Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфологический анализ карциносаркомы Walker 256: влияние общей гипертермии и противоопухолевых агентов (мелатонина и циклофосфана) на опухолевый рост

11-5

157

На правах рукописи

Овсянко Елена Владимировна

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256: ВЛИЯНИЕ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ (МЕЛАТОНИНА И ЦИКЛОФОСФАНА) НА ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ

14.03.02 — патологическая анатомия 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск — 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Минздравсоцразвития РФ и в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфо-логии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_» _ 2011 г.

в _ час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01

в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат диссертации разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01 доктор биологических наук,

профессор Молодых Ольга Павловна

Ефремов Анатолий Васильевич Лушникова Елена Леонидовна

Бакарев Максим Александрович Кливер Евгений Эдуардович Талалаев Сергей Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, онкологические заболевания по частоте заболеваемости занимают второе, а в некоторых про-мышлепно развитых странах - первое место; от них ежегодно умирает около 7 млн человек (Попович A.M., 2002). В структуре онкологической заболеваемости женщин почти во всех развитых странах первое место занимает рак молочной железы (Greenlee R. et al., 2000; Jemal A. et al., 2004 -2010). По сравнению с другими злокачественными новообразованиями рак молочной железы является одной из наиболее частых причин смерти женщин (Аксель Е.М., 2005).

Основными методами лечения в онкологии являются: хирургический, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия. В настоящее время применение интенсивной или высокодозной химиотерапии при лечении пациентов с солидными опухолями не всегда позволяет добиться эффективных результатов (Davidson A. et al., 1997). С целью преодоления хи-миорезистентности и повышения эффективности терапии этой категории больных продолжается интенсивный поиск новых лечебных подходов. Одним из возможных направлений в этом плане является общая гипертермия (ОГ) (Жаврид Э.А. и др., 1997; Исмаил-Заде P.C., 2004; Van der Zee J., 2002; Oldahm R.K., 2003), применение которой основано на том, что опухолевые клетки избирательно термочувствительны (при повышении температуры тела до 42 - 45°С).

В современных клинических и экспериментальных исследованиях при оценке эффективности противоопухолевой терапии и разработке новых методов терапии злокачественных новообразований основное внимание уделяется влиянию химических агентов и физических факторов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза (Летягин В.П., 2004; Куш-линский Н.Е. и др., 2005). Такие подходы обусловлены тем, что одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток (Белушкина H.H., 2008). Разные химические и физические воздействия вызывают разную интенсивность изменений перечисленных выше биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вариантов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной активностью.

Сочетание гипертермии с лучевой терапией оказывается эффективней, чем каждый из этих видов физического воздействия отдельно. При тепловом воздействии опухолевая ткань перенасыщается собственными продуктами обмена, кислотами, и в ней нарушаются важные системы регуляции. Вследствие этого опухолевая клетка становится более чувствительной к лучевой или химиотерапии, так что их дозировки могут быть

значительно снижены. Возможность уменьшения дозы вводимых цитоста-тиков до 50% с одновременным усилением противоопухолевого эффекта позволяет в ряде случаев избегать выраженного нефротоксического, кар-диотоксического, гепатотоксического действия химиопрепаратов. Влияние гипертермии на трансмембранный перенос и метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуноген-ности опухоли (Курнешов O.K. и др., 2003). Не являясь канцерогенным и мутагенным агентом, гипертермия может индуцировать в опухоли как апоптоз, так и некроз клеток (Yonezawa M. et al., 1996).

В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований стало создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза (Rafii S., 2000). Известно, что в опухоли образуется сосудистая сеть, которая значительно отличается от сосудов здоровой ткани (Dvorak H.F. et al., 1995; Bergers G. et al., 2003). Сосудистое русло опухоли, с морфологической точки зрения, является атипичным и составляет значительную часть опухолевой стромы. Показано, что если опухоль имеет периферическую сосудистую сеть, то в центре опухоли имеются участки некроза. Если опухоль имеет центральную сосудистую сеть, то некроз располагается по периферии. Микроскопически сосуды выглядят расширенными, извитыми, со множеством слепых петель. Все эти структурные различия влияют на внутриопухолевый кровоток, кровь проходит через опухоль непредсказуемым образом, а это оказывает отрицательное влияние на доставку лекарственных препаратов.

Для разработки новых схем противоопухолевой терапии и создания новых лекарственных препаратов на первом этапе всегда используются модельные опухолевые системы in vitro (линии опухолевых клеток) и in vivo (перевиваемые и спонтанные опухоли разной локализации). Одной из модельных опухолей, используемых на крысах, является перевиваемая опухоль Walker 256, идентифицированная впервые профессором G.Walker в 1928 году как спонтанно возникшая в молочной железе беременной крысы альбиноса (Rattus norvegicus) (Simpkins H. et al., 1991). После нескольких пересадок на протяжении многих лет были выделены несколько ее субштаммов, которые характеризуются морфологическими различиями и классифицируются как карцинома, саркома и смешанная карциносаркома (Simpkins H. et al., 1991). Возможно, карциносаркома Walker 256 возникла как смешанная опухоль и состояла из стволовых клеток, которые дают начало разным типам клеток. Использование этой опухоли в доклинических исследованиях новых методов противоопухолевой терапии позволяет оценить действие как отдельных химических и физических факторов, так и их сочетаний на разные биологические характеристики опухолевого роста.

В этой связи представляется актуальным изучение интенсивности пролиферации и гибели опухолевых клеток карциносаркомы Walker

256 при действии общей гипертермии в сочетании с цитостатическими препаратами (циклофосфаном и мелатонином), обладающими разными механизмами действия на клеточные популяции.

Цель исследования — изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой терапии с использованием общей гипертермии, циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.

Задачи исследования:

1. Изучить морфогенез и основные параметры опухолевого роста (митотический индекс, выраженность некротической и апоптотической гибели, частоту метастазирования, степень дифференцировки) карциносаркомы Walker 256 после трансплантации опухолевых клеток в мышцу бедра крыс Вистар.

2. Изучить особенности гистоархитектоники опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

3. Изучить ультраструктурные особенности основных типов опухолевых клеток и эндотелиоцитов карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном развитии и при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

4. Провести иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии антиапоптотического и проапоптотических белков семейства Вс1-2 в карциносаркоме Walker 256 крыс в процессе спонтанного развития и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

5. Изучить динамику изменений содержания токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

6. Изучить уровень антиоксидантной и прооксидантной активности сыворотки крови у крыс с трансплантированной карциносаркомой Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

7. Изучить динамику изменения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный патоморфоло-гический анализ опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии после трансплантации в мышцу бедра крыс и после модифицирующих воздействий общей гипертермии, циклофосфана и ме-

латонина. Показано, что морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиоге-неза. Впервые на основании электронно-микроскопического исследования установлено, что в карциносаркоме Walker 256 в ходе ее прогрессивного развития присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки, представлены их ультраструктурные характеристики.

Впервые выявлены патоморфологические особенности модифицирующего влияния общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на гистоархитектонику карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста. Установлено, что данные виды воздействий, примененные изолированно или в сочетании друг с другом, оказывают разные по выраженности эффекты на процессы пролиферации, гибели и дифференцировки опухолевых клеток, а также их метастатическую активность. Впервые показано, что применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией и мелатонином вызывает значительную транзиторную редукцию эпителиоидных клеток и изменение архитектоники опухолевого узла через 7 сут после воздействий с реверсией опухолевого фенотипа в последующем, но при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином или общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.

Впервые установлено, что применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно в сочетании с циклофосфаном. Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.

Впервые показано, что общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы. Гистоархитекгоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление

из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.

Впервые определена экспрессия проапоптогенных и антиапоптогенного белков семейства Вс1-2 в динамике развития карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что изолированное или сочетанное применение данных воздействий приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 и усилению экспрессии проапоптотических белков Вах и Bad. Установлена отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптотическим индексом, с другой, что позволяет считать изменение соотношений этих белков в клетках карциносаркомы Walker 256 одним из механизмов индукции апоптоза.

Впервые изучены показатели реакции перекисного окисления липидов, прооксидантной (ПОА) и антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Установлено, что спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе и основных параметрах опухолевого роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном росте и после изолированного и сочетанного воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина как физических и химических агентов с разными механизмами противоопухолевого действия. Выявленные особенности противоопухолевого эффекта общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина и их сочетаний имеют большое значение для разработки более эффективных схем терапии онкологических заболеваний.

Проведенное исследование показывает важность комплексного морфологического анализа спонтанного и модифицированного опухолевого роста в динамике для установления возможных мишеней противоопухолевой терапии и оценки ее эффективности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплени-

ями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Опухолевые клетки характеризуются высоким митотическим индексом, низким апоптотическим индексом, высокой частотой метастазирования по гематогенному и лимфогенному типам в регионарные лимфатические узлы, способностью индуцировать неопластическую кахексию.

2. Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гисто-архитектоники трансплантированной карциносаркомы WaLker 256. При сочетанном применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанном применении общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений - количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.

3. Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови как в сторону их понижения, так и повышения.

4. Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.

Апробация результатов исследования. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); IX Российско-Германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество

в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), межлабораторной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 15 - в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК РФ для публикации результатов докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 295 страницах текста, иллюстрирована 76 таблицами и 180 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, включающих материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (445 источников, из которых 165 отечественных и 280 иностранных авторов).

Весь материал диссертации получен, собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использован перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой кар цин о cap комы Walker 256 вводили крысам Вистар в мышцу задней части бедра в дозе 1*106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl (Хегай И.И. и др., 2008; Jacobson M.D., 1996; Monte О. et al., 2005). Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации.

Через 5 сут с момента перевивки опухоли, когда ее объем достигал 2,5±0,4 см3, животных разделяли на 12 групп с целью выявления особенностей опухолевого роста под влиянием общей гипертермии (ОГ) и противоопухолевых агентов (табл. 1). Макроскопический анализ проводили с вычислением объема опухоли, размеры измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях.

ОГ воспроизводили в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» (Ефремов A.B. и др., 2001). Предлагаемый способ предполагает разогревание экспериментальных животных в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С в водяной бане, при погружении в горячую воду до уровня шеи. Конструкция предусматривает автоматическое поддержание температуры нагрева воды и равномерное перемешивание ее слоев, что позволяет считать в эксперименте температуру постоянной величиной. Преимущество моделирования ОГ в водной среде перед воздушной заключается в том, что осуществляет-

Экспериментальные группы Условия воздействия Количество животных в группах

1-я группа Интактные крысы Вистар 7

2-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \Valker-256 в мышцу бедра («спонтанный» рост) 21

3-я группа «Интактные» крысы Вистар после воздействия мела-тонином 21

4-я группа «Интактные» крысы Вистар после общей гипертермии 21

5-я группа «Интактные» крысы Вистар после воздействия цик-лофосфаном 21

6-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \Valker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии 21

1-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \^а1кег-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином 21

8-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы >Уа1кег-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с циклофосфаном 21

9-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы АМа1кег-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином и циклофосфаном 21

10-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \VaIker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонином 21

11-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \Valker-256 в мышцу бедра и воздействие циклофосфаном 21

12-я группа Трансплантация клеток карциносаркомы \Уа1кег-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонином в сочетании с циклофосфаном 21

Итого 238

ся равномерное, глубокое и быстрое нагревание организма животного (ЬеэшсагН. 1989).

Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя подбирался экспериментально и составил 45 °С. Эту температуру можно считать оптимальной при моделировании ОГ, так как более высокие значения плохо переносятся крысами и приводят к их гибели. Время разогревания каждой особи до уровня ректальной температуры 43,5°С было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы животного и составляло не более 17 мин. Столь быстрое повышение температуры тела при разогревании в условиях 90 - 100% влажности объясняется полным

прекращением процесса испарения пота и отсутствием эффективного охлаждения (Meyer F. et. al., 1992; Monte О. et al., 2005).

Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). При более высокой степени разогрева следовала гибель животных в момент ОГ или в ранние сроки постгипертермического периода, так как в этих пределах находится верхняя граница температурного диапазона, переносимого животным организмом. При измерении ректальной температуры нагреваемых животных один из спаев дифференциальной термопары вводили в прямую кишку на глубину 3-4 см, а второй опускали в тающий лед. Температурная разница между 0°С и ректальной температурой выражалась в микровольтах на шкале микровольтметра-микроамперметра. Всех животных нагревали однократно в полном соответствии с описанной методикой до стадии теплового удара (ректальная температура 43,5°С).

Циклофосфан (ЦФ) («Биохимик», Саранск, Россия) вводили однократно из расчета 25 мг/кг в 0,1 мл изотонического раствора NaCl внутрибрюшин-но, спустя 5 сут с момента перевивки опухоли. При сочетанных воздействиях ЦФ вводили за 1 ч до начала сеанса ОГ ввиду особенностей фармакоки-нетики его активного метаболита. Мелатонин (МТ) (ICN Biomedicals Inc. USA) вводили в дозе 0,3 мг/кг внутрибрюшинно в течение 14 сут, начиная с 5-х суток после имплантации опухолевых клеток. Животных содержали при фиксированном световом режиме (свет-темнота- 12 ч: 12 ч с включением освещения в 8.00 ч и выключением в 20.00 ч).

У экспериментальных животных исследовали сыворотку крови и образцы опухолевой ткани. Материал забирали после декапитации животных под эфирным наркозом.

Оценка противоопухолевого эффекта препаратов in vivo. В качестве критериев оценки противоопухолевого эффекта препаратов выбраны динамика и торможение роста опухоли. Динамику опухолевого роста отслеживали периодически, измеряя размеры опухоли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях, вычисляли объем опухолевых узлов. Торможение роста опухоли (ТРО) оценивали по формуле:

TPO = fV -V WV х 100%

1 1 \J V v контроль * опыт/ ' v контроль 1 uv/ /UJ

где VK0HTpQJIb - среднее значение объема опухоли в группе контрольных животных, VonHT - среднее значение объема опухоли в группе опытных животных.

В работе представлены значения ТРО в тот день, когда разность между объемами опухолей в опытной и контрольной группах была максимальной.

Методы патоморфологического анализа. Опухолевую ткань для светооптического и электронно-микроскопического исследования забирали в следующих группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ; 3-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в

сочетании с МТ; 4-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в сочетании с ЦФ; 5-я группа — перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в сочетании с МТ и ЦФ; 6-я группа — перевиваемая карциносаркома Walker-256 после воздействия МТ; 7-я группа — перевиваемой карциносаркома Walker-256 после воздействия ЦФ; 8-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после воздействия МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа — через 5 сут с момента перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я, 7-я, 8-я группы - через 3, 7 и 14 сут с момента начала введения препаратов или воздействия ОГ.

Для светооптического исследования образцы опухоли фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин; окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по ван Гизону, азуром-2—эозином. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм получали на ультратоме LKB-8800 с блоков, залитых в эпон 812, окрашивали толуидиновым синим. Срезы изучали в микроскопах MS300A (Австрия) и Leica DM 4000В (Германия). Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Leica DFC320 и компьютерной программы Leica QWinV3.

В качестве основных параметров опухолевого роста определяли следующие:

1. Митотический индекс - число опухолевых клеток, находившихся на различных стадиях митотического деления. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Анализировали не менее 5 тыс. клеток.

2. Объемную плотность (Vv) клеток с некротическими изменениями;

3. Объемную плотность дистрофически измененных опухолевых клеток;

4. Объемную плотность паренхиматозных клеток опухоли;

5. Апоптотический индекс-число опухолевых клеток, находившихся в состоянии апоптотической гибели. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Анализировали не менее 5 тыс. клеток.

Для электронно-микроскопического исследования образцы карци-носаркомы Walker 256 крыс (по 5 от каждого животного) фиксировали сначала в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,4), затем в течение 1 ч дополнительно фиксировали в 1% четырехокиси осмия на фосфатном буфере (pH 7,4). После дегидратации образцы заключали в эпон 812.

С целью прицельной ультратомии различных зон карциносаркомы Walker 256 предварительно изучали в световом микроскопе полутонкие срезы. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800, контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. После напыления углеродом в вакууме контрастированные срезы изучали в электронном микроскопе JEM-7A.

Йммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Вс1-2 выполняли на парафиновых срезах опухолевой ткани толщиной до 5 мкм с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода (Эллиниди В.Н. и др., 2002).

Опухолевую ткань для иммуногистохимического исследования брали в следующих 6 группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа—перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ; 3-я группа — после воздействия ЦФ; 4-я группа — после воздействия МТ; 5-я группа - после сочетаемого воздействия МТ и ЦФ; 6-я группа - после воздействия сочетанием ОГ, МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа - через 5 сут с момента перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я группы - через 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ; 5-я и 6-я группы - через 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.

