Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патологические аспекты созревания ооцитов при стимуляции суперовуляции и их влияние на результаты ЭКО

№ .

'А

ХРУЛЕВА Наталья Валерьевна

ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ

14.03.03 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород - 2011

ЭКО

з 1 ш

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Юлия Павловна Потехина Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Артифексов Сергей Борисович Институт ФСБ России, г.Нижний Новгород

доктор медицинских наук, профессор Миннебаев Марсель Миргоязович ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г.Казань

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.061.03 при Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина, 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603104, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д.За.

Автореферат разослан _

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.А.Дурново

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Частота бесплодных браков на территории России колеблется от 8% до 17,8%, в отдельных регионах превышая определенный ВОЗ критический уровень 15%, при котором бесплодие может рассматриваться как фактор, значительно влияющий на демографические показатели и представляющий собой государственную проблему. Важнейшим достижением в лечении бесплодия явилось внедрение в клиническую практику методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Эффективность ЭКО в настоящее время не превышает 3540%, и около трети всех беременностей прерывается на ранних сроках (Кулаков В .И., Корнеева И.Е., 2001; Адамян Л.В., Торганова В. А., 2002). Причины отрицательных результатов часто остаются неизвестными.

Стимуляция суперовуляции в цикле ЭКО проводится на фоне существующих структурно-функциональных изменений женской репродуктивной системы и других хронических заболеваний. При этом происходит созревание гораздо большего количества фолликулов, чем во время физиологического менструального цикла. Эти факторы могут являться причинами того, что не у всех женщин созревание фолликулов в цикле ЭКО происходит нормально и, следовательно, далеко не всегда удается получить ооциты надлежащего качества, а затем добиться наступления беременности и рождения ребенка (Кулаков В.И., Корнеева И.Е., 2001).

В фолликуле существует гематотканевой барьер, функцией которого является высокое сопротивление диффузному потоку и избирательная проницаемость. В доступной литературе найдены единичные сведения о его строении и функционировании.

Фолликулярная жидкость синтезируется фолликулярным эпителием, расположенным вокруг ооцита второго порядка и является микроокружением развивающегося ооцита. В нее адсорбируются из крови и синтезируются клетками гранулёзы гормоны, факторы роста и другие вещества. Избыток или недостаток биологически активных веществ в фолликулярной жидкости оказывает негативное влияние на развитие ооцита (Яманова М.В. и соавт., 2004). Фолликулярная жидкость представляет большой интерес для исследователей, поскольку она легко может быть получена в достаточном количестве во время процедур вспомогательной репродукции и является единственной натуральной средой для ооцитов, обладающей всеми необходимыми компонентами (Грищенко В.И и

соавт., 1999). Чаще всего в фолликулярной жидкости определяют содержание половых гормонов и других биологически активных веществ (Хонина Н.А. и соавт., 2005; Anifandis G., Koutselini Е., Louridas К. Et al., 2005; Costa L.O., Mendez M.S., Ferriani R.A. et al., 2004; Mendoza C., Ruiz-Requena E., Ortega E. et al., 2002; Айзикович И.В., Айзикович Б.И., Леплина О.Ю. и др., 2006). Эти исследования сложны и дороги, что затрудняет их внедрение в повседневную клиническую практику. Данных об уровне веществ низкой и средней молекулярной массы и показателей свободнорадикального окисления в ФЖ в доступной литературе не обнаружено. Также нет сведений об исследовании морфологической картины фолликулярной жидкости методом клиновидной дегидратации.

Цель исследования: исследование местных и системных условий созревания ооцитов при стимуляции суперовуляции и их влияния на результаты

эко.

Задачи исследования:

1. Изучить показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной активности в плазме крови и фолликулярной жидкости женщин, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО.

2. Исследовать уровни веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови и фолликулярной жидкости и определить проницаемость для них гематофолликулярного барьера при различных видах бесплодия.

3. Изучить морфологическую картину плазмы крови и фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием.

4. Выявить особенности реакции женской репродуктивной системы на стимуляцию суперовуляции.

Научная новизна

Впервые исследованы показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной активности в плазме крови и фолликулярной жидкости женщин с бесплодием, и показаны возможности их влияния на результаты лечение методом ЭКО.

Впервые изучено содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови и фолликулярной жидкости женщин с различными видами бесплодия и проницаемость для них гематофолликулярного барьера. Установлено, что хронические воспалительные заболевания придатков матки и эндокринные нарушения могут приводить к патологическому повышению проницаемости гематофолликулярного барьера.

Впервые исследована морфологическая картина плазмы крови и фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием, проходивших лечение методом ЭКО. Выделены основные типы фаций - нормальные и патологические.

