Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Особенности липидного спектра крови при развитии карциносаркомы Walker 256 и воздействии общей гипертермии(экспериментальное исследование)

Молоков Кирилл Валерьевич ОСОБЕННОСТИ ЛИПИДНОГО СПЕКТРА КРОВИ ПРИ РАЗВИТИИ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 И ВОЗДЕЙСТВИИ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ (экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 и i |/лР 2014

Кемерово-2014

005546182

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ефремов Анатолий Васильевич

Официальные оппоненты:

Поляков Лев Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, заместитель директора по научной работе

Щербаков Владимир Иванович - доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии репродукции

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «_»_2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России

Автореферат разослан « »_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Разумов Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Проблематика заболеваемости и смертности от онкологической патологии - одна из самых актуальных в медицине. По данным ВОЗ, в мире каждый год умирает от злокачественных новообразований больше 4 млн. человек. Недостаточная эффективность при лечении онкологических заболеваний с использованием традиционных методов (цитостатическая химиотерапия, лучевая терапии, хирургические методы), заставляет искать новые способы терапии (Ефремов A.B., 2004; Киншт Д.Н., Киншт Н.В., 2006; Сувернев A.B. и др., 2009; Schlemmer М. et al., 2004; Song C.W. et al., 2005). В этой связи внимание ученых и практикующих врачей привлекает метод общей управляемой гипертермии, действие которой основано на том, что клетки опухоли обладают избирательной термочувствительностью.

Методики гипертермии успешно применяются в онкологии в качестве адъювантной терапии. Для экспериментальных исследований в области онкологии широко применяются модели опухолевых систем in vitro (линии опухолевых клеток) и in vivo (спонтанные и перевиваемые опухоли различных локализаций). Перевиваемая опухоль Walker 256, впервые описанная профессором Walker G. еще в 1928 г., является одной из модельных (Simpkins Н. et al., 1991). Использование подобной опухоли в доклинических исследованиях новых методов терапии онкологических заболеваний, позволяет оценить влияния отдельных факторов физической и химической природы, а также их сочетаний на различные характеристики роста опухоли.

Известно, что при общей гипертермии меняется структура межсистемных взаимодействий: существенно изменяется гомеостаз, звенья метаболизма организма, в том числе и показатели липидного обмена. Роль липидов в регуляции координированной деятельности органов и систем достигается строго упорядоченной функцией клеток и тканей организма, которые, синтезируя липиды и участвуя в их метаболизме, обеспечивают состояние жизнедеятельности на уровне, соответственно эволюционному и генетическому статусу живой системы (Козлов Н.Б., 1990; Пахомова Ю.В., Ефремов A.B., 2007). Традиционное отношение к липидам только как к источнику энергии и структурным компонентам клеточных мембран существенным образом ограничивает диапазон исследований общей системы регуляции организма, в которой липиды занимают достаточно важную роль.

При экстремальных ситуациях (управляемая гипертермия, синдром сдавления, опухолевый процесс) изменяется и физико-химическое состояние липидов, что, в свою очередь, ведет к нарушению структуры клеточных мембран (Безуглов В.В., Коновалов С.С., 2009; Гидранович А.В. и др., 2009; Асадчикова О.Н., 2010; Pires L.A. et al., 2009; Tamburrini A.L. et al., 2011). В литературных данных нет сведений, касающихся изучения липидного спектра крови при экспериментальном канцерогенезе при действии общей гипертермии. Отсутствуют работы по изучению различных звеньев системы метаболизма (в частности, липидного) при лечении онкологических заболеваний в условиях общей управляемой гипертермии.

Исходя из вышесказанного, следует, что изучение изменений липидных фракций при терапии онкологических заболеваний общей управляемой гипертермией, имеет важное теоретическое и практическое значение и может использоваться в совершенствовании схем лечения онкологических больных.

Цель исследования: охарактеризовать патогенетические особенности изменения липидных фракций крови и активности перекисного окисления липидов у крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии.

Задачи исследования:

1. Изучить характер изменения липидных фракций (содержание общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеидов высокой, низкой, очень низкой плотности, аполипопротеинов А1, В и активности липазы) в крови у интактных крыс и крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии.

2. Оценить динамику активности перекисного окисления липидов (по содержанию малонового диальдегида, диеновых конъюгатов) и общей антиоксидантной активности крови у интактных крыс и крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии.

3. Провести сравнительный анализ показателей липидных фракций крови и параметров оксидантно-антиоксидантного потенциала у интактных крыс и крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии.

4. Исследовать микроструктурные изменения опухолевого очага у крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии.

Научная новизна

Впервые показано, что важной патогенетической закономерностью развития перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после действия общей гипертермии на уровне целостного организма является нарушение липидного спектра крови и рост активности процессов перекисного окисления липидов у экспериментальных животных.

Выявлено, что у крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после влияния общей гипертермии отмечается гипохолестеринемия (за счет уменьшения содержания общего холестерина, ХС ЛПНП и ХС ЛПВП), снижение Апо-А1 и липазы, а также гипертриглицеридемия и повышение концентрации Апо-В и ХС ЛПОНП в крови.