Перед окрашиванием срезы депарафинировали, регидратировали, блокировали эндогенную пероксидазную активность и демаскировали антигены. Для обнаружения Вах применяли кроличьи поликлональные антитела к домену, играющему важную роль в образовании гомодимеров и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 («BD Biosciences», США), для Вс1-2 и Bad - мышиные моноклональные антитела («BD Biosciences», США) в разведении 1:100. Наблюдаемое окрашивание от бледно-желтого до темно-коричневого свидетельствовало о специфическом связывании антител с исследуемыми антигенами.

Морфометрическое исследование проводили на фотографических снимках при помощи моторизованного микроскопа М200 (Zeiss) и камеры AxioCam HRc (Zeiss) при конечном увеличении *630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision - Release 4.7.1. (Zeiss) и блока автоматических измерений (Auto measure). При подготовке программы были использованы фильтр-маски Segmentation, Sigma. В программу вычислений вводили процентное значение площади позитивно окрашиваемых опухолевых элементов. Для каждой группы оценивали по 40 изображений. Площадь препарата, получаемого на одном изображении, составляла 39437 мкм2.

Определение прооксидантной активности сыворотки крови. Определение прооксидантной активности (ПОА) сыворотки крови проводили по методу Д.Н.Маянского и соавт. (1996). В качестве тест-системы использовали лейковзвесь интактных крыс, которую получали следующим способом: пробирки с гепаринизированной кровью (5 ЕД/мл) интактных крыс отстаивали под углом 45° в течение 40 мин при 37°С. Затем слой лейкоцитов с прилежащим слоем плазмы осторожно отсасывали, центрифугировали при 1000 об ./мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 2 мл раствора Хэнкса без фенолового красного, повторно осаждали и ресуспендировали в 0,5 мл раствора Хэнкса. Полученные отмытые лейкоконцентраты от 5 крыс пулировали,

подсчитывали общее количество клеток в камере Горяева и доводили раствором Хэикса до концентрации 2x106 клеток/мл. Отдельно из лей-коконцентратов готовили мазки, окрашивали по Романовскому-Гимзе, подсчитывали процентное содержание нейтрофилов.

Определение антиоксидантной активности сыворотки крови. Общую антиоксидантную активность (АОА) сыворотки крови определяли с помощью хемшпоминесценции (XJI) по степени торможения суммарной светимости XJI, запускаемой 3% Н202 по методу А.И.Журавлева (1983).

Расчет коэффициента соотношения КС прооксидантной и антиоксидантной активности сыворотки крови. Дня объективной оценки баланса в системе «оксидант и антиоксидант» рассчитывали коэффициент соотношения (IQ про- и антиоксидантной активности сыворотки крови по формуле: К<. = (ПОА/АОА) * 100.

Определение ПОА и общей АОА, содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови, баланс в системе «про-/антиокси-данты» с помощью коэффициента К^ осуществляли в 8 группах: 1-я группа -перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа—Walker-256 после ОГ; 3-я группа-Walker-256 после ОГи МТ; 4-я группа-Walker-256 после ОГ и ЦФ; 5-я группа - Walker-2 56 после ОГ, МТ и ЦФ; 6-я группа-Walker-256 после воздействия МТ; 7-я группа - Walker-256 после воздействия ЦФ; 8-я группа - Walker-256 после воздействия МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа — через 5 сут после перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я, 7-я, 8-я группы - через 3, 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.

Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови. Первичные продукты ПОЛ-диеновые конъю-гаты (ДК) определяли спектрофотометрическим методом (Колосова Н.Г. и др., 1988). Определение вторичных, стабильных продуктов ПОЛ по уровню малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови проводили по методу Y.Yagi et al. (1976), по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). В работе использовали 2-Thiobarbituric acid («Sigma», США). Для вычленения неспецифического компонента (ТБК-связанные комплексы с аминокислотами, пигментами и др.) проводили спектрофотометрию пробы при длине волны 580 нм. Результаты просчитывали с учетом коэффициента миллимолярной экстинции - 155 ммоль"1 см"1 (Staucliff R.S. et al., 1969).

Определение содержания жирорастворимых витаминов (антиок-сидантов) в сыворотке крови. Анализ содержания жирорастворимых витаминов (ретинола и а-токоферола) в сыворотке крови проводили с помощью метода ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе «Милихром» (Микичур Н.И., Сафронов И.Д., 1988). В качестве свидетелей жирорастворимых витаминов использовали калибровочные растворы а-токоферола и ретинол-ацетата («Serva», США). Содержание жирорастворимых витаминов рассчитывали по величине амплитуды пиков, полученных на

хроматограмме, в пересчете на стандарт, и выражали в мг% для а-токо-ферола и мкг% для ретинола.

Определение содержания жирорастворимых витаминов антиоксидан-тов (ретинола и а-токоферола) в сыворотке крови осуществляли в следующих 7 группах: 1-я группа—перевиваемая карциносаркома Walker 256; 2-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после ОГ; 3-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия ЦФ; 4-я группа—перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия МТ; 5-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия МТ и ЦФ; 6-я группа- перевиваемая карциносаркома Walker 256 после ОГ в сочетании с МТ и ЦФ; 7-я группа—интакгная. Использовали следующие сроки: 1-я и 7-я группы - через 5 сут после перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я группы - через 3, 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.

Статистические методы обработки полученных результатов. Полученные цифровые данные подвергнуты статистическому анализу (Гланц С., 1998). Математические расчеты выполнены с помощью пакета статистического анализа Microsoft Excel. Вычисляли среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего (m), коэффициент корреляции (г). Значимость различий в сравниваемых группах определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считали результаты при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Патоморфологические изменения карциносаркомы Walker 256 после трансплантации в мышцу бедра. Через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток в бедро опухоль была представлена уже сформированным узлом (2,5±0,4 см3). Гистогенетически карциносаркома Walker 256 относится к опухолям молочной железы и является смешанной опухолью, образованной как саркоматозными (условно стромальными), так и эпите-лиоидными (условно паренхиматозными) компонентами; характеризуется инфильтративным ростом. Опухолевые клетки образовывали солидные комплексы, пласты и тяжи, которые внедрялись в мышечную ткань вдоль мышечных волокон и кровеносных сосудов, нарушая архитектонику и кровоснабжение скелетной мышцы.

Стромальные компоненты были представлены саркоматозными клетками (клетки 1-го типа, «темные» клетки) разной формы (веретоновидной, звездчатой) и размеров с гиперхромными ядрами. Эпителиоидные клетки (клетки 2-го типа, «светлые») по периферии опухолевого узла образовывали мелкие гнезда (псевдофолликулярные структуры) и солидные пласты. Подобные образования, как правило, нечетко отграничивались от окружающей саркоматозной стромы, но в некоторых участках форми-

ровались четко очерченные эпителиоидные структуры, обособленные от саркоматозного компонента. В центре узла плейоморфизм ядер и клеток был менее выражен, ткань - менее структурирована.

Эпителиоидные клетки отличались умеренным полиморфизмом, содержали преимущественно гипохромные ядра, часто подвергались митотическому делению. Некоторые эпителиоидные клетки были перстневидными и характеризовались смещением ядер к периферии. Эпителиоидные клетки - преобладающая клеточная популяция карциносаркомы Walker 256 (их объемная плотность через 5 сут после трансплантации составляла 88,5±1,8%). Прогрессивный рост карциносаркомы характеризовался достаточно высоким митотическим индексом (34,8±1,4%о) и низким апоптотическим индексом (0,7±0,2%о). Кроме апоптотической гибели в опухолевых узлах регистрировались разных размеров очаги некроза опухолевых клеток, которые располагались преимущественно в центральных зонах и были инфильтрированы нейтрофилами и моноцитами. Между клетками формировались кровеносные сосуды.

По мере дальнейшего роста и старения опухолевого узла (через 12 и 19 сут после трансплантации опухолевых клеток) его объем достигал соответственно 25,5±5,4 и 37,7±3,5 см3 (р<0,05), в нем отмечалось усиление «структурирования», которое проявлялось в разрастании тяжей саркоматозных («темных») клеток, между которыми гнездами располагались эпителиоидные клетки (формирование псевдофолликулярных структур). Усиление морфогенетических процессов проявлялось также в активном неоангиогенезе, врастании кровеносных сосудов в опухоль. В некоторых участках с сохранившимися мышечными волокнами отмечались их лизис и «расплавление» под действием протеолитических ферментов, синтезируемых опухолевыми клетками. В опухолевой ткани присутствовали очаги некроза опухолевых клеток, возрастало количество апоптотических телец (2,5±1,2%о).

По данным ультраструюурного анализа, в карциносаркоме Walker 256 при светооптическом и электронно-микроскопическом исследовании выявлены 2 типа опухолевых клеток. Опухолевые клетки 1 -го типа отличались высокой электронной плотностью как ядра, так и цитоплазмы. Клетки 2-го типа имели большие размеры и меньшую электронную плотность. Клетки каждого типа различались по размерам и насыщенности органеллами и были разбиты на 5 стадий дифференцировки.

Клетки 1-го типа на 1 -й стадии дифференцировки были мелкими, электронно-плотными, с большим количеством микроворсинок, небольшим объемом цитоплазмы и с крупными глыбками гетерохроматина в округлом ядре. Клетки на 2-й стадии дифференцировки были электронно-плотными с большим количеством микроворсинок, большим объемом цитоплазмы, с крупными глыбками гетерохроматина в удлиненном. Клетки, находившиеся на 3-й стадии дифференцировки, были крупными электронно-плотными, с большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и

вытянутым электронно-плотным ядром. Клетки, находившиеся на 4-й стадии дифференцировки, отличались большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и вытянутым электронно-плотным ядром и крупным ядрышком. Клетки, находившиеся на 5-й стадии дифференцировки, были крупными с электронно-плотной цитоплазмой, большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и вытянутым электронно-плотным ядром с крупным ядрышком.

Клетки 2-го на 1-й стадии дифференцировки были представлены мелкими электронно-плотными клетками с большим количеством свободных рибосом. Клетки, находившиеся на 2-й стадии дифференцировки, имели вытянутую форму с удлиненным ядром и крупным ядрышком; в цитоплазме — большое количество свободных рибосом и небольшие цистерны гранулярной цитоплазматической сети, расположенные по периферии клеток. Клетки на 3-й стадии дифференцировки были крупными, вытянутыми, распластанными, с удлиненным ядром и крупным ядрышком; в цитоплазме

- большое количество цистерн гранулярной цитоплазматической сети и свободных рибосом. Дифференцировка клеток данного типа проявлялась в увеличении количества цистерн гранулярной цитоплазматической сети. Клетки на 4-й стадии дифференцировки отличались крупными размерами, большим количеством цистерн гранулярной цитоплазматической сети, вытянутым ядром с изрезанными краями. Клетки на 5-й стадии дифференцировки имели еще более крупные размеры и еще большее количество цистерн гранулярной цитоплазматической сети.

По данным ультраструктурного анализа, на ранней стадии развития опухоли преобладающими были «высокодифференцированные» клетки обоих типов, часть из которых подвергалась деструкции, некрозу и апоп-тозу. В дальнейшем на 7-е сутки преобладали малодифференцированные опухолевые клетки 1-го типа и высокодифференцированные клетки 2-го типа, а к концу эксперимента картина была «зеркально» противоположной

- малодифференцированные опухолевые клетки 2-го типа и дифференцированные клетки 1-го типа.

Эндотелиоциты кровеносных капилляров были представлены как темными, так и светлыми формами. На протяжении всего срока эксперимента после трансплантации опухолевых клеток для ультраструктуры эндоте-лиоцитов кровеносных капилляров было характерно большое содержание органелл белкового синтеза (цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом), но практически не определялись микропиноцитозные везикулы. В эндотелиоцитах кровеносных капилляров, расположенных на периферии опухолевого роста, присутствовали немногочисленные микропиноцитозные везикулы. Численная плотность прикрепленных рибосом и объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети возрастали в большей степени к 14-м суткам (табл. 2). Однако концентрация крист митохондрий была увеличена в большей мере на ранней стадии развития опухоли.

Таблица 2. Морфометрический анализ эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 после трансплантации в мышцу бедра (М±ш)

Исследованные параметры Контроль 5 сут с момента трансплантации 12 сут с момента трансплантации 19 сут с момента трансплантации

Митохондрии:

-V, 8,4±0,15 7,8±0,12 8,2±0,17 8,5±0,32

- внутр. мембрана 2,1±0,12 2,6±0,14* 2,5±0,24* 2,3±0,15*

4,6±0,32 4,2±0,25 4,0±0,16 4,1±0,28

Гранулярная цитоплазмати-ческая сеть 10,2±0,14 18,3±0,19* 16,9±0,53* 19,3±0,45*

Рибосомы (Ыд):

- прикрепленные 25,1±1,28 38,6± 1,22* 36,1±1,48* 42,5± 1,67*

- свободные 28,4± 1,13 32,1±1,18* 29,7±1,32* 35,4±1,76*

Лизосомы (Уу) 2,1 ±0,22 2,2±0,15 2,3±0,19 2,2±0,12

Лизосомы (Ид) 2,0±0,17 2,2±0,36 2,1±0,25 2,3±0,34

Люминальные микропиноци-тозные везикулы (Уу) 21,6±0,42 7,1 ±0,27* 6,9±0,36* 6,2±0,1L*

Цитоплазматические микро-пиноцитозные везикулы (Уу) 24,3±0,55 7,4±0,39* 7,0±0,44* 6,5±0,27*

Базальные микропиноцитоз-ные везикулы (Уу) 18,1±0,34 8,9±0,16* 8,5±0,12* 5,3±0,14*

Примечание. Vv - объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); NA - численная плотность структур (число в тестовой площади); Sv - поверхностная плотность структур (мкм2/мкм3); * - р<0,05 по сравнению с интактными крысами.

Патоморфологическис изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после воздействия общей гипертермии. Одним из критериев оценки противоопухолевого эффекта ОГ была динамика торможения роста опухоли (ТРО). Начиная с 3-х суток и до конца эксперимента объем опухолевого узла после воздействия ОГ был больше, чем в контроле (соответственно в 9,8; 1,7 и 1,13 раза - 24,6±2,2, 42,3±5,3 и 42,5±3,5 см3, р<0,05). Поэтому показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал и был отрицательным (соответственно -878, -65 и -13%). Преобладал солидный рост опухолевого узла.

Через 3 сут после воздействия ОГ отмечалось снижение полиморфизма опухолевых клеток; опухоль была представлена преимущественно «светлыми» крупными клетками, которые образовывали гроздьевидные скопления, в центре - преобладали клетки с умеренным полиморфизмом ядер. По периферии узла встречались единичные соматические мышеч-

ные волокна, подвергавшиеся литическим превращениям. В центральной зоне и по периферии регистрировались очаги некроза опухолевых клеток, различавшиеся по размерам. Отмечались значительный отек опухолевой ткани и полнокровие сосудов. Преобладали сосуды капиллярного типа, чаще ветвящиеся. Через 7 сут после воздействия ОГ происходило усиление структурированности опухолевого узла, формировались псевдофолликулярные структуры, между которыми располагались тяжи из «темных» клеток. Сохранялись рассеянные очаги некроза. Через 14 сут структурированность опухолевого узла сохранялась, преобладали «светлые» клетки. По периферии узла встречались единичные соматические мышечные волокна, подвергавшиеся литическим превращениям. Отмечалась инвазия опухолевых клеток в мышечные волокна с резорбцией саркоплазмы. В центральной зоне и по периферии регистрировались очаги некроза опухолевых клеток, различающиеся по размерам.

Через 3 сут после ОГ митотический индекс снижался в 1,2 раза по сравнению со «спонтанным» ростом (до 28,6±1,3%о, р<0,01), но к концу эксперимента отмечалось его некоторое увеличение (до 30,5±0,8%о, р<0,05). Количество дистрофически измененных опухолевых клеток после воздействия ОГ было наиболее значительным на 3-й и 7-е сутки эксперимента (соответственно 30,8±3,5 и 41,5±3,4%) по сравнению со «спонтанным» развитием карциносаркомы (соответственно 16,2±1,9и 18,8±1,6%).

Паренхиматозный компонент карциносаркомы Walker 256 был уменьшен через 3,7 и 14 сут после воздействия ОГ соответственно в 1,27,1,29 и 1,2 раза. Уменьшение объемной плотности паренхимы было обусловлено увеличением зон некроза (в 2,6 раза), нарастающим отеком и кровоизлияниями. Апоптотическая гибель клеток после воздействия ОГ возрастала соответственно в 4,0 и 2,8 раза на 3-й и 7-е сутки исследования; доля таких клеток составляла 2,8±0,5 и 3,3±0,3%о.

