Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Пептидергические механизмы возникновения и ликвидации экспериментальных нейропатологических синдромов

Актуальность темы. Проблема регуляции функций является одной из важнейших для медико-биологических дисциплин, в частности, для патофизиологии. Выяснение и понимание причин нарушений, возникающих в процессе функционирования систем организма, позволяет оказать эффективное нормализующее воздействие на деятельность измененной физиологической системы. Нарушения регуляторного компонента в той или иной степени имеют место при всех патологических процессах, причем при многих из них регуляторные нарушения являются первичными, т.е. служат причиной развития последующих патологических реакций.

Принцип антагонистического взаимодействия систем играет существенную роль в регуляции функций в условиях нормы и патологии в поддержании гомеос-татических отношений, в механизмах защиты организма, его адаптации, в реализации процессов выздоровления. В норме антагонистические физиологические системы представляют собой функционально взаимосвязанные подсистемы, осуществляющие реализацию заданных функций. Изучение особенностей развития и подавления патологических синдромов в нервной системе позволило Г.Н.Крыжа-новскому (1980,1997) ввести понятие «антисистемы» как одного из универсальных механизмов предотвращения и ликвидации патологических состояний.

Возникновение той или иной формы патологии может быть связано не только с непосредственным повреждением физиологической системы, но и генетической или приобретенной недостаточностью функций антисистемы. Этот принципиально новый подход к пониманию патогенеза и механизмов ликвидации многих патологических состояний и заболеваний имеет не только важное теоретическое значение, но и обеспечивает базу для разработки патогенетической терапии. Одной из задач теоретической и практической медицины является определение механизмов взаимодействия антагонистических систем, выяснение условий возникновения патологических систем и особенностей эндогенной и экзогенной активации антисистем.

Исследование механизмов ограничения и подавления активности патологических систем представляет собой саногенетический базис для новых подходов к разработке методов лечения важнейших нейропатологических синдромов, таких как эпилепсия, болевой синдром и различные повреждения мозга.

Несмотря на высокую эффективность фармакотерапии эпилепсии, совершенствование хирургического лечения и мер профилактики, это заболевание остается весьма распространенным — частота встречаемости колеблется от 1,5 (Япония) до 15-30 (Африка и Южная Америка) на 1000 населения (Porter, 1985; Shoenenberg, 1987; Sidenvall, 1990). Кроме того, существует категория больных эпилепсией, резистентных к воздействию лекарственных препаратов и не имеющих показаний к хирургическому лечению и, следовательно, обреченных на неизбежную потерю трудоспособности и инвалидизацию. В то же время даже при эффективной фармакотерапии длительное применение препаратов сопряжено с развитием побочных эффектов (А.И.Болдырев, 1984; В.А.Карлов, 1990). Поэтому существующие методы лечения эпилепсии не могут быть признаны удовлетворительными.

Проблема патологической боли, имеющей дизадаптивное и патогенное значение для организма, продолжает оставаться одной из центральных проблем современной нейрофизиологии и клиники. Патологическая боль может возникать при различных формах соматической патологии и патологии самой нервной системы, она вызывает психические и эмоциональные расстройства и дезинтеграцию деятельности ЦНС, в ряде случаев приводит к суицидальным попыткам.

В рассмотрении механизмов возникновения и купирования исследуемых экспериментальных синдромов мы исходили из общей теории генераторных, детер-минантных и системных механизмов нейропатологических синдромов (Г.Н.Крыжановский, 1980-1997). Согласно данной теории, в основе развития нейропатологических синдромов лежит образование патодинамической организации из поврежденных и неповрежденных элементов ЦНС, которая является патологической системой (ПС), возникающей под влиянием гиперактивного образования

ЦНС (патологической детерминанты) и имеющей биологически отрицательное значение для организма.

Формированию представлений о системной организации генеза нейропатоло-гических синдромов предшествовал анализ клеточных и тканевых закономерностей локальных процессов в зоне детерминантной структуры. Это привело к разработке метода комплексной патогенетической терапии нейропагологических синдромов, использующего в качестве основного подхода к подавлению, в частности, эпилептической активности (ЭпА), применение веществ эндогенного происхождения, включаемых в комплекс в зависимости от нейрохимического полиморфизма в зоне детерминанты соответствующего синдрома. Новым этапом в понимании механизмов купирования нейропатологических синдромов явилось установление значения дистантных структур в подавлении патологической детерминанты и обоснование основных положений концепции антиэпилептической и антиноцицептивной систем. В принципиальном плане было показано, что подавление эпилептической ПС под влиянием фармакологических препаратов может осуществляться не только за счет прямого угнетения ими детерминантной структуры, патологических связей и синаптических механизмов, но и путем, опосредованным активацией соответствующих антисистем.

К началу проведения настоящих исследований оставался малоисследованным гуморальный механизм влияния антисистем на структуры-мишени, реализующийся с участием ликворной системы.

Одним из подходов к поиску веществ-посредников действия антисистем является изучение изменений в содержании этих веществ в ЦНС при формировании ПС и влиянии на сформировавшуюся ПС соединений, оказывающих модулирующее влияние на функциональное состояние нервной системы. К веществам данной группы относятся нейропептиды, для многих из которых установлена способность модулировать ЭпА (Mathern et al., 1996; Mazarati et al., 1999), изменять пороги ноцицепции (Broqua et al., 1996; Boom et al., 1999; Wu et al., 1999) и оказывать терапевтические эффекты при повреждении мозга (Тапака е1 а1., 1997; Бко^а & а1., 1999). Восстановление баланса пептидных нейромодуляторов может оказаться перспективным способом ликвидации нейропатологических синдромов. Кроме того, сдвиги в содержании определенных нейропептидов и белков в СМЖ являются характерными для многих заболеваний ЦНС. Анализы такого рода сопряжены с рядом технических трудностей даже в условиях стационара и совершенно неприменимы для раннего выявления доклинических стадий отклонений в деятельности ЦНС. Исходя из известной взаимосвязи белков СМЖ и сывороточных белков (Э.Эйнштейн, 1988), нам представлялось перспективным адаптировать для условий массовых обследований метод лазерной корреляционной спектроскопии, позволяющий оценивать соотношения между биомолекулами — периферическими маркерами активности нервной системы.

Целью настоящего исследования было определение нейрохимической организации систем и антисистем, в частности, пептидергических механизмов их взаимодействия при ряде нейропатологических синдромов. Основными объектами исследований были наиболее распространенные нейропатологические синдромы — эпилепсия, патологическая боль и повреждение мозга.

Задачи исследования:

1. Изучение изменений в содержании нейропептидов в ткани головного и спинного мозга и ликвора животных с указанными экспериментальными нейро-патологическими синдромами.

2. Выявление в ткани мозга и ликворе пептидов, способствующих и препятствующих развитию экспериментальных нейропатологических синдромов.

3. Изучение возможных механизмов наработки выявленных пептидов и реализации их эффектов.

4. Изучение возможности воздействия на скорость развития и тяжесть экспериментальных синдромов путем восстановления баланса в содержании нейропептидов.

5. Адаптация метода оценки метаболических сдвигов при помощи лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для массовых обследований.

Научная новизна. На различных экспериментальных моделях эпилептической активности (электрическая стимуляция коры, фармакологический кинд-линг) показано, что в ткани мозга животных обнаруживаются вещества пептидной природы, которые при введении животным-реципиентам повышают их чувствительность к эпилептогенам и могут индуцировать электрографические и поведенческие судорожные реакции. Напротив, в ликворе животных, подвергшихся электростимуляции антиэпилептических структур, выявлены пептиды, вызывающие у животных-реципиентов антиэпилептические эффекты — повышение порога чувствительности к эпилептогенам и ослабление интенсивности судорожных реакций. Обнаружение в ликворе веществ, оказывающих антиэпилептическое действие после стимуляции антиэпилептических структур без предшествующего судорожного приступа — результат, имеющий приоритетный характер. Полученные данные легли в основу создания новых моделей эпилепсии и активации антиэпилептической системы (авторское свидетельство № 1444872 от 15.08.1988).

Выявлены изменения в содержании ряда пептидов (энкефалины, соматоста-тин) в ткани головного мозга животных с экспериментальной эпилепсией. Установлена связь этих изменений со сдвигами в составе потенциальных белков-предшественников и интенсивности белкового синтеза в различных структурах мозга (лобная и затылочная кора, гиппокамп, стриатум, таламус).