Установлено, что изменения оксидантно-антиоксидантного потенциала у крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии характеризуется повышением содержания МДА и ДК в крови и увеличением общей антиокислительной активности крови.

Установлено, что после общей гипертермии происходят микроструктурные изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 в организме экспериментальных животных. Это проявляется разрыхлением опухолевого узла, появлением очагов некроза, усилением процессов апоптоза опухоли (преобладание апоптотического индекса над митотическим индексом) у крыс.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Данные, полученные в ходе проведения настоящего исследования, расширяют существующие представления о патогенетической значимости изменений липидного метаболизма и активности перекисных процессов при опухолевом росте в условиях воздействия общей гипертермии на организм.

Полученные данные об особенностях патоморфогенеза карциносаркомы Walker 256 после воздействия общей гипертермии (запуск механизмов апоптоза), являются патогенетической основой для разработки эффективных схем терапии онкологических заболеваний.

Методология и методы исследования

Работа носит экспериментальный характер. Для решения поставленных задач проведено биохимическое исследование, иммунотурбидиметрия, биохемилюминесценция, морфологическое исследование. Объект исследования - крысы-самцы линии Wistar, предмет исследования - оценка липидного

спектра крови при различных условиях. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики.

Положения, выносимые на защиту

1. У крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии изменяется липидный спектр крови, характеризующийся развитаем гипохолестеринемии, гипертриглицеридемии, дисапопротеинемии и

снижением активности липаз.

2. У крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии нарушается оксидантно-антиоксидантный потенциал, проявляющийся увеличением уровня перекисного окисления липидов и общей антиокислительной активности крови.

3. Характерными первичными микроструктурными изменениями перевиваемой карциносаркомы Walker 256 у крыс после воздействия общей гипертермии являются: разрыхление опухолевого узла, появление очагов некроза.

Степень достоверности результатов

Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов биохимических и морфологических исследований, достоверной выборкой экспериментальных животных, значительным объемом фактического материала и его адекватным статистическим анализом.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России по темам: «Типовые нарушения липидного обмена», «Патофизиология тканевого роста. Опухоли». Результаты исследования внедрены в научную работу Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России.

Апробация материалов диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены на: III, IV, V Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2011, 2012, 2013, соответственно); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс - конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-

2013» (Новосибирск, 2013), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2013).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 7 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, содержащего 268 источников (111 - отечественных, 157 - зарубежных). Текст иллюстрирован 10 таблицами, 28 рисунками.

Выполненная работа является частью комплексного исследования, проводимого кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России в рамках темы «Изучение механизмов патогенетических реакций организма в условиях общей гипертермии у экспериментальных животных» (№ государственной регистрации -01200952281).

Личный вклад автора

Автор лично занимался разработкой дизайна исследования и планирования эксперимента. Диссертант самостоятельно проводил сбор материала, анализ, статистическую обработку и описание результатов исследования. Поиск и критический анализ литературы по теме диссертации проведен лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Исследования проведены на 177 крысах-самцах линии Wistar (возраст 2,5 мес.). Крысы получены из вивария Центральной научно-исследовательской лаборатории НГМУ массой 235,18 ± 28,04 г. Уход за экспериментальными животными и их содержание в условиях вивария соответствовали требованиям приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» № 1045-73 от 06.04.1973; №1179 от 10.10.1983 МЗ СССР; №267 от 19.06.2003 МЗ РФ; «Правилам по обращению, содержанию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденным МЗ СССР (1977 г.) и МЗ

РСФСР (1977 г.). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России (№3 от 21.04.2011).

Экспериментальная модель. Общая гипертермия животных воспроизводилась в соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» (Ефремов A.B. с соавт., 2001). У экспериментальных животных регистрировали массу тела, исследовали плазму крови, световые полутонкие срезы тканей опухоли.

Работа с животными проводилась с соблюдением принципов гуманности, которые изложены в директивах Европейского сообщества (2010/63/ЕС) и Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).

Для перевивания использовался штамм карциносаркомы W256, который поддерживается in vivo (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, лаборатория физиологической генетики). Клетки перевиваемой опухоли W256 в виде суспензии инъекционно вводили крысам в мышцу задней части бедра в дозировке lxl 0е клеток в 0,1 мл физиологического раствора NaCl (Хегай И.И. и др., 2008; Monte О. et al., 2005; Jacobson M.D., 1996). Объем перевитой опухоли измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Спустя 5 сут. со времени перевивания опухоли ее объем достигал 2,47 ± 0,34 см3. С этого времени экспериментальные животные (177 особей) были разделены на 4 группы. I группа (82 крысы) - после ОГ, II группа (75 крыс) - после ОГ с опухолью W256. Исследования проводили в зависимости от сроков с момента перегревания: на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е и 21 сут. Группу контроля (III группа) составили 10 лабораторных животных. Группу сравнения (IV группа) составили 10 крыс с W256 (на 10 сут. после инициации опухолевого процесса) без воздействия ОГ. Выбранный срок для оценки липидных фракций крови соответствует средней фазе состояния опухоли и предшествует признакам выраженной кахексии с последующим летальным исходом (Khegai et al., 2006).

В ходе эксперимента в I группе гибель крыс составила 2 особи (по 1 на 14-е и 21 сут.), во II группе - 9 особей (1 - на 7-е, 3 - на 14-е, 5 - на 21-е сут.).

