Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Патоморфология печени и рекомбинационные механизмы консервации вирулентности ортопоксвирусов

0 и»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

БАЛАХНИН Сергей Маркович

ПАТОМОРФОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ

И РЕКОМБИНАЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОНСЕРВАЦИИ ВИРУЛЕНТНОСТИ ОРТОПОКСВИРУСОВ

14.00.15 — патологическая анатомия 03-00.06 — вирусология

Автореферат х

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК 19 96

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) и в Институте молекулярной биологии Государственного научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" МЗМП РФ (Кольцове)

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор л.м. непомнящих

кандидат медицинских наук е.ф. беланов

в О) часов на заседании Диссе ^

в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8-(383-2)-32-31-56, факс 8-(383-2)-32-43-39)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН

Автореферат диссертации разослан " 'У^ -с/ 1996 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор е.ф. бочаров кандидат медицинских наук г.а.лапий

Ведущая организация:

Кемеровская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.40.01 доктор биологических наук

е.л. лушникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время натуральная оспа ликвидирована как инфекционное заболевание, однако многие аспекты, связанные с особенностями вируса и заболевания, продолжают вызывать интерес исследователей. В последние годы определена полная первичная структура ДНК ряда штаммов вируса натуральной оспы и частично некоторых других представителей ортопоксвирусов, однако это не позволило полностью выяснить закономерности сохранения высокой ви-рулентости натуральной оспы.

Существующие теории эпидемического процесса избегают рассмотрения механизмов поддержания высокой вирулентности вирусов, или не дают этому удовлетворительного объяснения. Так, в известной теории саморегуляции паразитарных систем (Беляков В.Д. и др. 1987) введено понятие "резервацион-ного и эпидемического преобразования" возбудителя. Эти преобразования объясняются либо пассированием вируса через восприимчивый организм, либо считаются результатом длительного персистирования. Однако ряд инфекций, в том числе и натуральная оспа, в данную теорию не укладываются, так как для данной инфекции фаза резервационного преобразования отсутствует. Это ставит целый ряд вопросов, ответы на которые позволили бы по-новому взглянуть на проблемы резерва-ционной фазы и перехода возбудителя в фазу эпидемического преобразования.

Хорошо известно, что поксвирусы способны к эффективной рекомбинации, которая дает возможность перераспределять генетические признаки родительских штаммов л ведет к возникновению потомства с новыми свойствами, причем некоторые из них могут существенно отличаться от родительских, например, такие как вирулентность. Дальнейшее изучение процессов, связанных с рекомбинацией у ортопоксвирусов, поможет глубже понять общепатологическую сущность этого явления.

Несмотря на то, что патоморфология натуральной оспы интенсивно изучалась в течении многих лет, в настоящее время недостаточно сведений о патогенезе ортопоксвирусных ин-

фекций, повреждении и регенерации внутренних органов (Fenner et al., 1989). Печень, как центральный орган метаболизма, играющий важную роль в развитии патологических процессов при вирусных инфекциях, привлекает большое внимание исследователей при изучении ортопоксвирусов. При морфологических исследованиях незначительные изменения наблюдали в печени при натуральной оспе и оспе обезьян, но острая стадия оспы мышей характеризовалась значительным увеличением печени и многочисленными некротическими очагами (Allen et al., 1981; Jacoby, Bhatt, 1987). В гистологических и электронно-микроскопических работах основное внимание уделено образованию ортопоксвирусами телец включений (Ichihashi et al., 1971). Остается невыясненным влияние вирулентности возбудителя на динамику патоморфологических изменений в печени при острой эктромелии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было показать, что появляющиеся в природе низковнрулентные штаммы ортопоксвирусов могут восстановить вирулентность до исходной за счет образования рекомбинантов при одновременном инфицировании животных различными парами таких штаммов. В качестве модельных штаммов со сниженной вирулентностью предполагалось использовать температурочувствительные мутанты вируса эктромелии. Удобство данной модели связано с наличием естественного хозяина, доступного для экспериментального исследования и тем, что эпизоотология и патогенез эктромелии во многом напоминают натуральную оспу у человека.

Поставлены следующие задачи:

1. Получить представительную коллекцию температурочув-ствительных (ts~) мутантов вируса эктромелии, изучить их ростовые свойства и оценить вирулентные свойства in vivo при различных вариантах инфицирования основного хозяина;

2. Используя полученные ts" мутанты как имитаторы штаммов со сниженной вирулентностью, воспроизвести некоторые варианты их циркуляции в естественных условиях;

3. С помощью методов световой и электронной микроскопии изучить патоморфологические особенности поражения печени и ее регенерации в зависимости от вирулентности инфицирующего штамма.

Научная новизна. Впервые получена представительная коллекция температурочувствительных мутантов вируса экгроме-лии. Проведено изучение стабильности их фенотипа по показателям реверсии и "текучести". Рекомбинационный анализ полученных мутантов позволил выявить мутанты, имеющие единичные повреждения генома (одноударные) и расположить их на рекомбинационной генетической карте вируса.

Впервые экспериментально показано, что степень выраженности фенотипа и вирулентность для основного хозяина находятся в обратной корреляционной зависимости (г=-0,801; р < 0,05).

Введение мутации в геном вируса приводит к снижению вирулентности для основного хозяина, однако при одновременном инфицировании животных рекомбинирующими парами мутантов возможно восстановление вирулентности вируса за счет образования рекомбинантов с фенотипом и вирулентностью вируса исходного типа.

Показано, что степень репродукции 1з* мутантов во внутренних органах животных при одиночном заражении близка наблюдаемой у вируса исходного типа. При этом вирулентность 18" мутантов вируса эктромелии для белых мышей была снижена в 200-1000 раз. Таким образом, уровень репродукции вируса эктромелии во внутренних органах животного не всегда отражает вирулентные свойства штамма.