При болевых синдромах, вызванных созданием патологической системы в ноцицептивной системе, в спинном мозге обнаружены вещества пептидной природы, обладающие анальгетическими свойствами. Выраженность их анальгетичес-кого действия находилась в прямой зависимости от интенсивности и продолжительности болевого синдрома у крыс-доноров. Наибольшими анальгетическими свойствами обладали экстракты, полученные из области создания генератора патологически усиленного возбуждения.

Выявлены достоверные сдвиги в содержании энкефалинов в спинном мозге крыс с болевым синдромом на стороне создания генератора и на противоположной стороне. С учетом этих изменений осуществлена успешная попытка воздействия на скорость развития и тяжесть болевого синдрома путем избирательного изменения содержания отдельных пептидов в ткани спинного мозга экспериментальных животных.

Установлено достоверное ускорение восстановления условных рефлексов двустороннего избегания (УРДИ), нарушенных унилатеральной экстирпацией лобной коры, под действием веществ пептидной природы из мозга. Радиоиммунологическим методом показаны изменения в содержании вазоактивного интестинального пептида (ВИП) после фронтальной лобэктомии в различных структурах мозга. Хроническое внутрижелудочковое введение ВИП оказывало нормализующее действие на восстановление рефлексов и поведения, вызванные операцией. Кроме того, введение ВИП приводило к восстановлению баланса нейромедиаторов, нарушенному лобэктомией.

Таким образом, в экспериментальных условиях на моделях эпилепсии, патологической боли и повреждения мозга обоснована роль пептидных факторов в качестве гуморальных эффекторов патологических систем и антисистем. Показан универсальный характер реализации указанных эффектов нейропептидов у животных разных видов, свидетельствующий об общебиологаческом характере установленных нейрохимических механизмов.

С помощью лазерной корреляционной спектроскопии (Л КС) показана возможность доклинического выявления патологических изменений в нервной системе.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные в диссертационном исследовании, вносят существенный вклад в понимание нейрохимических механизмов системно-антисистемного взаимодействия при патологии нервной системы. Впервые показано, что активация патологических (эпилептической, ноцицептивной) систем и активация антисистемы сопровождается выделением эндогенных биологически активных веществ пептидной природы, индуцирующих соответствующие состояния. Использование подобных веществ (продуктов активации антисистем) может стать новым направлением в разработке специфической патогенетической терапии различных повреждений нервной системы.

Применение метода лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека в условиях массовых обследований открывает новые перспективы для доклинического выявления групп риска по заболеваниям нервной системы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активация патологической эпилептической системы и патологической ноцицептивной системы и активация антисистемы сопровождается выделением эндогенных биологически активных веществ пептидной природы, индуцирующих либо подавляющих соответствующие патологические состояния.

2. Отсутствие видовой специфичности при реализации пептидергических эффектов антиэпилептической системы свидетельствует об общебиологическом характере установленного механизма подавления эпилептиформной активности.

3. Метод лазерной корреляционной спектроскопии, примененный для массовых обследований, позволяет выделять группы риска при функциональных и органических нарушениях нервной системы.

Внедрение результатов работы. Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях в зонах экологических аномалий и техногенных катастроф внедрен в практику Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при МЗ РФ.

12

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 1-й Всесоюзной конференции по нейропептидам (Томск, 1985, Россия), на 4-й Всесоюзной конференции, посвященной Х.С.Коштоянцу (Москва, 1985 г., Россия), на 10-й Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы (Горький, июль 1987 г., Россия), на 1-й школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий" (Кобулети, декабрь 1987 г., Грузия), на 2-й Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1988 г., Украина), на 4-м Всесоюзном съезде патофизиологов (Москва, 1989 г., Россия), на Всесоюзном симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" (Горький, ноябрь 1990 г., Россия), на учредительном Конгрессе международного общества по патофизиологии (Москва, июнь 1991 г., Россия), на 5-й международной встрече Европейской нейроэндокринологической ассоциации (5th ENEA Meet., Будапешт, август 1991 г., Венгрия), на 24-м Европейском пептидном симпозиуме (24th European Peptide Symp., Эдинбург, сентябрь 1996 г., Великобритания), на 1-м Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, октябрь 1996 г., Россия), на 3-м международном симпозиуме по ВИП и родственным пептидам (3rd Int. Symp. on VIP, PACAPand Related Peptides, Фрайбург, сентябрь 1997 г, Германия), на 2-м Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, октябрь 2000 г., Россия), на научно-практической конференции «Медико-биологическая и экстремальная педиатрия» (Москва, октябрь 2000 г., Россия), на 10-м Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, январь 2001 г).

выводы

1. При фармакологическом и электростимуляционном киндлинге в ткани мозга животных выявляются видонеспецифические пептидные факторы, обеспечивающие повышение судорожной готовности мозга к действию конвульсантов — коразолаи пик-ротоксина, а также влияющие на латентный период появления и длительность судорожных разрядов. Местом накопления этих соединений являются вентральные отделы среднего мозга, в реализации их действия принимают участие опиоидные рецепторы.

2. Формирование эпилептической системы в условиях электростимуляци-онного коркового киндлинга приводит к снижению содержания лей-энкефалина и соматостатина в области синаптической стимуляции.

3. Электростимуляционный корковый киндлинг вызывает количественные и качественные изменения в интенсивности синтеза и наборе потенциальных белков-предшественников в коре и стриатуме экспериментальных животных.

4. Антиэпилептическая система реализует свои эффекты благодаря высвобождению в ликвор видонеспецифических гуморальных соединений пептидной природы. Внутрижелудочковое введение этих пептидов животным-реципиентам приводит к подавлению генерализованных острых и хронических судорожных реакций, предотвращает развитие клонико-тонических судорог и подавляет разряды эпилептических очагов в коре головного мозга.

5. При болевых синдромах, вызванных созданием патологической системы в системе болевой чувствительности, в спинном мозге обнаружены вещества пептидной природы, обладающие анальгетическими свойствами, что свидетельствует об активации антиноцицептивной системы. Выраженность их действия находится в прямой зависимости от интенсивности и продолжительности болевого синдрома у крыс-доноров.

6. В условиях болевого синдрома спинального происхождения выявлены сдвиги в содержании лей- и мет-энкефалинов на стороне создания генератора патологичес

192 ки усиленного возбуждения и на противоположной стороне. Избирательное изменение содержания этих пептидов в ткани спинного мозга экспериментальных животных снижает скорость развития и тяжесть болевого синдрома.

7. Хроническое внутрижелудочковое введение вазоактивного интестиналь-ного пептида (ВИП) оказывает нормализующее действие на восстановление рефлексов и поведения, вызванные фронтальной лобэктомией, и приводит к восстановлению баланса нейромедиаторов, нарушенному операцией.

8. Метод лазерной корреляционной спектроскопии, используемый для массовых обследований, позволяет выделять группы риска при нарушениях деятельности нервной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показывают, что в осуществлении эффектов образований антиэпилептической системы, реализующихся в различных условиях их активации, существенное значение имеет высвобождение в ЦСЖ факторов пептидной природы. На животных разных видов показано, что ЦСЖ после ЭШР, а также после ЭС мозжечка, хвостатого ядра, ВБЧ вызывает подавление судорожной активности у животных-реципиентов. Эффект угнетения генерализованной ЭпА отмечали в условиях провокации судорожной активности системным введением различных конвуль-сантов (коразол, пикротоксин, бикукуллин) после внутрижелудочковош применения ЦСЖ крысам. Однако, ЭпА, провоцируемая у животных системным введением стрихнина, не подавлялась ЦСЖ кошек после ЭШР и ЭС мозжечка (Л.С.Годлевский, 1991). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что противоэпилептичес-кое действие ЦСЖ проявляется в условиях моделирования ЭпА, механизмы развития которой связаны с нарушением ГАМК-ергического торможения — воздействие кора-зола, пикротоксина, бикукуллина, и не влияет на ЭпА, возникающую нарушения гли-цин-обусловленных тормозных механизмов (стрихнин).

