Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологический и молекулярно-биологический анализ почечно-клеточного рака. Диагностика и прогноз

На правах рукописи

Черданцева Татьяна Михайловна

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА. ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» МЗ РФ (Барнаул).

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор Лазарев Александр Федорович

доктор медицинских наук,

профессор Климачев Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

Майбородин Игорь Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Горчаков Владимир Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Кливер Евгений Эдуардович, доктор медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением ФГБУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина МЗ РФ.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет МЗ РФ.

Защита состоится: «_» _ 2014 г. в_ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь Диссертационного совета

_2014 г.

Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем онкоу-рологии остается улучшение качества морфологической диагностики, поиск дополнительных факторов в определении прогноза выживаемости больных после проведения хирургического лечения рака почки (РП). В структуре заболеваемости злокачественными опухолями в ряде стран РП выходит на 10-е место и составляет 3% от злокачественных новообразований у взрослых (Pantuck A. J. et al., 2001; Parkin D., et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 190 тыс. новых случаев РП. В России (для обоих полов) злокачественные новообразования почки в 2009 г. составили 3,6%, что соответствует 11 ранговому месту (Аполихин О.И. и др., 2011). В Алтайском крае эти показатели заболеваемости РГ1 выше общероссийских: 11,96 и 8,54 соответственно (Давыдов М.И. и др., 2005; Чиссов В.И. и др., 2003). В 2010 г. в Алтайском крае РП выявлен у 201 (60,1%) мужчины и 133 (39,9%) женщин (Ганов Д.И и др., 2011).

Социальное значение данного заболевания обусловлено высокими темпами прироста заболеваемости, выраженной связью с урбанизацией и низкой выживаемостью больных после лечения, так как РП в значительной степени резистентен к лучевой и химиотерапии (Пасечник Д.Г., 2001; Юдин А.Г., 2007).

РП представляет собой гетерогенную группу, включающую ряд различных по гистогенезу, темпам роста, клиническому течению опухолей. Преобладающей формой среди первичных опухолей почек является по-чечно-клеточный рак (ПКР), который встречается в 90-95% всех случаев опухолей почек у взрослых. Однако каждый из гистологических вариантов ПКР имеет свои уникальные морфологические и клинические характеристики. Особенностью РП является медленный рост первичного очага с одновременной агрессивностью и непредсказуемостью течения (Юдин А.Г., 2007). РП обладает высоким метастатическим потенциалом. Метастазы обнаруживаются у 25% пациентов на момент установления диагноза, у 30 - 50% пациентов дистантные метастазы диагностируются в различные сроки после нефрэктомии. Средняя продолжительность жизни этой категории больных составляет 6-12 мес (Матвеев В.Б. и др., 2005).

В клинической практике хорошо известны случаи различного течения опухолевого процесса и его исхода у больных РП, которые имели идентичные морфологические формы и стадию заболевания. Причины этого нередко наблюдаемого в клинической практике явления остаются неясными. Разнообразие клинических форм РП, непредсказуемость течения и результатов лечения свидетельствуют о значительной гетерогенности биологических характеристик РП, что оказывает существенное влияние на исход заболевания (Murphy W.M. et al., 2004). В связи с этим современная клиника нуждается в решении целого ряда вопросов, связанных с улучшением качества морфологической диагностики, поиском дополнительных

факторов в определении прогноза выживаемости больных после проведения хирургического лечения. Понимание механизмов, задействованных в процессах прогрессирования ПКР, - один из возможных путей совершенствования методов прогноза и, соответственно, его рационального лечения.

В последние годы выявлен целый ряд изменений, происходящих вблизи опухоли при раке различных локализаций (Федосенко К.Ф., 2002; Авдалян A.M. и др., 2010,2011; Сенчукова М.А. и др., 2010,2011; Медведев А.В. и др., 2011; Montironi R. etal., 1999; MairingerT. etal., 1999). Показано, что перитуморозная зона (ПЗ) при мног их злокачественных новообразованиях имеет важное биологическое значение. Патоморфология ПЗ при РГ1 практически не изучена. В то же время, актуальность исследования гистологического строения ПЗ РП и нарушений течения биосинтетических и пролиферативных процессов, происходящих в этой зоне, возникает в связи с распространением органосохраняющей хирургии опухолей почки (Аляев Ю.Г. и др., 2001, 2009; Атдуев В.А. и др., 2003; Матвеев В.Б. и др., 2007; Теплов А. А. и др., 2010). Отсутствие целенаправленных патологоана-томических исследований ПЗ РП позволяет некоторым авторам говорить, что наличие макроскопически «чистого» хирургического края при выполнении резекции почки позволяет отказаться от срочного гистологического исследования, которое из-за большого количества ложноотрицательных и ложноположительных результатов должно выполняться по усмотрению оперирующего хирурга (Kubinski D.J. et al., 2004; Duvdevani M. et al., 2005). Minervini А. и соавт. (2009) показали, что увеличение размера опухоли на 1 см значительно увеличивало число случаев обнаружения роста опухолевых клеток в перитуморозной псевдокапсуле. Другие авторы сообщают, что при органосохраняющих операциях опухолей, размер которых был даже меньше 4 см, обнаруживали инвазию в перитуморозную псевдокапсулу в 27% случаях (Li Q.-L. et al., 2003). С друтй стороны, существует еще одна крайность, когда оперирующие хирурги иссекают прилегающую к опухоли паренхиму почки на расстоянии до 3 - 4 см, что снижает функцию органа в дальнейшем (Переверзев А.С. и др., 2009).

В настоящее время особенно активно исследуется неоангиогенез при онкологических заболеваниях. Гипотеза неоангиогенеза была высказана J.Folkman (1992). В отсутствие кровоснабжения кислород и питательные вещества поступают в опухоль благодаря диффузии, и обычно новообразования имеют в диаметре не более 1 - 2 мм. В опухоли, не имеющей сосудов, темпы роста клеток равны темпам их гибели, поэтому опухоль остает ся в «спящем» состоянии до тех пор, пока в ней не начнется рост кровеносных сосудов из близлежащих капилляров - процесс, известный под названием ангиогенез. Ангиогенез имеет важное значение также для роста и распространения РП (Billemont В. et al., 2007; Sharma S.G. ct al., 2011). Работы по изучению ангиогенеза РП единичны, а исследования в ПЗ РП не проводились, и прогностическое значение ангиогенеза в 113 не исследовано. В то же время есть основания полагать, что гистологиче-

ское строение и, в частности, ангиогенез ПЗ и биологическое поведение опухоли могут быть взаимосвязаны между собой.

Тучные клетки (ТК) постоянно присутствуют в нормальной и патологически измененной почке (ЕЬага Т. е1 а1., 2003). Известно, что ТК посредством протеаз (химазы, триптазы, матричные металлопротеиназы), содержащихся в их гранулах, ведут реконструкцию и ремоделирование экстрацеллюлярного матрикса тканей для того, чтобы облегчить перемещение эндотелиальных клеток при новообразовании сосудов 8. е1 а!., 2006). При опухолевом росте ремоделирование ТК внеклеточного матрикса ведет к облегчению инвазии опухолевых клеток и метастазиро-вания опухоли (ЛоЬапвоп А. е1 а1., 2010). По данным Вигст Т. й а1. (2006), среднее число ТК значительно выше в РП, чем в нормальной почечной ткани, что, по мнению данных авторов, объясняется их участием в тумо-рогенезе (Вигст Т. е1 а1., 2006). В то же время не было найдено корреляций между числом ТК и клинико-морфологическими параметрами опухоли и ПЗ. С другой стороны, была обнаружена взаимосвязь между плотностью ТК и числом микрососудов в опухоли. Также данными авторами обнаружено более высокое число ТК в светлоклеточных карциномах, чем в других гистологических типах рака почки, что авторы объясняют более высокой метаболической потребностью данного гистологического типа рака. МоЬвет М.в. е1 а1. (2010) не нашли корреляции между числом ТК и плотностью микрососудов в РП. Исследования такого рода представляются нам актуальными, однако следует отметить, что исследования ТК в ПЗ РП не проводились.

В настоящее время ощущается все большая необходимость для пациентов быть информированными по аспектам течения болезни, включая риск метастазирования, рецидива и вероятного исхода заболевания. Новые точные молекулярно-биологические факторы могут помочь в разработке оптимальных алгоритмов для прогнозирования заболевания (Серегин А.В. и др., 2009). Поэтому есть необходимость в разработке прогностических моделей, включающих новые факторы прогноза при ПКР.

Таким образом, определение прогностического значения клинико-мор-фологических и биомолекулярных параметров опухоли и морфологических характеристик ПЗ у больных ПКР является актуальной проблемой, решение которой позволит объективизировать прогноз заболевания.

Цель исследования - изучить патоморфологические и молекулярно-биологические особенности почечно-клеточного рака и перитуморозной зоны в зависимости от степени злокачественности для определения прогностически значимых критериев и разработки алгоритма индивидуального прогнозирования послеоперационной выживаемости больных.

Задачи исследования:

1. Изучить патоморфологические особенности почечно-клеточного рака в зависимости от гистологического типа, гистоархитекгоники и степени злокачественности.

2. Изумить пролиферативную активность (митотический индекс, экспрессию К ¡-67, содержание ДНК, число AgNORs) опухолевых клеток и оценить в них экспрессию маркеров апоптоза (р53 и Вс1-2) в зависимости от стадии патологического процесса, гистологического типа, степени анаплазии, размера и метастатического потенциала опухоли.

3. Изучить гистохимические особенности внеклеточного матрикса и количественные параметры клеток соединительной ткани перитуморозной зоны в зависимости от степени анаплазии опухолевых клеток.

4. Изучить экспрессию молекулярно-биологических маркеров (Ю-67, р53, Вс1-2), определить количество ядрышковых организаторов (AgNOR), содержание ДНК и площадь ядер эпителиоцитов канальцев в перитуморозной зоне в зависимости от степени анаплазии.

5. Изучить характер изменений микроциркуляторного русла и воспалительного инфильтрата в опухолевой ткани и перитуморозной зоне в зависимости от патоморфологических особенностей опухолей.

6. Провести одно- и многофакторный регрессионный анализ клинико-морфологических и молекулярно-биологических характеристик почечно-клеточпого рака для выделения прогностически значимых критериев.

Научная новизна. Впервые на большом операционном материале рака почки выявлены и систематизированы взаимосвязи молекулярно-биологических параметров опухолей и морфологических характеристик перитуморозной зоны с рядом клинических и патоморфологических характеристик: полом, возрастом, стадией заболевания, гистологическим типом, размером опухолевого узла, степенью анаплазии по РиЬгшап и наличием метастазов. Впервые представлена комплексная морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика злокачественных опухолей почки в зависимости от гистологического строения и степени анаплазии.

Впервые детально охарактеризованы морфологические и молеку-лярно-биологические особенности перитуморозной зоны при почеч-но-клеточном раке в зависимости от степени анаплазии и выделены ее наиболее информативные качественно-количественные параметры для оценки неблагоприятного послеоперационного прогноза. Впервые проведена оценка 5-летней послеоперационной выживаемости больных с применением новых прогностических критериев: ширины ПЗ, степени склероза ПЗ, количества клеток воспалительного инфильтрата в 113 и суммарной площади сечения сосудов в ПЗ и показана их прогностическая значимость.

Впервые на основе многофакторного регрессионного анализа по Коксу сопоставлены клинико-морфологические и молекулярно-биологическис прогностические критерии опухоли и ПЗ с выделением наиболее значимых критериев 5-летней послеоперационной выживаемости больных. Показана прогностическая значимость молекулярно-биологических маркеров опухоли и параметров, характеризующих ПЗ.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования представляют собой новые знания о патоморфологии и молекулярно-биологических особенностях почечно-клеточного рака в зависимости от клинической стадии и степени анаплазии. В результате обобщения полученных данных оценена прогностическая значимость ряда клинико-морфологических, биомолекулярных и морфологических параметров опухолевого узла и ПЗ, что позволяет оптимизировать прогнозирование течения ПКР.

Результаты исследования имеют значение для прогноза возникновения регионарных и отдаленных метастазов, требующих дополнительного лечения и дальнейшего более тщательного динамического наблюдения.

Изученные параметры ПЗ новообразований почки позволят в практической работе патологоанатома более объективно определять степень злокачественности опухоли. Результаты количественных морфологических и иммуногистохимических исследований могут быть использованы при проведении научных исследований, направленных на поиск объективных критериев диагностики рака почки.

Основные положения, вьшосимые на защиту:

1. Биомолекулярные параметры опухоли и морфологические характеристики ПЗ ПКР (митотический индекс, содержание ДНК, экспрессия Bcl-2, Ki-67, р53 в опухолевых клетках; активность AgNOR в опухолевых клетках, выраженность склероза ПЗ, суммарная площадь сечения сосудов ПЗ, количество клеток воспалительного инфильтрата в ПЗ и ширина ПЗ) коррелируют с рядом клинико-морфологических параметров - наличием метастазов, размерами опухолей, степенью анаплазии опухолевых клеток (по Fuhrman) и клинической стадией заболевания.

2. Морфологические характеристики ПЗ взаимосвязаны со степенью анаплазии опухолевых клеток: для Gill - IV характерны увеличение ширины и выраженный склероз ПЗ, увеличение в ней морфофункциональной активности фибробластов и тучных клеток.

