Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекция белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеином

На правах рукописи

Макаров Евгений Владимирович

ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА ПРИ СИНДРОМЕ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ И ИХ КОРРЕКЦИЯ БЕЛКОМ ОСТРОЙ ФАЗЫ АЛЬФА-1-КИСЛЫМ ГЛИКОПРОТЕИНОМ

14.00,16 - Патологическая физиология 03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медициг""""

Челябинск - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» на кафедре патологической

физиологии

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ-доктор медицинских наук,

профессор Кривохижина Людмила Владимировна

доктор медицинских наук,

профессор Саломатин Вениамин Владимирович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук,

профессор Долгих Владимир Терентьевич

доктор медицинских наук,

профессор Мещанинов Виктор Николаевич

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Российский государственный медицинский университет, г. Москва

Защита диссертации состоится « У » í/tCs,^ 2005 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 117 02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» по адресу' 454092 г Челябинск, ул Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава»

Автореферат разослан <<f^S_>> ^¿счь \_2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор КривохижинаЛ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Синдром ишемии-реперфузии, лежащий в основе таких патологических процессов, как стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт, в настоящее время привлекает внимание большого числа исследовательских групп Целый ряд работ посвящен изучению месшого состояния тканей, вовлеченных в реперфузионное повреждение и поиску возможных способов их защиты от таких отрицательных факторов, как гипоксии, лейкоцитарной инфильтрации, цитокиновой агрессии (Daemen MARC, 1999, Frangogiannis N G , 1998, Nita D А , 2001,OsukaK etal , 2004, TuplingR etal ,2001) В то же время недостаточно изучена роль в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии одной из наиболее значимых и динамичных гомеостатических систем организма -системы регуляции агрегатного состояния крови (PACK) Имеются работы, в которых рассматривается значение ее функциональных составляющих в локальных проявлениях синдрома ишемии-реперфузии (Armaganian L , 2000, Chong A J , 2003, Cooper D, 2003, Massberg S , 1999), ряд авторов указывают на развитие местного ДВС-синдрома (Schoots I G , 2003) Однако комплексная оценка функционального состояния системы гемостаза и активности регулирующих ее факторов, в частности процессов свободнорадикального окисления (окислительный стресс), эндогенной интоксикации, лейкоцитарной реакции, при синдроме ишемии-реперфузии до настоящего момента не производилась

Особый интерес в плане коррекции нарушений гомеостаза организма в настоящее время привлекают «естественные» факторы, в том числе вещества, относимые к группе так называемых «острофазовых белков» Одним из перспективных представителей данной группы является белок II эшелона альфа-1-кислый гликопротеип (орозомукоид, серомукоид, КГП), существующий в виде лекарственной формы - препарата «Орозин» Приоритет в разработке данного препарата принадлежит кафедре биохимии ЧелГМА, а технология производства освоена Челябинской областной станцией переливания крови Спектр возможных показаний для применения данного препарата требует расширения. Концентрация альфа-1-кислого гликопротеина в плазме нарастает в 3-5 раз при различных экстремальных воздействиях на организм уже через 18-24 часа (Gabay С , 1999, Schreiber G , 1989) Данные литературы позволяют характеризовать шьный

компонент сосудистой стенки, участву

|прони

цаемости, как регулятор функционального состояния нейтрофилов и других клеток крови (Саломатин В В , 1993, Пухальский A JT , 2000, Sorrenson J , 1999, 2000) Имеются указания на наличие анти-оксидантной и антицитокиновой активности (Libert С , 1994, van Molle V, 1997) В последние годы орозомукоид привлекает внимание исследователей как корректор состояния организма при экстремальных состояниях (шок, бактериальная инфекция) (Hochepied I , 2000, Kuebler J F , 2004), a также как фактор местной защиты тканей при ишемии-реперфузии (Daemen M A R.C , 2000) В то же время информация о системном влиянии альфа-1-кислого тликопротеи-на, в том числе и при ишемии-реперфузии не формирует целостной картины. Исходя из этих предпосылок, были определена цель и задачи исследования

Цель исследован ия

Изучить патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекцию белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеином

Задачи исследования

1 Разработать адекватную модель синдрома ишемии-реперфузии, позволяющую получить выраженные изменения гомеостаза целое того организма

2 Изучить нарушения системы гемостаза при ишемии-реперфузии' системы тромбоцитов, свертывающей, антикоагулянтной и фиб-ринолитической систем