Пептидная природа факторов ЦСЖ, обеспечивающих ее противосудорожное действие в различных условиях активации антиэпилептической системы, подтверждается устранением эффектов угнетения ЭпА после инкубации ЦСЖ с проназой. Хроматографическое разделение на фракции, содержащие, с одной стороны, пептиды, а с другой — соли и нейромедиаторы, показало, что противоэпилептическое действие ЦСЖ кошек с ЭС мозжечка обусловлено пептид-содержащей фракцией. Эти результаты показывают участие пептидных соединений в осуществлении функций антиэпилептической системы и, в частности, мозжечка как существенно важной ее составной части. Следует отметить, что противосудорожные эффекты ЭС мозжечка связывают в основном с увеличением уровня ГАМК и норадреналина в ЦСЖ (Wood et al., 1977).

Сходная противоэпилептическая роль пептидных факторов ЦСЖ отмечена в работах Tortella (1988), Tortella, Long (1988), которые установили, что в условиях максимальных электрошоковых судорог в ЦСЖ накапливаются пептидные соединения, вызывающие при внутрижелудочковом введении эффект угнетения генерализованных судорог, индуцируемых у интактных крыс-реципиентов флуротилом. Дальнейшая идентификация активных факторов ЦСЖ показала, что эти вещества разрушаются проназой, взаимодействуют с дельта-опиоидными рецепторами, имеют молекулярную массу от 5 до 10 кДа и не являются динорфином А, лей- и мет-энкефалинами. По мнению авторов, речь идет о высокомолекулярном агонисте опиоидных рецепторов.

Противосудорожные эффекты ЦСЖ как после ЭШР, так и после ЭС мозжечка блокировались под влиянием системного введения налоксона, применяемого в относительно большой (10 мг/кг) дозе, в то время как меньшая доза препарата (1,0 мг/кг) не оказывала влияния на выраженность прогивоэпилеп-тического действия ЦСЖ. Эти данные свидетельствуют о том, что реализация подавляющего ЭпА влияния ЦСЖ опосредована опиоидными рецепторами кили 5-типа, блокирование которых может осуществлено введением налоксона только в большой дозе.

В условиях хронической ЭпА, формируемой у крыс с помощью фармакологического киндлинга, гуморальный механизм реализации эффектов АЭС обеспечивается другими, возможно, р,-опиоидными рецепторами, так как противоэпилептическое действие ЦСЖ киндлинговых животных на генерализованную ЭпА, индуцированную у интактных крыс введением пикротоксина, устранялось введением небольшой (1,0 мг/кг) дозы налоксона.

Таким образом, проведенные исследования позволяют полагать, что активация структур антиэпилептической системы, сопровождающаяся высвобождением в ЦСЖ противоэпилептических факторов пептидной природы, является важным механизмом снижения судорожной готовности структур мозга, так как накопление данных веществ в ЦСЖ сопровождается прямым угнетением данными соединениями активности очагов ЭпА в коре головного мозга.

Полученные данные позволяют рассматривать функциональные взаимоотношения между структурами антиэпилептической системы, реализующиеся в процессе осуществления подавления ЭШР-индуцированной ЭпА с участием гуморальных факторов ЦСЖ. В проведенных Л.С.Годлевским исследованиях показано, что ЦСЖ кошек, подвергнутых электрошоку в условиях предварительной механической билатеральной деструкции ВБЧ, не оказывала противоэпилептичес-кого эффекта на генерализованную ЭпА, вызванную пикротоксином у крыс, в то время как ЦСЖ этих же животных после ЭС коры червя мозжечка оказывала про-тивоэпилептическое действие. Вместе с тем, ЦСЖ, полученная в условиях ЭС ВБЧ у интактных кошек, снижала тяжесть судорог, вызванных пикротоксином у крыс. Этот эффект устранялся обработкой ЦСЖ проназой.

Поскольку ЭШР в этих условиях осуществлялось раздражением лобных отделов коры головного мозга, приведенные результаты позволяют заключить, что в условиях возникновения эпилептогенных изменений в структурах коры и лимби-ческих образований возбуждение передается по определенным нейрональным путям с участием образований ВБЧ к стволовым структурам, где в результате активации ретикулярных ядер происходит вовлечение образований мозжечка в развитие компенсаторного противоэпилептического ответа.

Приведенный вывод подтверждается результатами изучения ЭЭГ-изменений в структурах мозга при осуществлении ЭШР до и после деструкции ВБЧ (Л.С.Годлевский, 1991). Эти исследования показали, что эффект блокирования выделения противоэпилептических соединений пептидной природы в ЦСЖ после ЭШР обусловлен отсутствием гиперактивации структур мозжечка, т.е. депривацией генераторного механизма возбуждения образований АЭС. Следует отметить, что в исследованиях Browning (1985) показано, что под влиянием сходных по своему характеру повреждений среднего мозга, моста, сопровождающихся перерывом волокон верхних ножек мозжечка, не происходит вовлечения образований мозжечка в механизмы развития двигательных тонических судорожных приступов, индуцируемых электрошоком. Также отмечали уменьшение тяжести судорожных реакций при аудиогенных судорогах в условиях разрушения верхних ножек мозжечка и ретикулярного орального ядра моста (Browning, 1981). Таким образом, для вовлечения структур мозжечка в процесс развития эписиндрома характерным является наиболее интенсивное возбуждение, имеющее место на высоте развития судорожного синдрома. Рассматривая функцию выделения противоэпилептических веществ пептидной природы как результат максимального возбуждения мозжечка при мощном эпилептогенном раздражении, можно полагать, что выделение этих соединений в ЦСЖ является одним из резервных механизмов осуществления эффектов антиэпилептической системы.

Ряд исследований, в которых проводилось изучение импульсной активности нейрональных структур мозжечка в условиях развития ЭпА в образованиях те-лэнцефалона, показывают, что для возникновения изменений функциональной активности отдельных мозжечковых нейронов требуется достаточно высокая интенсивность ЭпА. Обнаружено, что одновременно с развитием генерализованной ЭпА, индуцируемой раздражением коры головного мозга, происходит усиление импульсной активности клеток Пуркинье, а в период клонических судорог их активность снижается. При развитии иктального разряда, индуцируемого пенициллином в коре головного мозга кошки, отмечается повышение импульсной активности клеток Пуркинье, которая возвращается к норме одновременно с прекращением ЭпА (Mitra, Snider, 1975). Показано наличие взаимосвязи изменений импульсной активности клеток Пуркинье и эпилептических потенциалов в коре головного мозга, индуцированных применением пенициллина (Hablitz, Wray, 1977). По достижении достаточно высокой мощности интериктальных пеницил-лин-индуцированных разрядов в сенсомоторных отделах коры головного мозга кошек наблюдается развитие высокочастотных залпов клеток Пуркинье, сопутствующих появлению каждого потенциала и регистрирующихся в контралате-ральных отделах червя и паравермальной области (Julien, Laxer, 1974). Разряды в коре мозжечка, возникающие в течение интериктальных потенциалов и отмечаются после каждого эпилептического разряда. При возникновении в коре головного мозга иктальных потенциалов синхронность их появления с разрядами в коре мозжечка нарушается, что может быть связано с наличием предела частоты пропускания импульсов лазающими волокнами. Изменение активности клеток Пуркинье во время развития иктальных разрядов происходит, по-видимому, под влиянием импульсации, проводимой мшистыми волокнами, обладающими более высокой пропускной способностью. В период иктальных разрядов частота импульсации клеток Пуркинье всегда ниже таковой в эпилептическом очаге. Вместе с тем, изменения активности клеток Пуркинье, характерные для их активации посредством лазающих волокон при генерализованных судорожных приступах, вызванных пенициллином, не обнаружены (Hablitz, Wray, 1977). По мнению этих авторов, во время судорожных разрядов в неокортексе происходят изменения активности клеток коры мозжечка посредством входов через ядра моста, мшистые и параллельные волокна. Указанные изменения активности нейронов мозжечка происходят в тех случаях, когда под влиянием ЭпА и индуктивного активирования хвостатого ядра этой активации оказывается недостаточно для угнетения эпилептогенеза.

Таким образом, приведенные данные позволяют полагать, что эффект высвобождения пептидных маркеров влияний антиэпилептической системы в ЦСЖ является результатом достаточно интенсивного возбуждения структурных элементов мозжечка. Данный вывод подтверждается результатами Л.С.Годлевского, показывающими, что как ЭС хвостатых ядер, так и ЭС ВБЧ не приводит к накоплению в ЦСЖ факторов пептидной природы, оказывающих эффект подавления ЭпА у животных-реципиентов в том случае, когда ЭС указанных структур осуществлялась в условиях нембуталового наркоза. Можно полагать, что отсутствие противоэпилептического действия ЦСЖ в данных условиях связано с «фармакологической декортикацией» мозжечка (Gordon et al., 1973). По-видимому, деятельность мозжечковой коры имеет существенное значение для высвобождения в ЦСЖ пептидных противоэпилептических соединений.