3. Количество сосудов микроциркуляторного русла выше в опухоли, чем в ПЗ. Наиболее высокое значение этого показателя характерно для светлоклеточного варианта ПКР В опухолях с высокой степенью злокачественности количество микрососудов уменьшается, при этом возрастает суммарная площадь сечения сосудов (СПлС). В ПЗ наиболее значимым показателем является СПлС, величина которой коррелирует со степенью анаплазии опухоли по Fuhrman и наличием регионарных и отдаленных метастазов. СПлС в ПЗ > 650 мкм2 является неблагоприятным критерием прогноза при ПКР.

4. Количество клеток перитуморозного воспалительного инфильтрата (KBИ) выше, чем интратуморозного инфильтрата. Возрастание количества КВИ в перитуморозной зоне коррелирует со степенью анаплазии опухоли, шириной ПЗ, экспрессией Ki-67 и наличием регионарных и отдаленных

метастазов. Количество КВИ в Г13 > 42 в пяти полях зрения (при увеличении х 1 ООО) является неблагоприятным фактором прогноза ПКР.

5. Ведущими критериями выживаемости больных ПКР являются биомолекулярные параметры опухоли и морфологические характеристики Г13. Клинико-морфологические параметры на прогноз влияют в меньшей степени. Факторами неблагоприятного исхода ПКР в индивидуальном прогнозе являются: наличие метастазов; большое количество КВИ в ПЗ; значительная ширина ПЗ; большой размер опухоли; высокая суммарная площадь сечения сосудов в ПЗ; И1-1V степень анаплазии по Fuhrman; высокие значения митотического индекса и содержания ДНК; возрастание экспрессии Ki-67 и числа AgNORs в клетках опухоли и отсутствие экспрессии Вс1-2.

6. Комбинированная модель индивидуального прогноза, где наряду с традиционными факторами прогноза включены молекулярно-биоло-гические параметры и морфологические характеристики ПЗ, повышает результативность оценки 5-летней выживаемости пациентов ПКР до показателя у2 = 88,0.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на XIV Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2010); Всероссийской научно-практической конференции онкоурологов (Красноярск, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Барнаул, 2010); 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2010); X региональной научно-практической конференции урологов Сибири (Барнаул, 2011); Российской научно-практической конференции с международным участием (Барнаул, 2011); 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2011); Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Владивосток, 2011); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти член-кор. РАМН О.В.Хмельницкого «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Санкт-1 [егербург, 2011); VI конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, 2011); 8-й конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, 2012); Российской научно-практической конференции с международным участием «Высокие технологии в онкологии» (Барнаул, 2012); межкафедральном заседании ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»; VII региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); III Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2012); VII съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Астана, 2012); VII конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, 2012); Российской научно-

практической конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике» (Барнаул, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 55 работ в международных и республиканских изданиях, из них - 19 в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. Получен патент РФ на изобретение № 2447438 от 07. 06. 2010 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследований», 5 глав «Результатов собственных исследований», заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя цитируемой литературы. Общий объем диссертации 280 стр. машинописного текста. Указатель литературы содержит 573 работы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 106 таблицами и 70 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного клинико-морфологического исследования 241 больного ПКР, находившегося на обследовании и лечении в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» г. Барнаула с 2008 по 2013 год. Средний возраст пациентов составил 58,1±0,6 лет (min. 34: max. 77; moda 64). Женщин было 127 (52,7%), мужчин - 114 (47,3%).

Морфологическую характеристику материала проводили как на макро, так и микроскопическом уровнях. При макроскопическом исследовании учитывали размер опухоли (наибольший размер по длиннику опухоли), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах, состояние вен и прорастание опухоли в капсулу, лоханку и паранефральную клетчатку. Средний наибольший размер опухоли составил 6,8±0,2 см (min - 1 см; max - 18 см; moda - 5 см).

Для патологогистологического исследования материал забирали из центра опухоли, из перитуморозной зоны (от края опухоли до неизмененной ткани почки) и из максимально отдаленных от опухоли участков.

Используемые классификации. При стадировании процесса ПКР использовали классификацию, предложенную Международным противораковым союзом (UICC) в 2002 г. (AJCC, 2002,6-е издание). При группировке опухолей по клиническим стадиям (I - IV) опухоли были распределены следующим образом: I стадия (T1N0M0) - 158 (65,5%) наблюдений; II стадия (T2N0M0) -35(12,9%) наблюдений; III стадия (T1N1 МО, T2N1 МО, T3N0M0, T3N1 МО) - 34 (14,1%) и IV стадия (T4N0M0, T4N1 МО, Тлюбая N2M0, Тлюбая №нобая М1) - 18 (7,5%) наблюдений.

Гистологические типы классифицировали в соответствии с классификацией ВОЗ 2004 г. В исследовании преобладал светлоклеточный рак почки (СРП), к которому было отнесено 162 (67,2%) наблюдения, включая 29 (12%) случаев СРП гранулярно-клеточного типа. Значительно реже

встречали мультилокулярную кистозную форму СРП - в 3 (1,3%) случаях. Папиллярный (хромофильный) вариант Г1КР - 19 (7,9%) наблюдений; хромофобный - 16 (6,6%) наблюдений, нейроэндокринный - 7 (2,1%), неклассифицируемый (саркоматоидный) ПКР - 7 (2,1%) наблюдений.

При исследовании гистоархитектоники опухолей, основываясь на данных W.Thoenes et al. (1986), отмечено преобладание опухолей с компактной гистологической архитектоникой (47,7%) относительно опухолей со смешанной (12,9%), тубулярной (30,7%), папиллярной (7,5%) и кистозной (1,2%) структурой.

Степень злокачественности определяли по S.A.Fuhrman (1982). Преобладали пациенты с GI - 89 (36,9%) и GII - 90 (37,3%) степенями ядерной атипии, меньшее число больных - 42 (17,4%) имели ПКР со степенью ядерной атипии GUI. У 20 (8,4%) больных отмечена GIV степень ядерной атипии.

Методы иатоморфологического анализа. Весь операционный материал маркировали, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после дегидратации заливали в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизон и по методу Маллори. На светоопгическом уровне оценивали цитологические особенности клеток, гистоархитектонику опухоли, степень ядерной атипии, характер воспалительного инфильтрата, явления некроза, склероза, гиалиноза и митотический режим клеток опухоли.

Гистохимические методы. Применяли следующие гистохимические окраски материала: на эластические волокна резорцин-фуксином по Вейгерту; серебрение аргирофильных волокон по методу Гомори; на нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ) проводили реакцию ШИК по Мак - Манусу; кислые ГАГ окрашивали альциановым синим по Стидмену и колоидным железом по Хейлу; количество ДНК в ядрах оценивали с использованием окрашивания по Фельгену.

Исследование тучпых клеток и фибробластов. Тучные клетки окрашивали основным коричневым по Шубичу М.Г. в модификации Голофеевского В.Ю. и соавт. (1987) и водным раствором толуидинового синего (рН - 3,9). При увеличении хЮОО подсчитывали плотность распределения ТК, размер, оценивали форму и процентное соотношение тучных клеток с компактным расположением гранул в цитоплазме и в состоянии дегрануляции в опухоли и ПЗ в 20 произвольно выбранных полях зрения.

Количественная оценка клеток фибробластического ряда включала определение их числа в поле зрения, подсчет числа ядрышек на 1 ядро, оценку площади ядра, количества ДНК, числа AgNORs.

Исследование ядрышковых организаторов (AgNOR). При изучении AgNOR срезы окрашивали AgN03 по двухступенчатому методу Y. Daskal et al. (1980) в модификации И.П.Боброва и соавт. (2010). Подсчитывали среднее число гранул на 1 ядро и на 1 ядрышко в каждом отдельном случае.

Оценивали среднее количество ядрышек на 1 ядро и их морфологический тип по морфофункциональной классификации ядрышек (Челидзе П.В., Зацепина О.В., 1988).

Митотическую активность оценивали путем подсчета митозов на 1000 клеток. Показатель митотической активности выражали в промиллях (%о). Оценивали частоту патологических митозов, которую выражали в % к общему числу митозов.

Методы иммуногистохимического исследования. Иммуногисто-химическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового и полимерного иммуноперокси-дазного метода с моно- и поликлональными антителами. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитогшазматический, ядерный, смешанный). Для исследования основных характеристик опухолевых клеток использовали следующие моноклональные антитела и разведения: Ki-67 (MIB-1, «Dako», разведение 1:25); р53 (D07, «Dako», разведение 1:25); CD31 (JC70, «Dako», разведение 1:10); Bcl-2, (МКА124, «Dako», разведение 1:10). Оценку экспрессии молекулярно-биологических маркеров проводили согласно общепринятым методикам и протоколам производителя.

Методы количественного морфологического анализа. Для исследования ангиогенеза морфометрическим методом препараты фотографировали цифровым фотоаппаратом в 5 полях зрения при увеличении х400 и сохраняли фотоснимок в формате JPG. Затем проводили обработку снимка в программе Adobe Photoshop 6.0. При обработке фотографий выделяли сосуды микроциркуляции, потом области выделения переносили на отдельный чистый лист и заполняли области выделения красным цветом. Морфометрию обработанных фотоизображений проводили с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.2.

С помощью методики «распределение по параметру» в автоматическом режиме определяли среднюю площадь сечения всех сосудов в поле зрения (СПлС) и средний суммарный периметр сосудов на 1 поле зрение препарата (анализировали не менее 5 полей зрения). Проводили измерения ширины ПЗ в микрометрах. Подсчитывали количество профилей сосудов микроциркуляторного русла (ПМЦР) в 1 поле зрения.

Проведен подсчет количества клеток воспалительного инфильтрата в поле зрения среза (при 000) с учетом пола, возраста, гистологического варианта ПКР, клинической стадии заболевания, степени ядерной атипии по Fuhrman, размера опухоли и наличия регионарных и отдаленных метастазов. Анализировали не менее 5 полей зрения.

Морфоденситоморфометрический метод исследования. Данные исследования проводили с целью определения площади ядер исследуемых клеток, оптической плотности объекта с вычислением содержания Фельген-ДНК ядер. Содержание ДНК в ядрах клеток определяли на ком-

пьютерном анализаторе изображений, состоящем из микроскопа Leica DNM, цифровой видеокамеры Leica DME (план объектив 100х/0,65, светофильтр 570 нм) с морфометрической программой Видео Тест-Морфология 5.2. Условия освещения и пороги яркости измеряемых объектов были одинаковыми для всех измерений. Определяли морфометрические параметры ядер клеток (площадь ядра, интегральную оптическую плотность). В каждом препарате определяли содержание ДНК в ядрах 25-30 интерфазных клеток, а также в ядрах 25 малых тканевых лимфоцитов в этом же срезе. Среднее содержание ДНК в ядре лимфоцита принимали за диплоидное значение (2с).

Статистический анализ результатов исследования. Данные о выживаемости больных получали из «Канцер-регистра» Алтайского края. Рассчитывали 5-летнюю выживаемость больных двумя способами, по методикам и формулам, предложенным Мерабишвили В.М. (2006) и Cutler S., Ederer F. (1958) - прямым способом и акгуриальным способом. При исследовании прямым способом производили вычисления, соответствующие расчетам наблюдаемой выживаемости в % (отношение числа больных, переживших контрольный срок, к числу больных, взятых под наблюдение). При исследовании акгуриальным способом, после создания специальной базы данных определяли общую выживаемость по Каплан-Мейеру (строили кривые кумулятивной выживаемости) с определением кумулятивной доли выживших, где время оценивалось по дням. Достоверность различий показателей выживаемости оценивали с помощью логарифмического рангового критерия (log-rank-test). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Проводили однофакторный и многофакторный регрессионный анализ по Коксу, без введения в прогностическую модель параметров, характеризующих изученные биомолекулярные параметры опухоли и параметры ПЗ, а затем с введением в прогностическую модель данных параметров. Использовали прикладной пакет программы Microsoft Office Excel. Базу данных создавали с использованием прикладной программы Statistica 6.0.

Все цифровые данные, полученные в работе, подвергали статистической обработке. Вычисляли: M - среднюю арифметическую и m - ошибку средней арифметической. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения, то применяли тест Колмогорова-Смирнова или U-тест Манна-Уитни. Для оценки значимости различий между группами по качественным признакам применялся односторонний критерий Фишера или критерий Хи-квадрат. Различия считались значимыми при р<0,05. Наличие связи между изучаемыми признаками проводили с использованием корреляционного анализа и рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R) для оценки силы связи между переменными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Патоморфологический анализ ПКР. При оценке локализации опухолевого процесса было отмечено, что поражение левой почки было у 119 больных (49,4%), а правой почки у 122 пациентов (50,6%), т.е. различий в локализации обнаружено не было (р>0,05). Наиболее часто опухоль располагалась в одном из полюсов почки - 116 (48,1 %) случаев, несколько реже отмечено расположение опухоли в средней трети почки - 112 (46,5%) наблюдений. В 13 (5,4%) случаях почка была поражена тотально. Опухоль выступала над поверхностью почки, т.е. располагалась частично внеорганно - 53 (22%) случая, в толще паренхимы опухоль располагалась в 188 (78%) наблюдениях.