3 Определить возможные механизмы нарушений системы гемостаза' изменения свободнорадикальных процессов в плазме и тромбоцитах, уровня эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов, выявить взаимосвязи между нарушениями системы 1емостаза и факторами, регулирующими гемостатические процессы

4 Выявить влияние «Орозина» на основные патогенетические механизмы, наблюдаемые при синдроме ишемии-реперфу ¡ии состояние системы гемостаза, состояние свободнорадикальных процессов, состояние эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов

5 Выяснить влияние «Орозина» на состояние компонентов системы гемостаза в условиях in vitro

Научная новизна Впервые показано, что изменения системы ге-

мостаза в динамике экспериментального синдрома ишемии-реперфузии носят фазный характер Ранняя с гадия характеризуется изменениями, подобными ДВСК-синдрому Функциональная активность тромбоцитов повышается в раннем периоде синдрома и снижается в позднем В ранней фазе (1 час реперфузии) активация свертывающей системы происходит по внутреннему пути, а в позднем периоде (24 часа) - по внешнему пути Одновременно происходят фазные согласованные изменения активности процессов СРО в плазме и тромбоцитах Показано, что синдром ишемии-реперфузии сопровождается развитием острофазовой реакции организма, а также преходящей реакцией системы лейкоцитов, проявляющейся нейтрофильным палочкоядерным лейкоцитозом на фоне лейкопении

Впервые изучено действие препарата «Орозин» на состояние организма при ишемии-реперфузии Показано, что белок снижает повышенную arpei ационную способность тромбоцитов и не оказывает эффекта при пониженной агрегационной активности, нормализует адгезивную способность тромбоцитов В условиях ишемии-реперфузии препарат оказывает аншоксидантный эффект вне зависимости от срока, опосредованный через повышение общего антиоксидангного потенциала плазмы и активное]и каталазы, снижает выраженность лейкоцитарной реакции.

В условиях m vitro впервые показано, что альфа-1-кислый гли-копротеин ингибирует функциональную активность тромбоцитов за счет второй волны агрегации Влияние на адгезивную способность и продукцию свободных радикалов в тромбоцитах различно в условиях in vitro и in vivo при синдроме ишемии-реперфузии

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты диссертационного исследования уточняют роль нарушений системы гемостаза, изменений свободнорадикальных процессов, уровня эндогенной интоксикации в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии, а также патофизиологическую значимость альфа-1-кислого гликопротеина как фактора неспецифической защиты организма Экспериментально обосновано применение препарата «Орозин» при состояниях, в основе которых лежит синдром ишемии-реперфузии, с целью коррекции нарушений тромбоцитарного, коагуляционного гемостаза и антикоагулянтной системы, нормализации свободнорадикальных процессов за счет усиления мощное ги антиоксидантной сист емы Разра-

ботанная модель синдрома ишемии-реперфузии является аиало! ом ряда ситуаций в клинике сосудистой хирургии и может применяться для проведения дальнейших научных исследований

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология системы крови», «Обмен белков» в Челябинской государственной медицинской академии

Разработанный «Способ моделирования синдрома ишемин-репер-фузии» внедрен на кафедру патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии для проведения дальнейших научных исследований

Положения, выносимые на защиту.

1 Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается фазными изменениями состояния системы гемостаза, которые могу1 быть расценены как ДВСК-синдром.

2 Изменения системы гемостаза опосредованы за счет изменения состояния свободнорадикальных процессов и эндогенной интоксикации

3 Препарат «Орозин» оказывает антиагрегантное и ангикоа!у-лянтное действие в условиях синдрома ишемии-реперфузии, опосредованное через изменение состояния свободнорадикальных процессов и уровня эндогенной интоксикации.

4 Препарат «Орозин» оказывает стереотипное антиоксидантное действие, опосредованное за счет повышения активности каталазы и общей антиокислительной активности.

5 В условия ишемии-реперфузии препарат «Оро шн» снижает выраженность лейкоцитарной реакции и уровень эндогенной ин гоксика-ции

Апробация работы

Основные положения работы изложены на научной конференции «Молекулярные основы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию со дня рождения П М Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Биохимия от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), I итоговой научно-практической кон-

ференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2003), научно-практической конференции «Актуальные вопросы кардиологии и внутренней патологии», посвященной 70-летнему юбилею ЮУЖД (Челябинск, 2004), II итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2004), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), II конференции «Патология сосудов и гемостаз» (Омск, 2005) Публикации.

По 1еме диссертации опубликовано 9 печатных работ Структура диссер?ации.