Впервые изучена динамика нарастания патоморфологичес-ких изменений в печени мышей при интраназальном инфицировании в эквивалентных дозах вирусами, имеющими различную вирулентность. Показано, что высокая скорость деструктивных изменений на фоне неадекватных процессов регенерации являлась одной из причин гибели животных на 9-е сутки от начала инфицирования. При одиночном инфицировании мутантами гипертрофия и пролиферация клеток Купфера по срокам появления не отличались от вируса исходного штамма, однако зарегистрирована более активная регенерация с увеличением количества двуядерных гепатоцитов (до 34%), что может служить хорошим прогностическим признаком.

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на механизм сохранения высоковирулентных штаммов в популяции ортопоксвирусов, имеющих уз-

кую экологическую нишу. До настоящего момента "эпидемическое преобразование" возбудителя обычно объяснялось либо пассированием вируса через восприимчивый организм, либо считалось результатом длительного персистирования, что не полностью отражает суть происходящих процессов у ортопок-свирусов. Данные, представленные в настоящей работе, позволяют утверждать, что одним из ведущих механизмов, лежащих в основе фазы эпидемического преобразования, при которой происходит появление высоковирулентных штаммов, является рекомбинация in vivo штаммов со сниженной вирулентностью. При этом фаза эпидемического преобразования у ортопоксви-русов происходит одновременно с фазой резервационного преобразования.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Научной конференции, посвященной 85-летию ТомНИИ вакцин и сывороток "Актуальные вопросы медицинской биотехнологии" (Томск, 1991); Всероссийской конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ" (Волгоград, 1992); Всероссийской конференции "Вопросы ветеринарии, вирусологии, микробиологии и эпизотологии" (Покров, 1992); Межведомственной конференции "Микроскопические аспекты особо опасных инфекций" (Кольцово, 1993); Конференции НИИ региональной патологии и патоморфолопш СО РАМН (Новосибирск, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 105 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы — 1 глава, характеристики материалов и методов исследования — 1 глава, собственных исследований — 4 главы, обсуждения — 1 глава, списка литературы (147 работ), 15 таблиц и 1рафиков, 20 микрофото.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы вирусологического исследования. Для выделения ts" мутантов в работе использовался вирус эктромелии, штамм — К-1, полученный из Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г.Москва).

Вирус поддерживали культивированием на хорионаллантоис-ной оболочке (ХАО) 11-12 дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), или на культуре клеток куриного эмбриона (ФКЭ), приготовленной по методике Porterfield, Allison (I960).

Инфекционную активность вируса определяли титрованием на ХАО РКЭ по образованию локальных поражений (оспин) и выражали в оспинообразующих единицах (ООЕ) или по образованию негативных колоний на монослое культуры клеток ФЭК под агаровым покрытием (бляшек), выражая в бляш-кообразующих единицах (БОЕ).

Для индукции мутаций в популяции вируса использовали N-mnpo-N-нитрозогуанидин (Sigma, Германия) по методике воздействия на реплицирующийся вирус. Для выделения ts" мутантов применялась многоэтапная методика селекции в модификации с применением двойного переноса (Беланов Е.Ф. и др., 1979). В качестве разрешающей температуры (рТ) при изучении ts' мутантов была выбрана 33"С, а в качестве неразрешающей (нрТ) — 37,5°С. Зараженные культуры инкубировали в течении опыта в воздушных термостатах, где температура выдерживалась с точностью ±0,ГС. Выделенные ts" мутанты дополнительно клонировали при 33°С и полученные клоны хранили при -40°С.

Стабильность полученных мутантов оценивали по показателям реверсии и текучести. Частоту реверсий в сторону ts+ фенотипа определяли по способности мутанта образовывать "бляшки" под агаровым покрытием в неразрешающих условиях, для чего урожай одноциклового роста, полученный при пер-миссивной температуре под жидкой средой, исследовали под агаровым покрытием при 33°С и 37,5°С и определяли эффективность бляшкообразования (ЭБО). Текучесть определяли как отношение урожая одноциклового роста мутанта под жидкой средой при 37,5°С к урожаю при 33°С, выраженное в процентах. Урожай определяли при пермиссивной температуре под агаровым покрытием.

При проведении рекомбинационного анализа за основу была взята методика Padgett и Tomkins (1968). Пробирки с монослоем ФКЭ (2х105 клеток на пробирку) заражали мутантами со множественностью 2,5 БОЕ/клетку при смешанном или 5 БОЕ/

клетку для каждого из мутантов при одиночном заражении. Далее исследовали урожай одноциклового роста вируса (36 часов) при разрешающей и неразрешающей температурах под агаровым покрытием с последующим подсчетом частот рекомбинации (ЧР) по формуле (SchafTer ct ah, 1973; Mackenzie et a1., 1975): ЧР = ((AxB)37,s / (AxB)33] x [Xoo/XJ x 2 x 100, где: (AxВ) — урожай смешанного заражения клеток соответствующими мутантами при 33°С, протитрованный при 37,5° и 33°С, соответственно. Хоп — ЧР в данном опыте пары мутантов, взятой в качестве стандартной, а Хст — средняя ЧР данной пары мутантов. Коэффицент 2 использовался для учета мутантов недикого типа, которые остаются не выявленными.

Стандартные отклонения от главного значения были подсчитаны по формуле [(ЧР)2/п — (ЧР)2/п3]1/2, где п — число независимых определений.

При изучении вирулентных свойств вируса эктромелии и его мутантов использовали беспородных белых мышей массой 16-18 г, полученных из питомника ГНЦ ВБ "Вектор". Интра-назальное инфицирование проводили под легким эфирным наркозом. Вируссодержащая суспензия, приготовленная на среде Игла, вводилась в объеме 0,03 мл. Аэрозольное инфицирование проводили в малой динамической камере МДК-20, используя аэрозольный генератор, образующий частицы аэрозоля со среднемассовым размером 2-5 мкм. Учет гибели животных проводили в течение 14 еут после заражения, специфичность гибели подтверждали путем выделения вируса из органов погибшего животного. О вирулентности ts" мутантов судили по соотношению титров инфицирующей дозы вируса при интраназальном инфицировании (lg ООЕ/животное) и lg дозы вируса, дающей 50%-ную гибель животных (LDS0), рассчитанной по методу Спирмена-Ксрбера.