Таким образом, индукция повышенной активности и последовательное вовлечение в формирование противоэпилептической защиты мозга структурных элементов антиэпилептической системы в случае развития генерализованной ЭпА при электрошоковом раздражении, осуществлявшегося в наших исследованиях через электроды в лобных отделах коры головного мозга, может быть представлена в виде схемы: детерминанта ЭпА (кора, лимбические структуры) — хвостатое ядро — РЧС — ВБЧ — структуры ствола мозга — мозжечок. Активация последнего приводит к высвобождению пептидных противоэпилептических факторов в ЦСЖ, что вызывает прекращение ЭпА за счет прямого угнетения активности де-терминантной структуры.

Можно полагать, что на каждом из этапов индукции активности структур антиэпилептической системы могут реализовываться собственные обратные отрицательные влияния соответствующих образований на очаги ЭпА, а в случае неэффективности этого механизма, являющегося промежуточным этапом активации антисистемы, происходит дальнейшая индукция активности ее компонентов. Хвостатое ядро, как первое звено приведенной схемы, получает афференты практически от всех участков коры головного мозга, а также от гиппокампа и миндалины (В.А.Отеллин, Э.Б.Арушанян, 1989; Fuller et al., 1987). Подтверждением первичного значения хвостатых ядер в реализации действия структур антиэпилептической системы на ЭпА служат данные исследований Э.Б.Арушаняна, Р.М.Ава-кяна (1980), Г.Н.Крыжановского и др. (1985), показывающие возникновение спайк-волновой активности, прежде всего, в структурах хвостатых ядер в ответ на введение субконвульсивной дозы пикротоксина или коразола. При этом активация стриатума, по-видимому, осуществляется посредством глутаматергических кортико-стриарных входов в виде возбуждения ГАМКергических нейронов хвостатых ядер. Возбуждение данных нейронов приводит к угнетению деятельности холинер-гических нейронов и подавлению ГАМКергических эфферентных влияний стриа-тума (К.С.Раевский, В.П.Георгиев, 1986). В результате возникает растормаживание структур, получающих стриарные эфференты — РЧС, бледного шара, энтопедун-кулярного ядра (Chevalier et al., 1985). В данной ситуации возбуждение указанных образований, имеющих тесные ГАМКергические связи с ядрами таламуса, сопровождается развитием торможения комплекса ядер —VA, VL, VM и других, что, по существу, приводит к инактивации синхронизирующего таламокортикального механизма. Как известно, деятельность последнего имеет важное значение в формировании ЭпА в коре мозга и ее генерализации. Поэтому можно полагать, что описанная последовательность приводит к ограничению и подавлению ЭпА в результате устранения облегчающих ЭпА синхронизирующих механизмов мозга.

Большинство ГАМКергических нейронов РЧС имеет дихотомические аксоны, оканчивающиеся на нейронах таламуса и глубоких слоев ВБЧ (Bentivoglio et al., 1979). Поэтому возбуждение нейронов РЧС, наряду с угнетением таламо-кор-тикальных синхронизирующих влияний, приводит к торможению нейронов глубоких слоев ВБЧ. Таким образом, на начальной стадии развития эпилептического синдрома, по-видимому, не реализуется значительный резерв саногенных влияний АЭС, осуществляемый в связи с возбуждением ВБЧ. Данная особенность деятельности антиэпилептической системы в условиях низкой интенсивности эпилептогенного возбуждения является оправданной, так как обеспечивает экономное расходование противоэпилептического потенциала антиэпилептической системы.

Можно полагать, что в механизмах угнетения синхронизирующих таламо-кортикальных влияний принимают участие также и другие компоненты антиэпилептической системы, в частности, зубчатые ядра, имеющие выраженные связи с нейронами вентро-латерального ядра таламуса, которые также, по-видимому, возбуждаются на раннем этапе развития эпилептического синдрома, так как, подобно хвостатым ядрам, имеют многочисленные входы от различных участков коры головного мозга (Yu Qi-Xiang et al., 1989). Увеличение числа структур антиэпилептической системы, вовлекаемых в компенсацию ЭпА, связано с увеличением выраженности эффектов торможения эпилептогенеза.

В условиях, когда описанные механизмы противоэпилептической деятельности антисистемы оказываются недостаточными для угнетения ЭпА, и при дальнейшем увеличении мощности эпилептогенного раздражителя, возможна деполяризационная инактивация ГАМКергических нейронов стриатума за счет чрезмерно интенсивных и продолжительных возбуждающих влияний кортико-стриарных афферентов. В подобной ситуации механизм формирования защитного ответа мозга на основе влияния со стороны антиэпилептической системы может быть обеспечен изменением знака активности нейронов РЧС и, в результате этого, — возбуждением нейронов ВБЧ по механизму растормаживания.

Таким образом, в период формирования относительно высокой интенсивности возбуждающих влияний эпилептической системы, угнетение ГАМКергических нейронов РЧС обеспечивает противоэпилептический эффект. Данное угнетение и противоэпилептическое действие, по-видимому, достигается введением в РЧС фармакологических препаратов (Bonhaus et al., 1987; Garant, Gale, 1986, 1987; King et al., 1987; Meldrum, Patel, 1989), в том числе и пептидной природы — пептида, вызывающего дельта-сон, динорфина АЬ13 (3-эндорфина.

С точки зрения концепции о вовлечении хвостатых ядер и последующего растормаживания других структур антиэпилептической системы как механизма формирования ее ответа на ранней стадии развития ЭпА, становятся понятными некоторые противоречивые данные о влиянии разрушения хвостатых ядер на ЭпА, вызываемую электростимуляцией коры головного мозга. Так, в работах Ono et al. (1986, 1987) разрушение хвостатых ядер вызывало достоверное увеличение порога возникновения генерализованной судорожной активности, вызванной низкочастотной электростимуляцией коры мозга крысы. При этом также уменьшалась утилизация дезоксиглюкозы в таламусе и черной субстанции. Проведенные этими исследователями эксперименты по изучению влияния хвостатых ядер на развитие киндлинга, индуцированного низкочастотной стимуляцией премоторной коры, показали, что деструкция стриатума блокирует формирование киндлинга, в то время как внутристриарное введение карбахола способствовало его облегчению. Авторы считают, что при снижении тормозных эфферентных влияний стриатума на эндопедункулярное ядро и черную субстанцию вызывается тоническая активность ГАМКергических эфферентов данных структур и подавление развития судорог в результате торможения таламических ядер. Данный механизм представляется весьма вероятным, поскольку ранние стадии киндлинга представляют собой модель абсансной формы эпилепсии, в реализации механизмов которой значительную рольмогут играть таламо-кортикальные синхронизирующие влияния (Г.Н.Крыжа-новский и др., 1985, 1988).

Выявленное нами увеличение включения меченых аминокислот в состав белков в стриатуме при электрическом корковом киндлинге согласуется с данными СИаф1ег ег а1. (1999) о кортико-стриальной долговременной потенциации в результате низкочастотной стимуляции коры. Механизм этих пластических перестроек может быть обусловлен глутаматергическими кортикостриальными синапсами (Са1аЬгез1 й а1., 1996; СЬагр1ег, Эешаи 1.М., 1997; С11агр1ег ег а1., 1997).

Постнигральный этап активации образований антиэпилептической системы, реализующийся посредством возбуждения глубоких слоев ВБЧ (Окаёа е! а1., 1989), в последующем может, по-видимому, приводить к возбуждению каудального ретикулярного ядра моста, нижних олив и других структур ствола, что также сопровождается возбуждением структур мозжечка. Подобная дивергенция следования сигналов и множественность вовлеченных противоэпилептических образований лежит в основе надежности данной системы. На данном этапе возбуждения антиэпилептической системы возникают тормозные противоэпилептические влияния, реализующиеся в образованиях переднего и спинного мозга и обеспечивающие максимум активности образований антиэпилептической системы.