Методика забора крови. Животных декапитировали под эфирным наркозом. Кровь собирали в пробирку с раствором гепарина, затем отстаивали в течение 10 минут и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 минут. До

момента определения плазма хранилась при -20°С в морозильной камере. От одной крысы с помощью данного способа получали до 3-4 мл крови.

Методика забора морфологических препаратов. Образцы карциносаркомы W256 исследовали на светооптическом уровне (микроскоп Axioskop 40). Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе MICROM («Карл Цейс» Германия). Заливку в парафиновые блоки проводили на станции АР 280 (использовали гистопласт с t° плавления 58°). Срезы толщиной 4 мкм (окраска гематоксилином и эозином) исследованы методом световой микроскопии. Для объективизации изменений, которые происходят с опухолью W256 при воздействии ОГ определяли: 1) МИ - находящиеся на разных стадиях митоза клетки опухоли в количественном отношении, выраженные в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Учитывалось не менее 2 тыс. клеток; 2) АИ — находящиеся в состоянии апоптотической гибели клетки опухоли в количественном отношении, выраженные в промилле к общему числу опухолевых клеток (%о). Учитывалось не менее 2 тыс. клеток.

Апоптоз определяли по морфологические признакам - прогрессирующей фрагментации клетки с формированием апоптозных телец, элиминирующихся фагоцитами при отсутствии воспаления (в отличие от некроза)1.

Фотографирование проводили при помощи цифровой камеры Leica DFC320 и компьютерной программы Leica.QWinV3.

Биохимические методы исследования.

ОХ в плазме крови определяли ферментативным методом (набор реагентов «Новохол-100» ЗАО «Вектор-Бест-Европа» (каталог В-8011)) по инструкции производителя, результаты выражали в ммоль/л (спектрофотометр СФ-46, Россия). ТГ определяли спектрофотометрическим методом (реактивы Biosub TG (Biocon, Германия)), результаты выражали в ммоль/л (спектрофотометр СФ-46, Россия). ХС ЛПВП определяли прямым энзиматическим методом (набор реагентов HDL Cholesterol «FL - Е» («Vital-Diagnostics»)), результаты выражали в ммоль/л. ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП определяли расчетным методом, результаты выражали в ммоль/л. Апо-А1 и Апо-В определяли методом иммунотурбидиметрии (набор реагентов ИМУ-ЛА-ТЕСТ (Pliva-Lachema Diagnostika)), результаты выражали в г/л (Marcovina

1 Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю. Гибель клетки (апоптоз). - М.: Медицина, 2001.- 192 с.

Б. М., 1991, 1993). Определение активности липазы крови проводили энзиматическим колориметрическим методом (Яковлева Г. Е., 2005; Ыеитеп и. с1 а1., 1984), (набор реактивов 5Р1КЯЕАСТ), результаты выражали в ед/л. МДА в плазме крови определяли спектрофотометрически (Владимиров Ю. А., Арчаков А. И., 1972), результаты выражали в нмоль/л (спектрофотометр СФ-46, Россия). ДК гидроперекисей в плазме крови определяли спектрофотометрическим методом (Волчегорский И. А. и др. 1989), результаты представляли в усл. ед. опт. пл. (спектрофотометр СФ-46, Россия). АОА плазмы крови определяли биохемилюминесцентным методом (Коган А. X., 1976), результаты выражали в усл. ед. (биохемилюминометр БХЛ-07, Россия).

Статистическая обработка данных проведена с помощью пакета программ 81а1!Биса 6.0 и пакета анализа программ МБ Ек е1 2010. Для адекватного выбора статистических методов анализа проводилась проверка нормальности распределения количественных переменных. При работе с базой данных определялись средние арифметические величины и стандартные ошибки средних арифметических (М ± ш). Результаты оценивали с использованием критерия Стьюдента (при соответствии нормальному закону распределения), непараметрического критерия Манна-Уитни, коэффициента ранговой корреляции Спирмена и коэффициента корреляции Пирсона (г). Достоверными считались результаты при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что экстремальные температуры приводят к гипохолестеринемии. В I группе содержание ОХ в плазме крови был стабильно низким на протяжении всего периода после воздействия ОГ (Таблица 1).

Таблица 1 - Динамика содержания ОХ и ТГ в плазме крови крыс после общей гипертермии______

Сроки исследования ОХ (ммоль/л) ТГ (ммоль/л)

Контроль (п=10) 2,14±0,06 1,15±0,02

1-е сутки (п=17) 1,12±0,08*** 1,51±0,03**

3-й сутки (п=17) 1,56±0,02*** 1,64±0,01 ***

7-е сутки (п=17) 2,05±0,03 2,43±0,02***

14-е сутки (п=15) 1,72±0,07*** 1,62±0,04**

21-е сутки (п=14) 1,74±0,02*** 2,25±0,03***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля:

В ходе эксперимента установлено снижение содержания ХС ЛПВП в течение всего периода после ОГ, тенденция к снижению ХС ЛПНП, превышение показателей ХС ЛПОНП по сравнению с контролем (Таблица 2).