Вируснейтрализуюгцую активность сывороток определяли в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах по методике Boulter (1957).

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Довольно часто уровень репродукции вируса в органах-мишенях связывают со степенью поражения этого органа и его вкладом в причины летального исхода. Это побудило

нас исследовать патоморфологическую картину в органах-мишенях при инфицировании животных различными вариантами вируса.

В качестве объекта исследования была выбрана печень, которая для вируса эктромелии является главной мишенью при различных способах инфицирования и поражения которой являются основной причиной гибели животных. Была проведена оценка динамики патоморфологических изменений в печени мышей при интраназальном инфицировании вирусом исходного штамма, одиночном и "смешанном" заражении рекомби-нирующими ts" мутантами.

Для гистологического исследования образцы печени фиксировали в 10% нейтральном формалине и обрабатывали по стандартной методике для получения парафиновых срезов. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, ставили PAS-реакцию.

Для электронно-микроскопического исследования образцы печени размерами не более 1 мм3 первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегвда (Уикли Б., 1975; Dykstra MJ., 1992), затем постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и после дегидратации заливали в смесь эпона и аралдита для получения полутонких и ультратонких срезов. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II, ставили PAS-реакцию. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB III и после контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе JEM 100С при ускоряющем напряжении 80 кВ.

С помощью морфометрического анализа определяли площадь очагов некроза гепатоцитов (мкм2) и их регенерацию при различных вариантах инфицирования.

Статистическую обработку результатов проводили с определением критерия достоверности t Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Вирусологические исследования температурочувствительных мутантов вируса эктромелии и механизмов консервации вирулентности ортопоксвирусов. Известно, что ts" мутанты вируса оспо-

вакцины, как правило, снижают свою патогенность для основного хозяина по сравнению с исходным штаммом (Черное В.И., 1975). Считается, что это связано с блокированием их репродукции при повышении температуры в организме хозяина. Это свойство легло в основу идеи об использовании ts- мутантов вируса эктромелии в качестве экспериментальной модели для изучения циркуляции в природе вариантов вирусов со сниженной вирулентностью, поэтому первым этапом работы было получение представительной коллекции ts' мутантов вируса эктромелии.

Для индукции ts" мутантов в популяции исходного штамма вируса в качестве мутагена был использован N-mrrpo-N-ни-трозогуанидин (НГ), которым воздействовали на реплицирующийся вирус. НГ, относящийся к классу супермутагенов, считается наиболее разносторонним по своему молекулярному действию мутагеном, так как удалось зарегистрировать любую из теоретически возможных замен (Weigert et al., 1967), а вызванные им мутационные повреждения ДНК, по-видимому, не подвергаются репарации. Для того, чтобы снизить ингибирую-щий эффект мутагена на репродукцию вируса, его вносили в культуральную среду в момент максимально интенсивного синтеза вирусной ДНК между 6 и 8 часами от начала репродукции вируса. Оптимальная концентрация мутагена для выбранной схемы мутагенеза была определена экспериментальным путем по кривой роста вируса в присутствии и отсутствии мутагена и соответствовала 12,5 — 25 мкг/мл культуральной среды, при которой снижение урожая составляло 1,0 — 1,5 lg БОЕ/мл.

Из полученного таким образом мутагенизированного пула вируса эктромелии выделялись ts* мутанты. При их выделении в качестве разрешающей (или пермиссивной) была выбрана температура равная ЗЗ'С, а в качестве неразрешающей (непер-миссивной) — 37,5°С. Использовалась многоэтапная методика селекции (Ensinger, Ginsberg, 1972) в модификации с применением двойного переноса, суть которой заключалась в применении на первых этапах температуры ЗЗ'С. На первом этапе селекции дискретные вирусные повреждения монослоя клеток под агаровым покрытием ("бляшки") обводили тушью, а флаконы переносили на 37,5°С. Всего на первом этапе было обве-

дено 789 бляшек, из которых отобрано 76 клонов (около 1%), которые не увеличили размеры во время инкубации при 37,5°С в течение 48 часов. На втором этапе клоны были исследованы под жидкой средой в виде дубликатов инфицированных культур по способности роста при 33" и 37,5°С. Результат оценивался качественно по цитопатическому действию (ЦПД), в результате чего 23 клона (38,3%) были отобраны для тестирования на заключительном этапе селекции как потенциальные ts- мутанты. На последнем этапе клоны исследовали по способности роста под агаровым покрытием при пермиссивной и непер-миссивной температурах (33°и 37,5вС соответственно). Было отобрано 7 клонов, у которых способность размножаться в неразрешающих условиях была снижена по сравнению с исходным штаммом не менее чем в 1000 раз. Они и были расценены как ts" мутанты. Мутанты 2-х кратно клонировали, нарабатывали, готовили аликвоты, чтобы снизить их дальнейшее пассирование до минимума, и хранили при -40°С.

Частота выделения мутантов из бляшек, не давших увеличения роста на первом этапе выделения, составила 9,2%.

Стабильность полученных ts* мутантов оценивали по показателям реверсии и "текучести".

Анализируя полученные значения, можно сделать заключение, что все выделенные ts' мутанты имеют низкий уровень реверсии (ниже чем Ю-3), вместе с тем уровень текучести у мутантов 16 и 29 оказался относительно высоким (24,62% и 9,0% соответственно), что не позволило оценить их ts" фенотип как стабильный.