Впервые показано, что фолликулы средних размеров в наибольшей степени соответствуют характеристикам преовуляторных фолликулов - и по размерам, и по свойствам фолликулярной жидкости.

Практическая значимость работы

Разработан способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом ЭКО на основе исследования показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной активности в фолликулярной жидкости (Патент РФ на изобретение №2357673 от 10.06.2009).

Обоснована возможность использования метода клиновидной дегидратации фолликулярной жидкости для оценки качества ооцитов.

Показано прогностическое значение размеров фолликулов на момент пункции для результатов ЭКО.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У женщин с неудачным исходом программы ЭКО наблюдаются признаки эндогенной интоксикации и повышение уровня свободно-радикального окисления в плазме крови, что приводит к повышению проницаемости гематофолликулярного барьера и создает неблагоприятный фон в организме для наступления беременности.

2. Стимуляция суперовуляции в цикле ЭКО приводит к созреванию большого количества фолликулов, которые к концу цикла оказываются разных размеров, и в отличие от нормального менструального цикла, преовуляторными фолликулами являются не самые большие, а средние.

3. Вследствие повышенной проницаемости гематофолликулярного барьера могут образовываться фолликулы объемом 5 мл и более (диаметром более 20 мм), в которых созревают некачественные ооциты.

Внедрение в практику

Разработанный способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения используется в работе клиники «АИСТ-НН».

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практическом семинаре «Новые технологии в медицине и биологии» (Саров, 18-19 апреля 2007 г.), межинститутской конференции молодых ученых, посвященной

100-летию акад. В.Н.Черниговского «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2007 г.), П Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, 5-7 декабря 2007 г.), на совместном заседании кафедр патологической физиологии, патологической анатомии, нормальной анатомии, биологии ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» (Нижний Новгород, 6 октября 2010 г., протокол №6).

Автором лично обследовано 70 пациенток, выполнено 70 трансвагинальных пункций, обработано 230 проб фолликулярной жидкости и 70 проб плазмы крови, выполнена статистическая обработка данных, проанализированы полученные результаты.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 -в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, четырех глав описания результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 19 таблицами. Список литературы содержит 216 источников, из них 127 отечественных и 89 иностранных.

Содержание работы.

Материал и методы исследования

Работа основана на анализе результатов обследования и лечения 70 женщин, страдающих бесплодием, возраст которых варьировал от 25 до 38 лет (медиана 32 года). Все обследованные нами женщины проходили лечение методом ЭКО на базе ООО «АИСТ-НН» г.Н.Новгорода в 2007-2009 гг.

Для выявления причин бесплодия пациенткам проводили общеклиническое и гинекологическое обследование, УЗИ органов малого таза, эндоскопическое исследование по показаниям, определяли концентрацию половых гормонов в крови. Мужчины проходили стандартную схему обследования. Оказалось, что доминирующим этиологическим фактором бесплодия являлся трубно-

перитонеальный (43 человек - 61%), эндокринное бесплодие наблюдалось у 12 человек (17%), и бесплодие, связанное преимущественно с мужским фактором - у 15 человек (22%).

Индукцию суперовуляции в лечебных циклах ЭКО осуществляли по стандартным протоколам с использованием диферелина и пурегона или гонап-ф. В качестве индуктора овуляции использовали прегнил.

Трансвагинальная пункция преовуляторных фолликулов диаметром 1 см и более проводилась под ультразвуковым контролем с использованием аппарата Aloka. Оценивали качество полученных ооцитов по общепринятой балльной шкале: нормальные ооциты хорошего качества - 4-5 баллов, измененные — менее 4 баллов (Serhai Р., Ranieri D. et al., 1997). Полученную при пункции фолликулов фолликулярную жидкость помещали в градуированные пробирки, измеряли объем фолликулярной жидкости из каждого фолликула. Всего было исследовано 235 проб фолликулярной жидкости. Перед проведением пункции у женщин забирали кровь из локтевой вены в гепаринизированную пробирку, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Для дальнейшего исследования брали только плазму.

Ооциты культивировали в 4-луночных планшетах в среде IVF ("MediCult", Дания). Ооциты оплодотворяли через 4-5 часов после пункции. Через 18-20 часов после оплодотворения ооциты исследовали на наличие пронуклеусов на инвертированном микроскопе при увеличении х400. Дальнейшую оценку дробления и качества эмбрионов проводили через 46-48 часов культивирования. Рассчитывали индекс оплодотворения (ИО) по следующей формуле: ИО = число оплодотвор. яйцеклеток / общее число ооцитов х 100%.

