Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патогенез, патоморфология и морфогенез вариантов хронического атрофического гастрита

На правах рукописи

Горелик Григорий Леонидович

ПАТОГЕНЕЗ, ПАТОМОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ВАРИАНТОВ ХРОНИЧЕСКОГО АТРОФИЧЕСКОГО ГАСТРИТА

14.03.02 - Патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 СЕН 2013

005533558

Челябинск-2013

005533558

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Казимирова Анжела Алексеевна

Официальные оппоненты:

Фрейнд Генриетта Герхардовна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, кафедра патологической анатомии, заведующий

Гиниатуллин Равиль Усманович доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ ЦОСМП «Челябинский государственный институт лазерной хирургии», отдел фундаментальных исследований, руководитель

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита диссертации состоится "22" 2013 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.117.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д.64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан "/7" са-ос2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Э.А. Казачкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования и степень его разработанности

Хронический гастрит и его осложнения приводят к увеличению числа случаев временной и даже стойкой утраты трудоспособности, значительному росту не только уровня заболеваемости, но и смертности населения (Sipponen, Р. et al. The Sydney System for classification of gastritis 20 years ago. J. Gastroenterol. Hepatol. 2011. Vol. 26. P. 31-34. Suppl. 1.). Частота хронического гастрита достигает 78-80% среди всех обследованных пациентов (Хронический гастрит. Аруин Л.И. и соавт. Амстердам, 1993. 308 е.; Ивашкин В. Т. Клинические рекомендации. Гастроэнтерология. М„ ГЭОТАР-Медиа, 2008. 208 е.). Заболевание начинается зачастую в детском или подростковом возрасте, имеет прогрессирующее и рецидивирующее течение.

Атрофический гастрит относят к факультативным предраковым поражениям слизистой оболочки желудка в связи с формированием кишечной метаплазии, имеющей генетическую связь с интраэпителиальной неоплазией (Correa Р. et al. The gastric precancerous cascade. Journal of digestive diseases. 2012. Vol. 13. № 1. P. 2-9.).

Хронический атрофический гастрит, согласно Хьюстонской модификации Сиднейской системы (1996), может быть аутоиммунным и мультифокальным. Аутоиммунный гастрит представляет большую сложность для своевременной диагностики, что обусловливается скрытой субклинической формой течения заболевания, а также тесной взаимосвязью с прочими аутоиммунными заболеваниями (аутоиммунным тиреоидитом, сахарным диабетом 1-го типа, первичным гиперпаратиреозом) (De Block С.Е. et al. Autoimmune Gastritis in Type 1 Diabetes: A Clinically Oriented Review. J. Clin. Endocrinol. & Metab. 2008. Vol. 93. № 2. P. 363371.). При этом установлено, что у пациентов с аутоиммунным гастритом в 3 раза больше риск развития злокачественного эпителиального новообразования желудка и в 13 раз -нейроэндокринного рака, чем у здоровых лиц (Гуревич JI.E. Диагностика нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта. Практическая онкология. 2005. Т. 6. № 4. С. 193201.). Вместе с тем, многими исследователями допускается существование хронического атрофического гастрита с аутоиммунным (иммунопатологическим) компонентом, который предположительно может являться своего рода предшественником аутоиммунного гастрита (Кононов A.B. Местный иммунитет и регенерация слизистых оболочек при хроническом воспалении (биопсийное исследование). Омск. 1993. 320 е.). Но, по мнению некоторых учёных, такая трансформация не является обязательной (Исаков В.А. и др. Хеликобактериоз. М., ИД медпрактика М, 2003. 412 е.). Кроме того, в последнее время вызывает большой интерес Helicobacter pylori (Я./гу/оп')-зависимьш механизм развития аутоиммунизации, которому ряд исследователей придает ведущее значение в индукции и прогрессировании хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом (D'Elios М.М. et al. Gastric autoimmunity: the role of Helicobacter pylori and molecular mimicry Trends in molecular medicine. 2004. Vol. 10. № 7. P. 316-323).

Существуют разные взгляды на выраженность процессов клеточного обновления в зависимости от присутствия H.pylori в слизистой оболочке желудка при хроническом атро-фическом гастрите без иммунопатологического компонента. Некоторые авторы полагают, что при //^/огг-ассоциированном варианте атрофического гастрита в слизистой оболочке желудка происходит интенсификация и апоптоза, и пролиферации, во многом связанная с изменением экспрессии некоторых факторов роста и последующим изменением активности матриксных металлопротеиназ (Bodger К. et al. Altered gastric corpus expression of tissue inhibitors of metalloproteinases in human and murine Helicobacter infection J. Clin. Pathol. 2008. Vol. 1 (61). P. 72-78.).

По другим данным, H.pylori обусловливает некоторое замедление клеточного обновления, что удлиняет жизненный цикл покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки же-

лудка (Морфологическая характеристика и морфогенез хронического гастрита культи. E.J1. Куренков и соавт. Челябинск. Изд-во ЧелГМА, 2006. 156 е.). В исследовании С.И. Мозгового (2011) отмечается, что при H.pylori-неассоциированном варианте атрофического гастрита нередко повышается именно индекс апоптоза, что связано с часто встречающейся кишечной метаплазией (Мозговой С.И. Атрофия слизистой оболочки желудка при хроническом воспалении как общепатологический процесс и прогностический критерий канцерогенеза, дис. ... д-ра мед. наук. Омск, 2011.485 е.).

В то же время выраженность процессов клеточного обновления при хроническом атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом остается малоизученной и практически неясной. Данные о влиянии H.pylori на развитие определённых форм нейроэн-докринной гиперплазии противоречивы и в литературных источниках освещены крайне недостаточно, вместе с тем её развитие, согласно различным взглядам, может быть связано как с гипергастринемией, так и со значительной выраженностью процессов атрофии в слизистой оболочке желудка (Capella С. et al. Endocrine tumours of the stomach. Pathology and genetics of tumours of the Digestive System, ed. S.R. Hamilton, L.A. Aaltonen. Lyon. IARCPress, 2000. P. 53-57.; Chao С. et al. Gastrin, inflammation, and carcinogenesis. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes. Obes. 2010. Vol. 17. № 1. P. 33-39.).

Вышеизложенное диктует необходимость уточнения механизмов развития, патомор-фологических особенностей и особенностей морфогенеза при данной патологии, свидетельствует о необходимости разработки и совершенствования комплексной морфологической диагностики хронического атрофического гастрита на ранних этапах его развития и течения, в период до формирования метаплазии. Изучение морфологических особенностей при различных вариантах данной нозологии, включая параметры клеточного обновления и нейро-эндокринной дифференцировки, поможет оптимизировать диагностические подходы, может явиться структурной основой для разработки этиологически и патогенетически обоснованной терапии этого страдания (Petersson F. et al. Prevalence of subtypes of intestinal metaplasia in the general population and in patient s with autoimmune chronic atrophic gastritis. Scand. J. Gastroenterol. 2002. Vol. 37. № 3. P. 262-266.).

Цель исследования - охарактеризовать особенности пато- и морфогенеза вариантов хронического атрофического гастрита на основании комплексного морфологического исследования гастробиоптатов.

Задачи исследования

1. Дать сравнительную патоморфологическую характеристику вариантов хронического атрофического гастрита и выделить диагностические критерии этих вариантов.

2. Определить особенности патогенеза вариантов хронического атрофического гастрита.

3. Определить особенности морфогенеза вариантов хронического атрофического гастрита.