Так как для наших исследований пригодны мутанты, имеющие единичные повреждения в геноме и способные к рекомбинации, было проведено их рекомбинационное изучение in vitro, которое показало, что они данной способностью обладают. Рекомбинационное изучение стабильных ts- мутантов вируса эктромелии позволило установить, что мутации расположены в разных участках генома, а также определить условное растояние между ними и расположить их на рекомбинацион-ной генетической карте генома. При подсчете частоты рекомбинаций в формулу был введен коэффицент стандартной частоты рекомбинаций (Mackenzie et al., 1975), который позволил

уменьшить колебания частот рекомбинаций, полученных в различных экспериментах. За стандартную частоту рекомбинации была принята средняя частота рекомбинации пары мутантов 19 и 30, которая составляла 33,2 ± 7,5%.

Рекомбинировали все пары исследуемых мутантов и частота рекомбинаций между разными парами колебалась от 5,2% (мутанты 30 и 31) до 33,2% (мутанты 19 и 30). Стандартные отклонения были достаточно большими, и полной аддитивности частот рекомбинаций получено не было, однако имеющиеся данные позволили расположить мутации на рекомбинацион-ной генетической карте в следующей последовательности: tsl9 — tsl8 — tsl5 — ts31 — ts30. Для дальнейших исследований нами были отобраны мутанты, способные эффективно реком-бинировать друг с другом.

Следующим этапом исследования было изучение вирулентных свойств полученных ts" мутантов для животных. Известно, что такие мутанты, как правило, снижают свою вирулентность по сравнению с исходным штаммом. Предполагают, это является результатом более эффективного блокирования репродукции вируса при повышении температуры тела у хозяина при развитии инфекционного процесса. Однако данные о связи выраженности ts' фенотипа мутантов с их вирулентностью в литературе отсутствуют. Поэтому для нас представляло интерес сопоставить значения вирулентности ts- мутантов, полученные при изучении их летальности для беспородных белых мышей, с выраженностью их ts* фенотипа, который был определен ранее in vitro.

Анализ данных позволяет сделать заключение, что степень снижения вирулентности и степень выраженности ts" фенотипа находятся в обратной корреляционной зависимости (i—-0,801; t=3,227; р<0,05)

Установлено, что полученные ts- мутанты in vitro эффективно рекомбинируют. Результатом этого является появление частиц с ts+ фенотипом исходного вируса. Причем, чем эффективнее рекомбинирует пара мутантов, тем больше частиц вируса исходного фенотипа образуется. Чтобы определить, как изменится вирулентность мутантов для мышей при "смешанном" инфицировании, их заражали интраназально парами ре-

Таблица 1. Реверсия вирулентности мушггов при «смешанном» инфицировании

Мутанты Урожай (БОЕ/мл) ЭБО Уровень (%) Фено-

(вирус) 33°С 37.5°С 37.5733° рекомбинации тип

tsl5 28 * 1G4 <102 <0.004 - ts-

tsl9 1.2 * 10* <102 <0.008 - ts*

ts30 5.9 х 104 <102 <0.002 - ts-

ts(15*30) 1.2 х 10« 1.5 -103 0.125 25.0 ts+

ts(19x3Q) 1.4 х 1СН 1.8 * 103 0.129 25.7 ts+

Исходный 5.1 * 104 5.4 * 104 1.002 - ts+

Примечание: 10% шмогенат печени исследовали на культуре клеток под агаровым покрытием.

комбинирующих мутантов и определяли LDS0 при одиночном и "смешанном" заражении, вычисляя кратность снижения LD^.

Результаты показывают, что для некоторых пар рекомби-нирующих мутантов (ts 19x30 и ts 18x30) смешанное инфицирование приводит к снижению инфицирующей дозы в 20-30 раз по сравнению с одиночным заражением. Для некоторых пар такое снижение практически не наблюдалось. Если сравнить данные результаты с рекомбинационной картой, то можно видеть, что степень повышения вирулентности зависит от расположения мутантов по отношению друг к другу, то есть от их способности к рекомбинированию.

В опытах in vitro было показано, что скрещивание мутантов приводит к появлению штамма с исходным ts+ фенотипом. Для того, чтобы убедится, что снижение летальной дозы при "смешанном" инфицировании в опытах in vivo также связано с появлением вируса исходного типа, было проведено исследование ts+ фенотипа вируса, репродуцирующегося в органах инфицированных животных, с забором проб на 7 сутки после инфицирования (табл. 1). Для выявления фенотипа вируса использовали 10% гомогенат печени от животных при одиноч-

ном или "смешанном" инфицировании.

Таким образом, при "смешанном" заражении в печени мышей происходит появление вируса с ts+ фенотипом вируса исходного типа, причем величина частоты рекомбинаций пар мутантов примерно соответствует частоте рекомбинаций, определенной in vitro.

Довольно неожиданным оказался тот факт, что репродукция ts" мутантов в печени при исследовании на 7 сутки не отличалась количественно от репродукции вируса исходного типа, хотя ранее для вирусов из других семейств отмечалось, что снижение вирулентности ts- мутантов обусловлено именно менее эффективной их репродукцией. Поэтому, чтобы более подробно изучить это явление, было проведено исследование динамики накопления вируса в легких мышей, инфицированных интраназально. Титр вируса в 10% гомогенате легких определяли на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов.

Полученные результаты показали, что репродукция мутантов в легких происходила также эффективно, как и в печени, причем степень их репродукции оказалась близка или даже выше, чем у вируса исходного типа, хотя летальность белых мышей при инфицировании данными мутантами более чем в 1000 раз была ниже летальности, определенной для вируса исходного (дикого) типа.