Перенос эмбрионов проводили под ультразвуковым контролем на 3 или 5 день культивирования. Для переноса отбирали эмбрионы с наиболее высокой оценкой их качества. Наступление клинической беременности диагностировали через 3-4 недели после переноса эмбрионов при ультразвуковом исследовании по наличию плодного яйца в полости матки. У 24 женщин наступила беременность (34%), у 46 - нет.

Методы исследования биологических жидкостей:

- исследование свободнорадикальной и антиоксидантной активности методом индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) (Кузьмина Е.И., Нелюбин A.C., Щенникова М.К., 1983);

- определение содержания веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) (Малахова М.Я., 1995);

- метод клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 1996), изображения фаций плазмы и ФЖ обрабатывались с помощью аппаратно-программного комплекса автоматизированного анализа структур биожидкостей «Морфотест» (разработка ВНИИЭФ совместно с СарФТИ, г.Саров).

Для определения проницаемости ГФБ рассчитывали коэффициент его проницаемости (КП) для различных фракций веществ низкой и средней молекулярной массы по формуле (Судаков К.В., 2000): КП = содержание вещества в ФЖ / содержание вещества в крови.

При КП=1 можно говорить об отсутствии барьера для данного вещества, то есть концентрации вещества выравниваются. КП>1 может свидетельствовать о повышении проницаемости ГФБ. КП<1 характеризует высокую сопротивляемость ГФБ.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2000 и Statistica 6.0. Так как большинство распределений в выборках отличались от нормального, то для описания выборок указывали число объектов исследования (п), минимальное и максимальное значения признака, медиану. Для выяснения различий между выборками применялись непараметрический критерий Вилкоксона для парных сравнений и U-критерий Манна-Уитни. Для анализа различий между несколькими выборками (больше двух) использовался метод Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Для исследования связи двух признаков использовали непараметрический метод Спирмена. Считалось, что линейная связь между признаками существует при коэффициенте корреляции г>0,4, уровень значимости р<0,05 (О.Ю.Реброва, 2002).

Результаты исследования и их обсуждение

Особенности свободно-радикальных процессов в организме женщин, страдающих бесплодием.

По всем показателям отличия между группами с разными результатами ЭКО статистически значимы (табл. 1). То есть при неудачном исходе ЭКО в организме женщин наблюдался сдвиг в сторону преобладания свободно-радикального окисления над АОА.

Таблица 1

Сравнение показателей свободнорадикального баланса плазмы при разных _результатах ЭКО_

Показатель Беременности нет Беременность наступила Отличие по критерию Манна-Уитни

1 max, мВ 1,41-2,02, медиана 1,69 1,11-1,86, медиана 1,42 р=0,02

АОА 0,05-0,073, медиана 0,058 0,052-0,117, медиана 0,082 р=0,008

Imax/AOA 20,6-39,2, медиана 30,8 10,9-35,4, медиана 17,4 р=0,01

Активация свободнорадикальных процессов независимо от причины может негативно сказаться, в частности, на созревании ооцитов, процессе их имплантации в матке и течении беременности, и, следовательно, на результатах ЭКО (Пзогга А. й а1, 2005).

Из таблицы 2 видно, что у пациенток, у которых наступила беременность, АОА фолликулярной жидкости статистически значимо ниже, чем у пациенток другой группы, и свободно-радикальный баланс сдвинут в сторону преобладания свободно-радикального окисления над АОА.

Таблица 2

Сравнение показателей свободнорадикального баланса фолликулярной жидкости

при разных результатах ЭКО

Показатель Беременности нет Беременность наступила Отличие по критерию Манна-Уитни

I шах, мВ 0,68-2,04, медиана 1,6 1,04-2,08, медиана 1,68 р=0,08

АОА 0,09-2,0, медиана 0,4 0,11-1,0, медиана 0,33 р=0,03

Imax/AOA 0,81-11,3, медиана 3,93 0,89-16,7, медиана 4,94 р=0,02

Известно, что в фолликуле перед овуляцией накапливаются провоспалительные факторы, а некоторые исследователи даже называют процессы в предовуляторном фолликуле «физиологическим воспалением» (Arid A., Oral Е., Bukulmez О. et al., 1996; J.S.Richards, D.L.Russell, S.Ochsner, L.L.Espey, 2002). Результаты тестов, показывающих уровень свободно-радикального окисления,

характеризуют активность воспалительного процесса (Weber Ch., Erl W., Weber K.S.C., Weber P.C., 1999). Можно предположить, что наблюдаемая нами активация свободнорадикального окисления в ФЖ женщин, у которых затем наступила беременность, свидетельствует о подготовке фолликулов к овуляции.