Методология и методы исследования

Настоящее исследование носило характер аналитического одномоментного исследования с элементами ретроспективного клинико-анамнестического анализа. Методология исследования базировалась на позициях диалектического материализма (Давыдовский И.В. Общая патология человека М.. Медгиз, 1961. 504 е.; Саркисов Д. С. и соавт. Общая патология человека. М., Медицина, 1995. 272 е.). Следующие методы исследования применялись в соответствии с целями и задачами диссертационной работы. Историко-архивный метод включал изучение медицинской документации в ретроспективном режиме. После тщательного изучения клинической картины для верификации диагноза, определения распространённости воспалительного поражения всем больным проводилась эзофагогастродуодено-фиброскопия с помощью фиброгастроскопа («Olympus», Япония) с прицельной биопсией

слизистой оболочки. Гастробиоптаты получали из 2-х отделов желудка (по малой кривизне: по 2 биоптата из антрального отдела и по 2 биоптата из фундального отдела желудка от каждого больного). Из морфологических методов на начальном этапе использовались гистологические - окраска гематоксилином и эозином и гистохимические методики: ШИК-реакция с докраской альциановым синим, окраски пикрофуксином по ван Гизону, метиленовым зеленым пиронином - по Браше. Затем проводилось морфометрическое исследования, которое осуществляли с помощью электронного аналога сетки Г.Г. Автандилова (в 100 полях зрения). Для оценки апоптоза, пролиферативной активности эпителиоцитов и экспрессии нейроэндокринных клеток в слизистой оболочке желудка проводилось иммуногистохимиче-ское исследование с помощью моноклональных антител к СРР32 (разведение 1:50), Кл67 (1:100), СЬгото§гагпп А (1:200) («Моуосазйа», Великобритания). Идентификацию Н.ру1оп проводили при помощи гистобактериоскопического (реакция с метиленовым синим) и им-муногистохимического методов (моноклональные антитела к Н.ру1оп в разведении 1:100) («МоуосаБй-а», Великобритания). Статистические методы исследования проводили с помощью программы 81айз1юа 6.0.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Исследование проводилось в соответствии с принципами доказательной медицины. Поскольку распределение в группах исследования отличалось от нормального, использовались методы непараметрической статистики. Для сравнения качественных признаков количественно малых групп применяли точный критерий Фишера. Вариационный анализ при сравнении количественных параметров осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни. Для выяснения корреляционных взаимосвязей ряда показателей использовали линейный коэффициент корреляции (г). Статистическое измерение связи проводилось путем вычисления коэффициента корреляции рангов Спирмена (р). Критерием статистической достоверности считался общепринятый в медицинской статистике уровень значимости р < 0,05.

Основные результаты и положения исследования представлены и обсуждены на II Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); научно-практической патологоанатомической конференции Уральского федерального округа (Челябинск, 2012); II и III международной (IX и X итоговой) научно-практической конференции молодых учёных (Челябинск, 2011, 2012); заседании Челябинского отделения Российского общества патологоанатомов (Челябинск, 2011).

Автором проведен анализ научных публикаций по теме диссертационного исследования, обработка архивного материала - поиск и отбор медицинской документации: первичных заключений по биопсийному материалу, медицинских карт стационарного и амбулаторного больного. Автором также проведен поиск и отбор биопсийного материала, лично автором осуществлялась его патоморфологическая оценка, морфометрическое и иммуногистохими-ческое исследование, статистический анализ полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту

1. Хронический Я./п'/оп-ассоциированиый атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом имеет морфологические признаки, свойственные для «воспалительного» подтипа гастрита, и характеризуется более высоким уровнем показателей клеточного обновления и нейроэндокринной дифференцировки по сравнению с хроническим Н.ру1оп-неассоциированным атрофическим гастритом с иммунопатологическим компонентом.

2. Хронический Я.ру/от-г'-неассоциированный атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом характеризуется морфологической картиной, свойственной «метапласти-ческому» подтипу гастрита с выраженностью, в первую очередь, метапластической атрофии.

3. Хронический Н.ру1оп-неассоциированный атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом у детей с минимальными нарушениями процессов регенерации характеризуется слабой выраженностью атрофии, морфологическая картина больше соответствует «воспалительному» подтипу гастрита.

Научная новизна

Определены некоторые звенья патогенеза вариантов хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом - впервые дана оценка процессов клеточного обновления и нейроэндокринной дифференцировки в слизистой оболочке желудка в их взаимосвязи при вариантах данного страдания. При хроническом Я.ду/оп'-ассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом отмечается более высокий уровень показателей клеточного обновления и нейроэндокринной дифференцировки, чем при хроническом //.ду/оп'-неассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом.

Описаны патоморфологические особенности каждого из морфогенетических вариантов у взрослых и детей: так, при хроническом //./ту/огг-ассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом у взрослых пациентов отмечается выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация в собственной пластинке слизистой оболочки желудка, среди эпителиоцитов желудочных желез встречаются явления нейроэндокринной гиперплазии. При хроническом Яду/ог/-неассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом у взрослых пациентов, по сравнению с предыдущим вариантом, также отмечается выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация в собственной пластинке слизистой оболочки желудка, достоверно реже встречаются явления нейроэндокринной гиперплазии эпителиоцитов желудочных желез, но значительно чаще наблюдаются явления кишечной метаплазии покровно-ямочного и железистого эпителия в слизистой оболочке желудка. При хроническом Н.ру1оп-неассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом у детей отмечается умеренная лимфоплазмоцитарная инфильтрация в собственной пластинке слизистой оболочки желудка, кишечная метаплазия и нейроэн-докринная гиперплазия отсутствуют.

На основе полученных данных выделены «воспалительный» и «метапластический» подтипы хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом с разной степенью выраженности процессов атрофии, показателей клеточного обновления. «Воспалительный» подтип гастрита характеризуется более высоким уровнем показателей клеточного обновления в слизистой оболочке желудка, чем «метапластический» подтип. Атрофия в слизистой оболочке желудка при «воспалительном» подтипе гастрита преимущественно носит характер абсолютной, встречается главным образом у взрослых пациентов, при «метапластическом» подтипе гастрита атрофия в слизистой оболочке желудка является преимущественно метапластической.

Теоретическая и практическая значимость

В результате исследования была дана морфологическая характеристика вариантам хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом, были проанализированы во взаимосвязи процессы нейроэндокринной дифференцировки и клеточного обновления в слизистой оболочке желудка, что существенно расширило представление о па-то- и морфогенезе данного страдания.

Данные, полученные в ходе исследования, позволяют представить понятие «хронический атрофический гастрит» в виде широкого спектра вариантов развития атрофического процесса в слизистой оболочке желудка, которые необходимо дифференцировать в клинической практике. Для выявления и характеристики некоторых из этих вариантов при формулировке патоморфологического диагноза хронического атрофического гастрита показана необ-

ходимость среди прочих параметров выделять иммунопатологический компонент хронического воспаления и гиперплазию нейроэндокринных клеток.

Выделение различных вариантов хронического атрофического гастрита обусловливает необходимость разработки индивидуального диагностического алгоритма и различной тактики патогенетической терапии при курации каждого больного.

Определен спектр дополнительных гистохимических и иммуногистохимических исследований, необходимых для унификации подходов к диагностике вариантов хронического атрофического гастрита на современном уровне. Для детализации характера атрофии из гистохимических реакций обязательно комплексное применение ШИК-реакции с докраской альциановым синим (для выявления кишечной метаплазии - метапластическая атрофия) и окраски пикрофуксином по ван Гизону (для регистрации уровня фиброза - абсолютная атрофия).

Иммуногистохимическое исследование требуется для выявления нейроэндокринной гиперплазии, наличие которой позволяет выделить среди пациентов группу риска по возникновению нейроэндокринного рака желудка. Иммуногистохимический метод выявления Н.руЬп оказался более специфичным при сравнении с гистохимическим методом детекции Н.ру1оп по Гимзе.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в повседневную практику государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Челябинское областное патологоанатомическое бюро» и централизованного патологоанатомического отделения муниципального бюджетного учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница №8» в г.Челябинск в соответствии с принятыми учрежденческими стандартами. Материалы диссертации используются в педагогическом процессе на кафедре патологической анатомии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего и профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Публикации

Автор имеет 14 опубликованных работ по теме диссертации общим объемом 43 печатные страницы, в том числе 3 статьи в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, характеристику объектов, материалов и методов исследования, две главы собственных исследований, обсуждение результатов исследования и заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 31 рисунком, 1 схемой. Библиографический список состоит из 165 источников, в том числе 55 отечественных и 110 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом для клинического исследования явилась документация (форма N003/y медицинская карта стационарного больного; форма N025/y-04 медицинская карта амбулаторного больного) 76 пациентов в возрасте от 19 до 74 лет и 15 пациентов в возрасте от 5 до 15 лет, обследованных в условиях ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница №1».

Все взрослые и дети при направлении на эзофагогастродуоденофиброскопию (ЭГДФС) имели диагноз «хронический гастрит» или «хронический гастродуоденит», который уточнялся в ходе проведения комплекса диагностических методов исследования. Для формирования выборок были разработаны критерии включения пациентов в исследование и критерии исключения из него.

Критериями включения являлись: 1) подтвержденный гистологически хронический атрофический гастрит (ХАГ); 2) метод получения морфологического субстрата - ЭГДФС с прицельной биопсией из антрального отдела и из тела желудка.