Влияние вирулентности возбудителя на динамику патоморфо-логических изменений в печени мышей при острой эктромелии. На предыдущем этапе исследования было обнаружено, что варианты исходного вируса, имеющие сниженную вирулентность для основного хозяина, репродуцируются во внутренних органах с такой же скоростью и в таких же количествах, как и вирус исходного штамма. Это не совсем соответствовало предварительно ожидаемому результату, так как предполагалось, что повреждающее действие вируса на органы-мишени, в том числе и на печень, прямо связано с количеством содержащихся в них вирусных частиц.

В связи с этим, была изучена динамика патоморфологичес-ких изменений в печени при интраназальном инфицировании мышей исходным штаммом, отдельными температурочувстви-тельными мутантами и парами рекомбинирующих мутантов.

На 4-е сутки после иитраназального инфицирования вирусом исходного типа в печени выявлялись острые нарушения гемодинамики с очаговым полнокровием синусоидов, диффузные и очаговые дистрофические изменения гепатоцитов со снижением количества гранул гликогена в цитоплазме и очаги некроза паренхимы. Дистрофически измененные и некротизиру-ющиеся гепатоциты располагались преимущественно в центральных и средних зонах дольки. Крупные и мелкие очаги некроза были окружены лимфоцитами и макрофагами. Отмечалось большое число крупных клеток Купфера и расширение пространств Диссе.

На фоне выраженных дистрофических и некротических изменений гепатоцитов отсутствовали митотически делящиеся клетки, наблюдалась гиперхромность ядер отдельных гепатоцитов и появление двуядерных клеток.

При изучении воздействия на печень температурочувстви-тельных мутантов гя- 19, 1з* 30 и 31 в описываемые сроют отмечались минимальные дистрофические изменения, локализующиеся в основном в центральных зонах долек. Очаги некроза гепатоцитов отсутствовали. Обнаружено большое число крупных клеток Купфера. Острые нарушения гемодинамики не выявлены.

При совместном заражении парами рекомбинирующих мутантов (19x30) и (19x31) выявлялись более выраженные изменения в печени в сравнении с описанными при одиночном заражении этими мутантами. Структура печени нарушена в связи с появлением мелких очагов некроза гепатоцитов. Не-кротизирующиеся гепатоциты окружены инфильтратами из лимфоцитов и макрофагов. Значительная часть гепатоцитов имела выраженные дистрофические изменения с минимальным содержанием в цитоплазме гранул гликогена. Однако нередко ядра в таких гепатоцитах сохраняли гиперхромность, ядрышки были гипертрофированы, можно было наблюдать гантелевидные ядерные структуры эндомитотического состояния ядра, что является проявлением компенсаторных реакций в ранние сроки после заражения. Дистрофические, некробиотические и некротические изменения локализовались преимущественно в центральных зонах печеночных долек, тогда как регенераторные про-

цессы выражены в средних и периферических зонах, где поврежденные гепатоциты практически отсутствовали.

На 7-е сутки после интраназального инфицирования исходным штаммом вируса экгромелии печень мышей значительно изменена, ее общая структура нарушена за счет дискомплекса-ции гепатоцитов центральных и средних зон печеночной дольки, где гнездами расположены очаги некроза и дистрофически измененные гепатоциты с накоплением в цитоплазме гепатоцитов мелких липидных капель. Тем не менее в дистрофически измененных клетках выявлялись анизоцитоз, анизокариоз, большие ядра с шперхромными ядрышками. Очаги некроза занимали площадь, по размерам соответствующую площади 5 — 10 крупных гепатоцитов. Клетки Кулфера многочисленны, гипертрофированы. Периферические зоны печеночных долек повреждены в значительно меньшей степени. Здесь изредка встречались мелкие очаги некроза, сохранившиеся гепатоциты имели гиперхромные ядра и крупные ядрышки. Митотически делящиеся клетки не обнаружены. В сохранившихся участках печеночной паренхимы появлялись двуядерные гепатоциты, что свидетельствует о процессе регенерации.

Картина патоморфологических изменений при одиночном инфицировании мутантами 19, 30 и гБ- 31 к 7 суткам становится более выраженной. Появлялись очаги некроза, которые не обнаруживались на 4-е сутки. Острые нарушения гемодинамики были более выраженными. Очаги некроза, вызываемые мутантом 31, были более обширны, чем у остальных, и занимали площадь 5-6 гепатоцитов. Очаги некроза располагались преимущественно в центральных зонах долек и были инфильтрированы лимфоидными клетками. Клетки Купфера менее многочисленны в сравнении с инфицированием вирусом исходного штамма. Митотически делящиеся гепатоциты отсутствовали. Репаративные процессы преобладали в периферических зонах долек, но встречались иногда и в центральных. Признаками этого являются гиперхромность ядер, гиперплазия ядрышек и наличие мелких двуядерных клеток. Количество дву-ядерных клеток варьировало от 15% в центральных зонах дольки до 34% на периферии.

При совместном- заражении парами рскомбинирующих му-

тантов (19x30) и (19x31) к 7 суткам очаги некроза становились более обширными. В центральных, средних зонах дольки и по периферии появлялись мелкие очаги некроза, которые не выявлялись на 4 сутки. Острые нарушения гемодинамики отмечены преимущественно в центре долек. Дистрофически измененные гепатоциты локализовались также в центральных зонах долек. Обращало на себя внимание накопление липидных капель в цитоплазме гепатоцитов. Довольно часто можно было видеть двуядерные гепатоциты на фоне явлений анизоцитоза и анизокариоза. Митотически делящиеся гепатоциты отсутствовали. Количество двуядерных клеток в средних и периферических зонах печеночных долек составляло 22 — 30%.

Мыши, инфицированные исходным штаммом вируса эк-тромелии, на 9 сутки все погибли. Что касается мутантов гв" 19, гв" 30 и 31, то вызванные ими повреждения печени в указанные сроки характеризовались нарушением общей архитектоники за счет дискомплексации гепатоцитов и наличия дистрофически измененных, гнездно расположенных гепатоцитов в основном в центральных зонах печеночных долек. Увеличение площади очагов некроза не отмечалось, что может быть расценено как положительная динамика в течении инфекционного процесса. Нарастала активность клеток Купфера. Во всех зонах печеночной дольки выявлялись двуядерные клетки (до 29%).