Таблица 2 - Динамика содержания ХС ЛПВП, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП в плазме крови крыс после общей гипертермии __

Сроки исследования ХС ЛПВП (ммоль/л) ХС ЛПНП (ммоль/л) ХС ЛПОНП (ммоль/л)

Контроль (п=10) 1,03±0,041 0,68±0,022 0,23±0,023

1-е сутки (п=17) 0,61±0,033*** 0,52±0,018*** 0,39±0,015***

3-й сутки (п=17) 0,66±0,017*** 0,54±0,022** 0,33±0,020***

7-е сутки (п=17) 1,02±0,028 0,61±0,021 0,60±0,018***

14-е сутки (п= 15) 0,83±0,021* 0,57±0,014* 0,37±0,012***

21-е сутки (п=14) 0,88±0,030* 0,51±0,023*** 0,47±0,013***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: *- р<0,05; ** -р<0,01; ***-р<0,001

Содержание аполипопротеинов также претерпевали значительные изменения: прогрессивное снижение Апо-А1 и повышение Апо-В (Таблица 3).

Таблица 3 - Динамика содержания аполипопротеинов Апо-А1 и Апо-В в плазме крови крыс после общей гипертермии __i

Сроки исследования Апо-А1(г/л) 'Апо-В (г/л)

Контроль (п=10) 0,56±0,014 1,09±0,025

1-е сутки (п=17) 0,29±0,034*** 2,68±0,017***

3-й сутки (п=17) 0,32±0,051*** 2,75±0,021***

7-е сутки (п=17) 0,37±0,047*** 4,12±0,019***

14-е сутки (п=15) 0,41±0,015** 3,96±0,024***

21-е сутки (п=14) 0,39±0,028*** 3,45±0,037***

Примечания: * - величины, достозерно отличающиеся от группы контроля: *- р<0,05; ** -р<0,01; *** -р<0,001

С учетом воздействия повреждающего фактора - экстремально высокой температуры, предполагается активация липолиза и повышение липолитической активности крови. Для подтверждения этого предположения, в крови крыс проведен анализ активности фермента липазы. В группе контроля

содержание липазы - 15,4±1,2 Ед/л, что принимали за 100,0%. Определение липазы показало повышенное содержание этого фермента в плазме крови крыс после ОГ: в 1-е сут. - на 45,5% (22,4±2,0 Ед/л) (п=17), (р<0,01), на 3-й сут. - на 50,0% (23,1±1,8 Ед/л) (п=17), (р<0,001), на 7-е сут. - на 40,9% (21,7±0,9 Ед/л) (п=17) (р<0,001), на 14-е сут. - на 27,3% (19,6±1,5 Ед/л) (п=15) (р<0,05), на 21-е сут. - (6,3±1,1 Ед/л) (п=14) - без достоверной разницы).

В ходе исследования показано, что в периоде после воздействия ОГ в плазме крови крыс отмечается изменение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ - МДА и ДК, при активации общей АОА (Таблицы 4,5).

Таблица 4 - Динамика содержания МДА и ДК в плазме крови крыс после общей гипертермии

Сроки исследования

Контроль (п=10)

1-е сутки (п=17)

3-й сутки (п=17)

7-е сутки (п=17)

14-е сутки (п=15)

21-е сутки (п=14)

МДА (нмоль/л)

20,19+0,94

21,63±0,85

18,10±0,92'1

18,3 ±0,63

20,02±0,71

17,2+0,46*

ДК ед. опт. пл.)

0,19±0,007

0,18±0,002

0,14+0,002*

0,16±0,007*

0,16+0,004*

0,17±0,007

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: * - р<0,05; ** -рО.О!; ***-р<0,001

Таблица 5 - Динамика изменения АОА плазмы крови крыс после общей гипертермии

Сроки исследования АОА (усл. ед.)

Контроль (п=10) 1,53+0,04

1-е сутки (п=17) 1,94±0,08***

3-й сутки (п=17) 2,62±0,03***

7-е сутки (п=17) 2,58±0,08***

14-е сутки (п=15) 2,09+0,06***

21-е сутки (п=14) 1,93+0,11***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля:

При проведении корреляционного анализа в 1-е сут. наблюдения выявлена умеренная положительная взаимосвязь между значениям МДА и ОХ (г=0,54), к 3 сут. зарегистрирована обратная связь между МДА и ТГ (г=-0,37), ДК и ХС ЛПНП (г=-0,44), прямая связь между ДК и ХС ЛПОНП (г=0,47), к 7-м сут. - обратная корреляционная связь между уровнем МДА и ХС ЛПВП и ХС ЛПОНП (г=-0,44 и г=-0,5; соответственно), между общей АОА и ТГ (г=-0,35).

Таким образом, изменение липидного спектра крови крыс при воздействии ОГ характеризовалось гипохолестеринемией, гипертриглицеридемией, снижением содержания ХС ЛПВП и аполипопротеина А1, снижением концентрации ХС ЛПНП (в первые 3 суток после воздействия ОГ), повышением ХС ЛПОНП и аполипропротеина В, увеличением липолитической активности крови. Повышение АОА крови способствует установлению равновесия окислительных процессов и антиокислительных систем и свидетельствует о благоприятном течении периода после ОГ.