Описанная последовательность функциональных изменений, возникающая в результате активирования стриатума, подтверждается данными Мапейо, Ыскку (1988), Регс1ауа11е е1 а1. (1985, 1987), которые также показали, что электростимуляция хвостатого ядра вызывает изменения активности клеток Пуркинье коры червя мозжечка. При этом авторы отмечают, что возможным направлением следования афферентного сигнала, возникающего в результате электростимуляции стриатума, является вовлечение стриарно-нигрально-парабрахиальных и энтопе-дункулярных синаптических переключений, что затем приводит к возбуждению ретикулярной формации продолговатого мозга, имеющей тесные связи с церебел-лярной паравермальной зоной.

Изучение эффектов экстрактов мозга животных с различными видами кинд-линга — фармакологического, вызываемого с помощью введения различных кон-вульсантов (пикротоксин, коразол) у крыс, а также электростимуляционного, приводит к накоплению в структурах мозга веществ, оказывающих эпилептоген-ное действие при их введении животным-реципиентам. Данный противоэпилеп-тический эффект экстрактов блокировался применением налоксона в небольшой дозе и обработкой проназой, что свидетельствует о возможной пептидной природе эпилептогенных факторов, действие которых опосредовано ц.-опиатными рецепторами.

Проэпилептический эффект эндогенных эпилептогенных соединений характеризовался видонеспецифичностью, а также универсальностью в отношении нейрохимических механизмов эпилептогенеза у животных-реципиентов и проявлялся как в условиях создания стрихнином очагов возбуждения в коре головного мозга, так и провокации генерализованной ЭпА у крыс и кошек введением коразола и пикротоксина. Эффекты пептидных экстрактов наблюдали при их внутримозговом и внутрибрюшинном введении. Это вполне согласуется с многочисленными данными об изменении нейропептидами электрической активности мозга человека и крысы при системном введении (Begley, Zlokovic, 1986; Miller et al., 1981; Banks, Kastin, 1987; Banks et al., 1986). За один пассаж крови мозг поглощает от долей процента до 2,5% введенных нейропептидов (А.Т.Марьянович, Е.Л.Поляков, 1991). При этом внутрижелудочковая инъекция относительно высокой дозы экстракта крысам самостоятельно вызывала судорожный синдром.

Изучение эффектов внутрижелудочкового применения экстрактов мозга кин-длинговых крыс показало, что ЭпА вначале возникала в образованиях гиппокам-па, где локализуется детерминантная структура эпилептической системы при киндлинге, вызываемом коразолом, а затем происходило распространение ЭпА на другие отделы мозга и возникала генерализация судорожной активности.

Нами было изучено влияние экстрактов гиппокампа — зоны формирования гиперактивной детерминантной структуры при фармакологическом киндлинге и вентральных отделов мезэнцефалона (ВОМ), имеющих важное значение в развитии двигательных судорожных расстройств при киндлинге, на генерализованную судорожную активность, провоцируемую коразолом у интактных крыс-реципиентов. Экстракты гиппокампа крыс, подвергнутых киндлингу, при внутрижелудочко-вом и внутримозговом (в гиппокамп и амигдалу) введении не оказывали влияния на выраженность генерализованных судорог, вызванных введением коразола, тогда как экстракты "остального мозга" вызывали достоверное увеличение тяжести судорожных проявлений. Введение коразола после внутрижелудочковой инъекции экстракта ВОМ (20 мкг) животных, подвергнутых киндлингу, сопровождалось развитием судорог, латентный период которых был достоверно меньшим, а средняя тяжесть — большей по сравнению с таковыми у животных-реципиентов, которым вводили экстракт ВОМ контрольной группы. Экстракты "остального мозга" в этих условиях не оказывали влияния на тяжесть судорог. В то же время введение экстракта ВОМ в дозе 0,2 мкг сопровождалось достоверным снижением тяжести судо-рогпо сравнению с таковой у животных контрольной группы, которым вводили экстракт BOM из мозга крыс контрольной группы. Эти данные позволяют предположить, что на начальных стациях формирования эпилептической активности активация пептидергических систем мозга может быть защитно-компенсаторным механизмом, препятствующим формированию патологической системы и развитию эпилептического синдрома. Однако на более поздних стадиях формирования эпилептической активности активация пептидергических систем мозга может защитно-компенсаторным механизмом, препятствующим формированию эпилептической системы и развитию эпилептического синдрома. Однако на более поздних стадиях продолжительная деятельность патологической детерминанты, вызывающая нарушение механизмов тормозного контроля и формирующая многочисленные порочные круги, обеспечивает усиленную продукцию эндогенных факторов, накопление их в больших количествах, что обеспечивает развитие патологической системы. Подобные доза-зависимые фармакологические эффекты характерны для веществ пептидной природы.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о накоплении в В ОМ мозга животных, подвергнутых коразоловому киндлингу, веществ, являющихся индукторами и активаторами деятельности эпилептической системы, лежащей в основе хронического эпилептического синдрома при киндлинге (Крыжановский Г.Н., 1997). Было показано, что патологическая детерминанта эпилептического синдрома при киндлинге формируется в структурах гиппокаммпа (Крыжановский Т.Н. и др., 1985). Поскольку накопление проэпилептических факторов происходит не в зоне детерминантной структуры, можно полагать, что развитие эпилептической системы при коразоловом киндлинге осуществляется путем вовлечения структур ствола мозга, в частности, по-видимому, черной субстанции, играющей важную роль в распространении эпилептической активности.

В условиях формирования устойчивых метаболических и функциональных нарушений при хронической ЭпА, в том числе и при киндлинге, одним из факторов развития эпилептогенеза может являться активное подавление структур антиэпилептической системы (Г.Н.Крыжановский 1980, 1986, 1990, 1997; Г.Н.Крыжа-иовский и др., 1992). Однако активация с помощью электростимуляции компонентов антиэпилептической системы в условиях формирования мощной ЭпА нередко способствует облегчению эпилептогенеза в зоне первичной детерминанты (Г.Н.Крыжановский, 1980, 1986, 1997; А.А.Шандра, Л.С.Годлевский, 1989,1990). В особенности этот эффект характерен для очагов — детерминантных структур с глубокими нарушениями тормозных механизмов.

Определение содержания опиоидных пептидов (лей- и мет-энкефалинов) в коре головного мозга крыс, подвергнутых электрическому киндлингу показало, что концентрация мет-энкефалина не меняется, а лей-энкефалина — снижается. Такой характер изменений обусловлен рядом обстоятельств: указанные пептиды локализованы в разных клетках, синтезируются из различных предшественников, их активность связана с различными фазами развития эпилептогенеза. Разнонаправленные сдвиги в содержании динорфина и мет-энкефалина, и, соответственно, мРНК продинорфина и препроэнкефалина были обнаружены на различных моделях экспериментальной эпилепсии (Harrison et al., 1995). Снижение уровня лей-энкефалина в наших опытах было вызвано, по-видимому, его высвобождением из клеток. В пользу этого предположения говорят данные о влиянии экзогенного лей-энкефалина на формирование судорожных разрядов в сенсомоторной коре крыс. Было показано подавление нарастания амплитуды и длительности CP, снижение порогов под действием нанесенного на кору лей-энкефалина (Г.Н.Крыжановский и др., 1992), что свидетельствует об антиэпилептических свойствах лей-энкефалина для данной модели. В связи с тем, что в опытах не было выявлено снижения пороговой интенсивности стимула для прямого и трансколлазального ответов, можно предположить, что лей-энкефалин предотвращает потенциацию возбуждающих синаптических связей. Поскольку генератор патологически усиленного возбуждения не возникает без усиления возбуждающих межнейрональных взаимодействий, то не происходит и вовлечения новых элементов популяции в эпилептиформную активность, а также синхронизации пароксизмальных разрядов. Последнее приводит к тому, что амплитуда судорожных разрядов в ходе стимуляции не нарастает под действием аппликации лей-энкефалина, подтверждая его противосудорожный эффект в этих условиях.