Критериями исключения являлись: 1) прием антибактериальных, антацидных, гастро-протективных или нестероидных противовоспалительных препаратов в течение 3 месяцев, предшествовавших обследованию; 2) наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, потребовавших проведения курса терапии цитостатическими препаратами и/или препаратами глюкокоргикоидных гормонов в течение 5 лет перед настоящим обследованием; 3) наличие аллергических, или других болезней, способных оказать влияние на течение основного заболевания; 4) резецированный желудок; 5) табакокурение и употребление алкогольных напитков; 6) наличие особых форм хронического гастрита: химический, радиационный, лимфоци-тарный, эозинофильный, гранулематозный, инфекционный; 7) наличие язв желудка или двенадцатиперстной кишки; 8) наличие рака желудка; 9) беременность, грудное вскармливание; 10) отказ от участия в исследовании; 11) возраст пациентов менее 5 лет, от 16 до 18 лет и более 74 лет.

Унификация сбора информации осуществлялась с помощью разработанной и использованной в настоящем исследовании оригинальной анкеты.

После тщательного изучения клинической картины для верификации диагноза, определения распространённости воспалительного поражения всем больным проводилась ЭГДФС с помощью фиброгастроскопа («Olympus», Япония) с прицельной биопсией слизистой оболочки. Биоптаты получали из 2-х отделов желудка (по малой кривизне: по 2 биопта-та из антрального отдела и по 2 биоптата из фундального отдела желудка от каждого больного) и из двенадцатиперстной кишки с последующим цитологическим и гистологическим исследованием тканевых образцов.

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости проводилось у 69 из 91 пациентов.

Объектом для морфологического исследования являлись 372 гастробиоптата, полученных в ходе диагностической ЭГДФС у 91 пациентов. Фрагменты взятой при ЭГДФС ткани слизистой оболочки желудка (СОЖ) после извлечения щипцов фиброскопа снимали препаровальной иглой и, не отмывая водой, помещали для световой микроскопии в 10% раствор нейтрального формалина на 24 часа. Далее материал обезвоживали, обезжиривали и заливали в парафин в гистологическом автомате по общепринятой методике. Парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, метиленовым синим (по Гимзе), метиленовым зелёным — пиронином по Браше; использовалась ШИК-реакция в сочетании с альциановым синим при pH 2,5. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей, приготовленные в соответствии с рекомендациями по гистологической технике (Лилли Р.Д. Патогистологическая техника и практическая

гистохимия: пер. с англ. М., Мир, 1969. 645 е.; Саркисов Д.С. Микроскопическая техника : руководство для врачей. М., Медицина, 1996. 543 е.).

Идентификацию H.pylori-инфекции проводили с использованием двух методов, согласно положениям IV Маастрихтского соглашения (2010). Первичную диагностику H.pylori-инфекции осуществляли с помощью гистобактериоскопического метода исследования. H.pylori идентифицировали в биоптатах антрального и фундального отделов желудка также с помощью иммуногистохимического метода с последующей оценкой индекса обсеменённо-сти слизистой оболочки желудка с использованием визуально-аналоговой шкалы (Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М., Триада-Х, 1998. 496 е.).

В результате для анализа материала было сформировано 3 группы исследования: 1-я группа - 30 взрослых пациентов с H.pyhri-ассоцшрованнът хроническим гастритом с выраженной атрофией с иммунопатологическим компонентом (ХАГ-ип Нр(+)); 2-я группа - 46 взрослых пациентов с H.pylori-неассоциированным хроническим гастритом с выраженной атрофией с иммунопатологическим компонентом (ХАГ-ип Нр(-)); 3-я группа - 15 детей с ХАГ-ип Нр(-). 4-я группа - дети с (ХАГ-ип Нр(+)) не была сформирована, в связи с отсутствием необходимого количества пациентов, результаты исследования которых, согласно критериям включения и исключения, могли быть подвергнуты статистической обработке.

Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России (протокол №4 от 25.01.2011 г.).

Морфологическое исследование гастробиоптатов проводилось в соответствии с Хьюстонской модификацией Сиднейской классификации хронического гастрита и методическими рекомендациями «Морфологическая диагностика гастрита на биопсийном материале» (Кокшаров В.Н., 2007). При этом оценивали локализацию поражения, атрофию и активность процесса, выраженность лимфоплазмоцитарной инфильтрации и инфильтрации эозинофиль-ными гранулоцитами в СОЖ. Учитывались также наличие и характер эрозий, метаплазии и дисплазии, наличие и выраженность лимфофолликулярной гиперплазии, фовеолярной гиперплазии, фиброза, периполеза (наличие межэпителиальных лимфоцитов), степень обсеме-нённости спиралевидными палочками и кокками. Для морфологической оценки изменений в СОЖ был также применен полуколичественный метод оценки в соответствии с диагностической таблицей-шаблоном Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита (Самара, 2009) (Аруин Л.И. и соавт. Международная классификация хронического гастрита: что следует принять и что вызывает сомнения. Архив патологии. 2009. № 4. С. 11-18.). Выраженность периполеза оценивали, принимая во внимание частоту встречаемости межэпителиальных лимфоцитов в норме (менее 7 на 100 покровно-ямочных эпителиоци-тов) и при лимфоцитарном гастрите (более 25 на 100 покровно-ямочных эпителиоцитов) (Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М., Триада-Х, 1998. 496 е.; Кокшаров В.Н. Морфологическая диагностика хронического гастрита на биопсийном материале: метод, рекомендации. Челябинск. 2007. 23 е.). Результаты гистологического исследования биоптатов сопоставлялись с заключениями клинического и эндоскопического обследования пациентов. Количественный (морфометрический) анализ всех гастробиоптатов осуществляли с помощью электронного аналога морфометрической сетки Г.Г. Ав-тандилова (счёт осуществляли в 100 полях зрения при увеличении х400) (Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: руководство М., Медицина, 1990. 384 е.).

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах. Демаскировку антигенов осуществляли в цитратном буфере (рН=6,0) при кипячении на водяной бане на протяжении 1 часа. Использовали первичные мышиные моноклональные антитела («No-vocastra», Великобритания) (таблица 1). Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Биоти-нилированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой, входили в систему визуализации «Novostain Universal Detection Kit» («Novocastra», Великобритания).

Таблица 1 - Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании

M КАТ Клон Рабочее разведение Фирма-изготовитель

Caspase-3 (СРР32) JHM62 1:50 "Novocastra"

Ki-67 MM1 1:100 "Novocastra"

Helicobacter pylori ULC3R 1:100 "Novocastra"

Chromogranin A 5H7 1:200 "Novocastra"

Для иммуногистохимического исследования были отобраны гастробиоптаты 25 больных с диагнозом «хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом» (ХАГ-ип). Среди обследованных было 10 взрослых пациентов с ХАГ-ип Нр(+) (1-я группа), 10 взрослых с ХАГ-ип Нр(-) (2-я группа) и 5 детей с ХАГ-ип Нр(-) (3-я группа).

Д ля маркеров Ki-67, СРР32, Chromogranin А в 10 полях зрения (площадь поля зрения при об. 90 и ок. 8 составляет 994,5 мкм2) подсчитывали количество клеток, дающих интенсивное связывание пероксидазы в 1 мм2 по Е. Savilahti (Savilahti Е. Immunoglobulin-containing cells in intestinal raucosa and immunoglobulins in the intestinal juice in chidren Clin. Exp. Immunol. 1972. Vol. 116. № 3. P. 415-425.).

Кроме того, для объективной оценки интенсивности процессов клеточного обновления в СОЖ вычисляли индекс пролиферации (ИП - экспонирование клетками антигена Ki-67), индекс апоптоза (ИА - экспонирование клетками антигена СРР32), индекс экспрессии нейроэндокринных клеток, как процентное отношение числа иммуногистохимически-позитивных эпителиоцитов к общему числу подсчитанных эпителиальных клеток. Обычно просматривали от 100 до 300 эпителиоцитов.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axi-oscop 40 («Carl Zeiss Jena», Германия) с использованием цифровой фотокамеры Axiocam MRc5 («Carl Zeiss Jena», Германия).

Статистические методы исследования. Статистический анализ материала начинался с определения типа распределения изучаемых переменных. Поскольку распределение в группах исследования отличалось от нормального (разница средней арифметической (М) и медианы (Me) составляла более 10%), указывались Me, нижний 25-й (L) и верхний 75-й (Н) квартили.