Прорастание опухоли в окружающие ткани и органы отмечено в 52 (21,6%) случаях. При инвазии в окружающие органы и ткани наиболее часто поражалась околопочечная клетчатка - 35 (67,3%) случаев, реже почечная лоханка - 10 (19,2%) и почечная вена - 7 (13,5%) наблюдений.

Средний размер опухоли по длиннику составил 6,2±0,2 см (пределы колебаний среднего размера первичного опухолевого очага по длиннику - от 1 до 18 см). При исследовании размера опухоли в зависимости от клинической стадии патологического процесса было выявлено, что у больных с I стадией средний размер опухоли составил 4,6±0,1 см, со II - 8,3±0,2 см (р=0,001), с III - 9,1 ±0,4 см (р=0,1) и с IV - 12,6±0,9 см (р=0,0002). Размер опухолевого узла достоверно возрастал в зависимости от клинической стадии патологического процесса.

У 12 (5%) больных ПКР сочетался со злокачественными новообразованиями других локализаций. Среди пациентов с первично-множественными злокачественными образованиями (ПМО), одно из которых было ПКР, было 9 женщин и 3 мужчины.

При оценке гистоархитектоники опухоли отмечали преобладание компактной гистоархитектоники - 11 5 наблюдений (47,7%). Среди опухолей имеющих компактное строение наиболее часто встречались ПКР солидного строения (56 случаев; 48,7%), несколько реже встречали ПКР альвеолярного строения (38 наблюдений; 33%), трабекулярного (8 наблюдений; 7%); солидно-трабекулярного (6 наблюдений; 5,2%) и тра-бекулярно-альвеолярного строения (4 наблюдения; 3,5%). К смешанной структуре относили те опухоли, которые помимо компактных имели в своем составе не менее 25% структур иного строения. Опухоли смешанного строения были отмечены в 31 (12,9%) случае. В этой группе опухолей обнаруживали: тубулярно-альвеолярные структуры в 3 (9,7%) наблюдениях, тубулярно-трабекулярные структуры - в 20 (64,5%) наблюдениях и солидно-тубулярные структуры - в 8 (25,8%) случаях. Преимущественно тубулярное строение обнаруживали в 74 опухолях (30,7%). В 18 наблюдениях (7,5%) в новообразовании преобладали папиллярные структуры. Кистозная архитектоника выявлялась в 3 случаях.

В изученном нами материале отдаленные и регионарные метастазы встретились в 32 (13,3%) наблюдениях из 241.

Интратуморозный воспалительный инфильтрат. Независимо от клинико-морфологических факторов, среднее количество клеток воспалительного инфильтрата (КВИ) варьировало от I до 87; среднее значение в опухоли составило 19,4±0,7. В целом количество клеток в опухоли было невысоким, в процентном отношении преобладали новообразования с небольшой воспалительной инфильтрацией (количество клеток воспалительного инфильтрата от 1 до 41 отмечено в 92,9 % случаев).

Количество КВИ у мужчин составило 21,6±1,1, у женщин - 17,0±1,0 (р=0,02). У больных в возрасте от 30 до 39 лет этот показатель составил 19,2±3,3; от 40 до 49 лет- 13,1±1,3; от 50 до 59 лет - 20,1±1,2; от 60 до 69 лет - 21,6± 1,5, от 70 до 79 лет - 17,2± 1,8 (р 1 -2 =0,03; р2-3 =0,002; р2-4 =0,002). То есть данный показатель оказался более высоким у мужчин и у больных в возрасте от 50 до 59 лет.

Наибольшее количество КВИ выявлено при папиллярном раке (24,15±3,4), наименьшее - при нейроэндокринном раке (1,3±0,3) (р=0,000003). При I клинической стадии этот показатель составил 18,0± 1,0, при II стадии -19,5±1,6, при 111 стадии - 23,9±2,0, при IV стадии - 1 5,4±2,3.

Количество КВИ возрастало в новообразованиях высокой степени злокачественности GI1I-GIV (25±1,6) по сравнению с низкими степенями GI-GII (17,8±0,9) (р=0,00004). Обнаружена тенденция к увеличению количества КВИ в крупных опухолях: в опухолях < 7,0 см - 18,6±0,95 клеток, в опухолях > 7,0 см - 20,2± 1,25 (р=0,3). У больных без метастазов количество клеток составило 18,3*0,8, а у больных с метастазами-24,7±2,1 (р=0,002).

Исследование ангиогенеза в опухоли. Достоверных различий по показателям ПМЦР и СПлС между мужчинами и женщинами не выявлено: среднее значение ПМЦР у мужчин составило 30,5±1,5, у женщин - 29,4± 1,3 (р=0,1); СПлС - 4313,4± 192,4 и 3578,2± 187,4 мкм2 (р=0,08) соответственно. Наименьшее значение ПМЦР опухоли выявлено у больных в возрастной группе ог 30 до 39 лет (14,9±1,4), а наибольшее значение СПлС (4312,2±424,4 мкм2) - в возрасте от 70 до 79 лет. При исследовании пеоангиогенеза в зависимости от клинической стадии показано, что при III и IV стадиях патологического процесса происходило уменьшение ПМЦР по сравнению с I и II стадиями (р<0,05), а СПлС в III и IV стадиях, напротив, возрастала по сравнению с I и П стадиями (р=0,00005) (табл. 1).

Выявлена умеренная коррелятивная связь между ПМЦР и гистологическим типом опухоли (г=0,36; р=0,01). Наиболее высокое значение ПМЦР обнаружено в светлоклеточном (36,9±1,3) и веретеноютеточном (32,6±6,1) раках, наименьшее - в зернистоклеточном (18,5±1,8) и хромо-фобном (16,1±1,3) раках. Промежуточное положение по ПМЦР занимали нейроэндокринный (27,1±3,6) и папиллярный (22,5±2,2) раки. Наиболее высокая СПлС была выявлена в зернистоклеточном (5009,4±681,95 мкм2), светлоклеточном (4732,7± 174,4 мкм2) и веретеноклеточном (4119,0±517,1

Таблица 1. Показатели неоангиогенеза в опухоли в зависимости от степени анаплазии опухоли и размера опухолевого узла (М±ш)

Параметры ПМЦР (в 5 полях зрения при ув. 400) СПлС (мкм2)

Степень анаплазии опухоли:

GI 38,9±1,7* 3382,1±276,3*

GII 29,1 ±2,0* 3731,5±189,05*

GIII 23,7±1,7* 4907,1±338,7

GIV 22,1±9,0 5134,8±382,1 *

Размер опухолевого узла: < 7,0 см > 7,0 см 33,6±1,4* 27,9±1,3* 4529,4±225,4* 3719,5± 174,7*

Примечание: * - р < 0,05.

мкм2) раках. Низкую СПлС имели хромофобный и папиллярный раки: 2548,8±236,3 и 1752,7±319,3 мкм2 соответственно. Промежуточное значение по СПлС отмечено для нейроэидокринного рака(3362,2±236,3 мкм2).

Обнаружена слабая корреляция между ПМЦР в опухоли и степенью анаплазии по РЫитпап (г=0,25; р=0,02). С увеличением степени ядерной атипии снижалось количество ПМЦР и происходило увеличение СПлС (см. табл. 1).

При проведении анализа параметров неоангиогенеза в опухоли в зависимости от ее размера было обнаружено, что в опухолях с размером < 7,0 см число ПМЦР составило 33,6±1,4, а при размере опухолевого узла

> 7,0 см - достоверно уменьшилось до 27,9±1,3 (р=0,005). СПлС в опухолях

> 7,0 см составила 4529,4±225,4 мкм2, тогда как в новообразованиях < 7,0 см она была достоверно меньше (3719,5±174,7 мкм2) (р = 0,02) (см. табл. 1).

У больных без регионарных и отдаленных метастазов число ПМЦР в первичной опухоли составило 33,4±1,15, а при наличии метастазов оно достоверно уменьшалось до 21,1 ±1,75 (р=0,00004). СПлС без наличия метастатических поражений составила 3954,7± 149,6, а при наличии метастазов достоверно возрастала до 4818,65±394,7 (р=0,02).

Пролиферативная акт ивность (митотический индекс, Ю-67, количество ДИК и AgNOR) опухолевых клеток. Вне зависимости от пола, возраста, гистологического варианта 11КР, размера опухолевого узла, стадии ТОМ, наличия метастазов содержание ДНК в ядрах варьировало от 2,1 до 10,7с., среднее значение составило 4,7±0,2с. Разброс показателей митотического индекса (МИ) был от 0 до 11%о, среднее значение МИ -2,4±0,3%о. Вариации экспрессии антигена Ю-67 были от 1 до 53%, среднее значение-5,4± 1,1%. Средние значения AgNORs на 1 ядро варьировали от 1,9 до 34,5, среднее значение AgNORs для всей группы составило 8,7±0,8.

Анализ в зависимости от пола больных показал, что среднее значение ИМКь67 у мужчин составил 6,0±0,95%, а у женщин -10,05±2,2% (р=0,08). В то же время средние значения ИМ К1-67 при низкой пролиферативной

активности (ПА) среди женщин были 2,5±0,2%, среди мужчин - 2,3±0,5% (р>0,05). При высоком ИМ Ki-67 составил среди женщин - 24±4,1 %; среди мужчин - 10,45±1,6% (р=0,001).

Анализ в зависимости от возраста пациентов показал, что самые высокие показатели содержания ДНК наблюдали в возрастной группе больных от 50 до 59 лет (5,2±0,3с), а самые низкие - в группе от 30 до 39 лет (4,1±0,6с) (р = 0,1). Наибольшие показатели МИ были выявлены в группе от 70 до 79 лет (3,8±0,9), наименьшие - в группе от 30 до 39 лет (0,8±0,3%о) (р=0,000001). Различий индекса мечения (ИМ) Ki-67 в зависимости от возраста больных обнаружено не было. При анализе AgNORs наибольшие значения были обнаружены в группе от 50 до 59 лет- 10,2±1,3, а наименьшие в группе от 30 - 39 лет - 3,2±0,2 (р < 0,05). Эти данные свидетельствуют об увеличении пролиферативной активности опухолевых клеток при 1IKP в старших возрастных группах.

Стадия патологического процесса коррелировала с содержанием ДНК (г=0,59; р-0,0001), МИ (г=0,49; р=0,0001), числом ПМ (г=0,0001) и числом AgNORs (г=0,69; р=0,0001). При I клинической стадии заболевания среднее содержание ДНК составило 3,8±0,1с, при II стадии - 4,7±0,6с, при стадиях III и IV достоверно возрастало до 6,5±0,5с и 6,7±0,3с соответственно (р<0,05). При стадии I МИ составил 1,52±0,2%о, при стадии II - 2,3±0,6%о (р=0,2), при стадии III - 3,25±0,7%о (р=0,7) и при стадии IV

- 5,6±1,0%о (р=0,07). Количество ПМ в зависимости от стадии возрастало и составило при стадии I - 13,8±4,2%, при стадии II - 27,9+10,5% (р=0,2), при стадии III - 28,5±7,8% (р=0,9) и при стадии IV - 48,2±12,3% (р=0,2). Значения ИМ Ki-67 были статистически значимо выше у больных с III и IV стадиями опухолевого процесса rio сравнению с I и II стадиями IIKP (р=0,009). При I стадии среднее значение AgNORs составило 4,8±0,4; при И стадии - 8,2±2,8 (р=0,04); при III стадии - 12,5±1,9 (р-0,36), в IV стадии - 17,3±1,7 (р=0,05). Таким образом, при увеличении клинической стадии заболевания отмечали возрастание пролиферативной активности опухолевых клеток.

Степень анаплазии по Fuhrman была взаимосвязана с содержанием ДНК (г=0,77; р=0,0001), МИ (r-0,61; р=0,0001), IIM (г=0,61; р=0,0001), ИМ Ki-67 (i-0,63; р=0,0001) и числом AgNORs (г=0,69; р=000,1). При степени анаплазии опухоли Gl содержание ДНК составило 3,3±0,1с, при GII - 4,8±0,2с (р=0,0000001), при GUI - 5,4±0,4с (р=0,0000001) и при GIV

- 7,0±0,4с (р=0,01). При степени анаплазии Gl МИ составил 1,1±0,2%о, при Gl! - 1,5±0,5%о (р=0,2), при GUI - 3,9±0,7%о (р=0,000007) и при GIV

- 5,1±0,8%о (р=0,3). ИМ Ki-67 при Gl степени атипии составил 3,45±1,0%, а при GII имел тенденцию к возрастанию до 6,0±1,2% (р=0,1). При Gill степени атипии ИМ Ki-67 увеличивался до 12,6±3,3% и был достоверно больше, чем при Gl (р=0,0008) и Gil (р=0,03). Количество ПМ составило при Gl - 15,9±6,1%, при G1I - 8,6±4,5% (р=0,4), при GUI - 29,75±7,0% (р=0,001) и при GIV- 53,25±8,25% (р=0,03).