Важным этапом работы было изучение липидного спектра и оксидантно-антиоксидантного потенциала крови крыс с перевиваемой карциносаркомой \V256 после воздействия ОГ.

Содержание ОХ в крови крыс отличалось от группы контроля, и достоверно снижалось в динамике периода после воздействия ОГ на протяжении первых 7 сут., далее - прослеживалась тенденция к гиперхолестеринемии (Таблица 6).

Таблица 6 - Динамика содержания ОХ и ТГ в плазме крови у крыс с перевиваемой опухолью после общей гипертермии

Сроки исследования ОХ (ммоль/л) ТГ(ммоль/л)

Контроль (п=10) 2,14±0,0б 1,15±0,02

Группа сравнения (п=10) 1,11±0,08* 2,31±0,05***

1-е сутки (п=15) 1,82±0,03* 2,20±0,06***

3-й сутки (п=15) 1,81±0,06** 2,37±0,04***

7-е сутки (п=14) 1,95±0,05 4,63±0,05***

14-е сутки (п=12) 2,04±0,02 5,43±0,02***

21-е сутки (п=10) 2,20±0,09 4,01±0,04***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля:

В группе сравнения (крысы с перевиваемой опухолью, без воздействия ОГ) концентрация ОХ достоверно ниже (1,11±0,08 ммоль/л (р<0,05)), а уровень ТГ - достоверно выше (2,31±0,05 ммоль/л (р<0,001)), по сравнению с аналогичными показателями у интактных крыс.

При сравнении межгрупповых различий установлено, что при гипертермии с опухолевым процессом значения ОХ были выше на 14 -е сут. в 1,2 раза, на 21-е - в 1,3 раза (р<0,05) по сравнению с группой без опухоли.

В течение всего периода после воздействия ОГ была зарегистрирована гипертриглицеридемия, при этом максимальные значения ТГ зарегистрированы на 14-е сут. У крыс с опухолью после ОГ имела место более выраженная гипертриглицеридемия во все сроки эксперимента по сравнению со значением ТГ у крыс после ОГ без опухолевого процесса.

При оценке содержания транспортных форм липидов крови установлено прогрессирующее снижение концентрации ХС ЛПВП, по сравнению с контролем (Таблица 7).

Таблица 7 - Динамика содержания ХС ЛПВП, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП в плазме крови у крыс с перевиваемой опухолью после общей гипертермии

Сроки исследования

Контроль (п=10)

Группа сравнения (п=10)

1-е сутки (п=15)

3-й сутки (п=15)

ХС ЛПВП (ммоль/л)

1,03±0,041

1,02±0,01

0,64±0,04***

0,61±0,01***

ХС ЛПНП (ммоль/л)

0,68±0,022

0,70±0,02

0,79±0,03

0,72±0,01

ХС ЛПОНП (ммоль/л)

0,23±0,023

0,47±0,01*

0,47±0,01***

0,51±0,02***

7-е сутки (п=14)

14-е сутки (п=12)

21-е сутки (п=10)

0,54±0,01***

0,52±0,01*

0,49±0,02***

0,45±0,04*

0,66±0Д9**

0,76±0,03

0,92±0,02***

1,10±0,03***

0,76±0,02***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: *- р<0,05; ** - р<0,01; *** -р<0,001

В отличие от значений в группе крыс с ОГ без опухоли, при опухолевом процессе и ОГ отмечались более низкие значения ХС ЛПВП (различия статистически достоверны с 7-х сут. эксперимента). Значения ХС ЛПНП имели тенденцию к повышению на 1- е и 3 сут. наблюдения, в отличие от группы крыс без опухоли, где концентрация ХС ЛПНП была ниже контроля.

Концентрация ХС ЛПОНП в плазме крови на протяжении всего периода после ОГ была выше, по сравнению со значениями в группе контроля.

Анализируя содержание Апо-А1 в крови крыс установлено, что весь период после ОГ значения показателя были ниже, а концентрация Апо-В в течении всего эксперимента превышала значения контроля (Таблица 8).

Таблица 8 - Динамика содержания Апо-А1 и Апо-В в плазме крови у

крыс с перевиваемой опухолью после общей гипертермии

Сроки исследования Апо-А1 (г/л) Апо-В (г/л)

Контроль (п=10) 0,56±0,014 1,09±0,025

1-е сутки (п=15) 0,23±0,087*** 2,36±0,052***

3-й сутки (п=15) 0,38±0,025*** 4,15±0,011***

7-е сутки (п=14) 0,47±0,077* 4,96±0,032***

14-е сутки (п=12) 0,31±0,063*** 3,06±0,027***

21-е сутки (п=10) 0,34±0,018*** 2,20±0,054***

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: * - р<0,05; ** -р<0,01; *** -р<0,001

При определении содержания липазы у крыс после ОГ с карциносаркомой W256, установлена более низкая концентрация в динамике наблюдения по сравнению с контролем: в 1-е сут,- на 5,6% (14,7±0,7 Ед/л) (п=15), на 3-й сут. - на 18,8% (12,5±1,1 Ед/л) (п=15), на 7-е сут. - на 27,3% (11 ¿±0,5 Ед/л) (п=14) (р < 0,01), на 14-е сут. - на 38,3% (9,5±0,3 Ед/л) (п=12) (р<0,01), на 21-е сут. - на 42,2% (8,9±0,4 Ед/л) (п=10) (р<0,001).