Для сравнения качественных признаков количественно малых групп применяли точный критерий Фишера (четырёхпольная таблица, одно- или двувариантный) (различия считали достоверными при р < 0,05). При множественном парном сравнении (3 группы) вводилась поправка Бонферрони, которая рассчитывалась по формуле к=ро/п, где ро - исходно заданный уровень статистической значимости, п - количество парных сравнений, и составила к = 0,05/3 = 0,017. Вариационный анализ в случаях распределения, отличающегося от нормального, осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни - для двух независимых выборок (при сравнении количественных параметров). Статистическое измерение связи (силы и направления) проводилось путем вычисления коэффициента корреляции рангов Спирмена (р) (Гланц С. Медико-биологическая статистика М., Практика, 1999. 459 е.). Дня расчетов использован статистический пакет лицензионных программ Microsoft Excel, Statistica 6,0 для операционной системы Windows ХР (Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica M., МедиаСфера, 2002. 312 е.).

Результаты исследования

Хронический гастрит (ХГ) является одним из наиболее частых заболеваний внутренних органов, при этом нет единого взгляда на тендерный аспект заболеваемости хроническим атрофическим гастритом. Тем не менее, по некоторым данным, женщины чаще обращаются за медицинской помощью по поводу данного страдания (Джулай Г.С. Клинико-патогенетические варианты хронического гастрита, критерии диагностики и выбора терапии: метод, рекомендации для студентов и врачей. Тверь, 2002. 27 е.); по другим данным, только в детском возрасте существуют достоверные различия между группами мужского и женского пола (Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М., Триа-да-Х, 1998. 496 е.). При исследовании было выявлено относительно равномерное распределение больных по полу, кроме группы ХАГ-ип Нр(-), в которой данное страдание встречалось достоверно чаще у женщин, чем у мужчин (р<0,05).

Распределение больных по возрасту: среди взрослых больных (1-я и 2-я группы) достоверно больше было пациентов старше 35 лет, находящихся в возрастном периоде поздней зрелости, либо в пожилом возрасте (р<0,05). Это связано с тем, что атрофия в СОЖ - про-градиентно текущий патологический процесс, развивающийся в течение многих лет после первоначального воздействия этиологического фактора.

В 3-й группе большинство пациентов было подросткового возраста. Это может объясняться тем, что в пубертатном периоде изменяются концентрация ряда гормонов гипофиза, половых гормонов, вследствие чего преображается эндокринная регуляция деятельности различных органов. В результате в просвете желудка возникает гиперхлоргидрия, что способствует развитию хронического воспаления в слизистой оболочке желудка (Римарчук Г.В. и соавт. Патоморфоз хронического гастродуоденита у детей в индустриальном городе. Российский педиатрический журнал. 2003. № 1. С. 50-57.)

Медиана и интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили) показателей возраста детей с ХАГ-ип Нр(-) составили 13 (7 - 14) лет, при ХАГ-ип Нр(+) у взрослых - 54,5 (36 -63) лет, при ХАГ-ип Нр(-) у взрослых - 56 (42 - 63) лет.

В 1-й и во 2-й группах сочетанная патология с поражением органов пищеварения (в т.ч. диффузные изменения печени и поджелудочной железы, хронический холецистит) встречалась достоверно чаще, чем в 3-й группе (р<0,05). В целом, среди всех заболеваний желудочно-кишечного тракта чаще всего в группах взрослых больных регистрировалась именно патология гепатопанкреатобилиарной системы (р<0,05), хронический холецистит и диффузные изменения поджелудочной железы. Кроме того, была отмечена тенденция к сочетанию хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом (ХАГ-ип) с диффузными изменениями печени независимо от наличия в СОЖ Н.ру1оп.

Среди негастроинтестинальной патологии у взрослых пациентов с ХГ заболевания сердца выявлялись чаще, чем другие болезни - у 19 из 91 больных. Поражение почек наблюдалось у 16 из 91 взрослых больных. Одинаково часто с поражением почек регистрировалось поражение щитовидной железы: диффузные изменения щитовидной железы наблюдались у 11 из 91 взрослых пациентов, очаговые изменения - у 2 взрослых пациентов. У детей сочетанная негастроинтестинальная патология выявлялась в единичных случаях в виде локальных изменений щитовидной железы.

При эндоскопическом исследовании у большинства больных наблюдалась сглаженность складок СОЖ вследствие выраженности процессов атрофии, в то же время у некоторых пациентов складки были гипертрофированы. Эрозии СОЖ мы наблюдали у 18 пациентов вне зависимости от возраста больных и ассоциации с Н.руЬп. Острые (неполные) эрозии были у 16 больных, локализовались либо только в антральном отделе желудка, либо и в фун-дальном, и в антральном отделах. Хронические (полные) эрозии возвышались над СОЖ, локализовались только в антральном отделе желудка, наблюдались у 2 больных с ХАГ-ип

Нр(+). У многих пациентов наличие эрозий наблюдалось одновременно с появлением зернистого рельефа в СОЖ. Полипы в слизистой оболочке желудка встречались у 11 больных во всех исследуемых группах.

ХАГ-ип Нр(+) был диагностирован при гистологическом исследовании гастробиопта-тов 30 пациентов в возрасте 19-74 лет (1-я группа). Н.ру1оп выявлялась в тканевых срезах антрального и фундального отделов желудка, имела вид палочковидных, либо спиралевидных структур.

В 1-й группе больных активность воспаления была низкой у 12 из 30 больных, она характеризовалась наличием в инфильтрате немногочисленных полиморфно-ядерных лейкоцитов независимо от выраженности мононуклеарной инфильтрации (не более 10 в поле зрения, х 400). У 9 из 30 пациентов наблюдалось неактивное воспаление, когда нейтрофильные гра-нулоциты в СОЖ отсутствовали, однако наблюдалась лимфоплазмоцитарная инфильтрация. Высокая степень активности воспаления в слизистой оболочке желудка обнаруживалась у 5 из 30 пациентов. В некоторых полях зрения отмечались крипт-абсцессы, встречались также выраженные расстройства кровообращения в виде стаза, кровоизлияний. Реже всего наблюдалась умеренная степень активности воспаления - у 4 из 30 пациентов, плотность полиморфно-клеточной инфильтрации была выражена меньше, нейтрофильные гранулоциты определялись только в эпителиоцитах концевых отделов желез.

Выраженность эозинофильной инфильтрации была низкой более чем у половины пациентов (у 18 из 30). Эозинофильная инфильтрация была умеренной у 5 из 30 больных, выраженной у 3 из 30 пациентов, а у 4 из 30 больных - отсутствовала.

Выраженность лимфоплазмоцитарной инфильтрации в собственной пластинке СОЖ в 1-й группе больных была высокой у 14 из 30 пациентов, причем объемный воспалительный инфильтрат нередко раздвигал железы, симулируя более тяжелую степень атрофии. У 11 из 30 пациентов была умеренной степени выраженности лимфоплазмоцитарная инфильтрация в собственной пластинке СОЖ. У 5 из 30 больных наблюдалась слабая степень выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации.

В данной группе лимфоидные фолликулы с небольшими герминативными центрами в СОЖ регистрировались у 12 из 30 пациентов: у 9 - в фундальном отделе, а у 3 - в антраль-ном отделе. Слабая лимфофолликулярная гиперплазия наблюдалась в слизистой оболочке у 6 пациентов 1-й группы, умеренная - у 3 пациентов, выраженная - также у 3 пациентов данной группы.

Периполез (появление межэпителиальных лимфоцитов в покровно-ямочном эпителии слизистой оболочки желудка) слабой степени выраженности отмечался у 18 из 30 пациентов 1-й группы, умеренно выраженный периполез - у трети больных (у 10 из 30), значительно выраженный - у 2 из 30 больных.

Результатом персистенции в СОЖ Н.ру1огг и связанных с этим процессов хронического воспаления явились нарушения регенерации. Фовеолярная гиперплазия или кистозная трансформация в ямках и железах СОЖ отмечалась у 14 из 30 пациентов 1-й группы.

У всех обследованных пациентов 1-й группы регистрировалась атрофия железистых структур СОЖ: более чем у половины (у 18 из 30) пациентов - слабой, у 8 из 30 - умеренной степени выраженности, у 4 из 30 - значительной степени выраженности.

Слабая выраженность фиброза определялась у трети пациентов (10 из 30), умеренная выраженность - у 6 из 30, пациентов, а значительная выраженность - у 3 из 30. У остальных больных данной группы фиброз в собственной пластинке СОЖ не регистрировался.

Полная кишечная метаплазия покровно-ямочного и железистого эпителия регистрировалась у 5 из 30 пациентов, причем у 2 пациентов она была выражена значительно, у 3 больных метаплазия наблюдалась в единичных ямках слизистой оболочки желудка.

ХАГ-ип Нр(-) у взрослых был диагностирован при гистологическом исследовании гастробиоптатов 46 пациентов в возрасте 19-74 лет (2-я группа).