При G1V степени атипии ИМ Ki-67 составил 18,3±4,9% и был выше, чем при G1 (р=0,00004) и GII (р=0,003). При GI число AgNORs составило 3,7±0,3, при GII возрастало до 6,7±1,4 (р=0,008), при GUI составило Н,3±2,1 (р=0,07) и при GIV - 14,4±1,4 (р=0,28). Выявлена тенденция к возрастанию числа AgNORs при увеличении степени анаплазии клеток опухоли и достоверное возрастание числа AgNORs при степени анаплазии GIV по сравнению с GI (р=0,0000001) и GII (р=0,0009). Таким образом, при возрастании степени анаплазии по Fuhrman отмечали увеличение показателей маркеров пролиферации и количества ПМ.

При анализе содержания ДНК в различных гистологических вариантах 1IKP наибольшее значение было отмечено при саркоматоидном варианте (9,3±0,2с), а наименьшее значение - при хромофобном раке (3,7±0,4с) (р=0,02). МИ имел наибольшее значение при саркоматоидном варианте (6,0± 1,1 %о), а наименьшее при хромофобном (0,9±0,2%о) (р=0,0005). Наибольшее число ПМ было выявлено в саркоматоидном раке (74,0±8,7%), следует отметить, что в нейроэндокринном раке ПМ обнаружено не было. ИМ Ki-67 был самым высоким при саркоматоидном раке (21,0±10,0%), наименьшим - при нейроэндокринном (1,3±0,3%) (р=0,1). Число AgNORs было наибольшим при саркоматоидном раке (22,2±0,2), а наименьшим -при нейроэндокринном (3,35±0,8) (р<0,05). Таким образом, показатели пролиферации были наиболее высокими при саркоматоидном варианте ПКР, а наименьшими-при хромофобном и нейроэндокринном вариантах.

Размеры опухолевого узла коррелировали с содержанием ДНК (г=0,57; р=0,0001), МИ (r=0,44; р=0,0001), ИМ Ki-67 (i=0,39; р=0,0001); ПМ(г=0,40; р=0,0001) и числом AgNORs (г=0,60; р=0,0001). При размере опухолевого узла < 7,0 см содержание ДНК равнялось 4,2с±0,2, а при размере > 7,0 см -достоверно возрастало до 5,9±0,3с (рЮ,000005). МИ при размере опухолевого узла < 7,0 см составил 1,6±0,2%о, а при размере > 7,0 см - 3,3±0,5%о (р=0,004). ПМ в клетках опухоли при размере < 7,0 см было 14,4±4,2%, а при размере > 7,0 см - 31,4±5,7% (р=0,02). ИМ Ki-67 при размере опухоли < 7 см был равен 5,2±0,5, а при размере > 7 см достоверно возрастал до 12,8±1,3 (р=0,0000001). Число AgNORs при размере опухолевого узла < 7,0 см равнялось 5,3±0,6, а при размере > 7,0 см - достоверно увеличивалось до 13,5±1,4 (р-0,0000001) (табл. 2).

Нами обнаружены взаимосвязи между наличием метастазов и ПА. С наличием метастазов были взаимосвязаны: содержание ДНК (г=0,46; р=0,0001), МИ (г=0,62; р=0,0001), ИМ Ki-67 (г-0,48; р-0,0001) и число AgNORs (г=0,68; р=0,0001). Среднее значение содержания ДНК в первичной опухоли у больных, имеющих регионарные и отдаленные метастазы, было статистически значимо выше (6,6±0,3с), чем среди пациентов, у которых метастазы обнаружены не были (3,9±0,1 с, р=0,0000001). У больных ПКР с метастазами МИ был равен 6,0±0,9%о, а у больных без метастазов - 1,7±0,2%о (р=0,0000001). Число ПМ у больных с метастазами составило 54,0±9,3%, а при отсутствии метастазов - 16,3±3,5% (р=0,0002). Среднее

Таблица 2. Пролиферативная активность опухолевых клеток в зависимости от размера опухолевого узла и наличия метастазов (М±т)

Маркеры ПА Размер опухоли < 7,0 см Размер опухоли > 7,0 см Метастазы отсутствуют Метастазы имеются

Содержание ДНК (с) 4,2±0,2* 5,9±0,3* 3,9±0,1* 6,6±0,3*

Митотический индекс (96о) 1,6±0,2* 3,3±0,5* 1,7±0,2* 6,0±0,9*

Патологические митозы (%) 14,4±4,2* 31,4±5,7* 16,3±3,5 54,0±9,3

Экспрессия Кь67 (%) 5,2±0,5* 12,8±1,3* 6,6±1,2* 16,4±3,0*

Число АйЫСЖя (на 1 ядро) 5,1 ±0,4* 17,1±1,2* 5,1±0,4* 17,1±1,2*

Примечание: * р < 0,05.

значение ИМ Ki-67 у больных, имевших метастазы, составило 16,4±3,0%, в то время как среди пациентов без метастазов - 6,6±1,2% (р=0,0065). В опухолях больных без метастазов содержание AgNORs составило 5,1 ±0,4, а при наличии метастазов — 17,1±1,2 (р=0,0000001)(см. табл. 2). Изученные маркеры пролиферации могут быть использованы при прогнозировании возникновения метастазов у больных ГТКР.

Экспрессия белков-регуляторов апоптоза (Вс1-2 и р53). Вне зависимости от пола, возраста, гистологического варианта ПКР, размера опухолевого узла, стадии TNM, наличия метастазов ПКР разброс значений экспрессии онкопротеина Вс1-2 был от 0 до 4 баллов. Среднее значение индекса экспрессии Вс1-2 составило 1,7±0,2 баллов, максимальное значение - 3,4*0,1 балла, минимальное - 0,95±0,1 балла. Среди всех исследуемых больных вне зависимости от исследуемых параметров разброс показателей экспрессии р53 был от 1 до 79%.

Достоверных различий в экспрессии Вс1-2 в опухолевых клетках между мужчинами и женщинами не было. Наиболее высокие показатели маркера Вс1-2 наблюдали в возрастной группе больных от 70 до 75 лет (2,8±0,4), а самые низкие - в возрасте от 50 до 59 лет(1,45±0,3) (р<0,05). При исследовании характера экспрессии р53 в зависимости от возраста пациентов статистические различия были выявлены только в возрастной группе до 40 лет, р53-позитивпых случаев среди больных данной группы обнаружено не было.

Установлена взаимосвязь экспрессии Вс1-2 с клинической стадией (г=0,25; р=0,045). У пациентов с I клинической стадией заболевания среднее значение экспрессии Вс1-2 составило 2,0±0,2 баллов, у пациентов со II стадией - 2,1 ±0,2 балла, у пациентов с III стадией 1,2±0,4 балла и у больных с IV стадией - 1,2±0,3 балла. Таким образом, выявлено уменьшение экспрессии онкопротеина при стадиях GIII-GIV по сравнению со стадиями GI-GII (р < 0,05). При анализе экспрессии р53 в клетках ПКР в зависимости от клинической стадии опухолевого процесса отмечено преобладание доли (55,5%) пациентов с р53-позитивным статусом ПКР среди больных с III и IV стадиями опухолевого процесса по сравнению с I и II стадиями (44,5%).

Обнаружена коррелятивная взаимосвязь между экспрессией Вс1-2 и гистологическим типом ПКР (i=-0,31; р=0,01). Наименьшее среднее значение экспрессии Вс1-2 было обнаружено у больных при светлоклеточном раке (1,0±0,2 балла) и у больных при нейроэндокринном раке (1,5±0,6 баллов). Промежуточное положение занимали хромофобный (2,0±0,2 балла), веретеноклеточный (2,5±0,3 балла) и зернистоклеточный (2,7±0,3 баллов) раки, наибольшие показатели Вс1-2 были отмечены при папиллярной карциноме (3,1±0,3 балла). При исследовании экспрессии р53 в зависимости от гистологического типа ПКР были получены следующие результаты: при саркоматоидном варианте выявлено наибольшее количество пациентов с р53-позитивным статусом (100%), а при хромофобном варианте преобладал р53-негативный статус опухолей (62,6%).

При исследовании взаимосвязи экспрессии Вс1-2 при ПКР со степенью атипии опухоли по Fuhrman показано, что с увеличением степени ядерной атипии происходит уменьшение экспрессии Вс1-2: при GI экспрессия составила 2,1 ±0,3 балла, при GII - 2,1 ±0,4 баллов, при GIII - 1,4±0,6 балла, при GIV - 1,6±0,3 балла. Выявлена умеренная положительная взаимосвязь между экспрессией р53 и степенью анаплазии по Fuhiman (г=0.43; р=0,0001). Анализ экспрессии р53 в зависимости от степени ядерной атипии показал преобладание р53-негативного статуса среди пациентов с G1-GII степенями атипии (89,6%) и, наоборот, большое число пациентов с р53-позитивным статусом среди больных ПКР с GIII и GIV степенями (61,1 %).

Обнаружена сильная прямая коррелятивная взаимосвязь между экспрессией Вс1-2 и размером опухоли (г=0,60; р=0,0001). При исследовании экспрессии Вс1-2 в зависимости от величины опухолевого узла обнаружено, что при величине опухолевого узла < 7,0 см экспрессия маркера была 2,0±0,2 балла, а при увеличении размера > 7,0 см экспрессия маркера уменьшалась до 1,2±0,2 балла (р=0,1). При исследовании экспрессии р53 в зависимости от величины опухолевого узла обнаружено, что при величине опухолевого узла < 7,0 см у 45,5% пациентов был р53-позитивный статус и у 62,7% пациентов - р53-негативный статус, а при величине опухолевого узла > 7,0 см у 54,5% больных обнаруживали р53-позитивный статус и у 37,3% больных р53-негативный статус, т.е. при увеличении размеров опухоли возрастало число р53-позитивных случаев.

Выявлена отрицательная корреляция экспрессии Вс1-2 с наличием метастазов (г=-0,31; р=0,001). У больных, без регионарных и отдаленных метастазов экспрессия Bcl-2 составила 2,0±0,2 баллов, а у больных с наличием метастазов она достоверно снижалась до 0,9±0,2 баллов (р=0,007). Обнаружена умеренная прямая корреляция между экспрессией р53 и метастатическим пот енциалом опухоли (г=0,41; р=0,0001). Среди пациентов с метастазами р53-позитивный статус был обнаружен в 100% случаях, а у больных без метастазов р53-позитивный статус выявляли в 33,3% случаев. Снижение экспрессии Bcl-2 и наличие р53 позитивного статуса клеток ПКР является неблагоприятным фактором развития отдаленных метастазов.

Таким образом, в целом для ПКР характерны низкие показатели экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2. Экспрессия Вс1-2 была взаимосвязана с рядом важных прогностических клинико-морфологических факторов и поэтому может быть использована в качестве дополнительного фактора прогноза. Отсутствие экспрессии Вс1-2 в клетках опухоли можно рассматривать в качестве критерия вероятного возникновения метастазов опухоли. Экспрессия р53 является довольно частым явлением при ПКР. Выявлены взаимосвязи экспрессии маркера с наиболее важными прогностическими маркерами ПКР, что открывает возможность использования его в качестве дополнительного прогностического фактора. Суперэкспрессия р53 может служить маркером возникновения метастазов при ПКР.

Гистологическое строение и гистохимическая характеристика перитуморозной зоны ПКР. За перитуморозную зону (ПЗ) принимали зону, которая располагалась от края опухоли до неизмененной ткани почки. Ширина Г13 варьировала от 30,4 до 2906,8 мкм, в среднем составила 830,17±60,6 мкм, медиана - 670,62 мкм. При степени анаплазии опухоли GI ширина ПЗ составила 609,9±52,9 мкм, при степени анаплазии GII -698,8±85,8 мкм (р=0,4), при G1II - 1250,7±168,8 мкм (р=0,002) и при GIV - 1288,3*249,31 мкм (р=0,9). Поскольку различия данных между GI и GII, а также между GIII и GIV были не значимыми, то они были объединены в группы: 1 -ю группу составили опухоли при GI и GII с не широкими ПЗ, 2-ю группу составили опухоли при G1I1 и GIV с широкими ПЗ. Ширина ПЗ в 1-й группе составила 649,5*48,1 мкм, во 2-й группе - 1262,6*137,8 мкм (р=0,000001).

Результаты исследования показали, что особенности гистологического строения ПЗ при раке почки зависели, прежде всего, от степени дифференцировки и злокачественности опухоли. В опухолях GIII-GIV ПЗ характеризовалась более выраженным склерозом. Одной из особенностей ПЗ этих опухолей было наличие большого числа эластических волокон, что может быть причислено к защитным проявлениям организма, направленных на ограничение опухолевого роста.

Патоморфологические характеристики эпителия канальцев ПЗ. В ПЗ опухолей GI-GII элементы каиальцевого эпителия незначительно отличались от канальцев неизменного эпителия почки. Они были окружены тонкой ШИК-положительной базальной мембраной. Ядра клеток были округлой формы, небольшого размера. Средняя площадь ядра эптелио-цитов канальцев составила 37,9*2,0 мкм2. Число AgNORs - 2,25±0,22 на 1 ядро.