В физиологическом менструальном цикле созревает только один доминантный фолликул, гораздо реже - два. Следовательно, только в доминантном фолликуле происходит активация процессов, ведущих к овуляции. То есть состав фолликулярной жидкости этого фолликула должен значительно отличаться от остальных, которые подвергаются атрезии. В цикле ЭКО при стимуляции суперовуляции растут несколько фолликулов, однако остается открытым вопрос о том, на сколько физиологичен этот процесс, и все ли фолликулы к моменту пункции, являются зрелыми.

У обследованных нами женщин в цикле ЭКО были пропунктированы с целью получения яйцеклеток все фолликулы, достигшие размеров 1 см. Мы попытались установить, на сколько велик разброс показателей свободно-радикального окисления в ФЖ, взятой у одной женщины. Для этого по каждому показателю были найдены максимальное и минимальное значения, а затем между ними вычисляли разницу — коэффициент разброса (KP): KPimax = макс Imax - мин Imax КРАОА = макс АОА - мин АОА На рис. 1 видно, что коэффициенты разброса показателей свободно-радикального баланса статистически значимо больше у женщин, у которых после цикла ЭКО наступила беременность. Следовательно, у этих женщин действительно выделились один-два фолликула, созревание которых в большей степени соответствовало физиологическому.

КРттах, МВ КР,

Рис. 1. Сравнение коэффициентов разброса показателей свободно-радикального баланса в ФЖ при разных результатах ЭКО.

Таким образом, наше исследование подтверждает, что в программе ЭКО могут наблюдаться различные реакции женской репродуктивной системы. При этом асимметричный ответ яичников в большей степени соответствует норме и является прогностически благоприятным признаком (рис. 2).

Цикл ЭКО - стимуляция суперовуляции

1

Повышенные уровни ФСГ и ЛГ

1

Рост и созревание большого количества фолликулов

1 1

«Физиологический ответ» яичников - «Нефизиологический ответ» яичников

асимметричный, с большим КР]тах - симметричный, с малым КРгтах

1

Прогноз благоприятный Прогноз неблагоприятный

Рис. 2. Варианты ответа яичников на стимуляцию суперовуляции.

Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в биологических жидкостях женщин, страдающих бесплодием.

В таблице 3 видно, что, во-первых, у женщин с отрицательным результатом ЭКО в плазме крови повышенное содержание веществ низкой и средней молекулярной массы определяется на четырех длинах волн, а при положительном результате ЭКО - только на двух, то есть у пациенток первой группы была обнаружена более выраженная эндогенная интоксикация.

Таблица 3

Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови при

разных результатах ЭКО

ВНСММ, усл.ед.

244 нм 254 нм 264 нм 274 нм 284 нм 294 нм

Беременности нет 0,18-0,29, медиана 0,27* 0,13-0,27, медиана 0,23* 0,15-0,3, медиана 0,25* 0,18-0,3, медиана 0,3* 0,16-0,3, медиана 0,28 0,07-0,2, медиана 0,14

Беременность есть 0,09-0,29, медиана 0,17* 0,07-0,28, медиана 0,23* 0,08-0,3, медиана 0,16 0,11-0,2, медиана 0,2 0,1-0,29, медиана 0,18 0,04-0,29, медиана 0,15

Отличия по критерию Манна-Уитни р=0,02 Р=0,8 р=0,3 р=0,001 р=0,03 Р=0,7

- значения медианы выше нормы (Добротина H.A., Копытова Т.В., 2004)

Во-вторых, при отрицательном результате ЭКО содержание веществ низкой и средней молекулярной массы, определяемое на длинах волн 244, 274 и 284 нм, было статистически значимо выше, чем при положительном результате лечения бесплодия.

Все обследованные женщины были жительницами большого промышленного города, и не удивительно, что содержание маркеров интоксикации в плазме крови у них несколько выше нормы. Причинами ее кроме неблагоприятной экологической обстановки, могут быть вредные привычки, профессиональные вредности, очаги хронической инфекции, любые хронические заболевания, лекарственная нагрузка и др. (Беломестнов С.М., 2006; Чаленко В.В., 1991). При этом повышение уровня веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме ухудшает результаты лечения бесплодия методом ЭКО.

Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в ФЖ варьировало в широких пределах и не имело статистически значимых различий

при различных результатах ЭКО. Однако при разных видах бесплодия наблюдались статистически значимые отличия по содержанию веществ низкой и средней молекулярной массы, определяемых на длине волны 274 нм. У практически здоровых женщин содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в ФЖ было ниже, чем при трубно-перитонеальном и гормональном бесплодии.