Почти у половины пациентов 2-й группы - 22 из 46 наблюдалось неактивное воспаление. Степень активности воспалительного процесса у больных, страдающих ХАГ-ип Нр(-), чаще была слабой - у 17 из 46 пациентов, реже - умеренной у 6 из 46 больных, а высокая степень активности наблюдалась лишь у трех из 46 пациентов этой группы.

Фовеолярная гиперплазия или кистозная трансформация в ямках и железах СОЖ отмечалась у 7 из 46 пациентов 2-й группы.

Выраженность лимфоплазмоцитарной инфильтрации в собственной пластинке СОЖ была значительной у 20 из 46 пациентов. Почти треть пациентов (16 из 46) имели умеренной степени выраженности лимфоплазмоцитарную инфильтрацию в собственной пластинке СОЖ. У 10 из 46 больных наблюдалась слабая степень выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации.

Во 2-й группе лимфоидные фолликулы с небольшими герминативными центрами в СОЖ регистрировались у 12 из 46 больных: у 8 пациентов - в фундальном отделе, а у 4 - в антральном отделе СОЖ. Слабая лимфофолликулярная гиперплазия наблюдалась в СОЖ у 8 пациентов 1-й группы, умеренная - у 1 пациента, выраженная - у 3 пациентов данной группы. В целом в этой группе лимфофолликулярная гиперплазия достоверно чаще отсутствовала, (р<0,013).

Периполез слабой степени выраженности был отмечен более чем у половины (у 28 из 46) пациентов данной группы, умеренно выраженный - у 7 из 46 больных наблюдался, значительно выраженный - у 11 из 46 (рис.4.1.10).

У всех обследованных пациентов 2-й группы больных регистрировалась атрофия железистых структур СОЖ: у 32 из 46 пациентов - слабой, у 9 из 46 - умеренной степени выраженности, у 5 из 46 — значительной степени выраженности; итак, достоверно чаще встречалась слабая атрофия (р<0,013).

Почти у половины пациентов 2-й группы определялась слабая выраженность фиброза - у 21 из 46, умеренная выраженность — у 4 из 46, а значительная выраженность - у 3 из 46. У остальных больных данной группы фиброз в собственной пластинке СОЖ не регистрировался. Итак, в данной группе фиброз был слабо выражен (р<0,013).

Неполная кишечная метаплазия эпителия желез регистрировалась у 11 из 46 пациентов, а полная кишечная метаплазия - у 12 из 46 больных.

ХАГ-ип Нр(-) у детей был диагностирован при гистологическом исследовании га-стробиоптатов 15 пациентов в возрасте 5-15 лет (3-я группа).

Степень активности воспалительного процесса у этих больных была преимущественно слабой — у 7 из 15 пациентов. Почти у половины пациентов 3-й группы — у 6 из 15 наблюдалось неактивное воспаление, высокая и умеренная степень активности воспаления наблюдались в единственном случае каждая. Кистозная трансформация желез СОЖ отмечалась у 1 из 15 больных.

Выраженность лимфоплазмоцитарной инфильтрации в собственной пластинке СОЖ была умеренной почти у половины (у 7 из 15) больных. Слабую либо сильную степени выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации в собственной пластинке слизистой оболочки имели по 4 из 15 пациентов.

В 3-й группе больных лимфоидные фолликулы с небольшими герминативными центрами в СОЖ регистрировались у 1 из 15 пациентов в фундальном отделе, ауЗиз 15-в антральном отделе. Слабая лимфофолликулярная гиперплазия наблюдалась в слизистой оболочке у 3 из 15 пациентов 3-й группы, умеренная - у 1 пациента.

Периполез слабой степени выраженности отмечался у половины (8 из 15) пациентов, умеренно выраженный - у 4 из 15 больных, значительно выраженный - у 3 из 15.

У всех обследованных пациентов 3-й группы регистрировалась атрофия СОЖ слабой степени. Снижение числа желёз сочеталось с дистрофическими изменениями железистого эпителия и с избыточным разрастанием коллагеновых волокон

Кишечная метаплазия покровно-ямочного и железистого эпителия в СОЖ у данной группы пациентов не регистрировались. Таким образом, с позиции общей патологии в данной группе преобладали процессы хронического воспаления.

Степень активности воспалительного процесса в СОЖ была выше у пациентов 1-й группы, чем у пациентов 2-й группы, что объяснимо персистенцией H.pylori (Чернин В.В. Хронический гастрит. Тверь. Триада, 2006. 304 с.)

Лимфоплазмоцитарная инфильтрация была значительно выражена в СОЖ у пациентов 1-й и 2-й групп, что может быть связано как с увеличением синтеза провоспалительных цитокинов под влиянием колонизации H.pylori, так и с выраженностью иммунопатологических процессов в СОЖ, возникающих при активации аутоантигенов в отсутствие H.pylori (Кононов A.B. Клиническая интерпретация биопсий в гастроэнтерологии: курс лекций для интернов и клинических ординаторов. Тюмень. ООО «Сити-пресс», 2007. 96 е.).

Поскольку в 1-й группе в присутствии H.pylori в СОЖ была значительно выражена лимфоплазмоцитарная инфильтрация с формированием лимфоидных фолликулов, это принималось во внимание при оценке степени атрофии. Так, у 6 из 30 пациентов в 1-й группе имевшаяся атрофия могла быть расценена как неопределенная. Во 2-й группе больных наблюдалась иная картина: была тенденция к преобладанию метапластической атрофии за счет кишечной метаплазии, а другие признаки атрофии, такие как значительная выраженность фиброза, уменьшение объемной плотности желез и снижение высоты собственной пластинки, проявлялись незначительно.

Некоторое различие в спектре вариантов атрофии объяснимо - тот факт, что 6 из 30 пациентов имели неопределенную степень атрофии, может быть обусловлен наличием Я./зу/оп-инфекции.

Таким образом, иммунопатологический компонент хронического воспаления имеет комплекс характерных морфологических признаков. Среди них, прежде всего, необходимо выделить выраженную лимфоплазмоцитарную инфильтрацию в собственной пластинке СОЖ (степень IV, согласно диагностической таблице-шаблону Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита), что подтверждается многими авторами (Faller G. et al. Antigastric autoantibodies in Helicobacter pylori infection: implications of histological and clinical parameters of gastritis Gut. 1997. Vol. 41. P. 619-623.). Важной составляющей иммунопатологического компонента хронического воспаления наряду с лим-фоплазмоцитарной инфильтрацией является периполез. Известно, что в норме в СОЖ содержится до 7 межэпителиальных лимфоцитов на 100 покровно-ямочных эпителиоцитов (Хронический гастрит. Аруин Л.И. и соавт. Амстердам, 1993. 308 е.). В то же время, на основании Хьюстонской модификации Сиднейской системы (1996) ряд авторов полагает, что при лимфоцитарном гастрите количество межэпителиальных лимфоцитов на 100 покровно-ямочных эпителиоцитов должно быть более 25 (Dixon M.L. et al. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994 Am. J. Surg. Pathol. 1996. Vol. 20. P. 1161-1181.). Другие авторы считают, что при лимфоцитарном гастрите периполез должен быть расценен как выраженный, а при аутоиммунном гастрите и ХАГ-ип при наличии более 7 и менее 25 межэпителиальных лимфоцитов на 100 покровно-ямочных эпителиоцитов периполез должен быть расценен как слабый, либо умеренный (Lash R. et al. Inflammatory disorders of the stomach. Surgical pathology of the gastrointestinal tract, liver, biliary tract and pancreas, ed. R. Odze, J. Goldblum. Philadelphia. Saunders Elsevier, 2009. P. 269-320.). Еще одним диагностическим признаком иммунопатологического компонента хронического воспаления является наличие лимфоидных фолликулов в собственной пластинке СОЖ (D'Elios М.М. et al. Gastric autoimmunity: the role of Helicobacter pylori and molecular mimicry Trends in molecular medicine. 2004. Vol. 10. № 7. P. 316-323).

По данным морфометрического анализа при оценке клеточного состава воспалительного инфильтрата в антральном отделе желудка при ХАГ-ип Нр(+) плазмоцитов Ме=270

(193 - 376) насчитывалось больше, чем при ХАГ-ип Нр(-) у взрослых и у детей - Ме=203 (185 - 223) и Ме=190,5 (169 - 269) соответственно (р<0,017).