В ПЗ опухолей GIII-GIV отмечали атрофичпые элементы канальцевого аппарата почки. Канальцы были «замурованы» в плотной склерозиро-ванной соединительной ткани, клеточные элементы в канальцах феноти-пически напоминали раковые клетки. В участках атипичных канальцев нельзя было дифференцировать различные отделы нефрона. Канальцы были окружены резко ШИК-положительной базальной мембраной. При

Таблица 3. Количественная характеристика эпителиоцитов канальцев ПЗ в зависимости от степени анаплазии опухоли (М±т)

Параметры эпителия Степень анаплазии опухоли

01-СИ СШ-С1У

Площадь ядра (мкм2) 37,9±2,0* 54,2±5,3*

Количество А "N01^ 2,25±0,2* 5,15±0,35*

Содержание ДНК (с) 3,9±0,2* 5,5±0,2*

Экспрессия Вс1-2, баллы 0,6±0,1* 3,8±0,2*

р53 Негативное окрашивание (%) 9,1 0

Слабо позитивное окрашивание (%) 72,7 27,2

Умеренно позитивное окрашивание (%) 9,1 36,4

Сильно позитивное окрашивание (%) 9,1 36,4

Экспрессия Кь67 1,8±0,5* 3,5±0,9*

Примечание: * - р < 0,05.

окраске нитратом серебра по Гомори базальная мембрана выглядела утолщенной. В некоторых канальцах просвет отсутствовал. Клетки эпителия канальцев имели признаки атипизма: полиморфизм и гиперхромию ядра, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения. Средняя площадь клеточного ядра составила 54,2±5,3 мкм2. Число AgNORs в ядрах клеток достигало 5,15±0,35 на 1 ядро.

Содержание ДНК в клетках эпителия канальцев ПЗ опухолей при 01-ОИ было близко к тетраплоидному (табл. 3), что может свидетельствовать о гипертрофических процессах, происходящих в эпителии канальцев. При в! 11-С1V содержание ДНК возрастало до 5,5±0,2с, что может говорить о тяжелой дисплазии. Увеличение среднего содержания ДНК сопровождалось нарастанием гетерогенности клеток по данному показателю, явлениями анеу- и полиплоидии, появлением клонов, содержащих 6с и 7с ДНК, что свидетельствует о нарастающей генетической нестабильности эпителия.

ИМ К1-67 в эпителии канальцев ПЗ опухолей вЮП варьировал от 0 до 3% и в среднем составил 1,8±0,5, а в ПЗ опухолей ОШ-СП V возрастал до 3,5±0,9 (р<0,05), пределы колебаний составили от 0 до 8%. В ПЗ опухолей степени анаплазии 01-011 в 9,1% случаев отмечался р53-негативный статус, в 72,7% - слабо позитивный, в 9,1% - умеренно позитивный и в 9,1% - сильно позитивный. В ПЗ опухолей степени анаплазии 0111-0IV негативной реакции р53 отмечено не было, слабо позитивное окрашивание отмечали в 27,2% случаев, умеренно позитивное - в 36,4% и сильно позитивное - в 36,4% случаев. Экспрессия Вс1-2 в ПЗ опухолей степени анаплазии бЮП составила 0,6±0,1 балла, а в ПЗ опухолей ОНТ-СТУ экспрессия возрастала до 3,8±0,2 балла (р<0,05) (см. табл. 3).

Результаты проведенного исследования показали, что в ПЗ ПКР возникают явления ренальной интраэпителиальной неоплазии, тяжесть которой зависит, прежде всего, от биомолекулярных и клинико-морфологических

особенностей опухоли. В ПЗ опухолей высокой степени злокачественности (СШ-С1У) по сравнению с опухолями низкой степени злокачественности (вГ-вН) в эпителии канальцев выявлены более высокие уровни экспрессии Кл-67, р53 и Вс1-2.

Патоморфологическая характеристика клеток фибробластиче-ского ряда. В ПЗ опухолей ОГ-СШ ядра клеток фибробластического ряда имели небольшие размеры и волнообразную форму. Количество клеток фибробластического ряда составило 77,3±3,0 в 5 полях зрения при х400. Они содержали преимущественно одно ядрышко кольцевидного типа. Среднее число ядрышек на 1 ядро составило 1,1 ±0,05. Площадь ядра составила 17,9±0,6 мкм2, количество ДНК - 2,9±0,1с, число А§ЫОЯз -1,3±0,1 на 1 ядро. Такие клетки нами были отнесены к зрелым неактивным фиброцитам.

В ПЗ опухолей СШ-СПУ количество клеток фибробластического ряда составило 109,2±4,9 в 5 полях зрения. Клетки фибробластического ряда ПЗ опухолей СШ-вГУ имели крупные, удлиненные овальные ядра. Ядра содержали 1 -2 ядрышка, в среднем 1,6±0,2 на 1 ядро, при этом отмечали многообразие морфологических типов ядрышек. Встречались ядрышки кольцевидного, нуклеолонемного типов и переходные между ними формы. Площадь ядра составила 37,9±1,3 мкм2, количество ДНК - 5,0±0,2с и число AgNORs - 4,8±0,4 на 1 ядро. Данные клетки можно отнести к активно синтезирующим и пролиферирующим фибробластам (табл. 4).

Воспалительный инфильтрат ПЗ. Без учета степени злокачественности опухоли количество КВИ в ПЗ составило 52,4± 1,65 в 5 полях зрения при х400. Количество КВИ умеренно коррелировало со степенью анапла-зии опухоли (г=0,57; р=0,0001); шириной ПЗ (г=0,53; р0,0001); ИМ Ю-67 в опухоли (г=0,44; р=0,001); количеством клеток интратуморозного воспалительного инфильтрата (г=0,38; р=0,001) и наличием метастазов (1-0,42; р=0,001). В ПЗ опухолей СН-вП количество КВИ составило 41,35± 1,6, а в опухолях ОШ-ОГУ достоверно возрастало до 80,3±3,4 (р=0,0000001). В ПЗ опухолей ОШ-С1У отмечали фолликулоподобные структуры, в некоторых из них обнаруживались светлые герминативные центры размножения. В ПЗ опухолей ОШ-С1У по сравнению с опухолями 01-СП достоверно возрастали количество КВИ, показатели площади, содержание ДНК, число ядрышек и количества AgNORs в них (см. табл. 4).

При степенях злокачественности 0Ш-01У число триплоидных клеток инфильтрата возрастало до 47,7%, а тетраплоидных до 10% по сравнению с опухолями С1-ОП.

При изучении клеточного состава воспалительного инфильтрата ПЗ рака почки показано, что в ПЗ опухолей СПЮГУ возрастало число плазматических клеток, лимфоцитов и нейтрофилов.

Таким образом, в ПЗ опухолей степени анаплазии 0Ш-01У выявлено возрастание как количественных, так и качественных характеристик клеток воспалительного инфильтрата по сравнению с ПЗ опухолей 01-011. При

Таблица 4. Количественные характеристики клеток воспалительного инфильтрата и фибробластов в перитуморозной зоне в зависимости от степени анаплазии опухоли (М±т)

Параметры Клетки инфильтрата Фибробласты

Степень анаплазии опухоли Степень анаплазии опухоли

01-011 СШ-01У о-вп СШ-С1У

Количество в поле зрения 41,35±1,6* 80,3±3* 77,3±3,0* 109,2±4,9*

Содержание ДНК (с) 2,4±0,04* 2,9±0,05* 2,9±0,1 * 5,0±0,2*

Площадь ядра (мкм2) 9,0±0,1* 11,7±0,2* 17,9±0,6* 37,9±1,3*

Число АйЫО!^ на 1 ядро 1,2±0,1* 2,4±0,2* 1,3±0,1* 4,8-10,4*

Число ядрышек на 1 ядро 1,1±0,1 1,2±0,1 1,1±0,05* 1,6±0,2*

Примечание: - * р < 0,05.

изучении клеточного состава воспалительного инфильтрата ПЗ опухолей степеней анаплазии ОНЮГУ выявлено возрастание числа плазматических клеток, нейтрофилов и бластных форм лимфоцитов, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета.

Морфологическая и гистохимическая характеристика тучных клеток ПКР. Исследованы морфологические и гистохимические особенности ТК в центре опухоли, в ПЗ и в неизмененной ткани почки, взятой из участков, максимально отдаленных от опухоли.

Количество ТК в неизмененной ткани почки составило 2,3±0,6, площадь - 56,4±3,7 мкм2 (табл. 5). ТК имели округлую или вытянутую форму, большинство клеток имело компактное расположение гранул в цитоплазме (73,9%), дегранулирующих клеток было 26,1%.

В центре опухоли количество ТК составило 6,7±1,6, площадь равнялась 71,3±4,5 мкм2 (см. табл. 5). ТК имели округлую или овальную, реже отросчатую форму, значительное количество клеток имело компактное расположение гранул (93,6%), число дегранулирующих ТК составило 6,4%. При окраске толуидиновым синим большинство ТК имели умеренно выраженную метахромазию, также отмечались светлые клетки, рыхло заполненными гранулами, с невыраженной метахромазией.

В ПЗ количество ТК составило 6,7±1,6, площадь была равна 71,3±4,5 мкм2 (см. табл. 5). Преобладали ТК, имеющие отросчатое строение. В состоянии дегрануляции находилось 55,8% клеток, имеющих компактное расположение гранул в цитоплазме было 44,2%. При окраске толуидиновым синим ТК выглядели темно-красными, с интенсивными метахромати-ческими гранулами. ТК располагались преимущественно вокруг сосудов микроциркуляции. Количество ТК в ПЗ ПКР и количество Г1МЦР в ПЗ были взаимосвязаны между собой (г=0,33; р=0,05). Когда число ТК в ПЗ было < 3 в 20 полях зрения, количество ПМЦР в ПЗ составило 7,1±0,9, а когда число ТК было > 3, количество ПМЦР составило - 8,7±0,9 (р=0,01). Число А§ЫОИ8 в эндотелии сосудов ПЗ было взаимосвязано с плотностью

Таблица 5. Параметры тучных клеток в неизмененной ткани почки, нери-туморозной зоне и центре опухоли

Ткань почки Количество в поле зрения Площадь тучных клеток (мкм2)

Неизмененная ткань почки 2,3*0,6* 56,4±3,7*

Перитуморозная зона 6,7*1,6* 71,3*4,5*

Центр опухоли 2,2*0,7* 45,3*4,3*

Примечание: * р < 0,05.

ТК в ПЗ (г=0,56). При числе гранул в эндотелии сосудов ПЗ < 1,5

число ТК в ПЗ было равно 5,5* 1,4, а при их содержании > 1,5 возрастало до 7,2*2,3 (р=0,001). Число ТК в ПЗ было взаимосвязано со степенью анаплазии опухоли (г=0,43; р=0,02). В опухолях вЮП количество ТК в ПЗ составил 10,2*2,4, а при СгШ-01У оно возрастало до 18,3*3,1 (р=0,05).

Обнаружена взаимосвязь между количеством ТК в ПЗ и наличием метастазов (г=0,52; р=0,04). В неметастазирующих опухолях число ТК в ПЗ составило 2,8*0,6, а при наличии метастазов - 6,4*1,7 (р=0,000001). При этом в ПЗ метастазирующих опухолей наблюдали увеличение дегра-нулирующих ТК до 54,9% по сравнению с неметастазирующими (47,4%). В ПЗ шириной < 700 мкм количество ТК составило 4,5*2,14, а в Г13 > 700 мкм, число ТК возрастало до 6,5*1,45 (р=0,01).

Таким образом, выявленные взаимосвязи указывают на значение ТК ПЗ ПКР для апгиогенеза, прогрессии опухолевого процесса и метаста-зирования.

Неоангиогенез перитуморозной зоны рака почки. В целом, без учета степени злокачественности опухоли количество сосудов МЦР в ПЗ составило 18,1*0,5 в 5 полях зрения прих400, СПлСбыла равна 964,5*31,4 мкм2 . Для 113 опухолей степени анаплазии С1-СН были характерны сосуды, имеющие строение капилляров, а для 0Ш-01У - сосуды лакунарного типа, образованные одним слоем эндотелиоподобных клеток.

СПлС в ПЗ была взаимосвязана с такими параметрами, как степень анаплазии опухоли по РиЬппап (г=0,32; р=0,003), ширина ПЗ (г=0,47; р=0,0()01); размер опухолевого узла(г=0,32; р-0,0004), количество КВИ в опухоли (г=0,52; р=0,0004) и наличие или отсутствие регионарных и отдаленных метастазов (г=0,32; р=0,0001).

При изучении параметров неоангиогенеза в зависимости от ширины ПЗ показано, что при ширине ПЗ < 700 мкм количество сосудов МЦР составило 22,7*0,9 сосуда в 5 полях зрения, а при ширине ПЗ > 700 мкм -13,15*0,6. СПлС при ширине Г13 < 700 мкм составила 702,05*31,5 мкм2, при ширине ПЗ > 700 мкм - 1146,3*44,2 мкм2. В более широких ПЗ отмечалось уменьшение количества сосудов, по в то же время возрастала СПлС. В эндотелии сосудов ПЗ шириной < 700 мкм число AgNORs составило 2,1*0,3, в ПЗ > 700 мкм - 3,6*0,4 (р=0,005) (табл. 6).

Таблица б. Количественная характеристика сосудов микроциркуляторного русла в зависимости от степени анаплазии опухоли и ширины ПЗ

Параметр Количество ПМЦР СПлС (мкм2) Число AgNORs в эндотелии

Степень анаплазии опухоли: 01-П СИМУ 20,5±0,7* 13,15±0,6* 839,4±31,6* 1233,9±66,2* 2,2±0,1* 4,4±0,2*

Ширина ПЗ: < 700 мкм > 700 мкм 22,7±0,9* 14,6±0,6* 702,05±31,5* 1146,3±44,2* 2,1 ±0,3 3,6±0,4

Примечание: * - р < 0,05.