Таблица 4

Коэффициент проницаемости гематофолликулярного барьера для ВНСММ при __разных результатах ЭКО_

Коэффициент проницаемости ГФБ

244 нм 254 нм 264 нм 274 нм 284 нм 294 нм

Беременности нет 0,34-1,54, медиана 1,02 0,25-1,6, медиана 0,87 0,24-1,54, медиана 0,89 0,2-1,55, медиана 0,96 0,21-1,6, медиана 0,93 0,3-1,53, медиана 0,87

Беременность есть 0,12-1,03, медиана 0,84 0,1-1,1, медиана 0,79 0,08-0,98, медиана 0,81 0,4-0,92, медиана 0,69 0,08-0,98, медиана 0,75 0,14-1,06, медиана 0,69

Отличия по критерию Манна-Уитни р=0,003 р=0,004 р=0,002 р=0,006 р=0,003 р=0,0002

Мы рассчитали коэффициент проницаемости (КП) ГФБ для всех

фракций веществ низкой и средней молекулярной массы при различных результатах ЭКО (табл. 4). Оказалось, что значения КП ГФБ у женщин, у которых в цикле ЭКО наступила беременность, были статистически значимо ниже, чем при отрицательном результате лечения. В группе забеременевших в подавляющем большинстве случаев КП был ниже 1, что свидетельствовало о низкой проницаемости ГФБ для веществ низкой и средней молекулярной массы, что, как правило, имеет защитный характер (Судаков К.В., 2000). У пациенток с отрицательными результатами лечения в большинстве случаев наблюдалось повышение проницаемости ГФБ, что делало созревающий ооцит более уязвимым для токсинов, лекарственных веществ и продуктов метаболизма. Эти воздействия могли привести к нарушению процесса его созревания и ухудшить его способность к оплодотворению.

1,2

1,1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

244 254 264 274 284 294

Мужское Трубное -А— Гормональное

Рис. 3. Значения коэффициента проницаемости ГФБ для веществ низкой и средней молекулярной массы при различных видах бесплодия.

При различных причинах бесплодия проницаемость ГФБ также различалась (рис. 3), а для веществ низкой и средней молекулярной массы, определяемых при длине волны 274 и 284 нм, такие различия были статистически значимыми (соответственно р=0,04 и р=0,03).

Обращает на себя внимание тот факт, что у практически здоровых женщин, бесплодие в браке у которых было обусловлено нарушением репродуктивной функции мужа, в подавляющем большинстве случаев КП ГФБ был меньше 1. Напротив, при гормональной дисфункции у женщин проницаемость ГФБ была повышена для всех фракций веществ низкой и средней молекулярной массы. При трубно-перитонеальном генезе бесплодия проницаемость ГФБ чаще и больше всего была повышена для двух фракций ВНСММ, определяемых при длинах волн 244 и 274 нм, то есть избирательно.

Таким образом, нами впервые исследовано содержание веществ низкой и средней молекулярной массы в фолликулярной жидкости, а также проницаемость для них ГФБ у женщин, проходивших лечение методом ЭКО. Установлено, что хронические воспалительные заболевания яичников и эндокринные нарушения могут приводить к патологическому повышению проницаемости ГФБ, что, в свою очередь, может снижать качество ооцитов и результативность вспомогательных репродуктивных технологий.

Исследование морфологической картины фолликулярной жидкости у женщин, страдающих бесплодием.

Исследование морфологической картины ФЖ показало, что можно выделить пять типов фаций (Рис. 4):

Рис. 4. Типы фаций фолликулярной жидкости..

1 — радиальный (4%) - с радиальными трещинами, образующими арки по краю фации и сходящиеся в центре, при этом нет четкой границы между зонами фации;

2 - в периферической зоне аркообразные трещины, в центральной зоне -сеть трещин (16,8%);

3 - в периферической зоне аркообразные трещины, в центральной зоне -циркулярные и волнообразные трещины (57,3%);

4 - в периферической зоне аркообразные трещины, в центральной зоне -мелкие кристаллические образования (18,5%);

5 - кристаллический (3,4%) - узкая периферическая зона, в центральной зоне - большие кристаллические образования.

Индекс оплодотворения, %

120 г—I-1-1-г-

.100

80

60

20

□ Месвап Г~| 25%-75%

~Г №п-Мах

1 2 3 4 ■ , 5

'1'ипы фации ФЖ

Рис. 5. Индекс оплодотворения при различных типах фации ФЖ.

