идентичный набор аминокислот, но и одинаковый качественный состав". Соответствующий цсптид из плазмы крови человека меньше'только на один-ос-, таток яланина и аспарапшоиой кислоты.'Можно-предполагать,', что ингибйторы_самосборки фибрина пептидной природы, свойственные тканям отдельных' -видов животных, образуются счет последовательного ограниченного протеолнза одного -белка, предшественника. .

О биологической роли пептидных ингибиторов самосборки фибрина. , Одной из моделей'гиперкоагулемии, обусловленной эндогенной тромбинемней., является -кровопогоря /Зубаироо Д.М,, 1962; Данильченио''Е.В. ,-1973/; Кровопог^рю осуществляли и объеме ЗОЯ. от всей .циркулирующей крови, повторяя ото через 24 и 48 ч (е. .последний.раз — обгшле -12$),.Отборы проб произиодили через Г ч после-воздействия. Содёрканиз ингибиторе« в'плазме повысилось уже. поело хдервой «ровсяотери т 3.2,2%, оставаясь примерно таким же после второй и"третьей, кроаопотсри. Наоборот, в тканях внутренних органов ~небдюдае.т.ея теиденпип -к: .ркизкению. .уровня, .ингибитора:. в. ларкцк лда, 16$,стенке -л-ортмоаг®,. се?-''

- г> -

лооашш, почке и Степке кикечника - на (51,6, 34,2, 12,7

н Я)"г' соптиотстненно,

}пм соарання гжзогемлой тромбине/,ми животным (масса тола 1001{5 г) в яремную вену шпепиросали риствор тромбина и 0,14 М растворе хлорида натрия в объема 0,4 мл (I мг/300 г, активность - 7 с). Операцию осуществляли I раз в сутки в течение 5 дней, отбирая нрпби перси I ч посла каалой инъекции, ¡г также через 1, 2, 3 к С суток по прекращении инъекций. Контрольные- инистше подверглись тем же манипуляциям с введением соответствующего объема растворителя (рис. 10).

15 Л/г 300

200 .

500

Рис. 10. Содержании шцпбито-рц в плазме и тканях крыс при введении тромбина (,1 шу 100 г) и по прекращении его виедвшя. Абсцисса - количество дней от начала опыта, ордината - содержание ингибитора, ЁЛ/г ткани (мл плазмы). 1 - 4 - головной мозг, к тп лапте?, сердце и плазма кро-

0 ш в и соответственно.

Содержание ингибитора а плазме в ответ-на введение тромбина но поменялось после яервмх.трех инъекций, но после пято!5 оказалось зоыетно повшеиннм (наВ1%). После пятой.инъекции различие в уровне ингибитора й.-тнанпх контрольных и опытных животных бшо достоверным во всех без исключения органах. Так, содержание ингибиторов в мозге снизилось на 32%, почке, селеяенке, печени, аорта, стенке кишечника и понеречно-л..десятой мышё - на 27, 26, 17, 33, 25 и 22% соответственно, Через I сутки по прекращению инъекций содержание ингибиторов л плазме нормализовалось, а во всех исследованных органах'оставалось пониженным. Чореа 6 суток содержание ингибиторов.-а тшь

- 2й -

иих ьоаьратилось к исходному.

Логично предгюлонеше, «то андогенная тромбинемия, обуолов-ленная выбросом тданевых факторов при кровоиотери, и ьигоген-пая тромбинемия ускоряют выход мш'иойтороа в кровоток, чтобы компенсировать их потери, связанные с образованием кошяексов мнгибитор-мономерный фибрин или ингибитор-Г'ШФ, количество которых увеличивается с появлением более высокого, чем в норме, уровня тромбина. Если ато так, то количество 1!пгт.бм\,ра в тканях должно возрастать в условиях, ограничивалныи тромбпжюбра-эованиа и, следовательно, активации фибриногена.

С этой целью использован антагонист витамина К - пелонтан, который (5 мг/100 г) вводили ежедневно.ь течение У диен в сос таре суточной-порции рациона. Пробы крови и тканой отбирали ежедневно в течение 14 дней, т.е. в период введения недентань и, в, последующие дни, В качества контроля использовали группу жлвотньк, содержащихся на таком же рационе питания без пелен-тана (рис. II).

ЁА/г 400

.200

Рис. 11. Содержание ингибитора в плазме и тканях крыс 4 при введении пелентана и по I прекращении его введения. у ¡4 Обозначении те же, что и на

рисунке 10.

Содержание ингибитора г плазме при введении пелентана достоверно увеличивалось к 6 - 7 дню от начала опыта (ни 21%). Б тканях в целом направленность изменений содержании ингибиторов одинакова; мы приводим для более наглядного восприятия.

- 29 -

графики ия1«ено1шя. содертлмл ингибиторов только в головном Monro, легких, горячо и илло'.'о кроои.