При заражении парами рекомбинирующих мутантов гв (19x30) и гя (19x31) картина повреждения печени на 9 сутки существенно не изменилась по сравнению с описанной на 7 сутки. Очаги некроза оставались обширными и хаотично расположенными. Регенераторная активность гепатоцитов сохранялась на прежнем уровне. Количество двуядерных клеток увеличивалось до 35%.

Результаты электронно-микроскопического изучения образцов печени мышей выявили комплекс ультраструктурных изменений в паренхиматозном и соединительнотканном компар-тментах органа. Большинство этих нарушений имели стереотипный характер и по степени выраженности коррелировали с вирулентностью вирусного инфекта.

Значительная часть гепатоцитов характеризовалась изменениями ультраструктуры ядра и цитоплазматических органелл.

Ядра клеток округлой формы с крупными ядрышками грану-лярно-фибрилдярного строения и дисперсно распределенным хроматином. В отдельных ядрах наблюдалось перераспределение хроматина, который формировался в отдельные конгломераты, распределенные по всей нуклеоплазмс. В цитоплазме дифференцируются полиморфные митохондрии с умеренно плотным матриксом и немногочисленными короткими крис-тами, часть митохондрий набухшие, с очагами просветления. Узкие профили цитоплазматической сети местами резко расширены, заполнены хлопьевидным субстратом, наблюдалась дегрануляция мембран. Количество гранул гликогена в цитоплазме существенно варьировало в различных клетках, но в целом было уменьшено.

В большинстве гепатоцитов выявлялись липидные включения в виде небольших округлых капель, местами сливающихся в значительные конгломераты, часть гепатоцитов в состоянии некробиоза характеризовалась резким просветлением цитоп-лазматического матрикса и выраженной деструкцией цитоп-лазматических органелл. В цитоплазме гепатоцитов и макрофагов обнаружены характерные для данной группы вирусов тельца-включения типа А и типа В.

Синусоидальная поверхность гепатоцитов формировала многочисленные микроворсинки, выступающие в пространство Диссе. Перисинусоидальные пространства расширены, содержали небольшое количество субстрата слабой электронной плотности. Стенка синусоидов образована эндотелиальными клетками с низкой микропиноцитозной активностью и значительным числом клеток Купфера. Последние имели крупные ядра, в цитоплазматическом матриксе множество полиморфных электронно-плотных лизосом, пиноцитозных вакуолей, микропиноцитозных везикул.

В целом следует отметить, что нарушения ультраструктуры гепатоцитов в значительной степени определялись повреждением цитоплазматических органелл, участвующих в осуществлении белкового и липидного обмена клетки, и существенно зависели от вирулентности возбудителя.

Таким образом, изучив динамику нарастания патоморфо-логических изменений в печени мышей при интраназальном

Таблица 2. Динамика повреждения и регенерации гепатоцитов при различных вариантах инфицирования мутантами вируса эктромелии

Мутант Дни после Площадь очагов некроза Регенерация

(вирус)* заражения гепатоцитов (мкм2) (%)**

4 - 15

19 7 918.3 ± 87.2 20

9 1164.5 ± 128.4 22

4 - 25

30 7 1171.9 ±134.5 34

9 1034.4 ± 91.4 19

4 - 22

31 7 1662.9±114.6 20

9 1911.5 ± 158.4 29

4 1011.8 ±96.9 15

19*30 7 2867.2 ±141.7 22

9 3404.3 ±177.3 35

4 913.4 ±53.3 13

19х31 7 2587.2 ±88.1 30

9 2822.5 ±119.5 22

Исходный 4 3565.8 ±135.8 7

(ЛУГ) 7 5943.6 ± 206.7 12

9 гибель -

Контроль некрозы отсутствуют 14

Примечание: * — инфицирующая доза соответствовала 50 ЬБзо ^УТ; ** — регенерация оценивалась по среднему % двуядерных клеток в дольках печени.

инфицировании в эквивалентных дозах вирусами, имеющими различную вирулентность, можно сделать следующее заключение (табл. 2):

Вирус исходного штамма к 4 суткам от начала инфицирования вызывал острые нарушения гемодинамики (полнокровие, стаз, плазматическое пропитывание периваскулярных зон),

дистрофию и некрозы гепатоцитов; была отмечена достаточно высокая активность купферовских клеток. Альтеративные изменения гепатоцитов нарастали к 7 суткам. Увеличивались число и размер очагов некроза, они занимали площадь 5-10 гепатоцитов. Многие гепатоциты находились в состоянии дистрофии с выраженной липидной инфильтрацией цитоплазмы. Компенсаторная регенерация печени протекала достаточно вяло, количество двуядерных клеток не превышало 15%. Вероятно, высокая скорость деструктивных изменений на фоне неадекватных процессов регенерации являлась одной из причин гибели животных к 9 суткам от начала инфицирования.

При одиночном инфицировании ^ мутантами (4519, 1в30 и 1вЗ 1) активность клеток Купфера по срокам появления не отличалась от вируса исходного штамма, однако являлась менее выраженной. Образование очагов некроза гепатоцитов было сдвинуто по времени и фиксировалось только на 7 сутки от начала инфицирования. Некрозы имели мелкоочаговый характер и располагались преимущественно в центральных зонах дольки. Регенерация протекала при этом довольно активно, количество двуядерных клеток достигало 34%. К 9 суткам площадь очагов некроза не увеличивалась, что можно расценивать как хороший прогностический признак.