В ПЗ опухолей 01-11 количество ПМЦР составило 20,5±0,7 в 5 полях зрения, а в опухолях в!И-IV достоверно уменьшалось до 13,15±0,6 (р=0,0000001). В ПЗ опухолей С1-П СПлС составила 839,4±31,6 мкм2, а в ПЗ опухолей вШ-ГУ^ СПлС достоверно возрастала до 1233,9±66,2 мкм2 (р=0,0000001). В эндотелии сосудов ПЗ опухолей 01-11 число А£МО!18 составило 2,2±0,09, а в опухолях ОШ-1V оно было достоверно выше (4,4±0,2) (р=0,0000001) (см. табл. 6).

В ПЗ опухолей без метастазов количество ПМЦР составило 19,3±0,6 в 5 полях зрения, а с наличием метастазов - возросло до 12,5±0,7 (р=0,0000001). СПлС при отсутствии метастазов составила 886,2±30,1 мкм2, а с наличием метастазов - 1314,2±97,4 мкм2 (р=0,0000001). Такие изменения количественных характеристик сосудов могут способствовать, с одной стороны, улучшению кровоснабжения опухоли, а с другой - возникновению метастазов. В эндотелии сосудов ПЗ опухолей без метастазов число А§ЖЖз составило 2,3±0,1, а в опухолях с метастазами - 5,3±0,2 (р-0,0000001).

Однофакторный и многофакторный прогностический анализ выживаемости больных

Проведен многофакторный анализ традиционных прогностических факторов и молекулярно-биологических маркеров опухоли (миготическая активность, плоидность, экспрессия Кл-67, р53, Вс1-2, СОЗ1 и активность AgNORs) и характеристик ПЗ (таких как ширина, выраженность склероза, интенсивность воспалительного инфильтрата и ангиогенез 113).

Клииико-морфологические факторы и послеоперационная выживаемость больных. 1-годичная выживаемость при Г1КР независимо от различных параметров составила 93,3± 1,6. В дальнейшем происходило ежегодичное снижение выживаемости, и к моменту 3-летнего контроля выживаемость составила 87,3±3,81%. Общая 5-летняя выживаемость при ПКР не превысила 81,2±7,8% (табл. 7).

Таблица 7. Общая 5-летняя выживаемость больных раком почки (прямой способ)

Показатель Скорректи] рованная выживаемость

1 2 3 4 5

Абс. число 225 из 241 162 из 176 76 из 87 41 из 50 26 из 32

% 93,3±1,6 92,0±2,13 87,3±3,81 82,016,0 81,2±7,8

Первично-множественные опухоли (ПМО) и прогноз. При исследовании 5-летней выживаемости по методу Каплан-Мейера графическое отражение анализа показало: при наличии ПМО к 1800-му дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,58; при отсутствии ПМО кумулятивная доля выживших не превышала 0,86. При сравнении данных выживаемости с помощью логарифмического рангового критерия установлено, что различия недостоверны (log-rank, р=0,6).

Гистоархитектоника опухоли и прогноз. При исследовании 5-летней выживаемости по методу Каплан-Мейера графическое отражение анализа показало: при смешанной гистологической архитектонике к 1800-му дню после операции кумулятивная доля выживших составила 1,0, при компактной архитектонике кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,60, различия данных достоверны (log-rank, р=0,004) (рис. 1).

Степень анаплазии опухоли по Fuhrman и прогноз. При степени анаплазии GI к 1800-му дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,96, при степени GII - 0,88, при GUI - 0,83 и при G1V - 0,30. Сравнительная оценка выживаемости не выявила статистически значимых различий у больных с опухолями GI и GII (log-rank, р=0,5). Выживаемость больных со степенью атипии GI была достоверно выше, чем с GUI (log-rank, р-=0,02) и с GIV (log-rank, p^OjOOOOOl). Аналогичные результаты получены при сравнении выживаемости групп с GII и GUI (log-rank, р-0,03).

Интенсивность воспалительного инфильтрата в ПЗ и прогноз. Графическое отражение анализа выживаемости показало: при количестве КВИ в ПЗ < 42 кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,89, при количестве КВИ в ПЗ > 42 кумулятивная доля выживших к 1800-му дню составила 0,60. При сравнительном анализе с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия между кривыми выживаемости в группах исследования достоверны (log-rank; р-0,00003) (рис. 2).

Размер опухолевого узла и прогноз. При размере опухолевого узла < 7 см кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,89, при размере > 7 см этот показатель уменьшался до 0,50, различия между кривыми выживаемости в данных группах исследования достоверны (log-rank; р-0,005).

Стадия TNM и прогноз. При стадии опухолевого процесса 1 -2 кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила

X о.; ш

S

ts

г

>N

* О,

log rang р = 0,004

Компактная

0 200 400 600 600 1000 1200 1400 1600 1000

Время (дни)

Рис. 1. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости больных 1ГКР в зависимости от архитектоники опухолей.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Время (дни)

Рис. 2. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости у больных ПКР в зависимости от количества клеток воспалительного инфильтрата в перитуморозной зоне.

0,88, при стадии опухолевого процесса 3-4 кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,59, различия между кривыми выживаемости в данных группах исследования достоверны (log-rank, р=0,05).

Интенсивность воспалительного инфильтрата в опухоли и прогноз. При количестве КВИ в опухоли < 14 (в 5 полях зрения при хЮОО) кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,87, при количестве КВИ в опухоли > 14 кумулятивная доля выживших составила 0,74, различия кривых выживаемости в группах исследования были недостоверны (log-rank; р^0,3).

Выраженность склероза 113 и прогноз. При умеренно выраженном склерозе ПЗ кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,99, при выраженном склерозе ПЗ кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,30, различия данных достоверны (log-rank; р=0,000001) (рис.3).

X

5 1.0

3

ш 0.9

X

*

л 0,8

ш

к S 0.7

о

ч 0.6

¡5

I ш 0,5

1 о; 0.4

Ц

>, 0.3

2

>.

0.2

Не выраженный склероз ШЗ

и.

Log rank р = 0,000001

; Выраженный склероз ГТ t

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Время (Дни)

Рис. 3. Кумулятивная пропорция 5-летнсй выживаемости у больных ИКР в зависимости от выраженности склероза в перитуморозной зоне.

Количество сосудов МЦР в опухоли и прогноз. При количестве ПМЦР в опухоли < 25 кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,81, при количестве >25 сосудов кумулятивная доля выживших составила 0,70; различия между кривыми выживаемости в группах исследования оказались недостоверными (log-rank; р=0,2), что не позволило рассматривать данный фактор как прогностический критерий 5-летней выживаемости у больных ГТКР.

Ширина ТТЗ опухоли. При ширине Г13 < 700 мкм кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,99, при ширине ИЗ > 700 мкм кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,32, различия данных достоверны (log-rank, р=0,00001) (рис. 4), что позволяет отнести данный показатель прогностическим критерием 5-летней выживаемости у больных Г1КР.

СПлС ПЗ и прогноз. При СПлС в Г13 < 650 мкм2 кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 1,0, при СПлС в 113 > 650 мкм2 кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,60. При сравнительном анализе с помощью логарифмического рангового критерия показано, что различия между кривыми выживаемости в группах исследования достоверны (log-rank; р=0,002) (рис. 5).

Наличие метастазов и прогноз. При отсутствии метастазов к 1800-му дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,98, при наличии метастазов кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,34, различия между кривыми выживаемости в данных группах исследования достоверны (log-rank, р=0,000001).

Содержание ДНК в клетках опухоли и прогноз. При содержании ДНК < 4с кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,98, при содержании ДНК > 4с кумулятивная доля выживших составила 0,51; различия данных достоверны (log-rank, р=0,00009), что

д- 0,9 П.

С 0.8

0 к

М 0,7

к и

s i о,®

5 со 0,6 о:

1

2

i 0.3

ПЗ < 700 мкм

\ log rank р =0,00001

13 > 700 мкм

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Время (Дни)

Рис. 4. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости у больных ПКР в зависимости от ширины ПЗ.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Время (дни)

Рис. 5. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости у больных ПКР в зависимости от СПлС перитуморозной зоны.

позволяет отнести данный показатель прогностическим критерием 5-летней выживаемости у больных ПКР.

Гистологический тип н прогноз. При свеглоклеточном раке ночки к 1800-му дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,89, при гранулярно-клеточном - 0,60, при папиллярном - 0,92, при хромофобном раке - 0,1, при нейроэндокринном - 1,0, при мультилоку-лярной кистозной форме - 1,0. В то же время из пациентов, страдавших саркоматоидным раком, до 1800-го дня не дожил ни один.

Сопоставление выживаемости больных в зависимости от гистологического варианта 1IKP с использованием логарифмического рангового критерия показало, что различия показателей выживаемости между больными со светлоклеточным, папиллярным, гранулярно-клеточным вариантами ПКР, мультилокулярной кистозной формой СРП не были статистически значимыми (log-rank, р=0,07 - 0,3). Выживаемость больных с саркоматоидным

X

<5 AgNORs

long - rang p = 0,0002

>5 AgNORs

с

2 0.4 £

0,3

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Дни

Рис. 6. Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости больных ПКР в зависимости от числа AgNORs в клетках опухоли.

ПКР была значимо ниже, чем у пациентов со светлоклеточным (log-rank, р=0,00007), папиллярным (log-rank, р=0,007), гранулярно-клеточным (log-rank, р=0,003), хромофобным (log-rank, р=0,002), нейроэндокринным (log-rank, р=0,02) вариантами и мультилокулярной кистозной формой СРП (log-rank, р=0,02). Таким образом, гистологический тип опухоли явился прогностическим критерием 5-летней выживаемости у больных ПКР.

Число AgNORs в опухоли и прогноз. При числе AgNORs на I ядро < 5 AgNORs кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,98, при числе AgNORs на 1 ядро > 5 AgNORs кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,43; различия данных достоверны (log-rank, р=0,0002) (рис. 6), что позволило отнести число AgNORs к прогностическим критериям 5-летней выживаемости у больных Г1КР.

Митотический индекс опухолевых клеток н прогноз. При МИ <3%о кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,98, при МИ > 3%о кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,49; различия между исследованными группами достоверны (log-rank, р=0,000001), что позволило отнести данный показатель к прогностическим критериям 5-летней выживаемости у больных ПКР.

ИМ Ki-67 и прогноз. При ИМ Ki-67 в клетках опухоли < 5,0% кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,95, при ИМ Ki-67 > 5,0% кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,42, получены достоверные, статистически значимые различия (log-rank, р=0,00003). Экспрессию Ki-67 в опухолевых клетках можно отнести прогностическим критериям 5-летней выживаемости у больных ПКР

р53 статус опухоли и прогноз. При ИМ р53 < 5% кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,95, при ИМ р53 > 5% кумулятивная доля выживших уменьшалась до 0,40; различия данных достоверны (log-rank, р=0,00001). Таким образом, гипсрэкспрессия р53

в опухолевых клетках явилась прогностическим критерием 5-летней выживаемости у больных ПКР.

Экспрессия Вс1-2 и прогноз. При ИМ Bcl-2 в опухоли в 3-4 балла кумулятивная доля выживших к 1800-му дню после операции составила 0,80, при ИМ Вс1-2 в 1-2 балла кумулятивная доля выживших составила 0,55, однако различия между группами недостоверны (log-rank, р = 0,1), что не позволило отнести данный фактор к прогностическим критериям 5-летней выживаемости у больных ПКР

Однофакторный прогностический анализ выживаемости больных. Следующим этапом исследования прогноза ПКР было проведение однофакторного регрессионного анализа по Коксу. В однофакторный регрессионный анализ по Коксу нами были включены клинико-морфоло-гические, биомолекулярные и морфометрические параметры, среди которых 4 параметра характеризовали Г13 новообразований. Однофакторный регрессионный анализ показал, что большинство исследованных нами факторов (13 факторов) являются прогностически значимыми (р=0,01 -0,000001) при оценке послеоперационного выживания больных. В то же время такие параметры, как стадия заболевания по TNM, гистологический вариант и гистоархитекгоника опухоли, количество КВИ в опухоли, количество микроциркуляторных сосудов в опухоли, наличие ПМО и экспрессия Вс1-2, оказались незначимыми (р=0,06 - 0,3).

Многофакторный прогностический анализ выживаемости больных. В многофакторный регрессионный анализ по Коксу нами были включены параметры, которые отвечали требованию достоверности р<0,1. Поэтому из многофакторного анализа были исключены гистологический вариант опухоли (р=0,3), количество КВИ опухоли (р=0,1) и количество Г1МЦР в опухоли (р=0,2). Для более точного рассмотрения значимости маркеров сначала нами был проведен анааиз значимости для нашего исследования традиционных прогностических факторов, поэтому исследованные молекулярно-биологические параметры (факторы пролиферации, апопгоза, митотической активности, ангиогенеза опухоли) и параметры, характеризующие ПЗ, были исключены из прогностического анализа.