Исходя ио ПрлдНОЯОЧЕОНИЯ о тон, что при яктивации тромбино-геиопя уменьшение содержания ингибитора в органах спязано с ого выводим п г\ при блокйдо тро?дбш!отенена ~ с на-

коплением (опдертеой) гз тканях, можно думать, что расходовании инт'ибиторгп ПЛЙЗДО крови сопровождается бнстрым посполие-ниом убили з« счет вмкодп из ткяней, а при .замедлении или-бл'жчде рас*одонон1)я ингибитора, вдаод его б кроиотег уменьшается, По-видимому, содержание ингибиторов ir пламя является константой, ночной для сохранения гемоптятичеслой функции.

Для подтверждения от ого предположения определяли содержание ингнбити^оо в плйп?ю кропи яивотиюГ-в радныо сроки после кповогютнри, оопроиочгдяемой трансфузией соотпотстдуицого объема ртпюлпглтпт. С этой целью у штатных отбирали 30$ циркулирующей крови и ояменшш равным- объемом роополиглшкнп-. Через Г) мин подержание ингибиторов соетапллло 3JÍ0, [ Кп/ш\ против исходной величины - 39^0,2 15Л/мл. Отбор кропи иароа 5 мин после кроиопотсри явился одновременно второй' кропопоте-po¡i (20fi), возмещенной таким же объемом рсоподиглпкинч. Содержание ингибиторов через Í3 мин после кроиопотери упало до 29-0,3-ЕЛ/ил, но уте'через 20 шн поднялась до 35ÍG,2, a через 60 мин - до 40-1),2 Rfi/u.iT. Следовательно, ингибитор поступает в кровоток но только с тканавой жидкостью при снижении объема циркулирующей крови, но и избирательно при снйження ого содержания в плазме..

Известно,, что около 30% фибриногена кэтзболизируят коагуля-циоинпи путем,. устраняясь ш» кровотока в штде растпаримих комплексов е.шноиернш* фибрином- /Зубаиров' Д.М..,. 1976/, Можно допустить,, что при ускоренной' октисации фибриногена,'в условия*

тромбинегди > сопровождающейся образованием мономерного фибрина, ингибиторы № большие, чем обдан- >, количества расходуются на обраяопгише комплексом о кономариьм фибрином, полимерами р°, о личной степени прелости и РИМ1!1, и в составе отит комплексов улаля'тея по кровотока. Содержание жо ингибиторон п илпз-но неизменным благодаря ускоренному поступлении} их

по 1'коне!',

Нопмгжнпсть образования ассоциатор ингибиторов с мономор-Ш4 фибрином но оызыляет сомнений. Комплекеообрааоваиие же о РКШ>, КОТОрнО, видимо, являются основной формой присутствующего в кгкжотоке активированного фибриногена, проверена оке-поримештшлю. (] отой целью к нулиропапной донорской плазме (4 мл) прибавили радиомеченныД ингибитор ( I 470 Да, 0,5 мл, I 0?.0 имн/мин в I мл) и инкубировали с 0,1 мл раствора тромбина (2,5 х КГ5 г). РШ осаждали добанлением спиртового раствора р -нафтола. Расчет показал, что 17,9% ингибитора со-осотдается с РНМФ, следовательно, ингибитор мпжет образовывать ассоциата ¡49 только с мономерным фибрином, но и с РЫ® в плазме крови.

Учитывал относительно высокую стабильность содержании ингибиторов й плазме крови при существенном изменении их уровня э тканях при тромбинемни или блокаде евертьптния, трудно

представить, «то все выброшенные из ткани ингибиторы расходу-

с

кнгл на предотвращение образования фибрина. Следует допустить существование пути, который обеспечивает быструю элиминацию ингибиторов, во всяком случав, более оперативную и функционируя и не только при патологических состояниях, каким является ускоренное превращение фибриногена, но и в условиях физио-

ЯОП'.ЧОСКОП НОр-МЫ.

Для ретеиия nxo.ro вопроса крысам сводили ежедневно раствор

■ ;îi' -

тромбина (кик опиешю вышаУ. Котроливм »ивотнш вводили 0,14 M раствор хлорвдо натрия. У обеих груш ясшютнш с ишащм об-t.№hhï,i< iuotok 00С5ир1Ш1 мочу. нурйллолыю у иоц'ГрОЛЪИПХ ¡1 подо-ш«ных куме на i - Ь ;н»и вве-деннн тремо.ша, a 'raine на 6 - 0 дни по нреирашеш» ого инеденин, определи ни врилн рвкаящифи-нгшии и содержание ингибиторов в вляами, ¡wmuami их содержание во псом обьеме крови. Мочу для исследований у крш; отбирали каждые VA ч, причем один рвя отобрали подоив, екотяииуюси :<ti ¡.M ч до iiepnoit инготдш.