Индексы оплодотворения при различных типах фации ФЖ статистически значимо отличались (р=0,004) (Рис. 5). Наиболее низкие ИО наблюдался при типах фации ФЖ 1 и 5. В случаях с первым типом фации морфологическая картина ФЖ была аналогична нормотипу плазмы крови, что может свидетельствовать о нарушении проницаемости ГФБ и неблагоприятных условиях для созревания фолликула. В норме состав ФЖ значительно отличается от состава плазмы (Судаков К.В., 2000). В случаях с пятым типом фации ФЖ можно предположить, что были пропунктированы кисты, что подтверждается отсутствием яйцеклеток в этих пробах. Наиболее высокие ИО наблюдались при типах фации 2, 3 и 4, вследствие чего их можно считать нормотипами для морфологической картины ФЖ. Обнаружение этих типов фации при морфологическом исследовании ФЖ является прогностически благоприятным признаком.

Особенности реакции женской репродуктивной системы на стимуляцию суперовуляции в цикле ЭКО.

Мы разделили все пропунктированные фолликулы на три группы по объему полученной из них ФЖ и сравнили их по результатам ЭКО:

1) 19,5% проб - объем ФЖ менее 2 мл (0,5-1,5 мл, медиана 1 мл) - беременность наступила в 23% случаев,

2) 61,7% проб - объем ФЖ от 2 до 4,5 мл (медиана 3 мл) - беременность наступила в 58% случаев,

3) 18,8% проб - объем ФЖ 5 и более мл (5-11 мл, медиана 6 мл) - беременность наступила в 37,5% случаев.

Индекс оплодотворения

Рис. 6. Сравнение индекса оплодотворения в разных по объему фолликулах.

Из этих результатов следует, что при индукции суперовуляции самые большие фолликулы не являются «доминантными». Именно самые большие фолликулы чаще оказываются пустыми, именно из них чаще всего получают некачественные ооциты. Сравнение этих трех групп по значению ИО показало статистически значимые различия - р=0,04 (Рис. 6). Обращает на себя внимание наибольший ИО в фолликулах среднего размера (медиана 45%) и наименьший ИО в фолликулах объемом 5 и более мл (медиана 23%).

Сравнительный анализ морфологической картины ФЖ, взятой из фолликулов разных размеров, показал статистически значимые отличия практически всех вычисляемых индексов (таблица 5). Причем характеристики фаций ФЖ из маленьких и средних фолликулов отличаются незначительно, а ФЖ из больших фолликулов значительно выделяется по своим морфологическим характеристикам, и это без учета фаций кристаллического типа, которые не обрабатывались программой «Рго1оВ1оос1».

Таблица 5

Сравнение структурных параметров фаций фолликулярной жидкости, взятой из __фолликулов разных размеров__

Индексы Объем фолликулярной жидкости Различие по критерию Краскела-Уоллиса

Меньше 2 мл 2-4,5 мл 5 мл и более

ЬепР1к 205000-746000, медиана 416000 210000-662000, медиана 407000 139000-570000, медиана 377500 р=0,054

12,7-20,9, медиана 14,7 11,8-19,2, медиана 15,0 12,5-18,3, медиана 15,6 р=0,0035

ЕпёКк 1,0-4,4, медиана 2,6 1,0-4,1, медиана 2,4 0,7-3,5, медиана 2,2 р=0,0037

Б!зЬа1 1,2-2,4, медиана 1,4 1,0-2,4, медиана 1,4 1,2-2,0, медиана 1,6 р=0,0004

1,4-2,8, медиана 2,0 1,0-3,1, медиана 2,0 1,3-2,9, медиана 1,8 р=0,045

Бевй- 65,5-347, медиана 184 67,5-317, медиана 179 58,1-251, медиана 151,5 р=0,003

Анализ связи показателей свободнорадикального баланса ФЖ с объемом фолликулов показал, что самый высокий уровень свободно-радикального окисления наблюдается в фолликулах средних размеров, самый низкий - в больших фолликулах (рис. 7), корреляция этого показателя с ИО т=0,4, р=0,03. По видимому, именно этот показатель свидетельствует о том, что фолликул имеет свойства доминантного и готовится к овуляции.

I шах, мВ 3/7

Рис. 7. Отличия показателей свободнорадикального окисления в разных по объему

фолликулах.

Фолликулы средних размеров в наибольшей степени соответствуют характеристикам доминантных фолликулов - и по размерам, и по свойствам фолликулярной жидкости. Фолликулы объемом меньше 2 мл, по-видимому, являются недостаточно зрелыми. Фолликулы объемом 5 и более мл содержат ооциты, практически не способные к дальнейшему делению. В ФЖ этих фолликулов наблюдается наименьший уровень свободнорадикального окисления, то есть, не смотря на их большие размеры биохимические сдвиги в ФЖ, свидетельствующие об их готовности к овуляции, выражены слабее.