Прослежены корреляционные связи между клеточными составляющими инфильтрата слизистой оболочки антрального отдела желудка. Так, при ХАГ-ип Нр(+) была отмечена сильная отрицательная корреляционная связь между выраженностью лимфоцитарной инфильтрации и количеством нейтрофильных гранулоцитов (г=-0,78, р<0,01). Также сильная отрицательная корреляционная связь была зарегистрирована и при ХАГ-ип Нр(-) у взрослых между выраженностью лимфоцитарной инфильтрации и количеством нейтрофильных гранулоцитов (г=-0,81, р<0,01).

Кроме того, при ХАГ-ип Нр(+) выраженность макрофагальной инфильтрации находилась в умеренной прямой корреляционной связи с выраженностью плазмоцитарной инфильтрации (г=0,72, р<0,01). И при ХАГ-ип Нр(+), и при ХАГ-ип Нр(-) у взрослых была отмечена сильная отрицательная корреляционная связь между плазмоцитарной инфильтрацией и количеством нейтрофильных гранулоцитов (г=-0,82, р<0,01) и (г=-0,8, р<0,01).

Морфометрический анализ гастробиоптатов фундального отдела выявил отчасти схожие с вышеуказанными результаты: плазмоцитарная инфильтрация слизистой оболочки была выражена значительнее у пациентов с ХАГ-ип Нр(+) Ме=216,5 (167-248), чем при ХАГ-ип Нр(-) у взрослых Ме=172 (149-209) и детей Ме=166 (144-193) (р<0,017). Корреляционный анализ показал, что в фундальном отделе желудка при ХАГ-ип Нр(-) у детей имелась прямая корреляционная связь средней силы между лимфоцитами и плазмоцитами (г=0,67, р<0,01).

Данные корреляционного анализа при ХАГ-ип показывают наличие связей, формирующих соотношения между компонентами воспалительного инфильтрата: преобладание лимфоцитарного компонента в воспалительном инфильтрате сопряжено с относительно высокой выраженностью плазмоцитарной инфильтрации, что указывает на прогрессирование хронического воспаления с иммунопатологическим компонентом.

При сравнении результатов морфометрического исследования компонентов клеточного инфильтрата в антральном и фундальном отделах желудка исследуемых групп нами были обнаружены некоторые различия: в антральном отделе желудка во всех 3 исследуемых группах выраженность плазмоцитарной инфильтрации была достоверно выше, чем в фундальном отделе желудка: Ме=270 (193-376) и Ме=216,5 (167-248), Ме=203 (185-223) и Ме=172 (149209), Ме= 190,5 (169 - 269) и Ме=166 (144-193) (р<0,05) соответственно. Кроме того, в 3-й группе в антральном отделе количество фибробластов в слизистой оболочке желудка была достоверно выше, чем в фундальном отделе: Ме=159 (140-225) и Ме=137 (125-156) (р<0,05).

При оценке объемной плотности желез СОЖ выяснилось, что у всех пациентов в группе ХАГ-ип Нр(+) наблюдалось уменьшение показателей данного параметра по сравнению с группой пациентов с ХАГ-ип Нр(-). Показатели объемной плотности желез СОЖ у пациентов 1-й группы также были меньше по сравнению с показателями пациентов с функциональной желудочной диспепсией - по данным E.J1. Казачкова и соавт. (2009) (Казачков E.J1. и соавт. Структурно-функциональные основы ремоделирования слизистой оболочки желудка при хроническом Helicobacter pylori-ассоциированном гастрите у детей. Уральский медицинский журнал. 2009. № 4. С. 22-27.). Данные собственного исследования согласуются с данными, полученными этими авторами, - у всех пациентов 2-й и 3-й групп также наблюдалось уменьшение объемной плотности желез СОЖ относительно литературных данных по объемной плотности желез в СОЖ при функциональной желудочной диспепсии (Казачков Е.Л. и соавт. Структурно-функциональные основы ремоделирования слизистой оболочки желудка при хроническом Helicobacter pylori-ассоциированном гастрите у детей. Уральский медицинский журнал. 2009. № 4. С. 22-27.).

Таким образом, по данным сравнительного морфологического и морфометрического исследования гастробиоптатов, следует отметить, что в 1-й группе больных атрофия в СОЖ

была преимущественно абсолютной, выражалась в основном в уменьшении объемной плотности желез, в меньшей степени - в появлении фиброза и в снижении высоты собственной пластинки СОЖ. Для сравнения: во 2-й группе больных изменился характер атрофии - значительно чаще регистрировалась метапластическая атрофия, по сравнению с ней абсолютная атрофия наблюдалась реже, а фиброз был выражен слабо. Необходимо отметить также, что в 3-й группе больных атрофия в СОЖ была выражена преимущественно за счет снижения объемной плотности желез, а кишечная метаплазия в этой группе вообще не регистрировалась.

В ходе нашего исследования также было произведено распределение гастробиопта-тов, полученных от пациентов всех групп, на подгруппы по выраженности одного из общепатологических процессов: хронического воспаления, атрофии, кишечной метаплазии (таблица 2).

Таблица 2 — Распределение общепатологических процессов по выраженности при вариантах хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом_

Группа Преобладание воспаления над атрофией Преобладание абсолютной атрофии Преобладание метапластической атрофии Общее количество

1-я группа 18* 10 2 30

2-я группа 8 15 23* 46

3-я группа 15* 0 0 15

Примечание: * - достоверность различия по горизонтали, р<0,017

Согласно данным таблицы 2, в СОЖ в 1-й группе больных достоверно чаще преобладали морфологические изменения, характерные для хронического воспаления, чем для мета-пластической атрофии (р<0,017). Во 2-й группе больных в СОЖ, наоборот, достоверно чаще наблюдалась метапластическая атрофия, чем хроническое воспаление (р<0,017). Следовательно, 2-я группа - группа «метапластического» подтипа ХАГ-ип. Стоит отметить, что в определении метапластической атрофии помогает применение ШИК-реакции с докраской альциановым синим (для выявления бокаловидных клеток), в определении абсолютной атрофии помогает окраска пикрофуксином по ван Гизону (для регистрации уровня фиброза).

В сравнении со взрослыми пациентами, у детей в 3-й группе в СОЖ метапластическая атрофия не регистрировалась, что наряду с данными о преобладании выраженности воспаления над атрофией (р<0,017) позволяет также отнести ХАГ-ип у детей к «воспалительному» подтипу.

Подводя определенный итог, можно определить хронический атрофический гастрит как групповое понятие, при котором в основе развития атрофии СОЖ лежат различные общепатологические процессы, такие как полнокровие сосудов и кровоизлияния, дистрофия и некроз, метаплазия и дисплазия.

ХАГ-ип Нр(+) у взрослых имеет морфологические признаки, характерные для «воспалительного» подтипа гастрита, и характеризуется выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией, активностью, большей, чем в группе взрослых больных без персистенции Н.ру1оп.

ХАГ-ип Нр(-) у взрослых обладает морфологическими признаками, характерными для «метапластического» подтипа гастрита с преимущественно неактивным хроническим воспалением, выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией, частой встречаемостью кишечной метаплазии.

ХАГ-ип Нр(-) у детей характеризуется гистологическими изменениями, характерными для «воспалительного» типа гастрита с умеренной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией и отсутствием кишечной метаплазии.

По результатам иммуногистохимического исследования для экспрессии маркера Ki-67 характерным являлось наличие метки в виде различного размера и плотности темно-коричневых гранул в ядрах клеток. Иногда метка выявлялась даже на вершинах валиков, что характеризовало расширение границ пролиферативного компартмента вверх и вниз в виде распространения зоны Ki-67-позитивно меченых клеток.

При ХАГ-ип Нр(+) митотическая активность эпителиоцитов с учетом маркера Ki-67 составила: Ме=29% (26-33) в фундальном отделе желудка. В биоптатах Ki-67-метка регистрировалась в ядрах клеток покровно-ямочной зоны, перешеечного и концевого отделов желез, а также в единичных гладких миоцитах сосудов.

В то же время, во 2-й группе больных в фундальном отделе СОЖ ИП был достоверно ниже, чем при ХАГ-ип Нр(+), особенно в покровно-ямочном эпителии и эпителиоцитах глубоких отделов желез, где встречались лишь отдельные клетки, экспрессирующие Ki-67 (р<0,017). Экспрессия Ki-67 эпителиоцитами фундального отдела желудка у этих пациентов составила: Ме=24% (16-28).

Кроме того, в 3-й группе больных ИП в антруме, Ме=24% (13,5-33,5), был достоверно выше по сравнению с аналогичным показателям в 1-й группе больных, Ме=7,5% (4-19) (р<0,017).