fipeiw» рокодтификации, опредоляин.ю и«рел 1 ч посла каждого введении тромбина удлинилось на 66% поело 1-го, на Ж,0 - после второго и на 35% - после Г>-го. Через двое «уток после инъекций тромбина, время рвмиплифмкыцни ураннивилогл, о контрольным. Об'шое содертаиив ингибиторов в плавив контрольной группы било одинаковым песо период наблюдении, в подопытной ив(««далось повыаенио поело !>-й интекции (на 63,3'/), нормализуясь на смедутише сутки. Содержание 'ингибиторов в 'суточной порции мочи у контрольных животных практически по изменялось. У подопытных животных содержание иигибитороп било заметно болышм поело 4-й и 5-й интенции тромбина на -12,5 и « таюко па 6-ii

день, т.о. через сучки после последней шшхдоии тромбина, на

ЛОМ.

Таким обралом, повторные иш.-емдш тромбина еонроиождак.уся усиленным выделенном ингибиторов'С мочой. 1>гот -факт но зависит от суточного диуреза й, за исключенном fMi лш.екипи, не сопровождается изменением, содержанием «нгцбш с.ров в илазня. Важно отметить, что .цветение -грс-мбина сопровг.жднетея, как пто показано выше, снижением концёнтрадин ингибиторов в ряде органов. .

¡! сдечуигсой сории акспй|.т«п«тов' крнпм получаля в составе

- 32 -рациона питания пелентан (5 мг/100 г). Часть животных одновременно с лелентаном-получала викасол (15 мг/ЮО г). Препараты вводили 7 дней, пробы брали г. течение 10 диен. Оощан'свертывающая активность у контролыпж животных бциа постопннной в течение всего окспернмонта. У лшютных, получали,их только пелентан, время ракальцификации на 3-й день опыта удлинилось в 2 раза, на. 7-Й - ь 47 раз. Через сутки по прекращению вве~ дегия пелентана началась нормализация свертывающей активности, закончившаяся к ТО-му дни опыта. Одновременное с полонтаны., введение викаоола заметно ограничивает- нротивоевертыгчшций оффект последнего; на 3 ~й день удлинение времени рокалщифи-кации составляло .69,5%, на 7-й - в 3,5 раза. Содержание ингибитора в плазме крови у животных, получавимх полетан, имело слабую тенденцию к нарастанию, наиболее выраженную (на 20,1%) в период максимального снижения свортноаюшей активности с поело,дующей нормализацией. У животши, получавших пелентан и викасол этого не наблюдали. Суточный диурез в ходе опыта существенно не изменялся. Содержание ингибитора в суточной порции мочи у.контрольных .животных было постоянным, а у получавших пелентан .заметно возрастало по мере снижения обшей свертывающей активности: на 3-й'день на 24$, 7-й и 9-й дни - на 131 и . 222$.

При введении викаоола одновременно с пелентаном в динамике выделения ингибитора с мочой наблюдали те же, но менеее выраженные тенденции. Так, на.3-й день выделение ингибитора не отличалось от контрольного, на ?~Ц и 9-й дни превышало только, на <30 и 20%, В тканях (ингибитор определяли в период максимального изменения экскреции с. о с" мочой) наблюдали увеличение концентрации И'"ибптора на 7-йг &~й и 4>~и дни, в частости, в ткани печени - на 37,5, 1Ь2,Г> и.'ЬЗ,2":?. Jlj.ii одноврепенн:>м

- 33 -

нпедении пелоптлна и викасола рост содержания ингибитора п ■гконпу был менее азмптон (п печени п то че сроки orí составил 53,0, 7,3 и lí)f' соотротстпснно) , а п некоторые вообще отсутст-вонгал.

Таким обрагюм, окпогоштл треэмблномчл, обуслопленнал введением тромсина, с последующей гипокошул«мией потребления сопровождается снижением содержания ингибитора во внутренних органах и ускоренном ого экскреции с мочой. Снижение свертывающего потенциала пелентоном ведет к накоплению ингибиторов п ■тканях и к повышенной экскреции с мочой, поторпл совпадает с периодом максимального снижения общей свертиввктщей нктишгости. Вшсасол в значительной мера ограничивает эффект лелентана, что унаэшапт на панисимость иноываемш иелентеном сдвигол от влияния янтикоогулянтп. на гомокоагулнцию.

Влияние внутрипвннык: интенций пептидных иигибитороо на состояние гемоиоп 1у;шции. Мы предприняли .попытку оценить изменение гемоноагулянии при внутривенном введении суммн пептидов-ингибиторов ип нланмы крови человека бельм крысам. С этой целью ингибиторы в количестве, в 53 раз провютащем их содержание в крови животных: Ш00 ЕЛ), вводили в яремную пену и через 3, 10, 20 и 30 мин после шгшкфш определяли вреют рекэльцификации, протромбиипвгю, тромбиноооо время и промя самосборки фибрина в плазме. Время рекялмшфикацич через'3 мин после инт/мщии увеличилось на "'<%, rpcwíwfonos время и' прамя самосб'орни - на ;í5 и 123% соотнетствгнно. ПротромСиновео врем?/ но изменилось, На 10-н мин. npewj рекальцификации и тромбшкшое время равнн контрольному, а время самосборки остужалось на 4b,&/V тят контрольного, но нормализовалось к'20-й минуте.