Активация процессов ПОЛ подтверждается результатами проведенных исследований. В плазме крови крыс с W256 после ОГ обнаруживается повышенная концентрация МДА и ДК в первые трое суток, с 7-е по 21-е сут. -резкое снижение МДА. При сравнении с группой крыс после ОГ без опухоли, зарегистрировано статистически значимое повышение содержания МДА в первые трое сут. наблюдения (р<0,05). Концентрация ДК в плазме крови крыс с W256 в течение всего периода наблюдения была выше подобного показателя у крыс после ОГ без опухоли (р<0,05) (Таблица 9).

В группе сравнения зарегистрировано более высокое содержание МДА (23,5±0,96 нмоль/л) (р<0,05), тенденция к повышению значений ДК (без

статистически достоверной разницы), средние значения АОА были достоверно выше (1,69±0,05 усл. ед.) относительно группы контроля (р<0,05).

Таблица 9 - Динамика содержания МДА и ДК в плазме крови у крыс с перевиваемой опухолью после общей гипертермии

Группы исследования МДА (нмоль/л) ДК (ед. опт. пл.)

Контроль (п=10) 20,19+0,94 0,19±0,007

Группа сравнения (п=10) 23,50±0,96* 0,21±0,003

1-е сутки (п=15) 29,63±0,78*** 0,23+0,004*

3-й сутки (п=15) 31,0+0,82*** 0,24±0,001**

7-е сутки (п=14) 15,31±0,92** 0,23+0,005*

14-е сутки (п=12) 17,02±0,63** 0,20±0,008

21-е сутки (п=10) 16,82±0,88* 0,20±0,006

Примечания: * — величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

В ответ на повышение интенсивности реакций ПОЛ с 1-х сут наблюдения отмечена активация общей АОА крови (Таблица 10).

Таблица 10 - Динамика изменения АОА плазмы крови крыс с перевиваемой опухолью после общей гипертермии

Группы исследования АОА (усл. ед.)

Контроль (п= 10) 1,53±0,04

Группа сравнения (п=10) 1,69+0,05*

1-е сутки (п=15) 1,76+0,07*

3-й сутки (п=15) 2,02+0,02***

7-е сутки (п=14) 2,18±0,05***

14-е сутки (п=12) 1,95±0,06***

21-е сутки (п=10) 1,60+0,07

Примечания: * - величины, достоверно отличающиеся от группы контроля: *- р<0,05; ** -р<0,01; ***-р<0,001

При сравнении АОА плазмы крови интактных крыс после ОГ и крыс с карциносаркомой W256 после ОГ, установлены более низкие показатели в последнем случае (р<0,05).

В 1-е сутки периода после воздействия ОГ выявлены умеренные корреляционные взаимоотношения между значениями МДА и ОХ (г=0,41), МДА и ХС ЛПНП (г=-0,49), ДК и ХС ЛПВП (г=0,56), ДК и ХС ЛПНП (г=-0,53), к 3 сут. изменились корреляционные взаимоотношения между значениями ДК и ХС ЛПНП (г=0, 56),к 7 сут. — отмечается ослабление связи между ДК и ХС ЛПВП (г=0,33), к 14 сут. появляется обратная корреляция между значениями МДА и Ano-Al (г=-0,43), умеренная прямая связь между ДК и ТГ (г=0,51), к 21 сут. - сильная обратная связь между показателями МДА и ХС ЛПОНП (г=-0,61), к 21- м сут. - усиление обратной связи между ДК и ОХ (г=-0,73), выявлялась обратная корреляция между ДК и ТГ (г=-0,4). Выявлены слабые обратные взаимосвязи между значениями общей АОА и ОХ (г=-0,31), АОА и ТГ (г=-0,31) в 1-е сут. после ОГ, в дальнейшем связь между АОА и ОХ усиливалась (г=0,45 — на 3 сут. и г=0,67 — на 14 сут., а к 21-м сут. — отмечалось ослабление корреляционных взаимоотношений (г = 0,48). К 7-м сут. выявлена прямая корреляционная связь между показателями общей АОА и ХС ЛПОНП (г=0,65), ослабевающая при дальнейшем наблюдении.

Подобные корреляционные взаимоотношения определяют непосредственную связь нарушений липидного спектра крови и состояния окислительного стресса в организме опытных животных.

Таким образом, изменение липидного спектра крови крыс с перевиваемой опухолью Walker 256 при воздействии ОГ характеризовалось гипохолестеринемией, гипертриглицеридемией (максимальное значение ТГ на 14-е сут. наблюдения), снижением содержания ХС ЛПВП (минимальные значения - к 14-м сут. наблюдения), тенденцией к увеличению ХС ЛПНП, увеличением ХС ЛПОНП относительно интактного значения (наибольший показатель — на 14 сут.), снижением содержания аполипопротеина Al и повышением аполипопротеина В, низкой липолитической активностью крови.