То есть, стимуляция суперовуляции приводит к росту и созреванию большого количества фолликулов, которые находятся, по видимому, на разных стадиях развития (Рис. 8). Одной из причин, которая может привести к образованию фолликулов больших размеров с некачественными ооцитами, может быть патологическое увеличение проницаемости ГФБ.

Нормальный менструальный цикл

I

Нормальные уровни ФСГиЛГ 1

Рост и созревание 1-2 доминантных фолликула 1

«Физиологическое воспаление» с активацией свободно-радикального окисления в ФЖ в преовуляторном фолликуле

4

Овуляция Рис. 8. Отличия роста

Цикл ЭКО — стимуляция суперовуляции

I

Повышенные уровни ФСГ и ЛГ 1

Рост и созревание большого количества фолликулов

4

Объем менее 2 мл - незрелые

(средний уровень 1тах и повышенная АОА в ФЖ)

4

Объем 2-4,5 мл -преовуляторные с активацией

свободно-радикального окисления в ФЖ

4

Объем 5 мл и более -трансформирующиеся в кисты (сниженный уровень свободно-

радикального окисления в ФЖ)

Пункция

и созревания фолликулов при стимуляции суперовуляции от нормального менструального цикла.

В таблице 6 показаны результаты сравнения КП ГФБ для ВНСММ у фолликулов разных размеров. Проницаемость ГФБ для всех видов ВНСММ практически одинакова у фолликулов малых и средних размеров. У больших фолликулов наблюдается отчетливая тенденция к повышению КП, а для ВНСММ, определяемых при длинах волн 244 и 284 нм, эти отличия статистически значимы.

В блок-схеме на рис. 9 показаны некоторые факторы, которые могут оказывать неблагоприятное влияние на состав ФЖ и результаты ЭКО. На основании результатов проведенных исследований можно предположить, что взаимосвязанные между собой эндогенная интоксикация и активация свободнорадикальных процессов могут приводить к увеличению проницаемости ГФБ, что может выступать одним из звеньев патогенеза женского бесплодия и ухудшать результаты ЭКО.

Таблица 6

Сравнение коэффициента проницаемости гематофолликулярного барьера для __ВНСММ в разных по объему фолликулах_

КПГФБ ДЛЯ ВНСММ Объем фолликула Отличие по критерию Краскела-Уоллиса

менее 2 мл 2-4,5 мл 5 мл и более

244 нм 0,58-1,1, медиана 0,9 0,35-1,54, медиана 0,9 0,49-3,1, медиана 2,9 р=0,003

254 нм 0,55-1,2, медиана 0,85 0,25-1,6, медиана 0,85 0,46-3,3, медиана 0,95 Р=0,5

264 нм 0,57-1,1, медиана 0,84 0,24-1,54, медиана 0,86 0,41-3,1, медиана 1,2 Р=0,3

274 нм 0,75-1,1, медиана 0,9 0,2-1,55, медиана 0,91 0,39-2,77, медиана 1,2 р=0,1

284 нм 0,61-1,1, медиана 0,84 0,21-1,6, медиана 0,93 0,4-2,97, медиана 2,3 р=0,04

294 нм 0,18-2,7, медиана 0,82 0,21-1,53, медиана 0,8 0,4-3,86, медиана 0,7 Р=0,4

Рис. 9. Факторы, ухудшающие результаты ЭКО.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с отрицательными результатами ЭКО наблюдается активация свободнорадикального окисления со снижением антиоксидантной активности в плазме крови. В доминантных фолликулах отмечается наивысший уровень свободнорадикального окисления, что свидетельствует об их готовности к овуляции. О «физиологичности» ответа яичников на стимуляцию суперовуляции может свидетельствовать высокий коэффициент разброса по этому показателю.

2. Исследование морфологической картины ФЖ показало, что можно выделить пять типов фаций, из которых второй, третий и четвертый можно считать нормотипами, а их обнаружение является благоприятным прогностическим признаком при проведении ЭКО. Причем третий нормотип содержит маркер воспаления, что является признаком преовуляторного фолликула.

3. У женщин с неудачным исходом программы ЭКО более выражены признаки эндогенной интоксикации (повышены уровни веществ низкой и средней молекулярной массы, определяемых на длинах волн 244, 254, 264 и 274 нм), чем у женщин, у которых в результате лечения наступила беременность.