В то время как опиоидные пептиды оказывают преимущественно тормозное воздействие на эпилептогенез, известно, что соматостатин играет противоположную роль. В гиппокампе в течение и после завершения фармакологического и электрического киндлинга были обнаружены существенные изменения в содержании и экспрессии соответствующих мРНК соматостатина и нейропептида У (Веп<1оШе1а1., 1993; 8Ыпос1а & а1., 1991; \Уап8с11егега1., 1990; БтопаЮ ег а1., 1998). Высвобождение нейропептида У и соматостатина из срезов гиппокампа также усиливалось во время и после киндлинга е1 а1., 1993; Уеггаш ег а1., 1992). В наших опытах выявлено достоверное уменьшение содержания соматостатина в зоне синаптической стимуляции на модели коркового электрического киндлинга. Следует отметить, что эти изменения были выражены сильнее у животных с длительными судорожными разрядами, чем с короткими. Исходя из предположения о снижении содержания соматостатина из-за усиленного выброса, было предпринято исследование развития судорожных разрядов в условиях блокады высвобождающегося соматостатина с помощью антисыворотки к нему. Показано, что инактивация высвобождающегося в межклеточное пространство соматостатина угнетает способность электростимуляции вызывать судорожные разряды и укорачивает длительность послеразрядов в тех немногих случаях, когда они возникают. Усиленный выброс соматостатина из синаптосом коры обоих полушарий был показан и на модели амигдалярного киндлинга (81шопа1о е1 а1., 1998). Указанный эффект наблюдали через 30 дней после окончания судорог.

Данные об участии синтеза белка в развитии следового разряда при корковом электрическом киндлинге, полученные в наших экспериментах, согласуются с многочисленными сведениями о появлении и усиленной наработке белков при эпилептогенезе. На модели фокального коркового эпилептогенеза было показано, что блокатор белкового синтеза циклогексимид предотвращает появление длительных следовых разрядов в коре головного мозга (Г.Н.Крыжановский и др., 1995). При исследовании синтеза белка у мышей, предрасположенных к развитию судорожных припадков при подбрасывании, было обнаружено его возрастание в пред-и послесудорожный период, в фазе тонических судорог наблюдалось уменьшение синтеза (РигШшка е! а1., 1989). Падало содержание белков с молекулярной массой 67 и 120 кДа. В наших опытах обнаружено резкое падение включения меченых аминокислот в состав белков коры головного мозга на стороне синаптической стимуляции. Белок р20 реже обнаруживали в коре и стриатуме слева и справа, белки р4 и р21 реже выявляли в зоне электрической стимуляции, р41 — в стриатуме с той и другой стороны, белки рЗ и р21 в стриатуме на стороне синаптической стимуляции, а белки р15, р39, р40, р44 — в стриатуме на стороне электрической стимуляции. В то же время ряд белков чаще выявляли в коре, особенно в зоне электрической стимуляции — р36, в левом стриатуме — р44, белок р5 — в коре левого полушария и в стриатуме правого. Особенно показательны белки р40, р44, р43, р15, рЗ, р4. В ряде работ указывается на увеличение концентрации некоторых белков во время ЬТР. В перфузате гиппокампа выявлено увеличение концентрации белков с молекулярными массами 64, 54, 48 и 16 кДа, а также появление нового белка с молекулярной массой 19 кДа после тетанической потенциации (Ашк8йе.щ е! а1., 1988). На модели кобальтовой эпилепсии было показано появление специфического белка с молекулярной массой 70-71 КДа в коре головного мозга (Опогика ег а1., 1990). Введение его в двигательную кору вызывало характерные электрографические изменения и судороги, предупреждаемые антиконвульсантами. Авторы связывают эффект этого белка с его действием на калиевую проводимость.

В наших опытах нанесение фракции белков, соответствующих выходу маркера с молекулярной массой 60 кДа, не оказало существенного влияния на развитие следового разряда. Это не означает, что содержащиеся в экстракте другие белки не обладают про- или антиэпилептическим действием. Кроме того, к моменту забора материала синтез белков мог быть недостаточно изменен для того, чтобы можно было выявить биологическую активность. Сама процедура тестирования позволяет определять активность медиаторов и модуляторов. В случае, если исследуемый белок представляет собой рецептор либо фермент, таким способом выявить биологическую активность невозможно.

Кроме упомянутых классов белков, в процесс эпилептогенеза вовлечены ней-ротрофины. Так, концентрация мозгового нейротрофического фактора (BDNF) при киндлинге возрастает в стриатуме и пириформной коре (Elmer et al., 1998). Введение этого вещества, в свою очередь, вызывает повышение содержания ней-ропептида Y, мет-энкефалина, соматостатина и холецистокинина в коре и гиппо-кампе крыс и снижение уровня динорфина в гиппокампе (Croll, 1994). Выше обсуждались наши данные по изменению содержания некоторых из этих пептидов в коре головного мозга крыс при электрическом киндлинге и их роль в эпилепто-генезе. Таким образом, можно предположить, что изменения концентрации мозгового нейротрофического фактора и родственных ему белков регулируют уровень нейропептидов в условиях нормальной работы мозга и при судорожных состояниях (Vezzanietal., 1999).

В спинном мозге крыс с болевым синдромом спинального происхождения выявлены факторы пептидной природы, способные в отсутствии первичного патогена (столбнячный токсин, пенициллин) вызывать весьма длительные изменения поведения у здоровых животных, сходные с симптомами доноров. Несмотря на то, что в большинстве опытов активные факторы экстрактов не вызывали гипе-ралгезию у реципиентов, их поведение напоминало реакции крыс, перенесших сильнейшую боль (резкое усиление отрицательных аффективных реакций, гиперрефлексия). Устранение действия пептидных факторов из мозга крыс с болевым синдромом налоксоном, и, следовательно, вероятная их принадлежность к семейству опиоидных пептидов побудила нас исследовать изменения содержания известных опиоидов — лей- и мет-энкефалинов — в ткани спинного мозга крыс при возникновении патологической ал-гической системы. Кроме того, наблюдавшиеся при введении симптомы (каталепсия и аналгезия) характерны для опиатов. Измерение содержания этих пептидов методом радиоиммунологического связывания показало, что содержание мет-энкефа-лина в люмбальных отделах спинного мозга крыс с болевым синдромом возрастало. Особенно резкое увеличение концентрации мет-энкефалина отмечали на стороне локализации генератора патологически усиленного возбуждения. Напротив, содержание лей-энкефалина падало в обеих половинах спинного мозга, однако достоверные изменения были выявлены лишь на стороне генератора.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка выяснить, насколько существенны выявленные сдвиги для механизмов возникновения, развития и ликвидации болевого синдрома. Для этого наблюдали за развитием болевого синдрома в условиях искусственного изменения концентраций лей- и мет-энкефалинов в спинном мозге. Связывание высвобождаемых пептидов специфическими антисыворотками приводило к противоположным результатам. Применение антисыворотки к мет-энкефалину удлиняло время существования болевого синдрома на высоте его развития, тогда как связывание лей-энкефалина приводило к сокращению этого периода почти вдвое. Известно, что свойством устранять антиноци-цептивное действие Р-эндорфина обладает антисыворотка к Мет-энкефалину (Suh, Tseng, 1990; Tseng, Suh, 1989). Восстановление баланса между пептидами путем одновременного применения экзогенного лей-энкефалина и связывания мет-энкефалина с помощью антисыворотки привело к резкому сокращению времени существования болевого синдрома.

При введении этих факторов животным с болевым синдромом спинального происхождения и адъювантным артритом наблюдали выраженное анальгетическое действие. Экстракты спинного мозга крыс с болевым синдромом при введении в желудочки мозга крысам-реципиентам с БС спинального происхождения вызывали анальгетический эффект: урежались приступы боли, значительно уменьшалась их интенсивность, животные становились спокойными. Анальгетическая активность экстрактов люмбального отдела обеих половин спинного мозга была тем более выраженной, чем сильнее и продолжительнее был БС у животных-доноров. Экстракты грудного отдела спинного мозга (области, удаленной от генератора в люмбальных сегментах) оказывали более слабое анальгетическое действие, однако и в этом случае по мере увеличения продолжительности БС животных-доноров анальгетическая активность экстрактов грудного отдела спинного мозга увеличивалась. Экстракты ткани спинного мозга на стороне аппликации конвульсанта (образования генератора) и противоположной стороны люмбальных сегментов спинного мозга крыс с БС продолжительностью 5-6 ч имели приблизительно одинаковую анальгетическую активность. С увеличением продолжительности БС у крыс-доноров анальгетическая активность экстрактов спинного мозга на стороне генератора не изменялась, в то время как анальгетическая активность контралате-ральный половины значительно уменьшалась вплоть до полного исчезновения.

В опытах с использованием спинного мозга животных с адъювантным артритом экстракт люмбального отдела спинного мозга со стороны инъекции адъюванта оказывал анальгетическое действие при его введении животным с БС спинально-го происхождения, значительно урежались самопроизвольные приступы, при провокации зоны проекции боли приступ был коротким (2-3 с), сопровождался единичным вскриком и короткой перебежкой. Экстракт контралатеральном стороны не обладал анальгетической активностью.