Обращает ни себя ннимяние кратковременность воздействия ии-тНбитлра. ira спертшаемость крови', Поскольку ингибиторы сэмос-

боркЯ <!!/,лержат'ия ну всех тканях внутренних органов животного не исключена возможность быстрого перераспределения дополни-

тольно введенного ингибитора между кровью и другими тканями организма. С.цель» проверки этого предположения рядиомеченний ингибитор (I3H ООО ими/мин) вводили в яремную вену и периодически измеряли уровень радиоактивности н .крови и других тканях-. Н крови через 30 с после инъекции радиоактивность соста- , аила 21 540 имп/мин в 1 мл, через 3, 5, 20 и 60 мин - соответственно 10,ii, М,В, 0,4 и 6,5% от этой величины. Радиоактивность тканей .Внутренних органон через I ч после инъекций коле-^ балась от 75 до БйО ими/мин в I г. влажной ткани. Следовательно, ингибитор быстро, но с неодинаковой скоростью, извлекается разными тканями из крови. Ири подкожном введении радиомечен- . него ингибитора (поверхность бедра задней лапы, III 200 ими/ мин) уже через 6 мин радиоактивность крови, составила 6G5 ими/ мин в I мл, не изменяясь достоверно в течение двух пасов. Радиоактивность тканей через 2 ч составила от 176ill (головной мозг) до 545^6 имп/мин на 1 г ткани (почка). Можно утверждать, что из подкожной клетчатки.ингибитор непрерывно поступает и кровоток, и с такой же интенсивностью извлекается из кропи исследованными органами при его .избытке. •: .

Таким образом, ингибиторы, несомненно, выполняя роль регулятора- агрегатного состояния крови на этапе коагуляционного превращения фибриногена, в дативном виде мало пригодны в.качестве сродства направленного воздействия на свертываемость крот-ви. Вместе, с тем весьма "вероятно что структуры, сходные с ингибитором, но способные длительно циркулировать в-крови,.'могут явиться перспективными янтцкоагуаднтами прямого действия, ограничивающими реакцию коагуляционного 'превращения•фибриногена..

Ингибитор уоагу.тяпнониогп, преврав'внид"фибриногена растителв-

шчч> ii|,oiiuyолдинни. lir-uMrcHiiii-i ücwiö/i,«}'..!},. проводимые ь nu-li'tiii лаборатории п тп^шлюшьи на вом.таппоти ппл/чс--

ния на растительного сырья продукте,!? с аитияоагулшлщой нктиа-НООТ1.П покапала» что ¿кстроиты juma леккротгенинх • рас.тиний могут ог|лнич(*яа'1Ч, фиАртюбразлвыме /¡¡ыц.оьский Л.[iL й ооавт., 1УВ.Ч; Герберт И.Я., 1\Ы)/. Особенно выражепньм гф^ектпн обда-¡¡.ньт ¡.честракт из трапы медуницы мягчайшей.

Мы инделили гомогоншШ ингибитор на трапп иедушщн млгчпй-uwii комплексом приеммп, вилючикидих окотршецию 0,2 М рнствором аммиака, гель-фил ьтршш» на сефадеаое С-50 и ионообменную хро~ матпграфню на <±№ -с.офадексо А-25 в ступенчатом градиенте ле-г тучего буфера. Голь-фп.льтргщин полученного про дукта через се— фадекс G-50 (со свидетелями-метчиками) укапала, что подученное еоединение имеет и , равную 2 200^60 Да, оледолательно, ингибитор относится к моденул&м средней массы. Сходств!/ споЛсти ингибитора из растительного сырья (термостаоилыюогь, значение молекулярной массы, растооримооть и воде) с ингибиторами из нлаяни крови и тканей животных побудило нес выяснить, не является ли ингибитор ил растений также пептидом.

Автоматический аминокислотный анализ гидролизата ингибитора ма медуницы показал, что он является пептидом, содержпшим, как и рассмотренные выше пептиды, те же 12 индоп ошномислот, почти полностью совпадающих по количественному ооетгу с наиболее "тяжелыми" ингибиторами из плазмы кропи и чинной крыш.!, крови быка, мшючной ткани'лягушки, отличаясь о г ник г.кмйиш • Набором аминокислот. tИнгибитор из мл-дуншш мягчайшей содержит П своем составе остатки Апр(2 остатка), 'ihr, Яаг, ein (2 остатка), iro (¿остатка), Uly (2 остатки),./зп (2 остатка), v«i, Не, Ген, Lys, Arg.