Через 3 сут после воздействия ОГ отмечалась гетерогенность эндо-телиальных клеток кровеносных капилляров. В одних эндотелиоцитах наблюдалось большое содержание органелл белкового синтеза (цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом); в других — цитоплазма была слабо структурирована. На 7-е сутки и в большей степени на 14-е сутки после ОГ в кровеносных капиллярах карциносаркомы Walker 256, расположенных по периферии опухолевого роста, сохранялись и возрастали структурные изменения, связанные с набуханием клеток, потерей связи эндотелиоцитов с базальной мембраной и разрыхлением межэндотелиальных контактов, уменьшением содержания цитоплазматических органелл.

При сравнении морфометрических показателей эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 после воздействия ОГ и эндотелиоцитов при «спонтанном» развитии опухолевого процесса на 3-й и 7-е сутки было выявлено снижение объемной плотности митохондрий на 52 и 65%, микропиноцитозных везикул: люминальных - на 70 и 48%,

цитоплазматических — на 70 и 40%, базальных — на 50 и 28%. Концентрация крист митохондрий была снижена на 29 и 46%, по сравнению с показателями контрольной группы (7,8±0,12 и 8,2±0,17, соответственно). Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была больше соответствующего значения в контроле на 35 и 54%, соответственно. На 7-е сутки достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных, рибосом, по сравнению с соответствующими величинами в контроле и с соответствующими величинами при спонтанном развитии опухоли.

На 14-е сутки после воздействия ОГ отмечали возрастание объемной плотности митохондрий на 74% из-за набухания. При этом концентрация крист митохондрий снижалась на 54%. Объемная плотность микропино-цитозных везикул уменьшилась: люминальных - на 57%, цитоплазматических - на 30%, базальных - на 46%. Достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных рибосом, по сравнению с интактными животными и «спонтанным» развитием опухоли. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была меньше на 11%, чем при «спонтанном» развитии опухолевого процесса.

Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после воздействия циклофосфана. После воздействия ЦФ, начиная с 7-х суток и до конца эксперимента, размеры карциносаркомы Walker 256 уменьшались по сравнению со «спонтанным» ростом (соответственно в 2,6 и 3,7 раза - 9,7±2,3 и 10,3±1,5см3, р<0,05). Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал (соответственно на 62 и 73%), достигая наибольшего значения к концу эксперимента.

Через 3 сут после воздействия ЦФ опухоль была представлена преимущественно светлыми клетками, темные клетки образовывали небольшие скопления и немногочисленные тяжи. Отмечалось уменьшение полиморфизма ядер опухолевых клеток. Сосуды были полнокровными, содержали лейкоциты. Наиболее значительные изменения архитектоники карциносаркомы Walker 256 происходили через 7 сут после введения ЦФ. В опухолевом узле практически не регистрировались «светлые» клетки, основную массу составляли мелкие округлые или вытянутые клетки с гиперхромными ядрами. Сохранившиеся светлые клетки часто были многоядерными, обособлялись, цитоплазма их образовывала выросты; такие морфологические превращения клеток отражали их миграционную способность, т.е. способность к метастазированию. Сохранявшиеся в опухолевом узле мышечные волокна подвергались значительным литическим изменениям. Отмечалось фиброзирование опухолевого узла. Опухоль содержала значительное количество тонкостенных сосудов капиллярного типа, чаще ветвящихся. Через 14 сут после воздействия ЦФ происходила реверсия фенотипа опухоли, в ней опять преобладали светлые клетки, которые образовывали гроздьевидные скопления по периферии опухолевого узла. В центре опухолевого узла располагались более мономорфные клетки

меньших размеров. По всему объему опухоли встречались варьирующие по размерам очаги некроза.

Митотический индекс опухолевых клеток снижался через 3 и 7 сут после воздействия ЦФ в 1,3 и 1,4 раза по сравнению со «спонтанным» ростом (24,3±0,8%о и 22,3±1,6%о); к 14-м суткам отмечалось его некоторое увеличение, но прирост был незначительным.

Объемная плотность дистрофически измененных опухолевых клеток при воздействии ЦФ возрастала только через 7 сут эксперимента (38,5±1,8), в остальные сроки она достоверно не изменялась. Объемная плотность очагов некроза после воздействия ЦФ возрастала, но не достоверно. Апоптотический индекс достигал максимальных значений на 3-й и 7-е сутки исследования и был выше соответственно в 6,3 и 5,0 раза, чем при «спонтанном» росте.

По данным ультраструктурного анализа, через 3 сут после введения ЦФ в карциносаркоме Walker 256 присутствовали 2 типа опухолевых клеток, находившихся на разных стадиях дифференцировки. В кровеносных капиллярах отмечалось набухание одних эндотелиоцитов; в других

— сохранялось повышенное содержание органелл белкового синтеза. На протяжении всего эксперимента практически не определялись микропино-цитозные везикулы. Начиная с 7-х суток после введения ЦФ наблюдалось увеличение электронной плотности эндотелиоцитов. Объемная плотность митохондрий в эндотелиоцитах снижалась в динамике эксперимента (соответственно на 33,41 и 49%). Объемная плотность микропиноцитозных везикул также снижалась: люминальных - на 81, 52 и 35%, цитоплазматических - на 85, 62 и 57%, базальных — на 77, 56 и 57%, относительно «спонтанного» развития карциносаркомы. На протяжении всего срока эксперимента достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных рибосом. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была уменьшена на 61, 69 и 72%.

Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после воздействия мелатонина. После воздействия МТ объем опухоли через 3 сут возрастал в 5,8 раза (до 14,5± 1, 5 см3), через 7 и 14 сут

- снижался (до 17,6±1,7 и 26,4±4,1 см3) по сравнению со «спонтанным» ростом. Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал и сохранялся на том же уровне до конца эксперимента (31 и 30%).

На протяжении всего эксперимента митотическая активность клеток карциносаркомы под действием МТ снижалась, в большей степени на 3-й и 7-е сутки - в 1,5 раза. Объемная плотность дистрофически измененных опухолевых клеток после воздействия МТ возрастала в 1,8 и 1,7 раза соответственно на 3-й и 7-е сутки эксперимента.

Через 3-7 сут после воздействия МТ отмечалось усиление структурированности опухолевого узла: по периферии узла светлые клетки образовывали псевдофолликулярные структуры (гнездные, гроздьевидные скопления), в центре - преобладали более мономорфные клетки, среди

которых располагались темные клетки, иногда образовывавшие тяжи. Опухоль была хорошо васкуляризирована; сосуды были полнокровными. В опухолевом узле регистрировались многочисленные мелкие очаги некроза, что обусловливало снижение объемной плотности паренхимы карциносаркомы по сравнению со спонтанным развитием опухоли. При воздействии МТ наблюдалось также усиление апоптотической гибели опухолевых клеток; апоптотический индекс возрастал соответственно в 9,3; 6,4 и 3,3 раза по сравнению с данным показателем при «спонтанном» росте карциносаркомы. К 14-м суткам в опухоли различались сформированные утолщенные соединительнотканные септы, которые разделяли опухоль на псевдофоликуллярные структуры. Вокруг опухолевого узла образовывалась соединительнотканная капсула, которая была разрыхленной, отечной. В этой зоне формировались многочисленные лимфатические сосуды си-нусоидного типа, в которьгх регистрировались опухолевые клетки. В этот же срок наблюдался значительный лизис мышечных волокон.

По данным ультраструктурного анализа, на протяжении всего эксперимента в карциносаркоме присутствовали 2 типа опухолевых клеток, чаще на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. К 14-м суткам появлялись опухолевые клетки на 3-й стадии дифференцировки.

Такая морфологическая картина была характерна для всех выбранных схем противоопухолевой терапии с включением МТ. Включение МТ в схемы противоопухолевой терапии обусловлено его антиоксидантной активностью и способностью ингибировать спонтанный и индуцированный опухолевый рост (Martins Е. et al., 1998; Anisimov V.N. et al., 2006). Кроме того, проведенное исследование позволяет полагать, что МТ является индуктором морфогенетических процессов, способствуя изменению архитектоники опухоли (формированию псевдофолликулярной структуры).

Через 3 сут после введения МТ регистрировалась выраженная гетерогенность эндотелиоцитов кровеносных капилляров: одни клетки выглядели набухшими, деструктурированными, другие - отличались конденсированной, электронно-плотной цитоплазмой. Через 7 и 14 сут эти ультраструктурные изменения эндотелиоцитов сохранялись. В выстилке кровеносных капилляров, наряду с эндотелиальными клетками, к концу эксперимента появлялись и опухолевые клетки. После введения МТ в эндотелиоцитах происходило снижение объемной плотности митохондрий (к 14-м суткам - на 45%); концентрация крист в них снижалась на 46%. Уменьшалась также объемная плотность микропиноцитозных везикул (люминальных - на 46,42 и 40%; цитоплазматических - на 57,49 и 51%, базальных- на 48,51 и 34%). Достоверно снижалась численная плотность митохондрий. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети снижалась на протяжении всего эксперимента (в большей степени на 3 сутки — на 63%). Численные плотности прикрепленных и свободных рибосом также были уменьшены на протяжении всего эксперимента (в большей степени на 14-е сутки — соответственно на 70 и 71%).

Патоморфологическис изменения перевиваемой карциносаркомы Walker256 после сочетанного воздействия общей гипертермии и цик-лофосфана. После сочетанного воздействия ОГ и ЦФ объем опухолевого узла, начиная с 7-х суток и до конца эксперимента, значительно уменьшался (соответственно в 3,4 и 16,9 раза по сравнению со «спонтанным» ростом, составляя 7,4±0,9 и 2,2±0,4 см3). Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал к концу эксперимента и составил 94%.

На 3-й сутки эксперимента после сочетанного воздействия ОГ и ЦФ опухолевый узел был представлен преимущественно мономорфными клетками, по периферии - светлыми клетками, образовывавшими псевдофолликулярные структуры. Через 7 сут, также как и после воздействия только ЦФ, в опухолевом узле практически отсутствовали светлые клетки, преобладали мелкие саркоматозные вытянутые клетки. По периферии опухолевого узла отмечался значительный отек, переход крупных опухолевых клеток в асцитное состояние. Такие значительные изменения архитектоники опухолевого узла исчезали к 14-м суткам. В этот срок карциносаркома имела вновь такое же строение, как и через 3 сут после сочетанного воздействия ОГ и ЦФ: по периферии доминировали псевдофолликулярные (псевдожелезистые) структуры из светлых клеток, в центре располагались более мономорфные клетки. Небольшие очаги некроза были рассеяны по всей толще опухолевого узла. Во все сроки отмечалась хорошая васкуляризация опухолевого узла; сосуды были в основном полнокровными.

Митотический индекс снижался на 3-й и 7-е сутки опыта в 1,5 и 1,6 раза (соответственно до 23,1 ±0,9 и 19,2±1,7%о, р<0,01) по сравнению со «спонтанным» ростом, но к 14-м суткам незначительно возрастал.

Объемная плотность дистрофически измененных опухолевых клеток при сочетанном воздействии ОГ и ЦФ была увеличена в 2,5; 2,3 и 1,8 раза соответственно через 3, 7 и 14 сут эксперимента. Объемная плотность паренхиматозного компонента на протяжении всего эксперимента достоверно снижалась (соответственно в 1,3; 1,3 и 1,2 раза) по сравнению со «спонтанным» ростом. Это было сопряжено с увеличением объемной плотности очагов некрозов, начиная с 7-х суток эксперимента. Значительно возрастал также апоптотический индекс (в 10,3, 6,2 и 3,4 раза через 3, 7 и 14 сут после воздействий).

По данным ультраструктурного анализа, через 3 сут эксперимента отмечалась деструкция митохондрий и расширение цистерн гранулярной цитоплазматической сети в опухолевых клетках 1-го и 2-го типов 5-й стадии дифференцировки. В опухолевых клетках на 5-й стадии дифференцировки присутствовали многочисленные вторичные лизо-сомы, что отражало усиление катаболических процессов. Через 7 сут после сочетанного воздействия ОГ и ЦФ в опухолевом узле выявлялись малодифференцированные и средней стадии дифференцировки опухолевые клетки 1-го и 2-го типов. К концу эксперимента встречались опу-

холевые клетки 1-го и 2-го типов на разных стадиях дифференцировки

Через 3 и 7 сут после сочетанного воздействия ОГ и ЦФ в эндотелио-цитах кровеносных капилляров, расположенных по периферии опухолевого узла, происходило усиление электронной плотности цитоплазмы; наблюдалась деструкция митохондрий. Регистрировались новообразованные кровеносные капилляры. Через 14 сут в эндотелиальной выстилке кровеносных капилляров появлялись эндотелиоциты с большим содержанием органелл белкового синтеза. Однако практически не определялись микропиноцитозные везикулы.

В эндотелиоцитах происходило снижение объемной плотности митохондрий на 28,33 и 41%; микропиноцитозных везикул: люминальных - на 55, 49 и 46%, цитоплазматических - на 35, 42 и 45%, базальных- на 45, 56 и 64%, соответственно через 3,7 и 14 сут эксперимента. Концентрация крист митохондрий также была снижена на протяжении всего срока эксперимента соответственно на 50, 58 и 54% по сравнению со «спонтанным» развитием опухоли. Численные плотности свободных и прикрепленных рибосом снижались на протяжении всего эксперимента, но в большей степени на 7-е сутки (соответственно на 56 и 62%). Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была уменьшена на протяжении всего эксперимента, но в большей степени на 3-е сутки (на 44%).

Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после сочетанного воздействия общей гипертермии и ме-латонина. После сочетанного воздействия ОГ и МТ объем опухолевого узла, начиная с 3 -х суток, изменялся волнообразно: на 3 -и сутки - в 5,7 раза превышал контрольный уровень (14,4±1,8 см3); на 7-е сутки-уменьшался в 2 раза (12,5±1,0 см3) по сравнению со «спонтанным» ростом; на 14-е сутки - вновь возрастал практически до контрольного уровня контроля (35,3±14,2 см3). Показатель ТРО, к 7-м суткам эксперимента достигал 51%. К концу эксперимента показатель ТРО снижался (6%), но достоверно отличался от контроля.

На протяжении всего эксперимента опухоль была представлена псевдофолликулярными структурами, расположенными по периферии и образованными большими «светлыми» клетками (часто вакуолизиро-ванными); в центральной зоне располагались более мономорфные клетки, «темные» клетки встречались редко. К 14-м суткам были выявлены сформированные утолщенные соединительнотканные септы, которые разделяли опухоль на псевдофоликуллярные структуры. Во все сроки наблюдались полнокровие сосудов и мелкоочаговый некроз опухолевых клеток, который обусловливал снижение объемной плотности паренхиматозного компонента. Установлено также увеличение апоптотического индекса, который к 14-м суткам был выше контрольного значения в 3,8 раза. Одновременно воздействие ОГ и МТ вызывало снижение митоти-ческого индекса через 3, 7 и 14 сут соответственно в 1,7; 1,5 и 1,4 раза по сравнению со «спонтанным» ростом.

По данным ультраструктурного анализа, через 3 сут после воздействия ОГ и МТ по периферии опухолевого роста выявлялись 2 типа опухолевых клеток, находившихся преимущественно на 1-й и 2-й стадиях диффе-ренцировки с сохранной цитоплазмой и структурой ядра. Через 7 сут в малодифференцированных клетках карциносаркомы Walker 256 отмечали структурные признаки развивающегося апоптоза. Однако по периферии опухолевого роста располагались опухолевые клетки 1-го и 2-го типов на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки и в состоянии митоза. Через 14 сут после воздействия ОГ и МТ во многих опухолевых клетках, находившихся на разных стадиях дифференцировки, отмечались ультраструктурные признаки апоптоза. По периферии опухолевого узла располагались опухолевые клетки 1-го и 2-го типов на 3-й и 4-й стадиях дифференцировки.

Через 3 и 7 сут после сочетанного воздействия ОГ и МТ происходило усиление электронной плотности эндотелиоцитов кровеносных капилляров, в то же время в эндотелиальной выстилке присутствовали набухшие и деструктурированные эндотелиоциты. Через 14 сут происходило истончение эндотелиальной выстилки кровеносных капилляров, расположенных по периферии опухолевого роста. Сохранялись электронно-плотные и деструк1урированные формы эндотелиоцитов.

После сочетанного воздействия ОГ и МТ в эндотелиоцитах происходило снижение (на 35%) объемной плотности митохондрий и концентрации крист в них (в большей степени на 7-е сутки — на 52%). Заметно снижалась объемная плотность микропиноцитозных везикул: люминальных

- на 28, 48 и 45%, цитоплазматических - на 41, 43 и 40%, базальных - на 47, 55 и 38%. Достоверно снижались численные плотности свободных и прикрепленных рибосом, а также объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети.

Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после сочетанного воздействия циклофосфана и мела-тонина. Объем опухолевого узла после сочетанного воздействия ЦФ и МТ, начиная с 7-х суток эксперимента, уменьшался в 12,3 и 15,6 раза (до 2,1±0,2 и 2,4±1,5 см3, р<0,05) по сравнению со «спонтанным» ростом. Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал на 92 и 94% по сравнению с контролем.

Через 3 сут после сочетанного воздействия ЦФ и МТ отмечались выраженные некротические изменения опухолевых клеток: в одних зонах

- диффузные, в других - очаговые; по периферии отмечался распад ткани. В структуре опухолевого узла преобладали псевдофолликулярные образования, в центральных зонах - скопления мономорфных эозинофильных клеток. К 7-м суткам происходило значительное изменение строения и архитектоники опухолевого узла: в нем практически исчезали «светлые» клетки, значительная часть опухоли была представлена вытянутыми саркоматозными клетками, инфильтрирована лимфоцитами. Встречавшиеся между этими клетками мышечные волокна подвергались литическим

превращениям и резорбции. Через 14 суг происходила реверсия фенотипа опухоли: опухолевый узел вновь был образован преимущественно «светлыми» клетками, которые образовывали псевдофолликулярные структуры, располагавшиеся по периферии, в центре опухоли - скопления мономорф-ных эозинофильных клеток с небольшими очагами некроза. Митотический индекс был ниже соответственно в 1,8; 1,8 и 1,4 раза через 3, 7 и 14 сут после воздействия по сравнению с контрольной группой.

Увеличение объемной плотности очагов некрозов после сочетанного воздействия ЦФ и МТ сопровождалось снижением объемной плотности паренхимы опухоли. Во все сроки эксперимента возрастал апоптотичес-кий индекс опухолевых клеток (наиболее значительно на 14-е сутки - в 5,7 раза).

По данным ультраструктурного анализа, на протяжении всего эксперимента в карциносаркоме присутствовали малодиффенцированные клетки обоих типов, в то же время встречались опухолевые клетки 2-го типа на 5-й стадии дифференцировки с большим содержанием вторичных лизосом и деструкцией органелл, что свидетельствовало о развитии в них деструктивных процессов.

Через 3 сут после воздействия сочетания ЦФ и МТ в кровеносных капиллярах отмечалось набухание эндотелиоцитов, разволокнение ба-зальной мембраны, отек периваскулярных пространств. Цитоплазма эндотелиоцитов содержала большое количество органелл белкового синтеза - цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом.

Через 7 сут после воздействия сочетания ЦФ и МТ наблюдалась гетерогенность эндотелиоцитов кровеносных капилляров: в эндотелиальной выстилке присутствовали как новообразованные, так и деструктивно измененные эндотелиоциты. Цитоплазма новообразованных эндотелиоцитов содержала большое количество органелл белкового синтеза - цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом. В некоторых эндотелиоцитах были значительно расширены цистерны гранулярной цитоплазматической сети. Отмечалось набухание и деструкция отдельных эндотелиоцитов. Присутствовали также клетки с повышенной электронной плотностью. В просвете капилляров наблюдались опухолевые клетки.

Через 14 сут после воздействия ЦФ и МТ на периферии опухолевого роста встречались эндотелиоциты с хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сетью, большим количеством прикрепленных и свободных рибосом. Встречались также набухшие и электронно-плотные эндотелиоциты.

После сочетанного воздействия ЦФ и МТ на протяжении всего эксперимента и в большей степени на 3-й сутки происходило снижение объемной плотности митохондрий эндотелиоцитов на 28% по сравнению со спонтанным развитием опухолевого процесса (8,2±0,2%). В связи с

набуханием органелл концентрация крист митохондрий была снижена на протяжении всего срока эксперимента, в большей степени на 14-е сутки - на 48% по сравнению со спонтанным развитием опухоли (8,5±0,3). Объемная плотность микропиноцитозных везикул уменьшалась также на протяжении всего срока эксперимента: люминальных - на 32, 41 и 34%, цитоплазматических - на 57, 50 и 51%, базальных - на 51, 53 и 36% соответственно. Достоверно снижалась численная плотность митохондрий. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была снижена на протяжении всего эксперимента, в большей степени на 3-й сутки (18,3±0,2%). Численные плотности прикрепленных и свободных рибосом также были уменьшены на протяжении всего эксперимента, в большей степени на 14-е сутки-на 76 и 69% (42,5±1,7 и 35,4±1,8).

Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после сочетанного воздействия общей гипертермии, цик-лофосфана и мелатонина. Объем опухолевого узла после сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ значительно снижался - в 22,6 и 18,0 раз, начиная с 7-х и до 14-х суток (соответственно до 1,1 ±0,1 и 2,1 ±0,5 см3), по сравнению со «спонтанным» развитием. Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, увеличивался на 96 и 94% по сравнению с контролем.

Через 3 сут после сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ опухолевый узел по периферии был представлен псевдофолликулярными структурами, в центральных зонах - скоплениями эозинофильных клеток с выраженным полиморфизмом ядер. В некоторых случаях отмечалось разрыхление периферических участков с переходом полиморфных опухолевых клеток в асцитное состояние. Небольшие очаги некроза опухолевых клеток были рассеяны по толще карциносаркомы. Через 7 сут после сочетанного воздействия происходила выраженная редукция «светлых» клеток в опухолевом узле, особенно по периферии, преобладающей была популяция мелких веретеновидных клеток. Отмечалось развитие фиброза вдоль сосудов. Через 14 сут в результате формирования массивных очагов некроза опухолевые узлы были разделены на несколько фрагментов, в каждом из которых возникали очаги опухолевого роста с присущей карциносаркоме Walker 256 гистоархитектоникой. По периферии образовавшихся компактных фрагментов располагались псевдофолликулярные структуры из «светлых» клеток, в центре-относительно мономорфные эозинофильные клетки; в некоторых участках встречались скопления и тяжи из «темных» саркоматозных клеток. Во все сроки наблюдения отмечалось выраженное полнокровие сосудов.

Митотический индекс был в 1,8; 1,7 и 1,6 раза ниже, чем в соответствующие сроки «спонтанного» роста опухоли. Объемная плотность паренхиматозного компонента карциносаркомы Walker 256 через 3, 7 и 14 сут после воздействия ОГ, ЦФ и МТ была уменьшена соответственно в 1,3; 1,4 и 1,3 раза по сравнению с соответствующими фазами развития опухоли без воздействий. Объемная плотность очагов некрозов опухолевых клеток

в данной группе возрастала во все сроки эксперимента. Апоптотический индекс опухолевых клеток был достоверно выше на протяжении всего эксперимента, чем при «спонтанном» развитии опухолевого узла, но особенно через 14 сут (13,8±0,6%о, р<0,01).

По данным ультраструктурного анализа, через 3 сут после сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ в карциносаркоме Walker 256 присутствовали как малодифференцированные опухолевые клетки 1-го типа, так и деструктивно измененные клетки 2-го типа, в которых отмечалось накопление липидных включений. Через 7 сут процессы деструкции, апоптотической трансформации опухолевых клеток 1-го и 2-го типов усиливались. Одновременно сохранялся пул неповрежденных опухолевых клеток обоих типов. Через 14 суток после воздействия ОГ, ЦФ и МТ ультраструюурные изменения опухолевых клеток обоих типов были аналогичны таковым через 3 сут.

Через 3 и 7 сут после сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ возрастала электронная плотность эндотелиоцитов кровеносных капилляров, расположенных по периферии опухолевого роста. Отмечались истончение эндотелиальной выстилки, фрагментация клеток, появление фрагментов эндотелиальных клеток в просветах капилляров. Через 14 сут регистрировалась структурно-функциональная гетерогенность эндотелиоцитов кровеносных капилляров, расположенных по периферии опухолевого узла: одни эндотелиоциты были деструктурированными, набухшими, другие

- отличались усилением электронной плотности и содержанием вакуолей. Практически не определялись микропиноцитозные везикулы. Контакты между эндотелиальными клетками были неплотными. Описанные изменения кровеносных сосудов при развитии опухолевого процесса отражают как реорганизацию существующих сосудов, так и их новообразование.

После сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ на протяжении всего эксперимента и в большей степени на 7-е и 14-е сутки снижалась объемная плотность митохондрий и концентрация крист митохондрий. Объемная плотность микропиноцитозных везикул также уменьшалась: люминаль-ных-на 32, 48 и 56%, цитоплазматических - на 47, 54 и 53%, базальных

- на 40, 56 и 62%, по сравнению со «спонтанным» развитием опухоли. Достоверно снижались численные плотности свободных и прикрепленных рибосом. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети снижалась через 3 и 7 сут соответственно на 54 и 46%, но через 14 сут данный показатель возрастал на 22% по сравнению с контрольным уровнем.

Иммуногистохимический анализ экспрессии белков семейства Bcl-2 в карциносаркоме Walker 256 в условиях спонтанного развития и при воздействии общей гипертермии и цитостатиков. Цитотоксическое действие большинства противоопухолевых препаратов реализуется через индукцию апоптоза, вне зависимости от конкретного механизма действия каждого из них (Владимирская Е.Б. и др., 1997). Апоптоз рассматривается в качестве одного из факторов, сдерживающих рост опухоли на ранних ста-

днях развития. По данным ряда исследований, Bcl-2, Bcl-XL и Вах могут принимать участие в формировании ионно-проводящих пор в липидном бислое митохондрий, образуя для этого димеры или олигомеры (Schlesinger Р.Н. et al., 1997). Считается, что при определенных обстоятельствах, в частности, при развитии оксидативного стресса, возможны значительное падение и/или потеря мембранного потенциала митохондрий, которые могут носить необратимый характер. В результате этих изменений возможен выход цитохрома с из межмембранного митохондриального пространства в цитозоль, его связывание с апоптоз-активирующим фактором-1 (Apaf-1) и формирование комплекса с каспазой-9 (Lesnicar Н., Budihna М., 1989), которая, в свою очередь, запускает каскад протеолитических реакций и активирует другие каспазы. Несмотря на то, что Вс1-2 и Вах могут образовывать гетеродимеры и нейтрализовать действие друг друга через непосредственное взаимодействие, по-видимому, оба белка могут также модулировать функции митохондрий и развитие апоптоза независимо друг от друга (Belzacq A.-S. et al., 2003).

В последнее время показано, что белки семейства Вс1-2 могут принимать участие в реализации других механизмов апоптотической гибели клеток, не зависимых от высвобождения цитохрома с из митохондрий (Zecchin K.G. et al., 2007). Установлено также, что Вс1-2 может реализовать свои цитопротекторные свойства через усиление экспрессии сурвивина, ингибирование аккумуляции р53 и р38МАРК (Kumar Р. et al., 2007). При этом гиперэкспрессия Вс1-2 связана с усилением малигнизации и мета-стазирования некоторых опухолей за счет индукции генной экспрессии матриксной металлопротеиназы-2 (Choi J. et al., 2005).

При «спонтанном» развитии карциносаркомы Walker 256 не было выявлено достоверных различий между уровнем экспрессии белков Вс1-2 и Вах (табл. 3). Уровень экспрессии Bad был достоверно выше, чем Вс1-2 и Вах соответственно в 1,6 и 1,7 раза.

Важное значение для характеристики пролиферативной активности клеток, их выживаемости и возможностей индукции апоптоза имеет оценка отношения Bcl-2/Bax. По современным представлениям, соотношение Bcl-2/Bax является ключевым фактором в регулирования апоптоза. Белки Вс1-2 и Вах находится в состоянии постоянного динамического равновесия, они образуют как гомо-, так и и гетеродимеры, что может приводить к развитию апоптоза клеток (Chinaiyan A.M., 1996). Считается, что низкое отношение Bcl-2/Bax может обусловливать развитие апоптоза, в то время как при высоких показателях может отмечаться устойчивость клеток к апоптотическим стимулам (Vaskivuo Т.Е. et al., 2002). Через 5 сут спонтанного развития карциносаркомы Walker 256 отношение Bcl-2/Bax составляло 1,04, а отношение Bcl-2/Bad - 0,61. Ранее было показано, что высокий уровень Bcl-2/Bax предотвращает митохондрии от повреждения, но это не исключает другого механизма развития апоптоза (Zecchin K.G. et al., 2007).

Таблица 3. Экспрессия белков семейства Вс1-2 в перевиваемой карциносар-коме Walker 256 после воздействия общей гипертермии, мелатонина и цнк-лофосфана (М±т)

Группа Сутки Вс1-2, % Вах, % Bad, %

Трансплантация клеток карциносар-комы Walker-256 в мышцу бедра («спонтанный» рост, контроль) 5-е 19,86±1,52 19,13±2,05 32,59±1,81

Трансплантация клеток карцино-саркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии 7-е 13,06±1,48* 71,52±4,49* 68,06±3,58*

14-е 8,91±1,41* 33,47±1,59* 70,58±1,95*

Трансплантация клеток карцино-саркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонина 7-е 5,93±1,49* 36,09±2,56* 35,00±2,57

14-е 5,04±0,54* 12,97±1,41 9,2 8± 1,47*

Трансплантация клеток карци-носаркомы Walkeг-256 в мышцу бедра и воздействие циклофосфана 7-е 18,92±1,73 28,56±2,73 21,62±0,99*

14-е 23,07±1,76 25,54±1,71 16,12±1,16*

Трансплантация клеток карци-носаркомы \Valker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином и циклофосфаном 14-е 9,34±1,63* 29,19±2,55* 70,51±2,48*

Трансплантация клеток карци-носаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонина в сочетании с циклофосфаном 14-е 3,03±0,34* 25,45±0,73 24,91±3,17

Примечание. * — р < 0,05 по сравнению со «спонтанным» развитием опухоли.

При воздействии ОГ на протяжении всего эксперимента резко возрастал уровень экспрессии промоторов апоптоза Вах и Bad, инициирующих программируемую клеточную смерть в присутствии ингибиторов каспаз. Уровень экспрессии Bad через 7 и 14 сут после воздействия ОГ был выше уровня при «спонтанном» развитии опухоли соответственно в 2,1 и 2,2 раза. Экспрессия проапоптогенного белка Вах через 7 и 14 сут была также выше соответствующего показателя в контроле соответственно в 3,7 и 1,7 раза. Уровень экспрессии антиапоптогенного белка Вс1-2 после ОГ был ниже на протяжении всего эксперимента, чем у животных со «спонтанным» развитием опухоли, в большей степени на 14-е сутки эксперимента (в 2,2 раза). Отношение Bcl-2/Bax через 7 сут эксперимента снижалось до 0,18, а Bcl-2/Bad — до 0,19, т.е. эти отношения были уменьшены на 83 и 69% по сравнению со «спонтанным» ростом опухоли. Через 14 сут отношение Bcl-2/Bax составляло 0,27, а Bcl-2/Bad - 0,13, т.е. эти отношения были уменьшены соответственно на 74 и 79%.

Однократное введение ЦФ существенно не влияло на экспрессию антиапоптогенного белка Вс1-2 на протяжении всего эксперимента, хотя через

7 сут отмечалось незначительное снижение интенсивности окрашивания срезов. Одновременно выявлено увеличение уровня экспрессии проапоп-тогенного белка Вах через 7 и 14 сут эксперимента—соответственно на 49 и 34%. Экспрессия проапоптогенного белка Bad была достоверно ниже, чем в контрольной группе, особенно на 14-е сутки, — соответственно в 1,5 и 2,0 раза (см. табл. 3). При этом экспрессия Вах и Bad была выше, чем Вс1-2 соответственно на 51 и 14% через 7 сут эксперимента. Через 14 сут экспрессия Вс1-2 и Вах существенно не различалась, в то время как экспрессия Bad была снижена по сравнению с Вс1-2 на 30%. Отношение Bcl-2/Bax через 7 сут эксперимента уменьшилось до 0,66, через 14 сут оно возросло до 0,90, приближаясь к контрольному уровню. Отношение Bcl-2/Bad через 7 сут эксперимента равнялось 0,88, через 14 сут - 1,43.

Ежедневное введение МТ вызывало значительное снижение уровня экспрессии Вс1-2 - соответственно в 3,4 и 3,9 раза через 7 и 14 сут при сравнении с контролем (см. табл. 3). Отмечалось как уменьшение количества позитивно окрашенных клеток, так и интенсивности окрашивания отдельных клеток. На 7-е сутки эксперимента возрастала экспрессия проапоптогенных белков Вах и Bad. Особенно значительно увеличивалась экспрессия Вах - на 89% при сравнении с контрольной группой. К 14-м суткам происходило снижение экспрессии проапоптогенных белков: Вах - на 32%, Bad - на 72% при сравнении с контрольной группой и соответственно в 2,8 и 3,8 раза при сравнении с показателями через 7 сут. Отношение Bcl-2/Bax через 7 сут эксперимента существенно уменьшалось и составляло 0,16, через 14 сут оно возрастало до 0,39, но было значительно меньше, чем при спонтанном развитии опухоли. Отношение Bcl-2/Bad также было значительно уменьшенным через 7 сут эксперимента - 0,17, через 14 сут оно повышалось, но оставалось уменьшенным по сравнению с контролем - 0,54.