Для экспрессии маркера СРР32 было характерным наличие метки в виде темно-коричневых гранул различного размера и плотности в цитоплазме эпителиоцитов. Эти гранулы имели хаотичное расположение.

В биоптатах слизистой оболочки и антрального, и фундального отдела желудка пациентов 1-й группы количество СРР32-позитивных клеток существенно превышало значение одноименного параметра 2-й группы больных (р<0,017). Клетки, вставшие на путь апоптоза, чаще всего регистрировались в зонах наибольшей пролиферативной активности эпителия: в покровно-ямочной и в шеечной зоне, реже - в глубоких отделах желез. Эпителиоциты, экспрессирующие СРР32 в своей цитоплазме, наиболее часто Ме=21% (13-25) обнаруживались в антральном отделе, реже Ме=26% (20-31) - в теле желудка. В гастробиоптатах 2-й группы немногочисленные СРР32-экспрессирующие клетки встречались в основном среди покровных эпителиоцитов и в генеративной зоне. В этой группе Me в антральном отделе желудка составила 13,5% (9-17), в фундальном - 19% (17-22). У пациентов 3-й группы ИА в слизистой оболочке фундального отдела желудка был достоверно ниже, чем у пациентов 1-й и 2-й групп: Ме=2% (1,5-3,5) (р<0,017).

Chromogranin А обнаруживали в цитоплазме нейроэндокринных клеток слизистой оболочки желудка, внутриклеточно он располагался преимущественно по периферии цитоплазмы, образуя из темно-коричневых гранул кольцо. Несколько большее скопление гранул, содержащих Chromogranin А, наблюдалось в базальных отделах эпителиоцитов. В слизистой оболочке фундального отдела желудка из гастробиоптатов 1-й группы больных экспрессия Chromogranin А была достоверно выше по сравнению с аналогичным показателем во 2-й группе больных: Ме=26 (17-29) и Ме=17,5 (12,5-21) (р<0,017).

Необходимо подчеркнуть, что гиперплазия нейроэндокринных клеток, выявленная на основе экспрессии Chromogranin А, была различной по объему и классифицировалась нами по схеме Е. Solcia et al. (2000) (Solcia E. et al. Histological Typing of Endocrine Tumors. World Health Organization: International Histological Classification of Tumors. Berlin. Springer, 2000. 156 р.). В антральном отделе желудка гиперплазия нейроэндокринных клеток: отсутствовала у 4 из 10 пациентов в 1-й группе, у 5 из 10 пациентов во 2-й группе, у 4 из 5 пациентов в 3-й группе. Нейроэндокринная гиперплазия являлась простой у 5 из 10 пациентов в 1-й группе и 3 из 10 пациентов во 2-й группе; являлась линейной у 1 из 10 пациентов в 1-й группе, у 2 из 10 пациентов во 2-й группе, у 1 из 5 пациентов в 3-й группе.

В фундальном отделе желудка гиперплазия нейроэндокринных клеток: отсутствовала у 2 из 10 пациентов в 1-й группе, у 6 из 10 пациентов во 2-й группе и у 4 из 5 пациентов в 3-

й группе. Нейроэндокринная гиперплазия являлась простой у 6 из 10 пациентов в 1-й группе, 3 из 10 пациентов во 2-й группе и 1 из 5 пациентов в 3-й группе; являлась линейной у 2 из 10 пациентов в 1-й группе и у 1 из 10 пациентов во 2-й группе.

Таким образом, в фундальном отделе желудка при ХАГ-ип Нр(+) имелась тенденция к преобладанию простой гиперплазии, когда в одной железе СОЖ обнаруживалось не более 5 Chromogranin A-позитивных клеток. Иногда регистрировалась линейная гиперплазия, когда в одной железе обнаруживалось более 5 Chromogranin A-позитивных клеток. При ХАГ-ип Hp (-) у взрослых имелась тенденция к отсутствию нейроэндокринной гиперплазии.

Корреляционный анализ показал, что в 1-й группе больных ИА в антруме находился в сильной прямой корреляционной связи с аналогичным показателем в теле желудка (г=0,77, р<0,01), и в умеренной обратной корреляционной связи с уровнем экспрессии Ki-67 в антруме (г=-0,48, р<0,02). В этой же группе в фундальном отделе желудка уровень экспрессии Chromogranin А находился в умеренной обратной корреляционной связи с аналогичным показателем в антральном отделе желудка (г=-0,54, р<0,01) и в умеренной прямой корреляционной связи с ИП в теле желудка (г=0,69, р<0,01).

В то же время, во 2-й группе больных уровень экспрессии Chromogranin А в теле желудка находился в умеренной обратной корреляционной связи с ИА и в теле (г=-0,53, р<0,03), и в антруме (г=-0,68, р<0,01), и с ИП в фундальном отделе желудка(1=-0,52, р<0,02).

Таким образом, при ХАГ-ип Нр(+) нами отмечено значительное ускорение процессов клеточного обновления и нейроэндокринной дифференцировки в слизистой оболочке фундального отдела желудка по сравнению с динамикой аналогичных показателей при ХАГ-ип Нр(-), которая носит разнонаправленный характер.

По некоторым данным, простая и линейная гиперплазия нейроэндокринных клеток, наблюдавшиеся нами в СОЖ в 1-й группе, могут представлять собой возможный результат гипергастринемии и являться последовательными этапами эволюции этого варианта гиперплазии (Solcia Е. et al. Hyperplastic, dysplastic, and neoplastic enterochromaffin-like-cell proliferations of the gastric mucosa. Classification and histogenesis. Am. J. Surg. Pathol. 1995. Vol. 19. P. 61-67. Suppl. 1). Через этапы микронодулярной и аденоматоидной гиперплазии эти изменения могут трансформироваться в диспластический процесс, на что указывают и другие авторы (Kokkola A. The risk of gastric carcinoma and carcinoid tumors in patients with pernicious anaemia: a prospective follow-up study. Scand. J. Gastroenterol. 1998. Vol. 33. P. 88-92.). Этому может способствовать большая выраженность индекса пролиферации в СОЖ в данной группе наряду с отмеченными нами умеренной обратной корреляционной связью между индексом пролиферации и индексом апоптоза, умеренной прямой корреляционной связью между индексом пролиферации и индексом экспрессии нейроэндокринных клеток (г=0,69, р<0,01). Вслед за интраэпителиальной неоплазией возможно образование «микрокарциноидов» как переходного звена канцерогенеза - от этапа нейроэндокринной гиперплазии к нейроэндо-кринныму раку желудка (рисунок 1) (Khan A. Surgical pathology of endocrine and neuroendocrine tumors. Worchester. Humana-press, 2009. 242 p.).

При сравнении методов выявления нейроэндокринной гиперплазии оказалось, что иммуногистохимическое исследование менее трудоемкое и более простое в применении, чем реакция Гримелиуса, результаты которой оказались, во многом, ложноположительными. В то же время, по литературным данным, чувствительность реакции Гримелиуса практически не уступает иммуногистохимическому исследованию с МКАТ к Chromogranin A (Belaiche J. et al. Fundic argyrophil cell hyperplasia in atrophic gastritis: a search for a sensitive diagnostic method. Acta Gastroenterol. Belg. 1993. Vol. 56. № 1. P. 11-17.).

По результатам гистологического исследования биоптатов у 30 больных 1-й группы выявлен ХАГ-ип Нр(+). Выраженная степень обсеменённости H.pylori наблюдалась у 7 из 30 пациентов этой группы, немного чаще встречалась умеренная степень обсемененности - у 8 из 30 больных, преобладала же слабая степень обсемененности - у 15 из 30 пациентов.

Хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом

Ассоциированный с Н.руїогі Воспалительный тип

î EGF і TGFß

Активация металлопротеиназ

Расширение зон пролиферации, апоптоза и нейроэндокринной диф-ференцировки \

Гиперплазия нейроэндокринных \

клеток: простая—»линейная -»микронодулярная—>аденоматоид-ная

Дисплазия нейроэндокринных

Микрокарциноид

Нейроэндокринный рак

Неассоциированный с Н.руїогі Метапластический тип

Î КІ67 і СРР32 4 Chromogramn А

î TGFß і EGF îp53

Расширение

пролиферации

t CDX-2 t MUC5AC t MUC2

Гиперпролиферативная кишечная метаплазия

Интраэпителиальная неоплазия эпи-телиоцитов покровно-ямочного и железистого эпителия

Carcinoma in situ

Аденокарцинома желудка

Рисунок 5.1 - Схема пато- и морфогенеза вариантов хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом (серым цветом на рисунках выделены изученные нами звенья, пунктирной стрелкой отмечен гипотетический путь канцерогенеза при Н.руїогі-ассоциированным гастрите с иммунопатологическим компонентом).