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, библиографического указателя. Диссертация иллюстрирована 62 ¡аблицами и 22 рисунками Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 194 - зарубежных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 139 белых беспородных крысах -самцах, массой 200 220 грамм и крови здоровых людей - доноров областной станции переливания крови - 50 наблюдений Самок в экс-перимен г не включали из-за лабильного гемостаза (Скипетров В , 1964). Параллельно экспериментальной группе животных всегда была группа сравнения - контроля, так как по данным литературы показатели [ емостаза зависят от времени года и метеорологических условий (Петрищев H H , 1988) Все исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР № 755 от 12.08 1977 Забор крови у экспериментальных животных производился из левого желудочка Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 51 для исследований тромбоцитарного гемостаза, и в соотношении 9 1 для исследований коагуляционного звена гемостаза. В экспериментах использовался альфа-1 -кислый гликопротеин - препарат «Орозии» производства Челябинской областной станции переливания крови Согласно технологии, препарат получали из отходов произ-

водства альбумина (Лютов А Г, 1987)

Моделирование производилось in vitro и in vivo В условиях in vitro на крови здоровых доноров оценивали влияние альфа-1-кислого гликопротеина на агрегационную и адгезивную способность тромбоцитов, интенсивность свободнорадикальных процессов в тромбоцитах, функциональное состояние плазменной системы гемостаза

В условиях in vivo применялась модель синдрома ишемии-ре-перфузии В условиях лапаротомии выделяли брюшную аорту ниже места отхождения почечных артерий и накладывали микрососудис гый зажим, что приводило к тотальной или субтотальной ишемии нижележащих тканей Животные экспериментальных групп получали внут-рибрюшинно «Орозин» в дозировке 300 мг/кг.

Оценку показателей гомеостаза производили через 1 час репер-фузии и через 24 часа реперфузии

Число тромбоцитов определяли путем световой микроскопии с предварительной окраской мешленовым синим (Ронин В С , 1983), адгезивность тромбоцитов оценивали по способное!и прилипать к стеклянной поверхности (Гусейнов И С , 1970) Агрегационную способное ib тромбоцитов определяли турбидиметрическим методом с использованием АДФ в качестве индуктора агрегации (Люсов В А , 1976, Born G VR , 1962) Число лейкоцитов и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами (Тодоров Й , 1968)

Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли спектрофотометрическим методом в изопропанольной фракции (Волчегорский И А , 1989) Уровень ТБК-положительных продуктов определяли в реакции с 2-тиобарби гуровой кислотой (Коробейни-кова Э Н , 1989) Общую ангиокислительную активность определяли по способности пла шы тормози i ь липопероксидацию эритроци-тарных мембран (Спектор Е Б , 1984) Активность супероксиддисму-тазы (СОД) оценивали по торможению реакции восстановления ниг-росинего тетразолия (Чевари С . 1985) Активность глютатион - ре-дуктазы оценивали по способности окислять НАДФ11 при длине волны 340 нм ГВерболович В П 1987) Акгивносгь катала 1ы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония (Королкж М А , 1988) Активность церулоплазмина определяли в реакции с пара-фенилендиамина гидрохлоридом (Тэн О В , 1981) Определение активности факторов свертывания крови, антикоагулянтной и фибринолитической сис-

тем производилось общепринятыми методами (БалудаВ.П , 1980, Бар-каган 3 С , 2001, Иванов Е П , 1983) и включало время рекальцифика-ции богатой и бедной тромбоцитами плазмы, активированное частичное громбопластиновое время (АЧТВ). протромбиновое время (ПТВ), тром-биновое время, содержание фибриногена (гравиметрически по методу Рутберг), ан I итро мби1 ювую акта вность Оценка показателей эндогенной интоксикации проводилась путем спектрофотометрического определения ТХУ-резистентных веществ в плазме и эритроцитах (Оболенский С.В, 1991). Одновреме] шо определяли содержание Лоури-позитивных веществ (ЛПВ, олигопептидов)(Ьо\Угу О Н., 1951) Хемилюминесценцию тромбоцитов оценивали на приборе «Хемилюминомер ХЛ-003» по оригинальной методике Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с помощью паке1а81а1]-5йса 6 0 Применялся ^критерий С 1ью-дента, однофакгорный и двухфакторный дисперсионный анализ, корреляционный анализ, методы непараме грической статистики (Плохинский Н.А., 1978).