При сочетанном воздействии ЦФ и МТ на протяжении всего эксперимента происходило снижение в 6,6 раза уровня экспрессии белка Вс1-2 по сравнению с контролем. При этом выявлялась значительная гетерогенность опухолевых клеток по содержанию Вс1-2. Однако уровни экспрессии проапоптогенных белков Вах и Bad достоверно не отличались от контрольного уровня. В отличие от Вс1-2 проапоптогенные белки Вах и Bad более равномерно распределялись по ткани опухоли. Отношения Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad при сочетанном воздействии ЦФ и МТ достигали самых низких значений через 14 сут эксперимента - 0,12.

При сочетанном воздействии ЦФ и МТ с ОТ на протяжении всего эксперимента было выявлено снижение в 2,1 раза уровня экспрессии белка Вс1-2 по сравнению с контролем. Уровни экспрессии проапоптогенных белков Вах и Bad после сочетанного применения ОГ, ЦФ и МТ достоверно возросли в 1,5 и 2,2 раза, соответственно. Отношение Bcl-2/Bax через 14 сут эксперимента равнялось 0,32, а Bcl-2/Bad - 0,13, т.е. эти отношения были уменьшены соответственно на 69 и 79%.

Полученные данные свидетельствуют о значительном снижении экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 и усилении экспрессии про-апоптотических белков Вах и Bad в опухолевых клетках карциносаркомы Walker 256 после введения ЦФ и МТ как в качестве моноагентов, так и в сочетании друг с другом и с ОГ. Через 14 сут после воспроизведения ОГ, введения ЦФ и МТ и сочетания этих воздействий происходило уменьшение отношения Bcl-2/Bax, наиболее значительно после сочетанного применения ЦФ и МТ (на 88%). Отношение Bcl-2/Bad также снижалось через 14 сут после данных воздействий, кроме ЦФ, наиболее существенно - после ОГ, ЦФ и МТ и сочетания ОГ, МТ и ЦФ - на 79%. Корреляционный анализ выявил сильную отрицательную связь между величиной отношений Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad и величиной апоптотического индекса (соответственно г = -0,81 и г = -0,61). Выявленная взаимосвязь позволяет считать, что изменение экспрессии и соотношений проапоптогенных и антиапоптогенного белков в клетках карциносаркомы Walker 256 индуцирует их апоптотическую гибель.

Метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256 в динамике опухолевого роста и после воздействия общей гипертермии, цик-лофосфана и мелатонина. Одной из патобиологических характеристик карциносаркомы Walker 256 является ее склонность к метастазированию, преимущественно в регионарные по отношению к месту ее трансплантации лимфатические узлы. При определении интенсивности метастазирова-ния рассчитывали частоту метастазирования опухоли, которую определяли как отношение числа животных с метастазами в подвздошных и паховых лимфатических узлах к общему количеству крыс в группе.

По данным проведенного светооптического исследования, карциносар-кома Walker 256 метастазирует по гематогенному и лимфогенному типу. В динамике развития опухолевого узла, начиная с 7-х суток эксперимента в подвздошных и паховых лимфатических узлах, были обнаружены метастазы, их частота составляла 28,6±1,7%. К 14-м суткам частота метастазирования значительно возрастала и составляла 85,7±3,8%.

Воздействие ОГ вызывало усиление метастазирования. Метастазы определялись в подвздошных лимфатических узлах начиная с 3-х суток от момента воздействия (16,7±0,9%), с 7-х суток и до конца эксперимента частота метастазов возрастала соответственно в 2,3 и 1,2 раза (соответственно до 66,7±1,5 и 100% при сравнении с контрольной группой). Цитостатическая терапия ЦФ существенно подавляло метастазирование: метастазы выявлялись только к 14-м суткам после воздействия с частотой 20,0±0,6%. После воздействия МТ метастазы в лимфатических узлах выявлялись через 7 и 14 сут с частотой соответственно 16,7±0,7 и 25,0±1,7%, то есть реже в 1,7 и 3,4 раза, чем при «спонтанном» развитии опухоли. При сочетании МТ с ОГ метастазы выявлялись только через 14 сут с частотой 50,0±2,8%. После воздействия МТ, ЦФ и ОГ метастазы также регистрировались только через 14 сут эксперимента с частотой 28,6±2,0%.

Сочетанное использование ЦФ с МТ или ОГ приводило к полному отсутствию метастазирования на протяжении всего эксперимента.

Полученные результаты свидетельствуют о наиболее выраженном антиметастатическом эффекте ЦФ и его сочетаниях с МТ и ОГ.

Синдром кахексии при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и действии общей гипертермии и цитостатиков. Карци-носаркома Walker 256 относится к модельным опухолям, обусловливающим развитие синдрома анорексии/кахексии, который, в свою очередь, ассоциирован с высокой смертностью в результате катаболизма белков скелетных мышц (Tisdale M.J., 2001; Bennani-Baiti N., Walsh D., 2009).

В условиях естественного роста карциносаркомы Walker 256 масса тела крыс (без учета опухолевого узла) снижалась к 19-м суткам с момента трансплантации на 19%. Через 14 сут после воздействия ОГ отмечено наиболее значительное уменьшение массы тела животных - на 160%, далее заметное снижение массы тела было выявлено после сочетанного воздействия ОГ и МТ (на 27%) и МТ (на 18%). После сочетанного воздействия ОГ, ЦФ и МТ или ЦФ с МТ масса тела крыс снижалась по сравнению с контрольной группой всего лишь на 6 - 8%, что свидетельствовало об отсутствии потери мышечной массы.

В настоящее время описаны некоторые особенности данной опухоли, касающиеся протеолитической активности и выработки медиаторов неопластической кахексии (Yano C.L. et al., 2008; Rebeca R. et al., 2008). При добавлении в культуру миотрубочек С2С12 молекул протеолиз-ин-дуцирующего фактора (PIF), выделенного из асцитной жидкости крыс-носителей карциносакромы Walker 256, было выявлено снижение синтеза белка и усиление его деградации в миотрубочках, сопровождавшиеся их ретракцией (Yano C.L. et al., 2008). Окислительный стресс также рассматривается в качестве одного из триггеров сигнальной трансдукции для активации протеосомальной системы и окисления протеинов (Guarnier F.A. et al., 2010).

По данным проведенного нами патоморфологического анализа карциносаркомы Walker 256, трансплантированной в мышцу бедра, мышечные волокна не только подвергались значительным литическим повреждениям в опухолевом узле, но и активной инвазии опухолевых клеток в мышечные волокна с резорбцией саркоплазмы.

Прооксидантная и антиоксидантная активности сыворотки крови в динамике развития карциносаркомы Walker 256. Согласно современным представлениям, свободные радикалы играют важную роль как в инициации канцерогенеза (вызывая модификацию ДНК), так и промоции опухолевого роста, когда инициированная клетка постепенно приобретает фенотипические черты злокачественной клетки (Зенков Н.К. и др., 2001).

Общая ПОА сыворотки крови интактных крыс составила 0,28±0,003 усл. ед. В динамике развития карциносаркомы Walker 256 ПОА сыво-

ротки крови во все сроки наблюдения достоверно превышала среднее контрольное значение. Через 5 сут развития карциносаркомы Walker 256 ПОА сыворотки крови была максимальной и составляла 0,56±0,01 усл. ед., что в 2,3 раза превышало контрольный уровень (р<0,05). К 7-м и 14-м суткам наблюдения ее средние значения превышали контроль соответственно в 1,6 и 1,5 раза, составляя в среднем 0,38±0,005 и 0,33±0,004 усл. ед. (р<0,05).

В результате определения вторичных, стабильных продуктов ПОЛ в динамике развития карциносаркомы Walker 256 был выявлен примерно одинаковый характер изменений в содержании малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в крови крыс. Уровень МДА в сыворотке крови крыс контрольной группы в среднем составил 0,06±0,004 нМ/мл. Через 5 сут развития карциносаркомы Walker 256 уровень МДА в сыворотке крови крыс достоверно возрастал до 0,077±0,006 нМ/мл (р<0,05). Однако на 7-е сутки его содержание было ниже контроля, а к 14-м суткам наблюдения - соответствовало контролю (соответственно 0,039±0,015 и 0,056±0,005 нМ/мл).

Уровень ДК в сыворотке крови крыс контрольной группы составил 0,39±0,028 нМ/мл. К 5-м суткам развития карциносаркомы Walker 256 уровень ДК в сыворотке крови крыс достоверно возрастал до 0,44±0,015 нМ/мл (р<0,05), в последующем - постепенно снижался. Содержание ДК на 7-е сутки развития карциносаркомы Walker 256 составило 0,41±0,046 нМ/мл, а к 14-м суткам не отличалось от контрольных величин (0,38±0,025 нМ/мл). Эти данные свидетельствуют о том, что на ранних сроках развития карциносаркомы Walker 256 ПОА сыворотки крови крыс значительно повышается, что свидетельствует об активации реакций ПОЛ.

Общая АОА сыворотки крови интактных крыс равнялась 9,6±0,08 усл. ед. В динамике развития карциносаркомы Walker 256 общая АОА сыворотки крыс во все сроки наблюдения была достоверно ниже, чем у крыс контрольной группы. На 5-е сутки общая АОА сыворотки крови была ниже контрольных величин в 1,3 раза (7,38±0,06 усл. ед., р<0,05). К 7-м и 14-м суткам общая АОА сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 была ниже контроля соответственно в 2,4 и 1,6 раза (4,0±0,03 и 6,0±0,05 усл. ед., р<0,05).

Для оценки баланса в системе «про-/антиоксиданты» были произведены расчеты коэффициента соотношения (KJ между показателями ПОА и АОА сыворотки крови крыс. В группе интактных крыс PQ. ПОА и АОА сыворотки крови составил 2,48±0,03 усл. ед. В динамике развития карциносаркомы Walker 256 Кс ПОА и АОА сыворотки крови значительно превышал контрольные цифры. Через 5, 7 и 14 сут Кс ПОА и АОА сыворотки крови крыс соответственно составил 7,42±0,09, 9,53±0,11 и 5,56±0,07 усл. ед. Эти данные свидетельствуют о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов, что говорит о развитии окислительного стресса в организме животных.

Прооксидантная и антиоксидантная активности сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии цик-лофосфаном. Через 3 сут после введения ЦФ интактным крысам ПОА сыворотки крови превышала контроль в 1,25 раза (р<0,05), а к 7-м и 14-м суткам постепенно снижалась: через 7 сут ПОА сыворотки крови была в 1,4 раза (р<0,05) выше, чем в контроле, а через 14 сут - практически не отличалась (табл. 4).

При введении ЦФ крысам с карциносаркомой Walker 256 ПОА сыворотки крови возрастала к 3-м суткам наблюдения в 2,7 раза (р<0,05). Менее выраженное повышение ПОА сыворотки сохранялось через 7 и 14 сут. На фоне умеренного повышения ПОА сыворотки крови через 3 сут после введения ЦФ происходил незначительный рост уровня МДА к 7-м суткам, что, вероятно, связано с цитостатическим действием препарата с активацией реакции ПОЛ. Так, на 3-й сутки после введения ЦФ уровень МДА в сыворотке крови крыс практически не менялся и составлял 0,061 ±0,003 нМ/мл (в контроле —0,06±0,004 нМ/мл). К 7-м суткам после введения ЦФ в крови крыс уровень МДА достоверно повышался до 0,067±0,002 нМ/мл, а к 14-м суткам - напротив, снижался до 0,041 ±0,005 нМ/мл.

На 3-й и 7-е сутки после введения ЦФ крысам с карциносаркомой Walker 256 уровень МДА в крови животных практически не отличался от контрольного. Однако при сравнении с крысами с карциносаркомой Walker 256, которым не вводили ЦФ, выявлено снижение уровня МДА на 3-й сутки после введения цитостатика с последующим ростом его содержания к 14-м суткам наблюдения (до 0,079 ± 0,008 нМ/мл). В отличие от МДА уровень ДК при введении крысам с карциносаркомой Walker 256 ЦФ значительно возрастал, особенно, на 3-й и 7-е сутки наблюдения. В эти сроки средние величины ДК составили соответственно 0,7±0,014 и 0,69±0,06 нМ/мл.

Прооксидантная и антиоксидантная активности сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии мелатонином.

При введении МТ интактным крысам ПОА сыворотки крови умеренно возрастала к 3-м и 7-м суткам наблюдения соответственно в 1,3 и 1,5 раза (р<0,05), а к концу эксперимента (14-е сутки) - достигала контрольного уровня (см. табл. 4).

На 3-й сутки после введения МТ крысам с карциносаркомой Walker 256 ПОА сыворотки крови увеличивалась и в 2,5 раза превышала данные контроля. Затем наблюдалось снижение ПОА сыворотки крови у этих крыс. Через 7 и 14 сут после введения МТ крысам с карциносаркомой Walker 256 ПОА сыворотки крови была выше контроля соответственно в 1,3 и 1,4 раза. На 3-й сутки после введения МТ интактным крысам уровень МДА в сыворотке крови достоверно возрастал до 0,088±0,017 нМ/мл (в контроле 0,06±0,004 нМ/мл) (р<0,05). К 7-м суткам после введения МТ уровень МДА в сыворотке крови нормализовался (0,058±0,003 нМ/мл), а к 14-м суткам наблюдения достигал 0,084±0,002 нМ/мл. Такая же динамика

Таблица 4. Прооксидантная активность сыворотки крови (усл. ед.) после воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на крыс с карциносаркомой Walkcr-256 (M±m)

Группа Сроки исследования (сутки)

3-й 7-е 14-е

Интактные крысы после введения циклофосфана 0,35±0,005* 0,32±0,004 0,29±0,004

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после введения циклофосфана 0,64±0,008Т* 0,43±0,0067" 0,3 8±0,0057"

Интактные крысы после введения мелатонина 0,31±0,004 0,36±0,005* 0,26±0,003

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после введения мелатонина 0,60±0,0087" 0,31±0,004 0,33±0,004*

Интактные крысы после воздействия общей гипертермии 0,26±0,003 0,36±0,005* 0,29±0,004

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после воздействия общей гипертермии 0,79±0,0Г/" 0,52±0,007*/" 0,36±0,005*

Контроль (интактные крысы) 0,28±0,003

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с контролем; ** - р<0,05 по сравнению с соответствующей группой интактных крыс.

изменений концентрации МДА была выявлена при введении МТ крысам с карциносаркомой Walker 256. При этом стоит отметить, что при введении МТ крысам с карциносаркомой уровень МДА на 14-е сутки наблюдения был достоверно выше (0,076 ± 0,007 нМ/мл, р<0,05), чем у животных, с опухолью без введения МТ.

В отличие от МДА при введении МТ интакгным животным происходило снижение уровня ДК в сыворотке крови. Через 3, 7 и 14 сут после введения МТ средние уровни ДК соответственно составили 0,24±0,005; 0,33±0,013 и 0,31 ±0,003 нМ/мл (в контроле - 0,39 ± 0,028 нМ/мл) (р<0,05). На 3-й и 7-е сутки после введения МТ крысам с карциносаркомой Walker 256 уровень ДК в сыворотке крови животных практически не изменялся. Однако к 14-м суткам опыта после введения МТ у крыс с карциносаркомой Walker 256 уровень ДК в сыворотке крови значительно возрастал до 0,69±0,017 нМ/мл (р<0,01).

Прооксидантная и антиоксидантная активности сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 при сочетанием воздействии циклофосфана и мелатонина. На 3-й и 7-е сутки после введения МТ и ЦФ крысам с карциносаркомой Walker 256 уровень ДК в сыворотке крови животных практически не изменялся. Однако к 14-м суткам опыта

после введения препаратов уровень ДК в сыворотке крови значительно возрастал.

В отличие от ДК уровень ПОА снижался. Через 3 и 14 сут после со-четанного введения МТ и ЦФ этот показатель соответственно составил 0,57±0,007 и 0,33 ± 0,004 усл. ед. (в контроле-0,28±0,003 уел ед) (р<0,05). Возможно, это обусловлено не только снижением содержания МДА, но и влиянием МТ, обладающего выраженным антиоксидантным действием (Анисимов В.Н. и др., 2000).