Сопоставление значений'И^ ', установлен!«« при гел «»-фильтра-

ции, и суммированием M входящих н его состав аминокислот выявило различие я отих величинах - на 450 Да, что свидетельствует JiMDo об аномальном поведении пептида при гель-фильтрн-ции, либо о наличии у пептида простатической группы. Исследование гидролизата пептида из растительного сырш методом хроматографии на Сумагу, пластинках Снлуфол и круговом поляриметре СМ-2 в присутствии моносахароо свидетелей нокозгию, чтг в качестве простетической группы пептид из растения содержит остатки гдакозн. lia этом основании можно заключить, что носитель АЛА, выделенный иа травы медуницы, представляет соОои глнкопептид, углеводная часть которого представлена.глюкозой пептидная - J7-» аминокислотными остатками. .

Высокая степень гомологии аминокислотного состава глпкопе тида и пептидов из плазмы кропи и тканей человека и животных подразумевает однотипность механизма торможения коагуляцион-тго превращения фибриногена. Действительно, исследование за висимости эффекта ингибитора от рН среды, использование мето "тестирования стадий", исследование влияния ингибитора на фе ментативиую и наферментативиую стадии коагуляции фибриногене под действием-тромбина подтвердило это предположение.

Для предварительной оценки перспективности использования ингибитора, из растительного сырья и качестве средства фарма!-логической коррекции гемостаза раствор инатранта медуницы (20, 40 и ВО ыг/кг массы) содержащий ингибитор, ¡¡водили в iîj н;ю вену, отбирая кровь через З мии, I, 3, 9 и 20 ч после ш екции и определяя время рекальцификации (рис. 12).

Как следует из рисунка 12, 'уке через 3 мин после иньекцш при дозе экстракта 1Ю мг/.-.г время свертывания рекальцифиаир; ванной п.чапмн "длишиюоь против контрольного в Г),6 раза, nej I и 3 ч - в 3,3 раза, чв|>ез £» ч - н ?.,9 рвав. Гшпжчйгулсми:

- ЗУ -

С!'Ур?)|Ш0ТО(| !( г-иуст.Ч 20 Ч после ШП'СКПШ! - промя рокяльцифи-КШИШ О «■•г1Н!,е но '¿'¿,'!% о-шдю, чем я ¡контроле, Интенсивность нзмононил аромат рпкплнчфткшрт зорчсчт о? догм окстрякта: иороп 1 ч поело инъекции и Р.О мг/кг промл рекпльцификации но орялиенип с контролем удлинилось п Р.,6 и 2,3 раза, череп У ч - п 1,0 и 1,3 разя соотпогстпшко..

ООО

300

100

Контроль

0,05

П

20 ч

Рис. 12. Иомадоп)?*? урепйнн рекалыЯфшэции в рангам сроки поело пньокции он'стракта медуницы. Абсцисса - гфогет, прошпдшсс поело инъекции, ч; ордината' - время реколмднфи-кации, с. I, 2 и 3 - допп эк-

стракта 00, 4Е) п 20 мг/кг.

Вант и с слоя о п ан заштныЧ оффект антикоагулянта при экячгвн-иоН тромболластш гомии^ живот»)®» двух групп еиодили антикоагулянт (40 и ВО иг/кг массы), а через 30 пин - взпось троибо-пдостиып (40 мг/кг). Контрольным животным до введения тромбо-пластина иньецировадя растворитель. В контроле (бй крысы) погибло 50-0, З'а иипотинх, но фоне менмчой дозы пнтикоягуляита (5? ярые) - 30—5,У, пп фона большей доян (59 крыс) - 10*3,9«. Следовательно, антиковгулпнт снизил частоту гибели животньк от тромбоза в I ИЗО и 5,0- раза при меньших ч больших дозях соответственно я условиях октпвпшт свертывания 'кропи тромбо-ллпетином. 1 ,

. Скрининг 50 видов растсняй, произрасташис г» Западно)? Сибири, направленный на выявлении растений-, содержащих янтикодгу-лякт, показал, что ряд рястекнй (лабазник вяоолпетнкй, полть

- 38 ~

обмкиовенная, репейиичек волосистый, цикорий обнкнопепнпП) , таккя как « медуница, перспоктивнн для поучения в кн'гостно сырья, являющегося источником витикоягулянтя. прямого действия: их якстрякть> увеличивают время рекальнификации, тромбиновое и протромбиновое время in vitro, ('локируют коагуляции ни« превращение фибриногена и ограничивают самосборку фибрина. Носители и» вышеперечисленных объектов но данным голь-Фильтрации принадлежат к молекулем средней массы и обладают одинаковым с медуницей механизмом влияния па гемокоогуляцит. При их внутривенном введении белым крысам и дозо 40 мг/кг мчссн рая-аивается стойкая пшсжгшулемия, наблюдаемая опусти '¿4 ч после однократной инъекции.