В 1-е сут. периода после ОГ патоморфологические изменения опухоли W256 характеризовались инфильтративным ростом по межфасциальным пространствам, эпителиоидные клетки локализовались в толще мышечной ткани, в виде пластов и тяжей, нарушая архитектонику и кровоснабжение мышечной ткани. МИ и АИ на 1 сут. эксперимента не отличались, и составили

8,3±0,5%о и 9,2±1,23%о, соответственно. На 3 сут. после ОГ наблюдалась дальнейшая прогрессия процессов распада опухолевой ткани. Мелкоочаговые

некрозы выявлялись по всей поверхности среза опухоли, регистрировались множественные очаги апоптотической гибели опухолевых клеток, инфильтрированные полиморфноядерными лейкоцитами, с выраженным межуточным отеком и кровоизлияниями (Рисунок 1). МИ по сравнению с 1 сут. эксперимента снизился на 49,8% (4,25±0,4%о) (р<0,05), АИ - увеличился на 441,8% (40,65±2,4%о) (р<0,001). В эти же сроки отмечалось наибольшее увеличение концентрации МДА, что характеризует состояние окислительного стресса в организме опытных животных. МДА, гидроперекиси являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью, вызывая задержку деления клеток.

Рисунок 1 - Межуточный отек ткани с очагами кровоизлияний на 3-й сут. после общей гипертермии (окраска гематоксилином и эозином. Ув. 1000 с иммерсией)

На 7 сут. эксперимента очаги некроза и апоптотической гибели опухолевых клеток увеличивались в размерах (Рисунок 2). Некрозы имели крупноочаговый характер, с преимущественной локализацией в центральной части опухоли с выраженным отеком и кровоизлияниями от диапедезных до обширных. Митотическая активность клеток наблюдалась только по периферии опухолевого узла и в межфасциальных тяжах опухоли. По сравнению с 1 сут. зарегистрировано максимальное снижение МИ на 72,3% (2,3±0,3%о) (р<0,001), и максимальное увеличение АИ - на 447,3% (41,15±1,2%о) (р<0,001).

очаг некроза

зона роста опухоли

Рисунок 2 - Очаг некроза. Периваскулярная зона роста опухоли на 7-е сут. после общей гипертермии (окраска гематоксилином и эозином. У в. 200)

На 14 сут. эксперимента на фоне выраженных процессов распада опухоли наблюдался дальнейший инфильтративный рост карциноматозной части опухоли в межфасциальных тяжах и периваскулярно. По сравнению с 7 сутками в периваскулярных муфтах и по периферии опухоли МИ увеличился в 2,4 раза (5,45±0,8%о) (р<0,05) и незначительно уменьшился АИ (33,95±1,5%о). Возможно, это связано с включением некоторых опухолевых потенций, а также тем, что поврежденные клетки еще не успевают полностью элиминировать из опухоли. На 21 сут. по всему срезу наблюдались массивные очаги распада опухолевой ткани. Значения МИ и АИ индексов сопоставимы с показателями, зарегистрированными на 14 сутки эксперимента - 5,21±0,5%о и 36,52±1,4%о, соответственно. Таким образом, однократная гипертермия запускает процессы апоптотической гибели в клетках опухоли, о чем свидетельствует превалирование АИ над МИ.

Таким образом, сравнительный анализ полученных результатов исследования в соответствии с литературными данными позволяет заключить, что липиды имеют значимую роль в компенсаторных и приспособительных механизмах в условиях экстремальных состояний, в частности, при общей гипертермии и при гипертермии на фоне опухолевого процесса. Нарушение гомеостаза холестерина и триглицеридов, модификация транспортных форм липопротеидов, дисапопротеинемия, изменение липолитической активности крови, активация процессов ПОЛ, обеспечивали приспособительные

структурные механизмы и способствовали поддержанию постоянства внутренней среды организма в других условиях.

ВЫВОДЫ

1. Изменения липидного спектра крови (гипохолестеринемия, гипертриглицеридемия, дисаполипопротеинемия, высокая липазная активность) с первых дней после общей гипертермии, а также снижение активности реакций ПОЛ и увеличение АОА крови у интактных крыс являются компенсаторным ответом организма на воздействие высокой температуры.

2. Изменение липидного спектра у крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей гипертермии характеризуется более выраженной гипохолестеринемией, гипертриглицеридемией, дисаполипопротеинемией и низкой липазной активностью крови, по сравнению с интактными животными, что отражает высокое напряжение компенсаторных механизмов организма.

3. У крыс с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 после общей гипертермии на фоне повышения общей АОА крови происходит достоверное увеличение содержания перекисных продуктов (МДА и ДК) в крови, что отражает рост активности окислительного стресса в организме животных.

4. У крыс с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии происходит запуск механизмов запрограммированной гибели опухолевых клеток в первые 7 суток эксперимента, о чем свидетельствует преобладание апоптотического индекса над митотическим и наличие множественных очагов некротического распада опухоли. Но в дальнейшем (14 -21 сутки) происходит инфильтративный рост опухоли (повышение митотического индекса в периваскулярных и межфасциальных зонах роста).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Молоков, К. В. Липидный спектр крови у лабораторных животных при росте опухоли Walker 256 / К. В. Молоков, А. В. Ефремов // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2012. - Т. 10, Вып. 4. - С. 66-70 (0,31 пл.).