Прооксидантная и антиоксидантная активности сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермии и ее сочетания с циклофосфаном и мелатониноном. При оценке влияния ОГ на ПОА сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 было установлено, что этот показатель возрастал к 3-м суткам эксперимента в 2,8 раза (р<0,05) (см. табл. 4). При этом ПОА сыворотки крови также была достоверно выше, чем у интакгных животных, подвергавшихся ОГ (р<0,05). Подобное, но менее выраженное повышение ПОА сыворотки крови сохранялось через 7 и 14 сут после ОГ у крыс с карциносаркомой Walker 256.

Под влиянием ОГ у интакгных крыс через 7 сут достоверно повышалось на 46,7% содержание МДА (до 0,088±0,014 нМ/мл, р<0,05) по сравнению с контролем (0,060 ± 0,004 нМ/мл) и на 57,1 % — по сравнению с 3-й сутками опыта (0,056±0,007 нМ/мл). Через 14 сут концентрация МДА у интакгных животных после воздействия ОГ была на 51,7% выше контрольного значения (0,091±0,004 нМ/мл, р<0,05).

У крыс с карциносаркомой Walker 256 после воздействия ОГ концентрация МДА в сыворотке крови на протяжении всего эксперимента была выше в 3,4 и 3,3 раза, на 76,7% (соответственно 0,203±0,034,0,200±0,026 и 0,106±0,010 нМ/мл, р<0,05), чем в контроле.

После воздействия ОГ у интакгных животных происходило достоверное (на 39,2, 27,7 и 30,5%) снижение концентрации ДК в сыворотке крови (соответственно до 0,237±0,018; 0,282±0,005 и 0,271±0,005 нМ/мл, р<0,05) при сравнении с контролем (0,390±0,028 нМ/мл). Воздействие ОГ у животных с карциносаркомой Walker 256 приводило к повышению концентрации ДК на 56,1, 44,0% и в 2,0 раза соответственно через 3, 7 и 14 сут опыта (до 0,370±0,019; 0,406±0,012 и 0,555±0,02 нМ/мл, р<0,05) по сравнению с интактными крысами. При этом на 14-е сутки опыта уровень ДК в сыворотке крови становился достоверно выше контрольного уровня.

После введения ЦФ и действия ОГ уровень ПОА и ДК в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 имел тенденцию к росту через 3 сут с последующим снижением к 14-м суткам эксперимента относительно контроля. В то же время концентрация МДА в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 не претерпевала существенных изменений. При сочетанном воздействии ОГ и МТ было обнаружено, что изучаемые

Таблица 5. Антиоксидантная активность сыворотки крови (усл. ед.) при воздействии циклофосфана, мелатонина, общей гипертермии крысам с карциносаркомой Walker 256 (M±m)

Группа Сроки исследования (сутки)

3-й 7-е 14-е

Интактные крысы после введения циклофосфана 12,48±0,10* 10,5б±0,09 8,64±0,07

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после введения циклофосфана 11,52±0,09* 8,73± 0,07 12,48 ±0,10*/"

Интактные крысы после введения мелатонина 14,40 ±0,12* 14,02±0,1Г 10,08±0,08

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после введения мелатонина 12,48±0,10* 14,60±0,10* 11,52±0,09*

Интактные крысы после воздействия общей гипертермии 12,48±0,10* 11,52±0,09* 12,00±0,10*

Трансплантация карциносар-комы Walker 256 после воздействия общей гипертермии 14,40±0,12* 16,32±0,137" 13,44±0,11*

Контроль (интактные крысы) 9,60±0,08

Примечание. * — р<0,05 по сравнению с контролем; ** — р<0,05 по сравнению с соответствующей группой интактных крыс.

параметры (ПОА, МДА и ДК) у крыс с карциносаркомой Walker 256 значимо не отличались от таковых в контроле. При сочетанном воздействии ОГ, ЦФ и МТ установлено достоверное увеличение в 1,9 раза содержания ДК в сыворотке крови у крыс с карциносаркомой Walker-256 к 14-м суткам эксперимента (р<0,05). Но при этом уровни ПОА и МДА значимо не отличались от данных контрольной группы (р>0,05).

Применение ОГ и ее сочетание с введением ЦФ и МТ приводило к разнонаправленному изменению содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону понижения, так и повышения их содержания. При этом общий уровень ПОА сыворотки крови имел тенденцию к снижению, что может быть связано с особенностями реагирования молекулярных систем, определяющих потенциал АОА сыворотки крови у экспериментальных животных.

При анализе динамики общей АОА сыворотки крови при действии ОГ, а также введении крысам с карциносаркомой Walker 256 ЦФ и МТ была обнаружена разная направленность изменений данного параметра (табл. 5). Через 3 сут после введения ЦФ интактным крысам АОА сыворотки крови превышала контрольные цифры в 1,3 раза (р<0,05), затем к 7-м и 14-м суткам постепенно снижалась.

При введении ЦФ крысам с карциносаркомой Walker 256 АОА сыворотки крови возрастала к 3-м суткам в 1,2 раза по сравнению с интакт-ным контролем, но также была достоверно выше, чем у крыс с опухолью (7,38±0,06 усл. ед., р<0,05). Подобное повышение АОА сыворотки сохранялось у крыс с карциносаркомой Walker 256 до 14-х суток после введения ЦФ (р<0,05). При введении МТ интактным крысам АОА сыворотки крови возрастала кЗ-ми 7-м суткам соответственно в 1,5 и 1,46 раза (р<0,05), а к 14-м суткам - достигала контрольного уровня.

На 3-й и 7-е сутки после введения МТ крысам с карциносаркомой Walker 256 АОА сыворотки крови животных увеличивалась в 1,3 и 1,5 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Через 14 сут АОА немного снижалась, но превышала контрольное значение в 1,2 раза (р<0,05). При сочетанном введении МТ и ЦФ крысам с карциносаркомой Walker 256 было установлено значимое повышение уровня АОА сыворотки крови животных с 3-х по 14-е сутки (соответственно с 10,56±0,09 до 14,40±0,12 усл. ед., р<0,05).

Однократная ОГ приводила к увеличению на 3-й сутки АОА сыворотки крови интактных крыс в 1,3 раза (р<0,05) по сравнению с контролем. Высокие уровни АОА в данной экспериментальной группе сохранялись и на 7 - 14-е сутки эксперимента (р<0,05). Аналогичная закономерность прослеживалась и в группе крыс с карциносаркомой Walker 256, подвергнувшихся действию ОГ: через 3, 7 и 14 сут АОА сыворотки крови крыс была выше, чем в контроле соответственно в 1,5; 1,7 и 1,4 раза (р<0,05).

Сравнивая сочетанное действие ОГ, МТ и ЦФ на уровень общей АОА сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 необходимо отметить, что данный показатель снижался к 14-м суткам эксперимента. Через 3 и 7 сут АОА сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 после сочетанного воздействия ОГ, МТ и ЦФ равнялась соответственно 17,28±0,14 и 20,16±0,16 усл. ед., к 14-м суткам она приближалась к контрольным данным - 14,40±0,12 усл. ед. (в контроле - 9,60±0,08 усл. ед., р<0,05).

При оценке баланса в системе «про-/антиоксиданты» с помощью коэффициента соотношения (Кс= ПОА/АОА сыворотки крови) обнаружено, что у контрольных крыс К<; в среднем составил 2,48±0,03 усл. ед. (табл. 6).

У интактных крыс, получавших ЦФ или ОГ, коэффициент ПОА/АОА имел тенденцию к увеличению. В динамике развития карциносаркомы Walker 256 на фоне действия ОГ и введения МТ и ЦФ ПОА/АОА сыворотки крови крыс в большинстве случаев значительно превышало контрольные значения. Следует отметить, что при сочетанном действии ОГ, МТ и ЦФ К^-сыворотки крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 был через 7 и 14 сут эксперимента ниже соответственно в 1,6 и 1,3 раза, чем в контроле.

Таким образом, при раздельном применении ОГ, МТ или ЦФ в динамике развития карциносаркомы Walker 256 наблюдалось достоверное повышение коэффициента К«., что может быть отражением дисбаланса

Таблица 6. Коэффициент соотношения ПОА/АОА (усл. ед.) сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker 256 при введении циклофосфана, мела-тонина и действии общей гипертермии (М±т)

Группа Сроки исследования (сутки)

3-й 7-е 14-е

Интактные крысы:

- после введения циклофосфана 2,81±0,034 3,07±0,037" 3,31±0,040*

- после введения мелатонина 2Д5±0,026 2,55±0,031 2,60±0,031

- после воздействия общей гипертермии 2,10±0,025 3,10±0,037* 2,38±0,029

Трансплантация карциносаркомы Walker 256:

- после введения циклофосфана 5,59±0,067*/** 4,92±0,0597" 3,06±0,037

- после введения мелатонина 4,77±0,057*/" 2,11±0,015 2,90±0,035

- после введения мелатонина и циклофосфана 5,42±0,065* 3,32±0,055* 2,32±0,028

- после воздействия общей гипертермии 5,46±0,065'Г 3,21±0,039' 2,66±0,032

- после воздействия общей гипертермии и циклофосфана 3,00±0,036 1,70±0,020* 1,77±0,02Г

- после воздействия общей гипертермии и мелатонина 2,79±0,033 2,48±0,030 2,67±0,032

- после воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина 2,07±0,025 1,54±0,018* 1,99±0,024*

Контроль 2,48±0,030

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с контролем; ** - р<0,05 по сравнению с соответствующей группой интактных крыс.

в системе «про-/антиоксиданты». При сочетанном действии ОГ, МТ и ЦФ Кс в динамике развития карциносаркомы Walker 256 уменьшался, свидетельствуя о снижении уровня окислительного стресса в организме животных, возможно, на фоне изменения уровня жирорастворимых ан-тиоксидантов в крови.

Изменение содержания жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови в условиях спонтанного роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии и цитостатиков. Отмечено, что опухолевые ткани часто содержат более низкие концентрации свободнорадикальных соединений в сочетании с относительно высоким содержанием антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, глютатиона) и высокой активностью протеинкиназы С (РКС) (Пальмина Н.П. и др., 1994). Показано, что а-токоферол ингибирует активность РКС, предотвращая аутофосфорилирование фермента, которое необходимо для активности, или дефосфорилированием РКС протеиновой фосфатазой РР2А, которая активизируется витамином Е (Clement S. et al., 1997). Среди форм витамина Е, сукцинат а-токоферола, является мощным апоптогеном, механизм действия которого использует пути

передачи сигналов, связанные с трансформирующим фактором роста ß, а также Fas и митоген-активированную РКС и сцепленный с фактором некроза опухоли лиганд Аро2 (Israel К. et al., 2000; Weber Т. et al., 2001). Все эти данные дают основание считать, что в развитии злокачественных опухолей большое значение имеют не только характер и динамика протекания свободнорадикальных реакций, но и состояние антиоксидантной регуляторной системы.

Рассматривая динамику содержания жирорастворимых антиоксидан-тов при опухолевой прогрессии, следует отметить, что у крыс с карци-носаркомой Walker 256 уровень а-токоферола в крови на 7-е и 14-е сутки эксперимента был на 57 и 60% ниже, чем в контроле (0,86±0,06) (р<0,05) (табл. 7). Аналогичная закономерность наблюдалась и для содержания ретинола, уровень которого в крови крыс с карциносаркомой Walker-256 на 7-е и 14-е сутки эксперимента был на 45 и 38% ниже, чем в контроле (40,10±1,05)(р<0,05).

При использовании ЦФ у крыс с карциносаркомой Walker 256 выявлено уменьшение содержания жирорастворимых антиоксидантов в крови. Через 7 сут уровни а-токоферола и ретинола были ниже контрольных соответственно на 49 и 43% (р<0,05). Через 14 сут низкое содержание жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови сохранялось, что может быть связано не только с особенностями опухолевого роста, но и действием ЦФ в организме. Известно, что метаболиты ЦФ индуцируют перекисное окисление липидов, продукты которого нарушают структуру и функции мембран, что, в свою очередь, способствует ускоренному расходованию антиоксидантов в свободнорадикальных реакциях (Меныцикова Е.Б. и др., 2008). Поэтому обоснованным является дополнительное использование в полихимиотерапии опухолей соединений, в частности МТ, обладающих антиоксидантным действием. МТ является более эффективным ингибитором гидроксильного (*ОН) и пероксильного (ROO*) радикалов, чем глютатион и витамин Е. Он и его метаболиты (6-гидроксимелатонин) беспрепятственно проникают в клетки и защищают нуклеиновые кислоты, липиды и белки от повреждения свободными радикалами. Выявлено также, что МТ может ингибировать NO-синтетазу и усиливать экспрессию генов, ответственных за синтез Cu/Zn-зависимой супероксиддисмутазы (Анисимов В.Н. и др., 2000).

Использование МТ у крыс с карциносаркомой Walker 256 приводило к сохранению на относительно высоком уровне жирорастворимых антиоксидантов в крови через 7 и 14 сут эксперимента. Аналогичная закономерность наблюдалась для содержания а-токоферола в сыворотке крови животных и при сочетанном использовании в терапии ЦФ и МТ, хотя и наблюдалось уменьшение концентрации ретинола в сыворотке крови через 7 и 14 сут эксперимента (р<0,05).

После воздействия ОГ у крыс с карциносаркомой Walker 256 концентрация жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови на протяже-

Таблица 7. Содержание жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови животных с карциносаркомой Walker 256 и при различных видах противоопухолевой терапии (М±ш)

Экспериментальная группа Токоферол (мг%) Ретинол (мкг%)

3-е сутки эксперимента

Карциносаркома Walker-256 0,36 ±0,100* 34,0 ± 1,92*

Карциносаркома Walker-256 + ОГ 0,68 ±0,051 38,7 ±2,17

Карциносаркома Walker-256 + ЦФ 0,77 ±0,091 37,5 ± 2,33

Карциносаркома Walker-256 + МТ 0,70 ± 0,085 39,1 ±3,15

Карциносаркома Walker-256+ЦФ+МТ 0,74 ± 0,026 35,4 ±4,11

Карциносаркома Walker-256+ОГ+ЦФ+МТ 0,67 ± 0,044 36,5 ± 3,47

7-е сутки эксперимента

Карциносаркома Walker-256 0,37 ±0,033* 22,2 ± 3,05*

Карциносаркома Walker-256 + ОГ 0,26 ± 0,055* 31,2 ±3,70*

Карциносаркома Walker-256 + ЦФ 0,44 ±0,100* 22,9 ± 2,24*

Карциносаркома Walker-256 + МТ 0,72 ± 0,065 33,3 ±3,80

Карциносаркома Walker-256+ЦФ+МТ 0,65 ±0,116 32,4 ± 1,92*

Карциносаркома Walker-256+ОГ+ЦФ+МТ 0,56 ±0,149 27,8 ±2,56*

14-е сутки эксперимента

Карциносаркома Walker-256 0,34 ±0,111* 25,0 ±2,79*

Карциносаркома Walker-256 + ОГ 0,23 ±0,014* 19,4 ±4,10*

Карциносаркома Walker-256 + ЦФ 0,28 ±0,601* 23,4 ±3,19*

Карциносаркома Walker-256 + МТ 0,54 ± 0,035 36,5 ± 3,62

Карциносаркома Walker-256+ЦФ+МТ 0,79 ±0,121 31,5 ±2,33*

Карциносаркома Walker-256+ОГ+ЦФ+МТ 0,29 ±0,029* 28,4 ± 1,27*

Интактные животные (контроль) 0,86 ±0,062 40,1 ±1,05

Примечание. * - достоверность различий р<0,05 по сравнению с интактными животными.

иии всего эксперимента имела четкую тенденцию к снижению. Содержание а-токоферола на 7-е и 14-е сутки было в 3,3 и 3,7 раза, а ретинола в 1,3 и 2,1 раза ниже контрольных значений (р<0,05) (см. табл. 7). Причем уровень последнего антиоксиданта в крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 при ОГ на 14-е сутки был достоверно меньше, чем на 7-е сутки эксперимента (31,2±3,7) (р<0,05).

При воздействии ОГ в сочетании с ЦФ и МТ на ранних стадиях развития опухолевого процесса не выявлено достоверных различий в концентрации жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови. На 7-е и 14-е сутки эксперимента уровни жирорастворимых антиоксидантов снижались по сравнению с контролем: а-токоферола - на 35 и 66%, ретинола - на 31 и 29% (р<0,05). Причем содержание а-токоферола в крови крыс с карциносаркомой Walker 256, получавших ОГ в сочетании с ЦФ и

МТ, на 14-е сутки было достоверно ниже, чем на 7-е сутки эксперимента (0,56±0,15)(р<0,05).