Таким' образом, в плазме крови и тканях внутренних органон человека и ксивотних содержатся ннгпбиторы ¡соагу.пяционного превращения фибриногена, ограничивающие скорость высвобождения ио фибриногена фибриномэптида В и образующие малоактивные комплексы с-мономернкм фибрином-и полимерами'различной степени зрелости ва-счет'электростатических взаимодействий с cor-' ментами'молекул мономера, расположенными, по-видимому, и и ~ домене. Экспериментальная гипер- или гипокоагулемпн существенно не изменяет уровень содержания ингибиторов в плазме кроят при одновременном уменьшении -или унели'тннн их содортаяия в тканях внутренних'оргвнор» являющихся лепо ингибиторе«, сопровождаясь усиленной окскрецией с мочой, что позволяет говорить о наличии-кесткой стабилизации урооня изучаемых .пептидов в кровотоке. Это, в свою пчорспь, свидетельствует о в*тюй Отологической функции ингибиторов. По нашему предположению, рол! ингибиторов сводится к создадим базового фона, на.кагором происходит непрерывно-осуществляющиеся процесс ¡мазмокоягуляцип бер превраг-ешя моюмерного .фибрчнп в Фибрин. Уровень ингибп-

- ЗУ -

торов в тканях и тайме зависит от степени зрелости организма и положения вида на яполюнионипП "лестнице". Ото свидетельствует о том, что пептиды ингибиторы являются наиболее древними регуляторпмп коагулпциЪино1'о превращения' фибриногена. Анализ' аминокислотного состава и первичной структуры пептидов покалил, что моннше И" молекулярной массе пептиды образуются при протеолипе своего более крупного предшественника. Исследуемые непгидн л силу быстрого перемещения изботка из крояогскя в ткачи не могут использоваться п качестве антикоагулянтор. Из растительного сырья иьщелон и исследован гликогелтид, белковая часть которого идентична пептидом животного происхождения, что обусловлинает одинаковый механизм торможения коагу-ляцнонного превращения фибриногена. Лнтикоагулянт растительного происхождения при вв еде ни и в яремную вену лабораторным шгвотнш вызывает стойкую' гшкжоагулемип, существенно снижает частоту гибели лаборатории животных от тромбоза, спровоцированного введением экзогенного тромбопластина, что обусловливает интерес к его дальнейшему исследованию в качестве средства воздействия на гемостаз. Предложен ряд растений,- перспективных в плане выделения аналогичного антикоагулянтя прямого "действия. ''.'.-.

В Ы 1МЗ д и

г. 13 плязмо крови человека содержатся ингибиторы коагуля-пионного превращения фибриногена - пептиды с молекулярной массой I -17.0,. 1 ЮЗ'иШЪДа,-' ■ ' -

Р.. Пептидные ингибиторы ограничивают ксагулягцюниое прев-', ратение фибриногена т ферментативной и. пефсрме»тативнгй стадия*, замедляя скорость высвобождения фибринопепгида В под .'деРстоисн тровбина и образуя долорктипнме аасопиатм пройму--П'готр.ен!кг г. ^ибриио!.? п., р сгйпеяи,' с пол«-

мерами различной степени зрелости эа счет электростатических связей. По мере формирования протофибрилл интенсивность взаимодействия уменьшается и в состав сформированного сгустка фибрина ингибиторы но входит.

3. Пептидный ингибитор с молекулярной Msceoti I 47(.1 /in име-

Вст 'ihrer первичную структуру; Mtl,-Gly-lle-T«l-Thr-I,pit-,«3er-Ani.-Mo-

f., А

-Olu-Oj.u-I,.yö--Arf;~2,ro-G:iy-Ö00ii.0n является предшественником пептидов с молекулярной массой 1 163 и ВД5 Да,

4. Пептидные ингибиторы коагуляционного превращения фибриногена с аналогичным механизмом действия присутствуют в кропи быка, в крови и тканях внутренних органов белой крысы.

5. Пепридьыа ингибиторы способны перераспределяться мечеду кровью и другими -тканями, содержание ингибиторов в которых-существенно вше, что позволяет считать их депо ингибиторов.

6. Подержание пептидных ингибиторов в плазме крови поддерживается на постоянном уровне благодаря тому, что избыток их устраняется усиленной окскрепивй с мочой, а снижение компенсируется поступлением из тканей.

7. Пептидные ингибиторы являются наиболее древними регуляторами коагуляционного превращения фибриногена, их уровень

в крови и тканях уменьшается по мере филогенетического и онтогенетического "старения", т.е. по мгзре уменьшения удельно!! эна-чнмостн коагуляционньге превращений фибриногена в цегш роакциН, ведущих к образованию фибрина. 0

8. В тканях ряда травянистых растений содержатся аналогичный пептидам-ингибиторам .ко механиому действия гликопептнд, молекула которого представлена аминокислотами 12-ти видов (пептидная часть) и остатками глюкозы (простотческая группа).