Полученные данные показали, что значение %2-кваДРат ДЛ" данной модели многофакторного регрессионного прогностического анализа выживаемости больных оказалось высоко значимо (у2 =57,9; df=6; р=0,000001), что указывает на наличие значимых прогностических параметров. При проведении многофакторного анализа без учета молекулярно-биологиче-ских параметров и характеристик ПЗ были выявлены следующие независимые прогностические факторы: наличие регионарных и отдаленных метастазов (р=0,0000001) и степень анаплазии по Furhman (р=0,02).

Следующим этапом исследования было введение в прогностический многофакторный регрессионный анализ по Коксу молекулярно-биологи-ческих параметров (митотический индекс опухолевых клеток, содержание ДНК, экспрессия Bcl-2, Ki-67, р53 и активность AgNORs в опухолевых

клетках) и морфологических параметров перитуморозной зоны (выраженность склероза ПЗ, СПлС ПЗ, количество КВИ и ширина ПЗ).

Результаты проведенного прогностического многофакторного регрессионного анализа выживаемости больных с введением в модель молеку-лярно-биологических параметров опухоли и ПЗ показало, что значение у2 оказалось более высоким, чем для предыдущей модели (х,2=88,0; сИ=16; р=0,00001), что указывает на то, что прогностически значимых параметров стало больше. При включении в прогностическую модель биомолекулярных маркеров (митотический индекс опухолевых клеток, содержание ДНК, экспрессия Вс1-2, Кь67, р53 опухолевых клеток, число AgNORs) и морфологических параметров перитуморозной зоны (выраженность склероза, СПлС, количество КВИ и ширина ПЗ) показано, что независимыми факторами прогноза явились (в порядке убывания значимости признака): наличие метастазов (р=0,002); количество КВИ в ПЗ (р-0,002), ширина ПЗ (р=0,003); размер опухоли (р=0,006); СПлС Г13 (р=0,01); митотиче-ская активность клеток опухоли (р=0,02); степень анаплазии по РиИгтап (р=0,02); экспрессия Ю-67 (р=0,02), содержание ДНК (р=0,03), экспрессия Вс1-2 (р=0,04) и количество AgNORs в опухолевых клетках (р=0,04).

Таким образом, при введении в многофакторпый анализ выживаемости больных молекулярно-биологических параметров (митотический индекс, содержание ДНК, экспрессия Вс1-2, Кь67, р53 опухолевых клеток, число AgNORs) и параметров, характеризующих перитуморозную зону (выраженность склероза ПЗ, СПлС ПЗ, количество КВИ и ширина ПЗ), многие из данных параметров оказались прогностически значимыми. При этом количество КВИ в Г13 оказалось по значимости на втором месте после такого важнейшего параметра ПКР, как наличие метастазов. Ширина ПЗ оказалась на третьем месте по значимости. СПлС в ПЗ оказалась более значимым фактором, чем такой важный фактор, как степень анаплазии опухолевых клеток по РиЬлпап. Также значимыми были митотическая активность, экспрессия К1-67, Вс1-2 и количество AgNORs в опухолевых клетках. Поэтому исследованные нами молекулярно-биологические параметры опухоли и ПЗ могут вводиться в прогностические модели наравне с традиционными факторами прогноза ПКР.

ВЫВОДЫ

1. По данным клинико-морфологического анализа, опухолевый процесс в равной степени поражает как левую (49,4% случаев), так и правую (50,6% случаев) почку. Рак почки практически с одинаковой частотой встречается как у женщин (53%), так и у мужчин (47%), преобладали лица трудоспособного возраста. Наиболее часто опухоль располагается в одном из полюсов почки (48,1 % случаев) и в средней трети почки (46,5% случаев). Гистоархитектоника опухолей в большинстве случаев характеризуется как компактная (47,7%), опухоли смешанного строения встречаются реже

(12,9% случаев). Метастазы в отдаленные и регионарные лимфатические узлы отмечаются в 13,3% случаев. В общей структуре ПКР преобладают I - II клинические стадии (68,4% случаев), небольшой размер опухолей (70,9%), светлоклеточный вариант новообразований (67,2%) и низкая степень злокачественности (Gl - И) (73% случаев).

2. Пролиферативная активность опухолевых клеток, содержание ДНК в ядрах, число ядрышковых организаторов (AgNORs) значительно различаются при разных гистологических вариантах ПКР: наибольшие значения данных показателей отмечаются при саркоматоидном варианте, наименьшие значения - при хромофобном и нейроэндокринном вариантах. Самые высокие показатели, характеризующие пролиферативную и репликативную активность опухолевых клеток (количество ДНК, митоти-ческий индекс, число AgNORs), выявляются у больных в возрасте 50-59, а наименьшие - в группе больных в возрасте 30 - 39 лет.

3. Пролиферативная активность (по оценке митотического индекса, экспрессии Ki-67, количеству ДНК, числу AgNORs) опухолевых клеток положительно коррелирует с размерами опухолевого узла (возрастает в опухолях > 7 см, г = 0,44 - 0,61, р = 0,0001), клинической стадией патологического процесса (возрастает в III - IV стадиях, г = 0,49 - 0,69, р = 0,0001), степенью злокачественности опухолевых клеток по Fuhrman (наиболее увеличена при GUI - IV, г=0,61 - 0,77, р=0,0001), наличием регионарных и отдаленных метастазов (увеличение при наличии метастазов, г=0,46 -0,68, р=0,0001).

4. Ширина перитуморозной зоны в опухолях GUI - IV в 1,9 раза (р=0,0001) превышает таковую в опухолях Gl—II. Особенности строения соединительной ткани перитуморозной зоны рака почки определяются степенью дифференцировки и злокачественности опухоли: при GI-II эпителий канальцев практически не изменен, с низкой пролиферативной активностью, фиброз слабо выражен, преобладают нейтральные гликоза-миногликаны, при GUI - IV проявляются полиморфизм, дисплазия, ансу- и полиплоидия эпителиоцитов канальцев, усиливается их пролиферативная активность (в 2 раза), возрастает количество коллагеновых, эластических волокон и кислых гликозаминогликанов. В перитуморозной зоне опухолей при GUI—IV возрастает морфофункциональная активность фибробластов (увеличиваются количество фибробластов в поле зрения, площадь ядер и содержание ДНК, число AgNORs на 1 ядро) по сравнению с опухолями Gl—II.

5. В опухолях почки количество профилей сосудов микроциркуля-торного русла выше (29,9±1,0), чем в перитуморозной зоне (18,1 ±0,5). Светлоклеточный вариант IIKP характеризуется наиболее высоким значением данного показателя (36,4±1,3). Количество профилей сосудов микроциркуляторного русла в опухоли слабо коррелирует со степенью злокачественности опухоли (г=0,36; р=0,01), уменьшается в опухолях высокой степени злокачественности, при этом суммарная площадь сечения сосудов возрастает. Для перитуморозной зоны наиболее значимым

показателем является суммарная площадь сечения сосудов, увеличение этого показателя > 650 мкм2 является неблагоприятным прогностическим критерием при почечно-клеточном раке.

6. Для перитуморозной зоны опухолей ОЮП характерны микро-циркуляторные сосуды, имеющие в основном строение капилляров, а для опухолей ОИЮГУ - сосуды лакунарного типа (образованные одним слоем эндотелиоподобных клеток), средняя площадь которых увеличена в 1,5 раза. В перитуморозной зоне опухолей с наличием метастазов средняя площадь сосудов также в 1,5 раза больше, чем в опухолях без метастазов. Особенности гистологического строения сосудов в перитуморозной зоне при 0Ш-01У способствуют усилению метастазирования.

7. Количество клеток воспалительного инфильтрата в перитуморозной зоне достоверно выше (52,4±1,6), чем в опухоли (19,4±0,7)(р = 0,01). Количество клеток воспалительного инфильтрата в опухоли и перитуморозной зоне возрастает но мере увеличения степени злокачественности опухоли (1-0,57; р=0,0001), ширины перитуморозной зоны (г=0,53; р=0,0001), экспрессии Ю-67 (г=0,44; р=0,001); наличия регионарных и отдаленных метастазов (г=0,42; р=0,001). В перитуморозной зоне это увеличение более выражено. В воспалительном инфильтрате ПЗ опухолей СП 1-0IV возрастает количество плазматических клеток, нейтрофилов и бластных форм лимфоцитов, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета.

8. Высокие уровни экспрессии Ю-67, р53 и Ьс1-2 в губулярном эпителии перитуморозной зоны опухолей с высокой степенью злокачественности, а также увеличение количества ДНК в опухолевых клетках, площади их ядер, числа ядрышковых организаторов свидетельствуют о дисбалансе процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза. В опухолях с высокой степенью злокачественности развиваются явления тяжелой ренальной интраэпителиальной неоплазии, что можно расценивать как неблагоприятный прогностический критерий, свидетельствующий об активности опухолевого процесса и высоком риске рецидивирования и метастазирования опухоли.

9. Наиболее высокий уровень экспрессии Вс1-2 характерен для папиллярной карциномы почки (3,1 ±0,3 балла). При саркоматоидном варианте ПКР р53-позитивный статус регистрируется в 100% случаев, при хромо-фобном варианте преобладает р53-негативный статус опухолей (в 62,6% случаев). Высокая экспрессия р53 и отрицательный Ьс1-2 статус коррелируют с высоким метастатическим потенциалом ПКР. Гиперэкспрессия ингибитора апоптоза Ьс1-2 в опухолевых клетках служит дополнительным молекулярно-биологическим критерием в дифференциальной диагностике папиллярного рака.

10. По данным однофакторного регрессионного анализа, к основным параметрам, которые определяют неблагоприятный прогноз 5-летней выживаемости, относятся: ширина ПЗ > 700 мкм (х2=34,1; р=0,000001); выраженный склероз ПЗ (%2=29,6; р=0,00001); количество клеток воспа-

лительного инфильтрата в ПЗ > 42 клеток (%2=26,9; р=0,000001); средняя площадь сечения сосудов в ПЗ > 650 мкм2 (%2= 28,3; р=0,000001); степень анаплазии опухолевых клеток по РиЬгтап ОПЮГУ (%2=15,5; р=0,003); наибольший размер опухоли > 7 см (^2=10,2; р=0,005); наличие регионарных и дистантных метастазов (%!-] 0,2; р= 0,0000001); количество ДНК в клетках опухоли > 4с (х2=21,2; р=0,002); количество AgNORs в клетках опухоли > 5 (у2=\8,1; р=0,0002); экспрессия Кь67 в клетках опухоли > 5% (х2 = 15; р = 0,0001) и экспрессия р53 в клетках опухоли >5% (х2=16,7; р = 0,0004).

11. По данным многофакторного регрессионного анализа, с включением в прогностическую модель молекулярно-биологических характеристик опухолевых клеток и морфологических параметров перитуморозной зоны, установлено, что к наиболее значимым факторами прогноза относятся (в порядке убывания): наличие метастазов (р=0,002); количество клеток воспалительного инфильтрата в перитуморозной зоне (р=0,002); ширина перитуморозной зоны (р=0,003); размер опухоли (р=0,006); средняя площадь сечения сосудов (р=0,01); степень анаплазии по РиЬгтап (р=0,02); митотический индекс (р=0,02); количество ДНК (р=0,03); экспрессия Кь67 (р=0,02); количество А§№Ж8 (р=0,04) и экспрессия Ьс1-2 (р=0,04). При прогнозировании течения ПКР молекулярно-биологические маркеры и параметры, характеризующие ПЗ, целесообразно рассматривать в качестве прогностических критериев наравне с классическими факторами прогноза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оптимизации послеоперационного прогноза ПКР целесообразно оценивать традиционные клинико-морфологические характеристики (размер опухоли, гистологическую структуру, гистологический вариант, степень ядерной атипии) и вносить эти параметры в протокол морфологического исследования. Это позволит объективнее оценивать биологическую агрессивность опухоли и прогноз заболевания.

2. Для уточнения прогноза заболевания и риска возникновения метастазов при патоморфологическом исследовании операционного материала, кроме традиционных факторов прогноза ПКР, необходимо учитывать данные биомолекулярных маркеров (митотического индекса, плоидности, экспрессии К1-67, числа А§ЫОЯз и экспрессии Вс1-2), а также данные, характеризующие ПЗ опухоли (ширину ПЗ, степень склероза ПЗ, интенсивность воспалительной инфильтрации в ПЗ и суммарную площадь сечения сосудов в ПЗ).

3. Особое внимание при динамическом наблюдении за больными следует уделять пациентам с наличием неблагоприятных факторов прогноза как по данным исследования самой опухоли, так и ПЗ.

4. Целесообразно на дооперационном уровне оценивать (инструментальными методами исследования) толщину псевдокапсулы опухоли, характеристики которой (склероз, ширина и ангиогенез) могут быть допол-

нительными прогностическими факторами при оценке злокачественности опухолевого процесса и уровня резекции неизмененной ткани почки при органосберегающих операциях. При опухолях с широкой перитуморозной зоной (псевдокапсулой) уровень отступа от визуального края опухоли должен быть увеличен (не менее чем на 0,3 см).