2. Молоков, К. В. Свободнорадикальное окисление при экспериментальном росте опухолевой ткани / К. В. Молоков, А. В. Ефремов // Вестник НГУ.

Серия: Биология, клиническая медицина. - 2012. - Т. 10, Вып. 5. - С. 68-72 (0,31 п.л.).

3. Ефремов, А. В. Патоморфологические изменения карциносаркомы Walker 256 после воздействия общей гипертермии / А. В. Ефремов, К. В. Молоков, Е. В. Овсянко И Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - Т. 20, №1.- С. 67-69 (0,19 пл.).

4. Изменения в липидном обмене при росте опухоли Walker 256 и терапевтический эффект гипертермии / А. В. Ефремов, И. И. Хегай, К. В. Молоков, Ю, В. Пахомова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2013. -Т. 156, №12. С. - 808-810 (0,19 п.л.).

5. Молоков, К. В. Динамика триглицеридов и липопротеинов плазмы крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 после общей гипертермии / К. В. Молоков, И. И. Хегай, А. В. Ефремов // Бюллетень СО РАМН. - 2013. - Т. 33,№2.-С. 49-53 (0,31 п.л.).

Публикации в электронных научных изданиях, рекомендованных ВАК

6. Биохимические показатели липидного обмена у лабораторных животных с

карциносаркомой Walker 256 [Электронный ресурс] / А. В. Ефремов, К. В. Молоков, Е. В. Овсянко, Ю. В. Пахомова // Медицина и образование в Сибири : электронный научный журнал. - 2012. - №5. - Режим доступа : http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text full.nho?id=800.

7. Антиканцерогенные эффекты общей гипертермии при развитии перевиваемой опухоли [Электронный ресурс] / Д. Б. Кузьменко, К. И. Поляков, И. Б. Лукьянов, Ю. А. Степанова, Ю. А. Степанова, С. Н. Алексеенко, А. В. Чаполоуцкая, К. В. Молоков, Е. Д. Макаров, Е. С. Лукьянова, А. А. Севастьянов, А. В. Ефремов // Медицина и образование в Сибири : электронный научный журнал. - 2013. - №4. - Режим доступа : http://vAvw.nemu.ru/cozo/mos/article/text full.php?id=1064.

Материалы конференций

8. Молоков, К. В. Особенности метаболических изменений при экспериментальном исследовании в динамике восстановительного периода после гипертермического воздействия / К. В. Молоков // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов : труды 111 Всероссийской научной конференции с международным участием. - Новосибирск, 20П. -

С. 172-175 (0,25 п.л.).

9. Молоков, К. В. Состояние липидного обмена при экспериментальном росте опухолевой ткани у крыс линии Wistar в условиях общей управляемой гипертермии / К. В. Молоков, А. В. Ефремов // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов : труды IV Всероссийской научной конференции с международным участием. - Новосибирск, 2012.-С. 186-188 (0,19п.л.).

10. Молоков, К. В. Состояние липидного обмена у крыс линии Wistar с перевиваемой опухолевой тканью в условиях общей гипертермии / К. В.

Молоков // Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия : материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 73-75 (0,19 пл.).

11. Анализ биохимического спектра плазмы крови животных в зависимости от сроков течения адаптационных реакций / К. В. Молоков, А. В. Ефремов, М. Г. Пустоветова, Ю. В. Пахомова // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов : труды V Всероссийской научной конференции с международным участием. - Новосибирск, 2013. - С. 77-81 (0,31 п.л.).

12. Механизмы антиканцерогенного действия общей гипертермии при развитии перевиваемой опухоли / К. И. Поляков, Ю. А. Степанова, А. А. Севастьянов, И. Б. Лукьянов, С. Н. Алексеенко, А. В. Чаполоуцкая, К. В. Молоков, Е. Д. Макаров, Д. Б. Кузьменко // Авиценна-2013 : труды IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2013. - С. 53-54 (0,13 пл.).

13. Молоков, К. В. Баланс липидов плазмы крови при росте опухоли Walker 256 в эксперименте / К. В. Молоков // Проблемы медицины и биологии : материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Кемерово : КемГМА, 2013.-С. 126-127(0,13 п.л.).

14.Холестерин крови у лабораторных животных при экстремальных воздействиях / К. В. Молоков, И. Б. Лукьянов, С. Н. Алексеенко, Е. В. Задорина-Хуторная, Д. Б. Кузьменко // Авиценна-2013 : труды IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2013. - С. 49-50 (0,13 п.л.).

W256

ОГ

ОХ

тг жк

ХС ЛПВП

ХС ЛПНП

ХСЛПОНП

Апо-А1

Апо-В

МДА

ДК

ПОЛ АОА МИ АИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

карциносаркома Walker 256 общая гипертермия общий холестерин триглицериды жирные кислоты

холестерин липопротеидов высокой плотности

холестерин липопротеидов низкой плотности

холестерин липопротеидов очень низкой плотности

аполипопротеин А1

аполипопротеин В

малоновый диальдегид

диеновые конъюгаты

перекисное окисление липидов

антиоксидантная активность

митотический индекс

апоптотический индекс

Подписано к печати 27.02.2014 формат - 60x34 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 122 ООО " Типография ЮГУС", ИНН 5402548639, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56, 225-04-47