Результаты и их обсуждение

Массивный синдром ишемии-реперфузии с вовлечением в повреждение большого объема тканей (таз, нижние конечности) уже через 1 час с момента реперфузии приводит к выраженным изменениям в системе гемостаза, которые могут быть расценены как синдром диссеми-нированного внутрисосудистого свертывания (ДВСК) в фазе гиперкоагуляции Параметры функциональной активности первого звена гемостаза - системы тромбоцитов - претерпевают типичные для ДВСК-синдрома изменения, а именно снижается число тромбоцитов, снижается их ад1 езивная способность, повышается АДФ-индуцированная агрегация и хемилюминесценция Через 24 часа число тромбоцитов нормализуется, однако АДФ-индуцированная агрегация и хемилюминесценция тромбоцитов снижается ниже нормальных потсазателей Адгезивная способность тромбоцитов через 24 часа снижается почти в 3 раза (таблица 1).

Согласно результатам однофакторного дисперсионного анализа, влияние ишемии-реперфузии на агрегационную и адгезивную способность тромбоцитов достоверно и составляет 61% и 72% от общей совокупности действующих факторов, соответственно (рисунок 1)

Состояние системы тромбоцитарного гемостаза определяется

Таблица 1

Функциональное состояние системы тромбоцитов в динамике синдрома ишемии-реперфузии (М±т)

Показатель Контроль (п 7) 1 час (п~7) 24 часа (п=7)

Число ТЦ,-10% 750±30,4 595+23,4 ** 740+69,6

Адгезия тромбоцитов, % 23,11±1,55 12,95±1,86 ** 7,10+2,08 ***

МА агрегации, мм 27,28±2,00 34,17+1,25 ** 22,50+2,06 *

Время агрегации, мин 17,№1,85 21,01+2,21 13,12+0,70 *

СГ АДФ-инд , у е «мин 4,50-1,32 7,17+3.18 # 3,43±0,66

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р^0,001 # - тенденция (по сравнению с i руппой контроля по t-критерию)

Агрегационная способность

Адгезивная способность

ре перфузия В Прочие

И Ицеьшя

ррперфуэия1 в Прочие

_ i

Рисунок 1 Влияние ишемии-реперфузии на агрегационную и адгезивную способность тромбоцитов

динамическим балансом межд> про- и антиагрегантными возлежи виями. в частности, состоянием СРО в плазме, уровнем эндогенной интоксикации, количественным составом лейкоцитарных клеток Согласно результатам наших исследований, на сроке 1 час с момента репер-фузионного повреждения повышается содержание всех продуктов ПОЛ в плазме, за исключением ТБК-позитивных продуктов, снижается общая антиокислительная активность плазмы Одновременно развивается относительный и абсолютный нейтрофилъный палочкоядерный лейкоцитоз на фоне лейкопении и уменьшение клеточного и плазменного пулов ЛПВ (олигопепгидов) Через 24 часа отмечаются обратные соотношения между уровнем продуктов ПОЛ и общей АОА плазмы уровень всех продуктов ПОЛ снижается, достоверно нарасгает АОА Также снижается активность СОД, повышается уровень перулоп-лазмина и количество ЛПВ эритроцитов Таким образом, срок 1 час с момента реперфузии отражает активацию процессов СРО, а срок 24 часа - активацию антиокислительной системы и компенсацию окислительного стресса (таблица 2)

Для уточнения влияния вышеперечисленных факторов на функ-

Таблица2

Состояние СРО в динамике синдрома ишемии-реперфузии (Mim)

Показатель Контроль (п=7) 1 час (п=7) 24 часа (п=7)

Е 220, у е 3,92t0,03 4,82±0,04 ** 3,59±0,07 ***

£232, у е 2,38±0,08 2,99±0,07 ** 2,02±0,05 **

2 278, у е 0,83±0,02 0,96±0,02 ** 0,81±0,03

ТБК «+» прод , нмоль/мл ">,24±0,14 3,93±0,27 *** 6,19±0,25 **

1 400, у е 0,03±0,01 0,04±0,01 0,06±0,02

АОА, % 29,48±0,83 15,61±1,42 *** 40,28±1,05 ***

ЦП, у е 46,86±1,43 48,16±2,82 61,00±1,93 ***

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 (по сравнению с группой контроля по ^критерию)

циональное состояние тромбоцитов применяли корреляционный анализ (рисунки 2,3) По сравнению с нормой, ишемия-реперфузия на сроке 1 час приводит к формированию сильных положительных корреляционных связей между содержанием в плазме всех продуктов ПОЛ и всеми показателями функциональной активности тромбоцитов, а также между содержанием МНиСМ в плазме и ЛПВ на эритроцитах.