Таким образом, в области генератора и результате гиперактивации нейронов в ноцицептивной системе спинного мозга накапливаются вещества, которые реализуют функциональные эффекты этой системы. Введение их животным-реципиентам вызывало анальгетическое действие. О пептидной природе этих веществ свидетельствовали опыты с использованием проназы. В первые часы развития БС происходит накопление активных факторов прежде всего в области генератора, о чем свидетельствует отсутствие анальгетической активности экстрактов контралатеральной стороны спинного мозга и слабая активность экстрактов удаленных от генератора областей спинного мозга. Однако говорить о полном отсутствии активности экстрактов контралатеральной стороны нельзя, т.к. анальгетическое действие экстрактов целого спинного мозга выше, нежели «генераторной» его половины, что свидетельствует о суммарном эффекте биологически активных веществ обеих половин спинного мозга. Тот же эффект мы наблюдали и на поздних стадиях развития БС. По мере усиления и удлинения БС (через 5 ч) можно наблюдать выраженную анальгетическую активность не только при аппликации экстрактов «генераторной» половины спинного мозга, но и экстрактов контралатеральной половины и грудных (удаленных от генератора) сегментов спинного мозга. Создание генератора в ноцицептивной системе люмбальных сегментов спинного мозга приводит к тому, что данный отдел становится гиперактивным и приобретает значение патологической детерминанты (Г.Н.Крыжановский, 1997). Те отделы центральной нервной системы, которые достаточно долго испытывают влияние детерминанты, могут сами становиться детерминантами. Это мы наблюдали на поздних стадиях БС, когда экстракты грудных отделов спинного мозга оказывали выраженное анальгетическое воздействие на животных-реципиентов, незначительно уступая действию экстрактов люмбального отдела спинного мозга. Если сравнить рассмотренные БС, то можно высказать предположение, что на эффекты и характер действия веществ, выделенных из ЦНС животных с БС, оказывает существенное влияние процесс формирования генератора: быстро нарастающий, взрывной характер развития генератора при БС спинального происхождения, сопровождающийся тяжелым стрессовым состоянием, или длительный, постепенный, не достигающий значительной степени при БС, вызванном адъювантным артритом. В последнем случае, вероятно, имеет значение ослабление адаптационных механизмов защиты живого организма от вредного воздействия боли.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при БС в спинном мозге вырабатываются и накапливаются вещества пептидной природы, обладающие анальгетическими свойствами при введении их животным с болевым синдромом и вызывают отдельные проявления симптомов болевого синдрома у здоровых животных. Возможно, при развитии синдрома нарабатываются эффекторы как патологической алгической системы, так и антиноцицептивной системы. Недавно был выделен эндогенный лиганд опиоидных рецепторов ORL, — ноцицептин, известный также как орфанин FQ (Menler et al., 1995; Reinscheid et al., 1995). Этот 17-членный пептид, в отличии от опиоидов, при внутрижелудочковом введении вызывает гипералгезию, тогда как введение на уровне спинного мозга приводит к аналгезии (Tian et al., 1997; Xu et al., 1996). Было высказано предположение, что гипералгезия, вызываемая внутрижелудочковым введением ноцицептина, обусловлена блокадой опиоидного механизма стрессорной аналгезии. Таким образом, ноцицептин выступает в качестве функционального антагониста опиатов (Mogil et al., 1996; Zhu et al., 1997). Такие свойства ноцицептин проявляет на супраспинальном, но не на спинальном уровне (Grisel et al., 1996). Пептид экспрессируется в дорсальных рогах спинного мозга при периферическом воспалении, становясь причиной повышенной ноцицептивной реактивности, влияет на двигательную активность животных и отрицательно влияет на обучение. Механизм действия ноцицептина связывают с подавлением высвобождения дофамина и потенциал-зависимой Са2+-проводимости, что приводит к снижению нейрональной проводимости (Darland et al., 1998; Henderson, McKnight, 1997).

Из того же предшественника — препроноцицептина — образуется нейропеп-тид ноцистатин с противоположными ноцицептину свойствами (Okuda-Ashitaka et al., 1998). Высокие уровни этого предшественника и соответствующей мРНК были обнаружены в структурах мозга, осуществляющих нисходящие антиноцицептив-ные влияния — гигантоклеточном ядре, перакведуктальном сером веществе и др. (Boometal., 1999).

Кроме того, различия в действии активных факторов при введении их здоровым животным и крысам с болевым синдромом могут быть объяснены следующим образом: при формировании патологической системы (в данном случае алгической) биохимические механизмы изменяются настолько сильно, что происходит обращение эффекта вводимых веществ по сравнению с физиологической системой.

В опытах с фронтальной лобэкгомией было установлено, что изменения поведения и содержания нейромедиаторов, вызываемые операцией, могут быть скор-ригированы введением ВИП. Сама операция достоверно снижала содержание этого пептида в коре. Ежедневная внутрижелодочковая инъекция ВИП в дозе 80 пкг/животное в течение 9 дней оказывала нормализующее влияние на исследовательское поведение крыс в условиях «открытого поля», нарушенное частичным удалением фронтальной коры. Введение антисыворотки к ВИП приводило к нормализации лишь локомоторной активности у лобэктомированных животных. Полученные нами результаты согласуются с данными о влиянии ВИП на поведение и обучение животных. Было показано, что у трансгенных мышей с дефицитом ВИП в мозге обнаруживаются сниженные способности к обучению (Gozes, 1993). Введение ВИП корригирует вызываемую скополамином амнезию (Yamaguchi, Kobayashi, 1994), а внутрижелудочковое введение антисыворотки к ВИП и его антагониста приводит к изменениям в сексуальном поведении (Askew, 1997).

Изменения поведения животных в условиях "открытого поля" сопоставляли с исследованием уровня нейромедиаторов: серотонина, норадреналина и дофамина в структурах мозга тех же крыс на 9-й день после лобэкгомии. Достоверные отличия были выявлены в гипоталамусе, где уровень серотонина снижался при лобэктомии, тогда как содержание норадреналина и дофамина, наоборот, достоверно возрастало. Введение ВИП, мало изменяя содержание серотонина и норадреналина, способствовало еще большему подъему содержания дофамина. Положительный нормализующий эффект, особенно выраженный для серотонина и дофамина, оказало введение антисыворотки к ВИП, на фоне действия которой уровень указанных нейромедиаторов в гипоталамусе приблизился к ложноопери-рованному контролю. В мезэнцефалоне фронтальная лобэктомия привела к снижению содержания серотонина и повышению уровня норадреналина и дофамина. Введение ВИП существенно не изменило этот эффект для серотонина и норадреналина, но достоверно снизило содержание дофамина. Введение антисыворотки к ВИП нормализовало уровень норадреналина и дофамина в этой структуре, не изменив содержания серотонина. В литературе приведены данные о действии ВИП на ферментативную активность. Показано, что ВИП регулирует активность тиро-зингидроксилазы, фермента, катализирующего первую стадию биосинтеза катехо-ламинов в адренергических нейронах (Ip et al., 1984; Zigmond, 1985). Этот пептид в концентрации 10"7М увеличивал активность холинацетилтрансферазы, не оказывая влияния на аденилатциклазную систему гипоталамуса (Luine, Rostene, 1984).