Проведенный комплексный анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, цикло-фосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами антибластомного действия. Циклофосфан и мелатонин (особенно в сочетании) более интенсивно, чем общая гипертермия, подавляют пролиферативную активность опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 и усиливают их апоптотическую гибель. Одновременно эти цитостатические препараты существенно влияют на изменения архитектоники карциносаркомы. Противоопухолевое действие общей гипертермии проявляется преимущественно в усилении алоптотической гибели клеток. Наиболее эффективно применение общей гипертермии в сочетании с обоими цитостатиками.

ВЫВОДЫ

1. По данным патоморфологического анализа, перевиваемая карци-носаркома Walker 256 является смешанной опухолью молочной железы крыс Вистар, образованной как эпителиоидными (условно паренхиматозными), так и саркоматозными (условно стромальными) клетками; характеризуется прогрессивным инфильтративным ростом (с увеличением объема опухолевого узла в 15 раз в течение 14 сут после трансплантации в мышцу бедра), высоким митотическим индексом (34,8±1,4%о), низким апоптотическим индексом (2,5±1,2%о), высокой частотой метастазирова-ния по гематогенному и лимфогенному типам в регионарные лимфатические узлы (85,7±3,8%), способностью индуцировать неопластическую анорексию/кахексию (снижение массы тела на 19% в течение 14 сут). Для гистоархитектоники опухолевого узла характерно формирование псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток, между которыми располагаются скопления или тяжи саркоматозных клеток и хорошо развитая сосудистая сеть.

2. По данным ультраструюурного анализа, в карциносаркоме Walker 256 на протяжении всего периода ее «спонтанного» роста после трансплантации в мышцу бедра крыс присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки. Повышение дифференцировки опухолевых клеток

каждого типа сопровождается уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, увеличением размеров клеток и ростом объемной плотности митохондрий, гранулярной цитоплазматической сети, численной плотности рибосом и митохондрий.

3. Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гисто-архитектоники трансплантированной карциносаркомы Walker 256. При сочетанием применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанием применении общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений - количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.

4. Общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы к концу эксперимента. Гистоархитектоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.

5. Применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с мелатонином или общей гипертермией обусловливает наиболее выраженные изменения гистоархитектоники карциносаркомы Walker 256 через 7 сут после воздействий (исчезновение псевдофолликулярного строения, выраженную редукцию эпителиоидных клеток и их обособление, преобладание популяции малодифференцированных, веретеновидных клеток) с реверсией опухолевого фенотипа к 14-м суткам эксперимента при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином или общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.

6. Применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению

апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно при сочетании с циклофосфаном (апоптотический индекс возрастает через 7 и 14 сут в 11 и 6 раз по сравнению со спонтанным развитием опухоли). Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.

7. По данным иммуногистохимического исследования, после применения циклофосфана и мелатонина как в качестве моноагентов, так и в сочетании друг с другом и общей гипертермией в опухолевых клетках карциносаркомы Walker 256 значительно снижается экспрессия антиа-поптотического белка Вс1-2 и усиливается экспрессия проапоптотичес-ких белков Вах и Bad. При этом происходит значительное уменьшение отношений Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, особенно при сочетанном применении цитостатических препаратов: отношение Bcl-2/Bax наиболее значительно снижается после сочетанного применения циклофосфана и мелатонина (на 88%), отношение Bcl-2/Bad - после общей гипертермии, сочетания циклофосфана и мелатонина и сочетанного применения цистостатгасов с общей гипертермией (на 79%). Отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптоти-ческим индексом (соответственно г = -0,81 и г = -0,61), с другой, позволяет считать, что изменение экспрессии и соотношений проапоптогенных и антиапоптогенного белков в клетках карциносаркомы Walker 256 индуцирует их апоптотическую гибель.

8. К особенностям структурно-функциональной организации кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 относятся выраженная гетерогенность эндотелиоцитов (присутствие «светлых», «темных» клеток, новообразованных и деструктивных форм) и нарушения межклеточных контактов, которые нарастают по мере развития опухоли. Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно или в сочетании друг с другом вызывают однонаправленные изменения внутриклеточной организации эндотелиоцитов: снижение объемной плотности митохондрий, гранулярной цитоплазматической сети, микро-пиноцитозных везикул, уменьшение численной плотности свободных и прикрепленных рибосом.

9. При спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 неопластическая кахексия проявляется в снижении массы тела крыс (без учета опухолевого узла) на 19% к 19-м суткам с момента трансплантации. Общая гипертермия усиливает синдром кахексии, обусловливая снижение массы тела в те же сроки на 160%. Сочетанное воздействие общей гипертермии и мелатонина также вызывают более выраженное снижение массы тела (на 27%), чем при спонтанном развитии опухолевого узла, Применение мелатонина не усиливает кахексический синдром (снижение массы тела на 18%). После сочетанном воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, а также циклофосфана и мелатонина происходит минимальная потеря массы тела крыс (на 6 - 8%).

10. Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения. При этом общий уровень ПОА сыворотки крови имеет тенденцию к снижению, что может быть связано с особенностями реагирования молекулярных систем, определяющих потенциал АОА сыворотки крови у экспериментальных животных.

11. Опухолевая прогрессия карциносаркомы Walker 256 сопровождается снижением содержания жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови крыс: уровень а-токоферола в крови на 7-е и 14-е сутки снижается на 57 и 60%, уровень ретинола снижается в эти же сроки на 45 и 38% (по сравнению с интактными животными). Общая гипертермия, цикло-фосфан и мелатонин оказывают различное влияние на динамику уровня жирорастворимых антиоксидантов в организме животных. Воспроизведение общей гипертермии и введение циклофосфана сопровождаются снижением содержания а-токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker-256. Введение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии способствует сохранению их содержания.

12. Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследования, отражающие ремоделирование опухолевого узла карциносаркомы Walker 256, могут служить базой для тестирования противоопухолевого эффекта новых лекарственных веществ.

2. Примененные в работе методы оценки основных параметров опухолевого роста целесообразно использовать при сравнительных исследованиях эффективности противоопухолевых препаратов и воздействий.

3. Для более полной характеристики противоопухолевой активности и побочных эффектов тестируемых антибластомных воздействий необходимо изучение как опухолевой трансформации, так и системных проявлений опухолевого процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ефремов A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В. Влияние мелатонина на морфологические изменения в лимфатических узлах // Вестник лим-фологии. - 2008. - Т. 3. - С. 46.

2. Ефремов A.B., Мичурина C.B., Начаров Ю.В., Овсянко Е.В., Па-хомова Ю.В., Пустоветова М.Г., Пупышев А.Б., Сазонов B.C., Федина Р. Г. Изменение активности перекисного окисления липидов у животных с карциносаркомой WALKER-256 под влиянием различных методов лечения // Вестник новых медицинских технологий. - 2008. - T. XV, № З.-С. 22-24.

3. Ефремов A.B., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Пустоветова М.Г., Сазонов B.C. Влияние управляемой гипертермии на морфофункциональное состояние висце-росоматических лимфатических узлов // Вестник новых медицинских технологий. - 2008.- T. XV, № 3. - С. 30 - 31.

4. Пупышев А.Б., Федина Р.Г., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Биохимическое исследование проапоптотических признаков при эксперминтальной терапии крыс с карциносаркомой Walker-256 // Всероссийская конференции с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск, 2008 - С. 154 - 155.

5. Астафьева К.А., Дмитриева К.К., Ефремов A.B., Игнатова A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Овсянко Я.У., Пахомова Ю.В., Пустоветова М.Г., Сазонов B.C., Самсонов A.B. Оценка патогенетического и саногене-тического эффектов общей управляемой гипертермии на примере анализа состояния тканевого микрорайона печени крыс Wistar // Вестник новых медицинских технологий. - 2008. - T. XV, № 4. - С. 25 - 28.

6. Зайцев С.А., Пахомова Ю.В., Овсянко Е.В., Астафьева К.А., Долото ва Н.В. Оценка морфофункционального состояния лимфатических узлов лабораторных животных при общей управляемой гипертермии // Медицина и образование в Сибири. - 2008 - № 5. - http://ngmu.ru/cozo/ mos/article/text_full.php?id=307.

7. Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. Оценка роли системы антиоксидантной защиты в патогенезе нарушения метаболизма у крыс с карциносаркомой Walker-256 под влиянием различных видов терапии // Медицина и образование в Сибири. - 2008 - № 5. -http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_ftill.php?id=307.

8. Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. К вопросу изучения степени нарушения баланса системы «оксиданты-анти-оксиданты» в плазме крови крыс в динамике развития саркомы Walker-256 // Межрегиональная научно-практическая конференция «Казначеевские чтения № 3. Синдром полярного напряжения». - Новосибирск, 2008 - С. 99-104.

9. Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. Оценка состояния системы антиоксидантной защиты у лабораторных животных с карциносаркомой Walker-256 под влиянием различных видов терапии // Межрегиональная научно-практическая конференция «Казначеевские чтения № 3. Синдром полярного напряжения». - Новосибирск, 2008 — С. 104 - 110.

10. Овсянко Е.В., Ефремов А.В, Мичурина C.B., Овсянко Я.У. Морфологическое исследование висцеро-соматических лимфатических узлов при воздействии общей управляемой гипертермии // Материалы конференции, посвящ. 80-летию академика Ю.И. Бородина «Морфология, лимфология, клиника». - Новосибирск, 2009- С. 248 -251.

11. Пупышев А.Б., Федина Р.Г., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Эффект общей управляемой гипертермии на содержание продуктов липидпероксидации и активность лизосомных ферментов в сывортки крови у крыс с карциносаркомой Walker-256 // Вопросы онкологии. - 2009.

- Т. 55, № 2. -С. 221 -223.

12. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Сафронов И.Д., Мичурина C.B., Пахомова Ю.В. Изменение содержания жирорастворимых антиоксидантов у животных с карциносаркомой WALKER-256 под влиянием различных видов терапии // Вопросы онкологии. - 2009. - № 3. - С. 27 - 29.

13. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Цырендоржиев Д.Д., Мичурина C.B., Пахомова Ю.В. Состояние про- и антиоксидантной активности сыворотки крови у крыс с карциносаркомой Walker-256 // Сибирский онкологический журнал. - 2009 - № 4 (34). - С. 57 - 61.

14. Овсянко Е. В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Гусев A.B. Изучение степени нарушения баланса в системе «оксидант-антиоксидант» в организме крыс в динамике развития карциносаркомы Walker-256 //1 Всероссийская науч.-пракг. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».

- Новосибирск, 2009,- С.- 275 -278.

15. Овсянко Е. В., Дмитриева К.К., Пахомова Ю.В., Макаров Е.Д., Пустоветова М.Г. К вопросу изучения антиоксидантов в сыворотке крови крыс с линейно-неспецифической карциносаркомой Walker-256 в динамике и на фоне применения различных видов консервативной терапии // I Всероссийская науч.-пракг. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2009,-С. 279-281.

16. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Мичурина C.B., Бгатова Н.П., Луш-никова Е.Л., Овсянко Я.У., Вакулин Г.М. Ультраструктурный и стереоло-гический анализ клеток карциносаркомы Walker 256 на разных стадиях дифференцировки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 149, № 9. - С. 337 - 342.

17. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Лушникова Е.Л., Ларионов П.М., Архипов С.А., Непомнящих Л.М., Овсянко Я.У. Иммуногистохимический

анализ программируемой гибели клеток карциносаркомы Walker 256 при воздействии цитостатическими препаратами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 149, № 10. - С. 455 - 460.

18. Пахомова Ю.В., Ефремов A.B., Пустоветова М.Г., Овсянко Е.В., Овсянко Я.У., Мичурина C.B., Астафьева К.А., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Сазонов B.C., Самсонов A.B. Изменения эндокринно-метаболичес-ких профилей плазмы крови крыс в остром периоде после общей управляемой гипертермии, как проявление синдрома воспалительного ответа животного на экстремальное воздействие // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - T. XVI, № 4. - С. 17 -19.

19. Кунц Т.А., Мичурина C.B., Белкин А.Д., Овсянко Е.В. Морфологическое исследование паренхиматозного и соединительнотканного компартмента печени крыс с перевиваемой карциносаркомой Уокера-256 // Выездная научная сессия, посвященная 80-летию С.У.Джумабаева «Лимфология». - Узбекистан, 2008. - № 1-2. - С. 46 - 48.

20. Овсянко Е.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. Оценка антиоксидан-тного потенциала сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker-256 на фоне применения общей управляемой гипертермии, циклофосфана и мелатонина // Материалы ХПГВсероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученные в медицине». -Казань, 2009.-С. 171-172.

21. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Ларионов П.М., Овсянко Я.У. Апоп-тоз-индуцирующая эффективность общей гипертермии у крыс с карциносаркомой Walker 256 // II Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2010. — С. 113 — 117.

22. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Особенности ультраструктурной организации клеток карциносаркомы Walker 256 при воздействии общей гипертермии // Морфология. - 2010. - Т. 137, № 4. _ с. 145.

23. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Ультрас-трукгурные изменения эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 при воздействии общей гипертермии // Морфология. - 2010. - Т. 137, № 4. - С. 145 - 146.

24. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ищенко И.Ю., Ефремов A.B., Овсянко Е.В. Энергетический потенциал клеток печени крыс с карциносаркомой Walker 256 при терапии цитостатиком // IX российско-германская научно-практическая конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении». - Новосибирск, 2010.-С.181 - 182.

25. Овсянко Е.В., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Показатели активности процессов перекисного окисления липидов и апоптоза у крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермии // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2011. - Т. 31, № 1. - С 17 - 21.

26. Овсянко Е.В., Сафронов И.Д., Овсянко Я.У., Вакулин Г.М. Ультраструктурная реорганизация эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 в условиях спонтанного роста и при воздействии общей гипертермии // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2011. - Т. 31, № 1. - С. 22 - 26.

27. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Лушникова E.JL, Сафронов И.Д., Кунц Т.А., Морозов И.Д., Овсянко Я.У., Виноградов A.B. Морфологические показатели канцерогенеза перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при воздействии цитостатиками // III Всероссийская науч.-пракг. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».- Новосибирск, 2011-С. 197-201.

28. Кунц Т.А., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Вакулин Г.М., Ищенко И.Ю., Пустоветова М.Г. Субклеточная организация печени крыс с экспериментальной карцино саркомой в постцитостатический период // III Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». - Новосибирск, 2011,-С. 149- 152.

29. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Печень крыс при продвинутых стадиях карциносаркомы Walker 256 // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9, вып. 2. - С. 126-129.

30. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Пустоветова М.Г., Жураковский И.П. Ультраструктурные параметры клеток печени крыс на ранних стадиях развития карциносаркомы Walker 256 // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. — Т. 126, № 3. — С. 91 - 96.

Соискатель

Е.В.Овсянко

Подписано в печать 17.06.2011. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 63.

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 333-37-39

2010012251

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, онкологические заболевания по частоте заболеваемости занимают второе, а в некоторых промышлен-но развитых странах — первое место; от них ежегодно умирает около 7 млн человек (Попович A.M., 2002). В структуре онкологической заболеваемости женщин почти во всех развитых странах 1-е место занимает рак молочной железы (Greenlee R. et al., 2000; Jemal A. et al., 2004 — 2010). По сравнению с другими злокачественными новообразованиями рак молочной железы является одной из наиболее частых причин смерти женщин (Аксель Е.М., 2005).

Основными методами лечения в онкологии являются: хирургический, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия. В настоящее время применение интенсивной или высокодозной химиотерапии при лечении пациентов с солидными опухолями не всегда позволяет добиться эффективных результатов (Davidson A. et al., 1997). С целью преодоления химиорезистентно-сти и повышения эффективности терапии этой категории больных продолжается интенсивный поиск новых лечебных подходов. Одним из возможных направлений в этом плане является общая гипертермия (ОГ) (Жаврид Э.А. и др., 1997; Исмаил-Заде P.C., 2004; Van der Zee J., 2002; Oldahm R.K., 2003), применение которой основано на том, что опухолевые1 клетки избирательно термочувствительны (при повышении температуры тела до 42 — 45°G).

В современных клинических и экспериментальных исследованиях при оценке эффективности противоопухолевой терапии и разработке новых методов терапии злокачественных новообразований основное внимание уделяется влиянию химических агентов и физических факторов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза (Летягин В.П., 2004; Кушлинский Н.Е. и др., 2005). Такие подходы обусловлены тем, что одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток (Белушкина H.H., 2008). Разные химические и физические воздействия вызывают разную интенсивность изменений перечисленных выше биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вариантов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной активностью.