9. При внутривенном сведении гликопептид ип растительного сырья длитеды г) циркулирует в кр-щптокб, вызывает стойкую гп-

- ,il -

iuit(i',ai'yji(;MiiKi, что оииаетельству.ет о перспективности ого после-• делания и юшеетъе аитикоагуляпта прямого действия.

ТО. Г'аурьсотпн способ выделения гомо) ешшх пептидов ив материала »цветного происхождения.

¡1. Разработал способ получения ервдотв», обладающего анти-ксагулкпгной активностью, из сырья растительного происхождения.

СПИСОК работ, опубликованных но теме диссертации

I. Пишеьский А.Ш., Чирятьев К.Д.. Физиологический ингибитор аутополимерияации фибрин-мономера //Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии: Тез. докл. Всесовз. совещания. - М. , 1902, С. 89 -93.

Р.. БишевскиИ А.Ш., Чирятьев К.Л. Ингибитор самосборки фибрина // Укр. биохим. жури. - 1983. - Т. 55. - № 3. - 0, ?.60-¿65.

3. К вопросу о регуляции заключительного отава сьертиваши - самосборки фибрина / Л.11!. Бнкевский, Е.А. Чирятьев, U.K. Умутбаева, С.И. Тажудинова // Поражения сосудистой стшки и гемостаз: Тез. докл. 11 Всесоюэ. конф. ~Ь!., 1903. С. 51Я-Б20.

4. Бшевсивй А.Ш., Чирятьев Е.А. Н механизму торможения самосборки термостибильиым ингибитором сыворотки крови // Вопр. мед. химии. - 1983. - Т. 29. - № 5.. - С: йй - 27.

б. Влияние антивитамина К на формирование кальций-зависимых бедкоВг-прокоагулянтои и обмен ингибиторов фибрйносбрйзова-ния /Л.III. Ешсвскнй, C.JI. ('¿ляп,- Ё.А. Чирятьев и др. // .'.нги-вчташии в регуляции обмена вешеств: Тез. докл. V Гр- дненокого симп. - Гродно, 19!Й. - С. 61 - 6Л.

6. А.с. -lOW-V-l а:СГ,-!ШЙ А 61 Б Г0/00. Способ получен»»? ин--иС итсра пглинериэаняи фибрина /А.Ш. Бшввсиий, К.А, Чирят»-

- 42 -

ев. - Опубл. 30,09,83. Вам. № 36.

7. Бышевский _Л.Ш., Умутбаева Ы.К., Чирятьоь Е.Л. Аминокислотный состав ингибитора самосборки фибрина из тканей крыс // Биохимия. - 1904. - Т. 49.4i J2. - 0. 1934 - 1939.

В. О регуляции самосборки фибрина в кровотоке /Л.Ш. Еии^ао кий, СЛ. Галин, ЕЛ. Чирятьеи и др.// Клинические и .'экспериментальные аспекты регуляции агрегатного состоянии крови: Межвузовский сб. науч. трудов. - Г,аратов, "1904. - 0. Ов - У4.

9. А.с. I122695 СССР, ШШ2 А 61 В 10/00. Способ получения ингибитора полимеризации фибрина / li.A. Чирдтьео, W.lt. Умут-баегза. - Опубл. 07.II.84. Бюл. 8» 41.

10. Бышевский Л.Ш., Уыутбаова М.Н., Чирнтьов Е.Л. К биологической роли ингибитора самосборки фибрина пептидной природь // Физиология и фармакология полипептидов / Под рвд. Б.И. Кус ника. - Чита, 1985. - С. 45 - 46.

11. Чирятьвв Е.Л. Выделение ингибитора самосборки фибрина us биологических жидкостей и окстрактов тканей '// Там же, - С 69 - 70.

12. Бышевский A.111., Чирятьев Е.А., Умутбаева U.K. Выделение ингибитора самосборки фибрина из плазмы крови и икстрактс тканей // Вопр. мед. химии. - 1905. - № 5. - С. 30 - 32.

13. К ыехани&му регуляции самосборки фибрина /Л.Ш. Бышевский, Е.Л. Чирятьев, С.И.' Тажудинова и др. // Биохимическая вколотя. Экспериментальная tt клиническая биохимия (информац! онные материалы), - Свердловск, 190)0. - С, 10 - 19.

14. Вшевский А.III., Чирнтьев Е.А., Уыутбаева М.К. О ьодмо; ной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции спертнван! крови // Гематология и трансфу.чиология. - 1905, - Т. 30. - li I. - С. 35 - 3d.

15. О регуляции нофсрментативного »тана свертывания крови

- 4Н -

Л.111. Внгаевски!!, С.Л. Галян, Е.А. Чирятьев и др. // И Всесогоз. с;-ег'д гематологон и трянсфузиологов: Тез. докл. - М., 1985. -С. 44\ - 441.