Полученные данные позволяют заключить, что в условиях патологии ЦНС регуляторное действие ВИП более выражено, чем в норме. Нормализующие эффекты этого пептида на баланс медиаторов проявляются в основном в подкорковых структурах. Однонаправленное действие ВИП и антисыворотки к нему на содержание некоторых нейромедиаторов и локомоторную активность может быть связано с отсутствием строгой дозовой зависимости для эффектов ряда пептидов. Поскольку любое повреждение мозга индуцирует пластические перестройки и реорганизацию соответствующих отделов нервной системы, особая роль в восстановлении функций после травмы принадлежит эндогенным нейротрофическим факторам (Г.Н.Крыжановский, В.КЛуценко, 1995; Г.Н.Крыжановский, 1997). Они поддерживают жизнеспособность нейронов, вызывают разрастание нейритов, облегчают прорастание отростков к их мишеням. Сходным с нейротрофинами образом действуют некоторые нейромедиаторы и нейропептиды (Longo, 1993; Marty et al., 1996; Pincus etal., 1990; Schwartz, 1992). В частности, ВИП оказывает разнообразные эффекты на культуру фибробластов, стимулируя митоз, выживание и аксо-нальный рост (Pincus et al., 1990). Было показано, что ВИП препятствует клеточной смерти, вызванной тетродотоксином (Kaiser, Lipton, 1990). Действие ВИП опосредовано высвобождением факторов пептидно-белковой природы из глиальных клеток. Было показано, что под действием 0,1 нМ ВИП из астроцитов коры головного мозга высвобождаются значительные количества интерлейкина-1а, ингибитора протеаз с^-антихимотрипсина и нейротрофического фактора ADNF с молекулярной массой 14 кДа. Анализ аминокислотной последовательности этого белка выявил гомологию с участком белка теплового шока с молекулярной массой 60 кДа (Вгеппетап е1 а1., 1997). Очищенный ADNF способствует выживанию корковых нейронов в культуре при действии тетродотоксина (Вгеппетап, Оогев, 1996). Следует отметить, что хотя все три упомянутых вещества играют важную роль в процессе выживания нервных клеток, наиболее существенным представляется вклад ADNF, поскольку это фактор проявляет активность в субфемтомолярном диапазоне концентраций. Подобная высокая активность может послужить основой для создания высокоэффективных фармакологических препаратов.

Из изложенного видно, что в регуляторном влиянии нейропептидов на нервную систему важную роль играет нейромодуляция, т.е. такой способ регуляции, когда вещество не запускает какую-либо функцию нейрона, а изменяет его функциональную активность. Модулирующие эффекты нейропептидов на нейромеди-аторные процессы могут быть опосредованы за счет их действия на внутрисинаптическом, дистантном и внесинаптическом уровнях, что обусловливает тесную взаимосвязь между нейромедиаторными системами. Описано несколько механизмов нейромодуляции. К ним относятся регуляция нейропептидами ферментов синаптической передачи путем прямого взаимодействия пептида с молекулой фермента, изменение аффинитета рецепторов посредством взаимодействия пептидов с их активными центрами, что приводит к изменению активности систем вторичных посредников. Кроме того, пептиды могут взаимодействовать непосредственно с ионными каналами, влиять на вязкость мембран и образовывать нековалентные комплексы с классическими нейромедиаторами, что ведет к изменению реакции постсинаптической клетки (С.АМураневич, 1993). Особенно ярко регуляторные свойства пептидов проявляются в условиях патологии. Однако нейропептиды могут служить не только эффекторами патологических систем и антисистем, но и маркерами их активности. Последнее обстоятельство может служить основанием для разработки методов выявления патологических сдвигов в деятельности нервной системы на ранних стадиях.

Поиск способа детекции пептидно-белковых периферических маркеров активности нервной системы в биологических жидкостях связан с рядом трудностей. Это обусловлено высокой протеолитической активностью ферментов крови и небольшими сроками полураспада большинства нейропептидов — от минут до часов. Однако в так называемых «открытых» синапсах происходит высвобождение из тер-минали в кровь, СМЖ и другие жидкости организма ряда пептидов — окситоци-на, вазопрессина, АКТГ, эндорфинов, меланоцит-стимулирующего гормона и некоторых других. Либерины и статины гипоталамуса также переносятся кровью к гипофизу и там реализуют свои функции. Описаны белки, нековалентно связывающие нейропептиды и стабилизирующие их в процессе транспорта кровью. Это нейрофизины, переносящие вазопрессин и окситоцин, альбумины и глобулины, стабилизирующие холецистокинин и гастрин (П.К.Климов, 1986; М.В.Полосатов, 1977). Кроме того, продуктом протеолитического расщепления нейропептида часто является новое биоактивное соединение (И.П.Ашмарин, М.А.Каменская, 1988). Выход пептидно-белковых соединений из нервных клеток в кровь в ряде случаев сопровождается образованием специфических антител. В опытах на крысах с кобальтовой эпилепсией удалось выявить в сыворотке аутоантитела к субъединице глутаматного рецептора, причем уровень антител коррелировал с высотой развития экспериментального синдрома (Dambinova et al., 1998). Аутоантитела к пептиду рецептора серотонина были обнаружены в сыворотке детей с дефектами развития (Verdot et al., 1998). Содержание специфических белков (DARP) в ЦСЖ и крови неврологических больных коррелировало с характером и тяжестью заболевания (Verdugo-Diaz et al., 1997). Таким образом, определение соотношения между компонентами, в частности, пептидно-белковыми, биологических жидкостей, может оказаться полезным для раннего выявления групп риска по заболеваниям нервной системы. Использованный нами метод лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС), позволяющий определять размеры субклеточных частиц и соотношения между ними, оказался весьма эффективным для достижения этой цели.

У детей с астено-невротическим синдромом выявляются умеренные сдвиги, проявляющиеся в возрастании доли низкомолекулярных компонентов за счет резкого снижения количества ингредиентов с молекулярными размерами от 50 до 400 нм (с 71,79% до 49,71%). У школьников с органическими поражениями ЦНС эта закономерность выражена еще ярче: частицы с размерами 50-400 нм вносят лишь 39,46% в светорассеяние, и существенно возрастает вклад сверхнизкомолекуляр-ных компонентов (до 18,14%). Кроме того, резко увеличивалась доля сверхвысокомолекулярных компонетов (в районе 10000 нм) — до 17,65 % по сравнению 4,75% у здоровых детей. Можно предположить, что эти сдвиги связаны с усиленной наработкой низкомолекулярных пептидов и высокомолекулярных антител и иммунных комплексов.

Предварительные исследования выявили ряд закономерностей, которые имеют значение для формирования групп обследуемых контингентов и оценки полученных результатов. Так, половая принадлежность и группа крови не оказывала существенного влияния на характер распределения частиц. В то же время была обнаружена возрастная динамика в составе субклеточных компонентов. Выявленные различия субфракционного состава сыворотки доноров из разных географических регионов, отличающихся климатическими и экологическими условиями, имели выраженный характер. Данное обстоятельство необходимо учитывать при формировании информационных групп. Кроме того, полученный результат может свидетельствовать о невозможности использования унифицированного банка данных по информационной группе. В референтных группах эти особенности предстоит еще выяснить, поскольку грубые сдвиги гомеостаза, обусловленные патологическим процессом, могут нивелировать незначительные популяционные отклонения, связанные с климатическими и экологическими факторами.

Сегодня в клинической практике используются многочисленные методы изучения системы гомеостаза: биохимические, иммуноферментные, электрофорети-ческие, гистохимические и др. Главный недостаток подобных комплексных исследований в том, что они трудоемки, длительны и зачастую не унифицированы. Степень информативности многих из них напрямую зависит от числа измеряемых параметров, способных охарактеризовать скоррелированность сдвигов в изучаемой интегральной системе. К подобным системам в первую очередь относится гуморальный гомеостаз, включающий в себя многочисленные ингредиенты, обеспечивающие метаболизм, систему гемостаза, неспецифическую резистентность и иммунный статус.

Многие диагностические подходы формируют соответствующие группы риска на основе идентификации конкретного этиологического фактора. Вместе с тем, только на основе идентификации возможной причины заболевания достаточно редко можно предсказать форму и характер патологического процесса, степень его выраженности и прогноз исхода. Вот почему кажется совершенно очевидным, что особой перспективностью для медико-биологических обследований обладают те симптомокомплексные исследования, которые нивелируют перечисленные недостатки. Поэтому на сегодняшний день стоит задача разработки и внедрения в клиническую практику новых методов исследования, с помощью которых можно получить интегральный показатель, одновременно характеризующий работу нескольких систем организма на определенный момент времени. В этом плане метод лазерной корреляционной спектроскопии полностью удовлетворяет потребности исследователя, так как он обеспечивает одномоментную многопараметровую детекцию системы гомеостаза в автоматическом режиме, соответствующем требованиям экспресс-диагностики.

Отличительной особенностью метода ЛКС является полная автоматизация процедур измерения и обработки результатов, простота получения биологическо

190 го материала и высокая пропускная способность установки (до 10-12 определений в час). Сам прибор малогабаритный, может эксплуатироваться в любом помещении, а результаты исследований получаются в виде, удобном для архивирования и накопления в информационных сетях. Успешное применение метода Л КС в сочетании с традиционными методами медицинского обследования на различных кон-тингентах позволяет нам считать его весьма перспективным для выявления групп риска при массовых обследованиях.