4. Эндогенная интоксикация и повышение уровня свободно-радикального окисления в плазме крови женщин могут быть факторами, приводящими к повышению проницаемости гематофолликулярного барьера и создающими неблагоприятный фон в организме для наступления беременности. В норме проницаемость гематофолликулярного барьера для веществ низкой и средней молекулярной массы ниже единицы. При трубно-перитонеальном бесплодии наблюдается патологическое увеличение его проницаемости для веществ низкой и средней молекулярной массы, определяемых при 244 и 274 нм, а при эндокринном бесплодии - для всех фракций МСМ, что отрицательно сказывается на результате ЭКО.

5. Стимуляция суперовуляции в цикле ЭКО приводит к созреванию большого количества фолликулов, которые к концу цикла оказываются разных размеров, и, следовательно, находятся на разных стадиях развития. При этом, в отличие от нормального менструального цикла, преовуляторными фолликулами являются не самые большие, а средние - объемом от 2 до 4,5 мл. Фолликулы объемом 5 мл и более (диаметром более 20 мм) не являются преовуляторными, о чем свидетельствует наименьший уровень свободнорадикального окисления в ФЖ

и кристаллический тип ее фации. К образованию больших фолликулов может приводить патологически увеличенная проницаемость гематофолликулярного барьера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для прогноза результатов ЭКО предлагается использовать коэффициент разброса по показателю свободнорадикального окисления. Для этого в фолликулярной жидкости, взятой из каждого фолликула, нужно определить показатель 1тах, далее найти самое маленькое и самое большое значение, и после этого вычислить КР1та;< по следующей формуле:

КР|тах = макс 1тах - мин 1тах При КРгтах 0,3 и выше прогноз благоприятный - вероятность наступления беременности 60%, при КР}тах ниже 0,3 прогноз неблагоприятный. Метод БХЛ требует малых затрат времени и сравнительно недорогих реактивов. Чувствительность предложенного нами способа прогнозирования результатов ЭКО равна 1, специфичность - 0,48. Его можно применять непосредственно во время пункции фолликулов.

2. Для определения качества ооцитов, полученных при пункции фолликулов в цикле ЭКО предлагается использовать метод клиновидной дегидратации ФЖ. Обнаружение нормотипов фаций является признаком хорошего качества ооцитов.

3. Для определения качества ооцитов также предлагается оценивать объем фолликулярной жидкости, полученной из каждого фолликула. При объеме от 2 до 4,5 мл ФЖ на один ооцит можно предполагать хорошее качество соответствующего ооцита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хрулёва Н.В Исследование физико-химических и морфологических параметров фолликулярной жидкости / Н.В.Хрулёва, Ю.П.Потехина, Т.Г.Щербатюк Д.В.Кулакова // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. проф. Н.А.Гавришевой, проф. В.И.Николаева. - СПб., 2007. - С. 137-138.

2. Хрулёва Н.В Сравнение физико-химических и морфологических свойств фолликулярной жидкости при различных видах бесплодия / Н.В.Хрулёва, К.В.Кулакова // Санкт-Петербургские научные чтения-2007: II Международный молодежный медицинский конгресс. — СПб, 2007. - С. 12-13.

3. Хрулёва H.B Исследование морфологической картины фолликулярной жидкости / Н.В.Хрулёва, Ю.П.Потехина, В.В.Базаркина.// Материалы XVIII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Самара, 2008. - С. 36-37.

4. Хрулёва HB Влияние интоксикации и проницаемости гематофолликулярного барьера на результаты лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения / Н.В.Хрулёва, Ю.ПЛотехина, Т.Г.Щербатюк // Нижегородский медицинский журнал. - №6. - 2008. - С. 15-18.

5. Хрулёва Н.В. Свободнорадикальный статус женщин с бесплодием

/ Н.В.Хрулёва, К.В.Кулакова // Вестник новых медицинских технологий. — Том XVI, №2. - 2009. - Приложение: Сборник матер. VIII Всероссийской университетской научно-практич. конференции молодых ученых по медицине. - С. 190-191.

6. Хрулёва Н.В Исследование морфологической картины фолликулярной жидкости / Н.В.Хрулёва // Аспирантский вестник Поволжья. - 2009. - №7-8. -С. 191-194.

7. Хрулёва Н.В Особенности реакции женской репродуктивной системы на стимуляцию суперовуляции в цикле ЭКО. / Н.В.Хрулёва, Т.Г.Щербатюк, Ю.П.Потехина // Современные технологии в медицине. - 2011. - №1. - С. 20-23.

Патент на изобретение.

1. Патент РФ на изобретение №2357673 от 10.06.2009. - Способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения. / Н.В.Хрулёва, Ю.П.Потехина, Т.ГЛЦербатюк, заявители и патентообладатели Н.В.Хрулёва, Ю.П.Потехина, Т.Г.Щербатюк.

Подписано в печать 02.03.2011 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,1. Заказ № 51. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40