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AgNOR - ядрышковый организатор

КВИ - клетки воспалительного инфильтрата

МА - митотическая активность

МИ - митотический индекс

MP - митотический режим

МЦР - микроциркуляторное русло

ПА - пролиферативная активность

ПЗ — перитуморозная зона

ПКР — почечно-клеточпый рак

ИМ - патологический митоз

ПМО — первично-множественные опухоли

РГ1 - рак почки

СПлС - суммарная площадь сечения сосудов СРП - светлоклеточный рак почки ТК - тучные клетки

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Черданцева Т.М., Брюханов В.М., Климачев В.В., Бобров И.П., Гервальд В.Я. Некоторые особенности гистологического строения, про-лиферативных и биосинтетических процессов в перитуморозной зоне при раке почки // Вестник Алтайской науки. - 2010. - Т. 8, № 1. - С. 31 -34.

2. Черданцева Т.М., Климачев В.В., Бобров И.П., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я. Некоторые особенности гистологического строения и пролиферации клеточных элементов в перитуморозной зоне при раке мочки // Тезисы. Современные аспекты урологии, онкоурологии. - Красноярск, 2010 г. - С. 49-50.

3. Брюханов В.М., Бобров И.П., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Авдалян A.M., Самуйленков О.В. Морфо-функциональная характеристика активности белков ассоциированных с областью ядрышковых организаторов при раке почки: клинико-морфо-логические параллели // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. - Москва, 2010. - С. 325-326.

4. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Брюханов В.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Авдалян A.M., Самуйленкова О.В. Морфо-

функциональная характеристика активности белков ассоциированных с областью ядрышкового организатора в дифференциальной диагностике светлоклеточного рака почки // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. - Москва, 2010. - С. 331-332.

5. Бобров И.П., Авдалян A.M., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Брюханов В.М., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю., Ковригин М.В. Модифицированный метод выявления аргирофильных белков области ядрышкового организатора на парафиновых срезах // Морфология. -2010.-№5.-С. 65-67.

6. Гервальд В.Я., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Авдалян A.M. Не-оангиогенез перитуморозной зоны как фактор прогноза при раке почки // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - Приложение № 1. - С. 32-33.

7. Гервальд В.Я., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Авдалян A.M. Клинико

- морфологические сопоставления и прогностическое значение исследования морфофункциональной активности тучных клеток перитуморозной зоны рака почки // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - Приложение № 1. - С. 33-34.

8. Долгатов А.Ю., Гервальд В.Я., Бобров И.П., Черданцева Т.М., Авдалян A.M. Экспрессия аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR) при рак^почки: клинико-морфологические параллели//Сибирский онкологическии журнал.-2011.

- Приложение № 1. - С. 45.

9. Чеданцева Т.М., Бобров И.ГТ., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю. Гистологическое строение и некоторые особенности биосинтетических и пролиферативных процессов в перитуморозной зоне рака почки в зависимости от плоидности опухоли // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - С. 553-557.

10. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Гервальд В.Я., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Значение исследования не-оангиогенеза перитуморозной зоны при раке почки // Материалы Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Владивосток, 2011. - С. 75-76.

11. Черданцева Т.М., Бобрйв И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Тучные клетки перитуморозной зоны рака почки: клинико - морфологические параллели // Материалы Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Владивосток, 2011. - С. 76-77.

12. Гервальд В.Я., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Бобров И.П., Брюханов В.М., Авдалян A.M., Лазарев А.Ф. Нефросклероз и пролифе-ративные процессы в перитуморозной зоне при раке почки // Материалы Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Владивосток, 2011. - С. 78-79.

13. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я. Тучные клетки перитуморозной зоны рака

почки: клинико-морфологические сопоставления II Вопросы онкологии.

- 2011. - Приложение № I. - С. 4-5.

14. Климачев В.В., Бобров И.П., Черданцева Т.М., Брюханов В.М., Гервальд В.Я., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Морфофункциональная характеристика активности аргирофильных белков ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR) при раке почки: клинико-морфологические параллели // Вопросы онкологии. - 2011. - Приложение №1.-С. 35-36.

15. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Гервальд В.Я., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М. Неоангиогенез в перитумо-розной зоне рака почки // Вопросы онкологии. - 2011. - Приложение № 1.-С. 15-16.

16. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.В., Гервальд В.М., Барсукова Н.И., Обухова Л.Е. Гистологическое строение перитуморозной зоны при раке почки // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина.

- 2011. - № 2. - С. 141-145.

17. Лазарев А.Ф., Бобров И.П., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Брюханов В.М., Авдалян A.M., Лубенников В.А., Гервальд В.Я. Тучные клетки и опухолевый рост // Сибирский онкологический журнал. -2011.-№4.-С. 60-63.

18. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Тучные клетки при раке почки: клинико-морфологические параллели // Медицина в Кузбассе. -2011. - №2. - С. 48-51.

19. Черданцева Т.М., Бобров И.Г1., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Морфофункциональная характеристика тучных клеток перитуморозной зоны при раке почки новообразований // Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 233-234.

20. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Брюханов В.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Прогностическое значение исследования активности опухолевого неоангиогенеза в перитуморозной зоне рака тючки // Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием. - Санкт-Петербург. 2011. - С. 235-236.

21. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Барсукова Н.И., Обухова Л.И., Лубенников В.А. Особенности строения перитуморозной зоны рака почки // Тезисы докладов III эмбриологического симпозиума Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Юрга - Эмбрио - 2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» // Морфология. - 2011. - Т. 140, № 5. - С. 72.

22. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Тучные клетки и ангиогенез в перитумороз-

ной зоне рака почки / Тезисы докладов III эмбриологического симпозиума Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Юрга - Эмбрио - 2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» // Морфология. - 2011. - Т. 140, №5.-С. 125.

23. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю., Попов В.А. Клинические аспекты опухолевого ангиогенеза в перитуморозной зоне у больных раком почки // Онкоурология. - 2011. - № 4. - С. 25-27.

24. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Клинические аспекты исследования опухолевого ангиогенеза в перитуморозной зоне у больных раком почки / Материалы VI конгресса Российского общества онкоурологов // Онкоурология. -2011. -С. 212-213.

25. Бобров И.П., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Гаранина Т.С. Морфофунк-циональная активность ядрышковых организаторов: взаимосвязь с гистологическим строением перитуморозной зоны // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 11. - С. 485-490.

26. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Клинико-морфологические аспекты исследования пролиферативных и диспластических процессов в перитуморозной зоне у больных раком почки // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2012. - № 1. - С. 63-68.

27. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Таранина Т.С. Патоморфология перитуморозной зоны рака почки разной степени злокачественности // Медицина в Кузбассе. - 2012. - Т. 11, № 1. - С. 27-31.

28. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я. Гистологическое строение перитуморозной зоны рака почки и размер опухоли // Проблемы клинической медицины. - 2011. - № 1 -2. - С. 100-104.

29. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Таранина Г.С., Гервальд В.Я. Перитумо-розная зона рака почки: все ли проблемы решены // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 4. - С. 141-145.

30. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Гервальд В.Я., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М.Экспрессия онкомаркера Вс1-2 в карциноме почки // Петровские чтения - 2012: Тезисы 8-й конференции по фундаментальной онкологии. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 152-154.

31. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Гервальд В.Я., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Микроспектрофотометричес-кое и иммуногистохимическое исследование эпителия канальцев пери-

туморозной зоны рака почки // Петровские чтения - 2012: Тезисы 8-й конференции по фундаментальной онкологии. - Санкт-Петербург, 2012. -С. 154-156.

32. Гервальд В.Я., Сеченев Т.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Ав-далян A.M., Климачев В.В., Брюханов В.В. Экспрессия аргирофильных белков ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR) при раке почки: клинико-морфологические сопоставления // Сибирский медицинский журнал. — 2012. — Приложение № 1. - С. 42-43.

33. Гервальд В.Я., Сеченев Т.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Авда-лян A.M., Климачев В.В., Брюханов В.В. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 при раке почки: клинико-морфологические сопоставления // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Приложение № 1. - С. 43-44.

34. Сеченев Т.М., Гервальд В.Я., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Ав-далян A.M., Климачев В.В., Брюханов В.В. Клинико-морфологические сопоставления и прогностическое значение исследования активности тучных клеток в перитуморозной зоне рака почки // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Приложение № 1.-С. 143-144.

35. Сеченев Т.М., Гервальд В.Я., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Авда-лян A.M., Климачев В.В., Брюханов В.В. Микроспектрофотометрическое и иммуногистохимическое исследование эпителия канальцев перитуморозной зоны рака почки // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Приложение № 1.-С. 144-145.

36. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Обухова Л.Е., Барсукова Н.И. Пролиферация и апоптоз почечного эпителия в перитуморозной зоне при раке почки // Вестник Новосибирского государственного университета. Серии: Биология, клиническая медицина. - 2012. - №3. - С. 180-187.

37. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф. Экспрессия ингибитора апоптоза bcl-2 при почечно-клеточном раке // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 7. - С. 415-419.

38. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Гервальд В.Я., Авдалян A.M., Лазарев А.Ф., Котовщикова Е.Ф., Сеченев Е.И. Экспрессия маркера пролиферации Ki-67 при раке почки // Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий: Материалы III Международной научно-пракгической конференции. - Екатеринбург, 2012.-С. 272-274.

39. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Сеченев Е.И., Смирнов П.В. Прогностическое значение микроспектрофотометрическое исследования ДНК при почечно-клеточном раке // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 4. - Science-education.ru>104-c6543.

40. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Обухова Л.Е., Барсукова Н.И. Прогностическое

значение экспрессии ингибитора апоптоза bcI-2 при почечно-клеточном раке // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 8. - С. 169-173.

41. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд, Е.И. Сеченев. Неоангиогенез в перитуморозной зоне почечно-клеточного рака // Материалы VII съезда онкологов и радиологов стран СНГ. - Астана, 2012. - С. 311-312.

42. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Гервальд, Обухова Л.Е., Смирнов П.И. Экспрессия ингибитора апоптоза BCL-2 при почечно-клеточном раке// Материалы VII съезда онкологов и радиологов стран СНГ. - Астана, 2012. - С. 337.

43. Климачев В.В., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я. Характеристика экспрессии маркеров регуляции апоптоза в эпителии канальцев перитуморозной зоны рака почки // Материалы VII съезда онкологов и радиологов стран СНГ. - Астана, 2012.-С. 320.

44. Черданцева Т.М., Бобров И.II., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф. Ki-67, Р53 и bcl-2 при местно-распрастраиенном и метастатическом раке // Материалы VII конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2012. - С. 174.

45. Климачев В.В., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф. Иммуногистохимическое исследование ренальной интра-тубулярной неоплазии перитуморозной зоны почечно-клеточного рака // Материалы VII конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2012.-С. 153-154.

46. Брюханов В.М., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Лазарев А.Ф. / Экспрессия ингибитора bcl-2 при почечно-клеточном раке: клинико-морфологические параллели // Материалы VII конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2012. - С. 142-143.

47. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Гервальд В.Я., Сеченев Е.И. Гистофотоме-трическое и иммуногистохимическое исследование ренальной интрату-булярной неоплазии в перитуморозной зоне рака почки // Онкоурология. - 2012. - № 3. - С. 18-23.

48. Бобров И.П., Черданцева Т.М., Брюханов В.М., Климачев В.В., Авдалян A.M., Долгатов А.Ю., Казарцев A.B. Прогностическое значение количественного анализа аргирофильных белков области ядрышкового организатора (AgNOR) при почечно-клеточном раке // Российский онкологический журнал. - 2013. - № 1. - С. 19-24.

49. Черданцева^Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Долгатов А.Ю., Казарцев A.B. Прогностическое значение компьютерной плоидометрии при почечно-клеточном раке // Российский онкологический журнал. - 2013. - № 1. - С. 32-35.

50. Бобров И.П., Черданцева Т.М., Брюханов В.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M. Способ окраски ядрышковых организаторов

на гистологических препаратах и цитологических мазках. Патент РФ, №2447438; 2010 (Россия).

51. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Долгатов А.Ю. Размер опухолевого узла гистологическое строение перитуморозной зоны рака почки // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 3. - С. 188-193.

52. Бобров И.П., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф. / Экспрессия аргентофильных белков ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR) при раке почки // Российская научно-практическая конференция с международным участием «Новые методы в онкологической практике». - Российский онкологический журнал. - 2013. - № 4. - С. 33-34.

53. Долгатов А.Ю., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Авдалян A.M. Кариометрия в оценке отдаленных результатов послеоперационной выживаемости пациентов с почечно-клеточным раком // Российская научно-практическая конференция с международным участием «Новые методы в онкологической практике». - Российский онкологический журнал. - 2013.-№ 4. - С. 39.

54. Лазарев А.Ф., Черданцева Г.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Авдалян A.M. Экспрессия ингибитора апоптоза Вс1-2 при раке почки: клинико-морфологические сопоставления // Материалы VII конгресса Российского общества онкоурологов. - Москва, 2013. - С. 147-148.

55. Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян A.M., Долганов А.Ю., Самарцев Н.С. Морфофунк-циональная характеристика клеток фибробластического ряда перитуморозной зоны почечно-клеточного рака разной степени злокачественности // Российский онкологический журнал. - 2013. - №6. - С. 12-16.

Подписано в печать 30.05.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0.

_Тираж 100 экз. Заказ № 18._

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Соискатель

Т.М. Черданцева

I I I

OA3í

2014155939