16. Ингибитор коагуллдионного метаболизма фибриногена на уровне самосборки / Е.Л. Чирятьев, Н.К. Умутбаева, С.И. Тату-дгшопя и др. // У Всосоюз. биоуим. съезд: Топ. докл. - М., (9!ЗГ). - Т. 2. - С. 237 - 23?. ,

17. Пептид - регулятор агрегатного состояния-крови на этане самосборки фибрина /А.Ш, Бншевский, Е.А. Чирптьеп, U.K. Умутбаепа и др. // Гематология и траггсфуяиология. 1906. - № 6. - С. 26 - 31.

.18. Циркулирующие антигсоагулянты /А.Ш. Бышвский, П.И. Ле-пен, Е.А. Ч1Грятьеп и др. // Свертываемость крови при реакции напряжения/ Под редакцией Б. 11. Кузника. - Свердловск; Средне-Уральское кн. иэд-во. - 1986,. - С. 34 - 40.

19. Ингибиторы взаимодействия тромбин-фибриноген, самосборки и стабилизации фибрина /А.Ш, Ьышевсиий, О.А. Терсенон, Е.А. .Чирятьев // Там те.— С. 40 - 52..

20. Лепен П.И., Чирятьев Е.А. Реакция гемокоагуляции. на не паническую травму //Там же. - С. 76 - 79 г

21. О регуляции агрегатного состояния крови на уровне самосборки фибрина / Е.Л. Чирятьев, А.Н. Левкил, А.И. Мухачев

и др. //Лктуалытае пробледа гемостаза п клинической практике: Тез. докл. Всесо^э. конф. - If.',-1987. - С. 131 £31.

22. йндогениме пептиды.- регуляторы самосборки фибрина / Е.А. Чирятьев,-A.IK Левкин, А.И. Мухачев и др. // Тим же. - С. 174 - 174. ■'"■'• :. ' ;

23. Чирятьев В. А,, Екчевский А.Ш., Умутбаева М.К. Обмен ингибитора самосборки у крыс //Бвд,., оксг.ерим, бпсл. и мед. -I9Ü7: - Р .6..\-;q;.'562 - 564/': • '

- 4'i

24. Регуляция заключительного £-twir евертмиппня кроки / К.А. Чнрятьев, С,И. Тажуднновгз, С.Л. Грльчн и др. // Ачтуолып проблемы физиологических и структурно-<{>ункцис1.шм1ь>.х' основ жнпнздеятепьности: Науч, труди СО АМН СССР,- Новосибирск, 1907. - С. 211 - 2П.

25. Регуляция коагуляционцьвс превращений фибриногена / Й..Ш. Бышовский, С.Л. Галян, fi.il. ЧирятМ) в и др. - Сворл'кч'ок Средно-Уральскор кн. иэд-но, 1907. - 205 с.

26. Чирятьев Е.Л., Леонова 0.П., Бьниевскии Л.Ш. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природа // Биохимия. - 1988. - Т. 53. - № б. - П. 1025 - К«2.

27. Сопоставление «механизмов торможения самосборки фиори ингибиторами из ражт источников / Е.А. Чирят ьев, ИЛ. Гор берт, О.П. Леонова н др. // Иеханиамы регуляции гемостгют н уровне молекулярных вмдаодействнй / Под рэд. Л.11!. Вмиоршго - Свердловск, 1988. - С. 24 - 28. '

ЕВ. Чирят ьев К. Л., Быюеиокий Л.Ш., Дорэднево К,2'. lljwpcv йнгикоагулянта из травы медуницы млгчайшеЯ // ВеороеиГюкая Неуч.-практ. коцф.-мол. ученик: Тйя. докл. - КуЙбдарв, 190* Г„ IB6 - 18В,-

Ш. Чирят ьев Ё.А., Леонова. 0.11., (¿¿аденский /(.1!!. I1 run/мод етвие пептидного" ингибитора г, двумя Формами мотчдерного фи :!а, различотсшкися по степени «ггивппии // Угср. 0и«ч. жури 198?. - Т. 61. - № J-. ~ С. 3 - У. *

30,. Лнтиксагулянтлмй эффект извлечений ив некоторых рК<-ний Западной Сибири / Чмрятигв Е.А.Дороднева К.В., и др. // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Днл! Востока: Tea. докл. Псесоыа. конф.' - Томск, 1909. - 0. Ш1,

31. Гег:ение 1ШЙЙП1Э № 4053404/30 - 14(027773) от 1&.12 MHJV* А 61 К 35/70. Способ получения средства, 'рблгчамиго

- 415 -

тикоагутштно!! актионостыи /К.Л. Чирятьем, 11,И. Левей, H.A. -Дементьева, Е.Ф. Дсроднеьа.

32. биохимический компонент сьертывания кропи /А.Ш.Бышевс-шш, C.JI. Галян, Е.А. Чирятьев н др. - Свердловск, над-во-Уральского ун-та, [990. - 250 с.