По тяжести повреждающего действия инфицирование парами рекомбинирующих мутантов занимало промежуточное положение. Мелкоочаговые (нередко моноцеллюлярные) некрозы гепатоцитов появлялись в те же сроки, что и при инфицировании вирусом исходного штамма. Активность клеток Купфера была достаточно высокой. К 7 суткам количество некротических фокусов увеличивалось, однако они не были такими обширными, как при инфицировании вирусом исходного штамма. Количество двуядерных клеток было высоким (30 — 35%) и соответствовало уровню этого показателя при инфицировании каждым из мутантов в отдельности. К 9 суткам татоморфоло-гическая картина не претерпела существенных изменений, за исключением незначительного увеличения площади очагов некроза.

Таким образом, динамика и тяжесть патоморфолошческих изменений печени соответствовала степени вирулентности ис-

следованных вирусов.

Очевидно, что 15" мутанты вируса эктромелии вызывали у мышей инфекционный процесс, о чем свидетельствуют выделение вирусных частиц из внутренних органов и данные пато-морфологических исследований. Однако, если при интраназаль-ном заражении животных вирусом исходного (дикого) типа инфекционный процесс как правило заканчивался летально, то при инфицировании 18" мутантами исход чаще всего оказывался благоприятным. Поэтому представляло интерес исследовать иммуногенные свойства мутантов. Так, в сыворотках крови во время инфекционного процесса было обнаружено нарастание титра вируснейтрализующих антител. В связи с тем, что для ортопоксвирусов отсутствует прямая корреляция между титром антител и степенью защиты от инфекции, были проведены дополнительные эксперименты по инфицированию животных 18" мутантами с последующим разрешением вирусом исходного (дикого) типа.

Исследованные 18" мутанты обладают выраженными имму-ногенными свойствами в достаточно широком диапазоне концентраций, обеспечивая через 21 сут практически полную защиту животных от гибели при заражении 50 ЬБ50 вируса дикого типа.

Рассматривается возможность использования живых ослабленных вакцин на основе 18" мутантов, однако следует иметь в виду, что при встрече такой вакцины с другими низковирулер-тными вариантами, латентно циркулирующими в популяции, возможна ее реверсия в результате рекомбинации в высоковирулентный штамм с последующим развитием "цветущей" эпидемии.

Используя 18" мутанты как примеры штаммов вирусов со сниженной вирулентностью, мы попытались смоделировать их циркуляцию непосредственно в условиях экспериментальной популяции. Так как мутанты эффективно репродуцируются в легких, то естественно было предположить, что они способны циркулировать внутри стада животных, передаваясь от инфицированных животных неинфицированным. Были проведены эксперименты по совместному содержанию животных, инфицированных различными мутантами какотдель-

но, так и совместно с подсаженными "чистыми" животными.

Вирус эктромелии эффективно распространяется внутри стада лабораторных животных, о чем свидетельствует выделение вируса из органов подсаженных мышей. Если в популяции циркулировал только один низковирулентный вариант (1«19 или ^30), то и из органов подсаженных мышей выделялся вирус с низковирулентным 18" фенотипом. Когда в популяции начинают циркулировать два (или более) низковирулентных варианта, у подсаженных ("чистых") животных развивается острая экгромелия с высокой летальностью и выделением от них вы-соковирулентнош вируса с исходным фенотипом, появление которого является результатом рекомбинации низковирулентных вариантов. Рекомбинация может протекать как в организме первично инфицированных мышей (19x30) с последующим распространением частиц на подсаженных, так и в организме подсаженных мышей в случае, когда не происходит смешанного заражения первично инфицированных мышей [(19)+(30)1.

Следует отметить, что такого рода эксперименты были успешны только при раннем объединении животных — сразу после инфицирования. При объединении через 3 суток или позже, данный результат не был получен, вероятно, из-за развития невосприимчивости к суперинфекции.

Таким образом, с помощью мутагена удалось получить коллекцию температурочувствительных мутантов вируса эктромелии. У мутантов были определены показатели реверсии и "текучести", что позволило выделить среди них группу со стабильным 15" фенотипом.

Температурочувствительные мутанты были использованы в качестве модельных штаммов для изучения циркуляции в популяции животных штаммов со сниженной вирулентностью. Показано, что при инфицировании животных одновременно двумя низковирулентными штаммами происходит довольно резкое повышение вирулентности (в 20-30 раз), что является результатом их рекомбинационного взаимодействия с образованием потомства вируса высоковирулентного исходного типа с фенотипом.

Уровень репродукции 18* мутантов во внутренних органах мышей (в печени и в легких) не отличался, а в некоторых случаях и превышал уровень репродукции вируса исходного (дикого) типа. В связи с этим было проведено патоморфологичес-кое изучение печени и установлено, что степень ее повреждения соответствует вирулентности исследованных штаммов, а не количеству образовавшегося в ней вирусного потомства.

ВЫВОДЫ

1. Получена представительная коллекция температурочув-ствительных мутантов вируса эктромелии. Использование ни-трозогуанидина в качестве мутагена и многоэтапной методики селекции позволяет выделять температурочувствительные мутанты вируса эктромелии с частотой до 9,2%. Селектированные 18" мутанты являются одноударными и способны рекомби-нировать друг с другом при скрещивании с частотой до 33,2 %. Рекомбинационный анализ показал, что мутации располога-лись на рекомбинационной генетической карте вируса эктромелии в следующей последовательности: 19 — 18 — 15 —

31 — 30.

2. Введение 15" мутации в геном вируса приводит к снижению вирулентности для основного хозяина. При этом показано, что степень снижения вирулентности находится в обратной корреляционной зависимости от выраженности 15' фенотипа мутанта. При одновременном инфицировании животных рекомбинирующими парами мутантов возможно восстановление вирулентности вируса за счет образования рекомбинантов с фенотипом и вирулентностью вируса исходного типа.

3. Степень репродукции гй- мутантов во внутренних органах животных при одиночном заражении близка наблюдаемой у вируса исходного типа, то есть уровень репродукции вируса эктромелии во внутренних органах не всегда отражает вирулентные свойства штамма, однако тяжесть и динамика пато-морфологических изменений в печени зависят от вирулентных свойств возбудителя.