Во 2-й группе больных при окраске материала метиленовым синим в слизи, покрывающей эпителий валиков, и под ней в антральном и фундальном отделах желудка спиралевидные формы Н.руїогі не выявлялись, а кокковая обсемененность обнаруживалась лишь у 12 из 46 пациентов; таким образом, достоверно чаще микробная обсемененность не регистрировалась (р<0,025). У 5 из 15 больных детского возраста при окраске материала метиленовым синим в слизи, покрывающей эпителий валиков, и под ней в антральном и фундальном отделе также обнаруживалась кокковая обсемененность.

При бактериоскопическом исследовании материала достоверных различий между степенью обсемененности по результатам гистохимической реакции с использованием метиленового синего и иммуногистохимической реакции с антителами к Н.руїогі выявлено не было (р>0,05) (таблица 3).

Таблица 3 - Распространенность и степень выраженности хеликобактерной обсемененности в слизистой оболочке желудка у пациентов с хроническим атрофическим гастритом с иммунопатологическим компонентом_

Степень обсемененности Н.руїогі 0 1 2 3 Общее число обследованных больных

Метиленовый синий 15 5 3 2 25

МКАТ к Н.руїогі 11 6 4 4 25

В то же время, отмечалась тенденция к увеличению количества фактов выявления обсемененности Н.ру1оп - бактерия была выявлена у 4 из 46 пациентов 2-й группы; тенденция к увеличению числа биоптатов СОЖ с выраженной хеликобактерной обсемененностью по результатам полуколичественной оценки.

Таким образом, можно предполагать, что иммуноморфологическая верификация

H.ру1огг в СОЖ является более специфичным методом, чем гистохимическая реакция с использованием метиленового синего. Вместе с тем, исходя из этих данных и учитывая литературные данные (Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М., Триада-Х, 1998. 496 е.), нельзя отрицать того, что некоторые из кокков, выявленные в тканевых срезах при использовании окраски метиленовым синим, являются кокковыми формами Н.ру1оп.

ВЫВОДЫ

I. Хронический Я./гу/ог/'-ассоциированный атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом имеет морфологические признаки, свойственные для «воспалительного» подтипа гастрита, и характеризуется повышенными индексами апоптоза и пролиферации в слизистой оболочке тела желудка, более значительными показателями экспрессии СЬгото§гашп А в слизистой оболочке антрального отдела желудка, чем при хроническом Н.ру1ог1-неассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом.

2. Хронический //.ду/оп-неассоциированный атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом характеризуется морфологической картиной, свойственной «метапласти-ческому» подтипу гастрита с выраженностью, прежде всего, метапластической атрофии.

3. Хронический Н.ру!оп-неассоциированный атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом у детей с минимальными нарушениями процессов регенерации характеризуется слабой выраженностью атрофии, морфологическая картина соответствует «воспалительному» подтипу гастрита.

4. Атрофия слизистой оболочки желудка при хроническом Н.ру1оп-ассоциированном атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом характеризуется наличием гиперплазии нейроэндокринных клеток, которая взаимосвязана с изменениями параметров клеточного обновления в слизистой оболочке желудка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для верификации характера атрофии в слизистой оболочке желудка обязательно комплексное применение гистохимических реакций: ШИК-реакции с докраской альциановым синим (для выявления кишечной метаплазии, маркер метапластической атрофии) и окраски пикрофуксином по ван Гизону (для регистрации выраженности фиброза, маркер абсолютной атрофии).

2. При формулировке патоморфологического заключения «хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом» необходимо учитывать комплекс признаков: 1) слабый и умеренный периполез (более 7 и менее 25 межэпителиальных лимфоцитов на 100 покровно-ямочных эпителиоцитов); 2) выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация в собственной пластинке слизистой оболочки (степень IV, согласно диагностической таблице-шаблону Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита); 3) наличие лимфоидных фолликулов с герминативными центрами в собственной пластинке слизистой оболочки желудка.

3. В формулировке патоморфологического заключения при хроническом атрофическом гастрите с иммунопатологическим компонентом следует отражать наличие и характер гиперплазии нейроэндокринных клеток в слизистой оболочке желудка (простая, линейная, микро-нодулярная и аденоматоидная) с целью прогнозирования течения заболевания и разработки подходов таргетной терапии. Для выявления гиперплазии нейроэндокринных клеток приоритетным является иммуногистохимическое исследование.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горелик, Г. Л. Клинико-морфологическая характеристика хронического атро-фического гастрита с иммунопатологическим компонентом / Г. Л. Горелик // Материалы II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых учёных. - Челябинск, 2011. - С. 50-54.

2. Казимирова, А. А. Морфометрическая характеристика некоторых параметров воспалительного инфильтрата при различных вариантах хронического атрофического гастрита / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2011. - С. 80-81.

3. Казимирова, А. А. Сравнительная морфометрическая характеристика хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом у взрослых и детей / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». -Новосибирск, 2011. - С. 81-82.

4. Казимирова, А. А. Пути оптимизации морфологической диагностики различных вариантов хронического атрофического гастрита / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Владивосток, 2011. - С. 171-173.

5. Казимирова, А. А. Варианты хронического атрофического гастрита — характеристика воспалительного инфильтрата / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы научно-практической конференции «Развитие идей академика А.И. Струкова в современной патологической анатомии». - Москва, 2011. - С. 36-37.

6. Казимирова, А. А. Морфологическая характеристика слизистой оболочки желудка при вариантах хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». - Москва, 2011. - С. 74-75.

7. Казимирова, А. А. Сравнительная морфологическая характеристика клеточного состава воспалительного инфильтрата при вариантах хронического атрофического гастрита с

иммунопатологическим компонентом / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2011. - Т. 21, № 5. - С. 29. - Прил. 38.

8. Казимирова, А. А. Сравнительная морфологическая характеристика вариантов хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 2. - С. 87-88.

9. Казимирова, А. А. Хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом - морфологическая характеристика слизистой оболочки желудка / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы научно-практической патологоанатомической конференции Уральского федерального округа. - Челябинск, 2012. - С. 81-84.

10. Горелик, Г. Л. Вопросы морфологической характеристики хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Материалы III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых учёных. - Челябинск, 2012. -С. 81-85.

11. Горелик, Г. Л. Некоторые аспекты дисрегенерации при вариантах хронического атрофического гастрита с иммунопатологическим компонентом / Г. Л. Горелик // Материалы II всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия. - [Прил. «Медицинский академический журнал». - 2012. - С. 201-203].

12. Казимирова, А. А. Сравнительная характеристика морфологических методов выявления Н. pylori / А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2012. - Т. 22, № 5. - С. 27. - Прил. 40.

13. Казачков, Е. Л. Структурные особенности процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка при хроническом атрофическом гастрите различного генеза / Е. Л. Казачков, А. А. Казимирова, Г. Л. Горелик // Уральский медицинский журнал. - 2012. - № 12 (104). - С. 53-58.

14. Казимирова, А. А. Морфологическая характеристика нейроэндокринной гиперплазии при хроническом атрофическом гастрите с аутоиммунным компонентом / А. А. Казимирова, Е. Л. Казачков, Г. Л. Горелик // Уральский медицинский журнал. — 2013. -№3(108). -С. 15-19.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИА - индекс апоптоза

ИЛ -интерлейкин

ИП - индекс пролиферации

МКАТ - моноклональные антитела

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ТНФа — фактор некроза опухоли а

ХГ - хронический гастрит

ХАГ - хронический атрофический гастрит

ХАГ-ип - хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом ХАГ -ип Нр(+) — хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом, ассоциированный с Н.руїогі

ХАГ -ип Нр(-) — хронический атрофический гастрит с иммунопатологическим компонентом, неассоциированный с Н.руїогі ЭГДФС - эзофагогастродуоденофиброскопия - иммуноглобулин

На правах рукописи

Горелик Григорий Леонидович

ПАТОГЕНЕЗ, ПАТОМОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ВАРИАНТОВ ХРОНИЧЕСКОГО АТРОФИЧЕСКОГО ГАСТРИТА

14.03.02 - Патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать 8 августа 2013. Формат 60x84/16. Бумага офисная. Уел печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ №574.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ТЕТА (ИП Алексеев C.B.) 454048, г. Челябинск, ул.Яблочкина, 23 Тел. 225-09-18, e-mail: teta-art@mail.ru