Сочетание гипертермии с лучевой терапией оказывается эффективней, чем каждый из этих видов физического воздействия отдельно. При тепловом воздействии опухолевая ткань перенасыщается собственными продуктами .обмена, кислотами, и в ней нарушаются важные системы регуляции. Вследствие этого опухолевая клетка становится более чувствительной к лучевой или химиотерапии, так что их дозировки могут быть значительно снижены. Возможность уменьшения дозы вводимых цитостатиков до 50% с одновременным усилением противоопухолевого эффекта позволяет в ряде случаев избегать выраженного нефротоксического, кардиотоксического, гепатоток-сического действия химиопрепаратов. Влияние гипертермии на трансмембранный перенос и метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуногенности опухоли (Курнешов O.K. и др., 2003). Не являясь канцерогенным и мутагенным агентом, гипертермия может индуцировать в опухоли как апоптоз, так и некроз клеток (Yonezawa M. et al., 1996).

В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований стало создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза* (Rafíi S., 2000). Известно, что в опухоли образуется сосудистая сеть, которая значительно отличается- от сосудов здоровой ткани (Dvorak H.F. et al., 1995; Bergers G. et al., 2003). Сосудистое русло опухоли, с морфологической точки зрения, является атипичным и составляет значительную часть опухолевой стромы. Показано, что если опухоль имеет периферическую сосудистую сеть, то в центре опухоли имеются участки некроза. Если опухоль имеет центральную сосудистую сеть, то некроз располагается по периферии. Микроскопически сосуды выглядят расширенными, извитыми, со множеством слепых петель. Все эти структурные различия влияют на внут-риопухолевый кровоток, кровь проходит через опухоль непредсказуемым образом, а это оказывает отрицательное влияние на доставку лекарственных препаратов.

Для разработки новых схем противоопухолевой терапии и создания новых лекарственных препаратов на первом этапе всегда используются модельные опухолевые системы in vitro (линии опухолевых клеток) и in vivo (перевиваемые и спонтанные опухоли разной локализации). Одной из модельных опухолей, используемых на крысах, является перевиваемая опухоль Walker 256, идентифицированная впервые профессором G.Walker в 1928 году как спонтанно возникшая в молочной железе беременной крысы альбиноса (Rattus norvegicus) (Simpkins Н. et al., 1991). После нескольких пересадок на протяжении многих лет были выделены несколько ее субштаммов, которые характеризуются морфологическими различиями и классифицируются как карцинома, саркома и смешанная карциносаркома (Simpkins Н. et al., 1991). Возможно, карциносаркома Walker 256 возникла как смешанная опухоль и состояла из стволовых клеток, которые дают начало разным типам клеток. Использование этой опухоли в доклинических исследованиях новых методов противоопухолевой терапии позволяет оценить действие как отдельных химических и физических факторов, так и их сочетаний на разные биологические характеристики опухолевого роста.

В этой связи представляется актуальным изучение интенсивности пролиферации и гибели опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 при действии общей гипертермии в сочетании с цитостатическими препаратами (циклофосфаном и мелатонином), обладающими разными механизмами действия на клеточные популяции.

Цель исследования - изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста* карциносаркомы Walker 256 при ее- трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой терапии с использованием общей гипертермии, циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.

Задачи исследования:

1. Изучить морфогенез и основные параметры опухолевого роста (ми-тотический индекс, выраженность некротической и апоптотической гибели, частоту метастазирования, степень дифференцировки) карциносаркомы Walker 256 после трансплантации опухолевых клеток в мышцу бедра крыс Вистар.

2. Изучить особенности гистоархитектоники опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

3. Изучить ультраструктурные особенности основных типов опухолевых клеток и эндотелиоцитов карциносаркомы Walker 256'при ее спонтанном развитии и при модифицирующем воздействии общей гипертермии, цикло-фосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.

4. Провести иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии ан-тиапоптотического и проапоптотических белков семейства Вс1-2 в карцино-саркоме Walker 256 крыс в процессе спонтанного развития и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

5. Изучить динамику изменений содержания токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

6. Изучить уровень антиоксидантной и прооксидантной активности сыворотки крови у крыс с трансплантированной карциносаркомой Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

7. Изучить динамику изменения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.

Научная' новизна. Впервые проведен комплексный патоморфологиче-ский анализ опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии после трансплантации в мышцу бёдра крыс и после модифицирующих воздействий общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Впервые на основании электронно-микроскопического исследования установлено, что в карцино-саркоме Walker 256 в ходе ее прогрессивного развития присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки, представлены их ультраструктурные характеристики.

Впервые выявлены патоморфологические особенности модифицирующего влияния общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на гистоар-хитектонику карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста. Установлено, что данные виды воздействий, примененные изолированно или в сочетании друг с другом, оказывают разные по выраженности эффекты на процессы пролиферации, гибели и дифференцировки опухолевых клеток, а также их метастатическую активность. Впервые показано, что применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией и мелатонином вызывает значительную транзиторную редукцию эпителиоидных клеток и изменение архитектоники опухолевого узла через 7 сут после воздействий с реверсией опухолевого фенотипа в последующем, но при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином или общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.

Впервые установлено, что применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно в сочетании с циклофос-фаном. Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.

Впервые показано, что общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы. Гистоархитектоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.

Впервые определена экспрессия проапоптогенных и антиапоптогенно-го белков семейства Вс1-2 в динамике развития карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что изолированное или сочетанное применение данных воздействий приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка. Вс1-2 и усилению экспрессии проапоптотических белков Вах и Bad. Установлена отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптотическим индексом, с другой, что позволяет считать изменение соотношений этих белков в клетках карциносаркомы Walker 256 одним из механизмов индукции апоптоза.

Впервые изучены показатели реакции перекисного'окисления липидов, прооксидантной (ПОА) и антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Установлено, что спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в. системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе и основных параметрах опухолевого роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном росте и после изолированного и сочетанного воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина как физических и химических агентов с разными механизмами противоопухолевого действия. Выявленные особенности противоопухолевого эффекта общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина и их сочетаний имеют большое значение для разработки более эффективных схем терапии онкологических заболеваний.

Проведенное исследование показывает важность комплексного морфологического анализа спонтанного и модифицированного опухолевого роста в динамике для установления возможных мишеней противоопухолевой терапии и оценки ее эффективности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Опухолевые клетки характеризуются высоким митотическим индексом, низким апоптотическим индексом, высокой частотой метастазирования по гематогенному и лимфоген-ному типам в регионарные лимфатические узлы, способностью индуцировать неопластическую кахексию.

2. Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гистоархитекто-ники трансплантированной карциносаркомы Walker 256. При сочетанном применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанном применении общей гипертермии, циклофосфана и ме-латонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений - количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.

3. Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелато-нином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови как в сторону их понижения, так и повышения.

4. Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.

Апробация результатов исследования. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); IX Российско-Германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), межлабораторной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 15 -в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК РФ для публикации результатов докторских диссертаций:

1.Ефремов A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В. Влияние мелатонина на морфологические изменения в лимфатических узлах // Вестник лимфологии. -2008.-Т. З.-С. 46.

2.Ефремов A.B., Мичурина C.B., Начаров Ю.В., Овсянко Е.В., Пахомо-ва Ю.В., Пустоветова М.Г., Пупышев А.Б., Сазонов B.C., Федина Р.Г. Изменение активности перекисного окисления липидов у животных с карциносар-комой WALKER-256 под влиянием различных методов лечения // Вестник новых медицинских технологий. — 2008. — T. XV, № 3. — С. 22 — 24.

3.Ефремов A.B., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Пустоветова М.Г., Сазонов B.C. Влияние управляемой гипертермии на морфофункциональное состояние висцеросоматиче-ских лимфатических узлов // Вестник новых медицинских технологий. -2008.- T. XV, № 3. - С. 30 - 31.

4.Пупышев А.Б., Федина Р.Г., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Биохимическое исследование проапоптотических признаков при экс-перминтальной терапии крыс с карциносаркомой Walker-256 // Всероссийская конференции с международным участием «Молекулярная онкология». -Новосибирск, 2008 - С. 154 - 155.

5.Астафьева К.А., Дмитриева К.К., Ефремов A.B., Игнатова A.B., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Овсянко Я.У., Пахомова Ю.В., Пустоветова М.Г., Сазонов B.C., Самсонов A.B. Оценка патогенетического и саногенетического эффектов общей управляемой гипертермии на примере анализа состояния тканевого микрорайона печени крыс Wistar // Вестник новых медицинских технологий. - 2008. - T. XV, № 4. - С. 25 - 28.

6.Зайцев С.А., Пахомова Ю.В., Овсянко Е.В., Астафьева К.А., Долото-ва Н.В. Оценка морфофункционального состояния лимфатических узлов лабораторных животных при общей управляемой гипертермии // Медицина и образование в Сибири. — 2008 - № 5. - http://ngmu.ru/cozo/mos/article/textfull.-php?id=307.

7.Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. Оценка роли системы антиоксидантной защиты в патогенезе нарушения метаболизма у крыс с карциносаркомой Walker-256 под влиянием различных видов терапии // Медицина и образование в Сибири. - 2008 - № 5. - http://ngmu.ru-/cozo/mos/article/text full.php?id=307.

8.Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. К вопросу изучения степени нарушения- баланса системы, «оксиданты-анти-оксиданты» в плазме крови крыс в динамике развития саркомы Walker-256 // Межрегиональная научно-практическая конференция «Казначеевские чтения № 3. Синдром полярного напряжения». — Новосибирск, 2008 — С. 99 — 104.

9.Овсянко Е.В., Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова А.В: Оценка состояния системы антиоксидантной защиты у лабораторных животных с карциносаркомой Walker-256 под влиянием различных видов терапии // Межрегиональная научно-практическая конференция «Казначеевские чтения № 3. Синдром полярного напряжения». - Новосибирск, 2008 - С. 104 - 110.

10. Овсянко Е.В., Ефремов А.В, Мичурина C.B., Овсянко Я.У. Морфологическое исследование висцеро-соматических лимфатических узлов при воздействии общей управляемой гипертермии // Материалы конференции, посвящ. 80-летию академика Ю.И.Бородина «Морфология, лимфология, клиника». — Новосибирск, 2009 — С. 248 - 251.

11. Пупышев А.Б., Федина Р.Г., Мичурина C.B., Овсянко Е.В., Ефремов A.B. Эффект общей управляемой гипертермии на содержание продуктов ли, пидпероксидации и активность лизосомных ферментов в сывортки крови у I

4 крыс с карциносаркомой Walker-256 // Вопросы онкологии. — 2009. — Т. 55,

2.-С. 221,-223.

- 12. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Сафронов И.Д., Мичурина C.B., Пахомова Ю.В. Изменение содержания жирорастворимых антиоксидантов у животных с карциносаркомой WALKER-256 под влиянием различных видов терапии // Вопросы онкологии. - 2009. — № 3. - С. 27 — 29.

13. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Цырендоржиев Д.Д., Мичурина C.B., Пахомова Ю.В. Состояние про- и антиоксидантной активности сыворотки крови у крыс с карциносаркомой Walker-256 // Сибирский онкологический журнал. - 2009.- № 4 (34). - С. 57 - 61.

14. Овсянко Е. В:, Пахомова Ю.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Гусев A.B. Изучение степени нарушения баланса в системе «оксидант-антиоксидант» в организме крыс в динамике развития карциносаркомы Walker-256 // I Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы, патогенеза типовых патологических процессов». — Новосибирск, 2009 - С - 275 - 278.

15. Овсянко Е. В., Дмитриева К.К., Пахомова Ю.В., Макаров Е.Д., Пус-товетова М.Г. К вопросу изучения антиоксидантов сыворотке крови крыс с линейно-неспецифической карциносаркомой Walker-256 в динамике и на фоне применения различных видов консервативной терапии // I Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». — Новосибирск, 2009 — С. 279 — 281.

16. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Мичурина C.B., Бгатова Н.П., Лушни-кова Е.Л., Овсянко Я.У., Вакулин Г.М. Ультраструктурный и стереологиче-ский анализ клеток карциносаркомы Walker 256 на разных стадиях диффе-ренцировки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2009. - Т. 149, № 9. - С. 337 - 342.

17. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Лушникова Е.Л., Ларионов П.М., Архипов С.А., Непомнящих Л.М., Овсянко Я.У. Иммуногистохимичкский анаV к i

15 лиз программируемой гибели клеток карциносаркомы Walker 256 при воздействии цитостатическими препаратами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 149, № 10. - С. 455 - 460.

18.Пахомова Ю.В., Ефремов A.B., Пустоветова М.Г., Овсянко Е.В., Овсянко Я.У., Мичурина C.B., Астафьева К.А., Дмитриева К.К., Игнатова A.B., Сазонов B.C., Самсонов A.B. Изменения эндокринно-метаболических профилей плазмы крови крыс в остром периоде после общей управляемой гипертермии, как проявление синдрома воспалительного ответа животного на экстремальное воздействие // Вестник новых медицинских технологий.

- 2009. - T. XVI, № 4. - С. 17 - 19.

19.Кунц Т.А., Мичурина C.B., Белкин А.Д., Овсянко Е.В. Морфологическое исследование паренхиматозного и соединительнотканного компар-тмента печени крыс с перевиваемой карциносаркомой Уокера-256 // Выездная научная сессия, посвященная 80-летию С.У.Джумабаева «Лимфология».

- Узбекистан, 2008. - № 1-2. - С. 46 - 48.

20. Овсянко Е.В., Дмитриева К.К., Игнатова A.B. Оценка антиоксидантного потенциала сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker-256 на фоне применения общей управляемой гипертермии, циклофосфана и ме-латонина // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученные в медицине». - Казань,

2009.-С. 171-172.

21. Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Ларионов П.М., Овсянко Я.У. Апоп-тоз-индуцирующая эффективность общей гипертермии у крыс с карциносаркомой Walker 256 // II Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов».

- Новосибирск, 2010. - С. 113 - 117.

22. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Особенности ультраструктурной организации клеток карциносаркомы Walker 256 при воздействии-общей гипертермии // Морфология. - 2010. — Т. 137, № 4. - С. 145.

23. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Ультраструктурные изменения эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 при воздействии общей гипертермии // Морфология. —

2010. - Т. 137, № 4. - С. 145 -146.

24. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ищенко И.Ю., Ефремов A.B., Овсянко Е.В. Энергетический потенциал клеток печени крыс с карциносаркомой Walker 256 при терапии цитостатиком // IX российско-германская научно-практическая конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» -Новосибирск, 2010.- С. 181 - 182.

25. Овсянко Е.В., Бгатова Н.П., Овсянко Я.У. Показатели активности процессов перекисного окисления липидов и апоптоза у крыс с карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермии // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2011. - Т. 31, № 1. - С 17 - 21.

26. Овсянко Е.В:, Сафронов И.Д., Овсянко Я.У., Вакулин Г.М. Ультраструктурная реорганизация эндотелиоцитов кровеносных капилляров карци-носаркомы Walker 256 в условиях спонтанного роста и при воздействии общей гипертермии // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2011. - Т. 31, №1.-С. 22-26.

27. Овсянко Е.В., Ефремов A.B., Лушникова Е.Л., Сафронов И.Д., Кунц Т.А., Морозов И.Д., Овсянко Я.У., Виноградов A.B. Морфологические показатели канцерогенеза перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при воздействии цитостатиками // III Всероссийская науч.-практ. конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». -Новосибирск, 2011- С. 197-201.

28. Кунц Т.А., Ефремов A.B., Овсянко Е.В., Вакулин Г.М., Ищенко И.Ю., Пустоветова М.Г. Субклеточная организация печени крыс с экспериментальной карциносаркомой в постцитостатический период // III Всероссийская науч.-практ. конф. с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». — Новосибирск, 2011— С. 149 — 152.

29. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Овсянко Е.В., Ефремов А.В: Печень крыс при продвинутых стадиях карциносаркомы Walker 256 // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. — 2011. - Т. 9, вып. 2. - С. 126 -129.

30. Кунц Т.А., Вакулин Г.М., Ефремов A.B.,. Овсянко Е.В, Пустоветова М.Г., Жураковский И.П. Ультраструктурные параметры клеток печени крыс на ранних стадиях развития карциносаркомы Walker 256 // Кубанский научный медицинский вестник. — 2011. Т. 126, № 3. — С. 91 — 96.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. РЕГУЛЯЦИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА и современней: подходы к химиотерапии опухолей

1. Результаты исследования, отражающие ремоделирование опухолевого узла карциносаркомы Walker 256, могут служить базой для тестирования противоопухолевого эффекта новых лекарственных веществ.

2. Примененные в работе методы оценки основных параметров опухолевого роста целесообразно использовать при сравнительных исследованиях эффективности противоопухолевых препаратов и воздействий.

3. Для более полной характеристики противоопухолевой активности и побочных эффектов тестируемых антибластомных воздействий необходимо изучение как опухолевой трансформации, так и системных проявлений опухолевого процесса.

практические рекомендации