4. Представлен один из возможных механизмов консервации вирулентности ортопоксвирусов за счет рекомбинации ва-

риантов со сниженной вирулентностью в организме восприимчивого хозяина. При этом появление вариантов со сниженной вирулентностью может приводить к снижению напряженности эпидемического процесса, однако при встрече двух штаммов со сниженной вирулентностью возможна их рекомбинация с образованием штамма, вирулентность которого будет близка исходному.

5. Результаты электронно-микроскопического изучения образцов печени мышей выявили комплекс ультраструктурных изменений в паренхиматозном и соединительнотканном ком-партментах органа. Большинство этих нарушений имеют стереотипный характер и по степени выраженности коррелируют с вирулентностью вирусного инфекга. Нарушения ультраструктуры гепатоцитов в значительной степени определяются повреждением цитоплазматических органелл, участвующих в осуществлении белкового и липидного обмена клетки, и существенно зависят от вирулентности возбудителя.

7. Вирус исходного штамма К-1 вызывает появление очагов некроза гепатоцитов к 4 суткам после инфицирования. На 7 сутки альтеративные изменения нарастают и сочетаются с диффузной дистрофией сохранившихся гепатоцитов, увеличением количества клеток Купфсра и двуядерных гепатоцитов. Степень и скорость нарастания деструктивных процессов превышает структурно-компенсаторные реакции органа, что является одной из причин гибели животных к 9 суткам от начала инфицирования.

6. При инфицировании мутантами альтеративные изменения гепатоцитов возникают лишь к 7 суткам. В эти сроки обнаруживаются мелкие очаги некроза, количество и размеры которых к 9 суткам не увеличиваются. Активность купферовс-ких клеток выявляется уже к 4 суткам, но степень ее значительно меньше в сравнении с заражением вирусом исходного типа; количество двуядерных гепатоцитов увеличивается до 34%. Все это свидетельствует о наличии положительной динамики в течении инфекционного процесса к 9 суткам от начала инфицирования.

8. По тяжести повреждающего действия пары рекомбини-рующих мутантов занимают промежуточное положение. Мел-

коочаговые некрозы гепатоцнтов появляются на 4 сутки, то есть в те же сроки, что и при инфицировании вирусом исходного штамма. К 7 суткам количество некротических фокусов увеличивается, однако они менее обширны в сравнении с теми, которые возникают при заражении вирусом исходного штамма. Компенсаторные реакции, оцениваемые по активности куп-феровских клеток и количеству двуядерных гепатоцнтов (30 — 35%) соответствуют уровню их состояния при инфицировании каждым из мутантов в отдельности, но выше, чем при инфицировании вирусом исходного штамма. К 9 суткам патоморфо-логическая картина стабилизируется.

В целом, динамика нарастания иатоморфологических изменений и их тяжесть соответствуют вирулентности исследованных возбудителей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Батенко Л.И., Балахнин С.М., Зиновьев В.В., Овечкина Л.Г., Бсланов Е.Ф. Исследование влияния иммунизации антигенами на морфологические изменения органов белых мышей, зараженных вирусом эктромелии, штамм К-1 // Микроскопические аспекты патогенеза вирусных инфекций: Тезисы докл.

— Кольцово, 1991. — С. 39.

2. Беланов Е.Ф., Балахнин С.М., Киселев С.А. Рекомбина-ционные механизмы поддержания вирулентности штаммов вируса. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ: Тезисы конф. — Волгоград, 1992. — С. 9.

3. Беланов Е.Ф., Балахнин С.М., Киселев С.А. Рекомбина-ционные механизмы восстановления вирулентных свойств штаммов вируса со сниженной патогенностью // Вопросы ветеринарии, вирусологии, микробиологии и эпизотологии: Материалы конф. ВНИИ ветеринарии. — Покров, 1992. — С. 270

- 271.

4. Беланов Е.Ф., Балахнин С.М., Киселев С.А. Рекомбинация как один из механизмов поддержания и восстановления вирулентности ортопоксвирусов // Тезисы межведомственной конференции, Кольцово, 1993. — С. 10.

5. Беланов Е.Ф., Зиновьев В.В., Овечкина Л.Г., Балахнин С.М., Мацкова Л.В., Коновалов Е.Е., Черный Н.Б., Малыгин Э.Г. Получение и исследование специфических антител к вирусу осповакцины из яиц иммунизированных кур // Иммунология. - 1993. - N 6. - Деп. ВИНИТИ 15.12.92, н.3556-В.

6. Беланов Е.Ф., Зиновьев В.В., Балахнин С.М. и др. Снижение чувствительности к ортопоксвирусам развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) из яиц кур, иммунизированных вирусом осповакцины // Вопросы вирусологии. — 1995. — N 4. — Деп. ВИНИТИ 31.01.95, н.268-В.

7. Беланов Е.Ф., Зиновьев В.В., Балахнин С.М. и др. Видовая специфичность противовирусной активности иммуноглобулинов (1бУ) из желтков яиц иммунизированных кур // Вопросы вирусологии. — 1995. — N 4. — Деп. ВИНИТИ 31.01.95, н.269-В.

8. Балахнин С.М. Изменение активности лизоцима сыворотки крови при острой вирусной инфекции // Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН. — Новосибирск, 1996. — С. 12.

9. Балахнин С.М., Проскурякова И.С. Регенерация печени при острой вирусной инфекции у мышей // Там же. — С. 13.

Подписано в печать 14.06.96. Формат бумаги 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 91. Тираж 100 экз. Оригинал-макет подготовлен в редакцион-но-издательском отделе НИИ региональной патологии и патоморфо-логии СО РАМН. Редактор-корректор М.Бакарев.

Типография СО РАМН, 1996 г.

630117 Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2

С.М.Балахнин