Корреляционный анализ взаимосвязей на сроке 24 часа с момента реперфузии позволил выявить увеличение количества отрицательных связей между содержанием продуктов ПОЛ, «средних молекул» и показателями функциональной активности тромбоцитов Таким образом, многочисленные положи гельные влияния, имевшие место на сроке 1 час, нивелируются, и большое значение приобретет активность АОС.

В целом, ишемия-реперфузия сопровождается динамичными и согласованными изменениями функциональной активности тромбоцитов, показателей свободнорадикального окисления в плазме и в тромбоцитах, а также эндогенной ин гоксикации Срок реперфузии 1 час характеризуется активацией системы тромбоцитов и свободнорадикального окисления, срок 24 часа - снижением функциональной активнос-ш тромбоцитов, ингибированием СРО и активацией антиоксидан-тных механизмов

Состояние коагуляционног о гемостза на сроке 1 час характеризуется гиперкоагуляционными сдвигами Наибольшее значение имеет укорочение АЧТВ и снижение активности антитромбина, что отражает «внутренний» механизм развития гиперкоагуляции и падение антикоагуляшной активности плазмы На сроке 24 часа гиперкоагуляция сохраняется, но АЧТВ удлиняется в сравнении с кон-

Рисунок 2 Корреляционные взаимосвязи между показателями функциональной активности тромбоцитов и состоянием СРО в плазме на сроке 1 час реперфузии

Рису нок 3 Корреляционные взаимосвязи между показателями функциональной активности тромбоциюв и состоянием эндогенной интоксикации на сроке 1 час реперфузии

тролем, а укорачивается протромбиновое время, то есть гиперкоагуляция развивается по «внешнему» механизму (таблица 3)

На сроке 24 часа повышается содержание в плазме фибриногена, а также уровень продуктов деградации фибрина (ПДФ) Это является признаком активности процессов фибринолиза, протекающих при диссеминированном внутрисосудистом свертывании (ДВСК) Продолжение процессов внутрисосудистого свертывания крови подтверждается прогрессивным снижением активности антитромбина в 6 раз по сравнению с исходным уровнем

Для оценки влияния ишемии-реперфузии на некоторые показатели коагуляционного гемостаза был применен однофакторный дисперсионный анализ Согласно его результатам, влияние ишемии-реперфузии на показатель АЧТВ и активность антитромбина является достоверным и составляет 42% и 88% от обшей совокупности действующих факторов, соответственно (рисунок 4)

Результаты говорят о фазности изменений в системе коагуляционного гемостаза На ранних этапах реперфузии гиперкоагуляция развивается преимущественно по «внутреннему» механизму,

АЧТВ

Антитромбин

ИИшрмия репярфузия иИшемия репе&4уэия

НПрочие^ _ _ ■ Прочие

Рисунок 4 Влияние ишемии-реперфузии на показатель АЧТВ и активность ангитромбина в плазме

на позднем этапе - по «внешнему» механизму 11а позднем этапе отмеча-е1ся повышение фибриногена плазмы, а также ПДФ В целом состояние тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в динамике синдрома ишемии-реперфузии отражает процесс диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

В те же сроки изучалось влияние препарата «Орозин» на изучаемые показатели Препарат вводили внутрибрюшинно однократно в момент реперфузии, в дозировке 300 мг/кг массы тела Обнаружено, что на раннем этапе реперфузионного повреждения «Орозин»

Таблица 3

Коагуляционный гемостаз при синдроме ишемии-реперфузии

Показатель Контроль (п~6) 1 час (п=6) 24 чаеа (п=6)

ВР (ОТП), с 56.4±9,22 21,66±2,50 41 * 42,40+6,19

ВР (БТП), с 187,8+20,4 96,83+8,66 ** 143,0+16,7

АЧТВ, с 5 1,33+2,71 42,20+1,82 * 55,8014,27

ПТВ,с 40,67+5,26 41,08+1,86 26,13+5,16 *

ТВ, с 10,2510,87 7,66+0,28 * 6,50+0,27 **

Фибриноген, г/л 3,07+0,07 3,41+0.67 6,38+0,21 ***

Антитромбин, у е 62,6715,56 43,20+1,24 * 10,50+1,38 ***

ПДФ, мг/л 85,6±2,6 80.0+0,4 150,3+9,8 ***

* - р-^0,05, ** - р0,01, *** - р-Т),001 (по сравнению с группой контроля по ^критерию)

оказывает влияние на функциональную активность тромбоцитов, проявляющееся в следующем.

- снижае гея агрега> шонная способное гь,

- снижается АДФ-индуцированная хемилюминесценция,

- адгезивность снижается на правах тенденции

Таким образом, в условиях гиперагрегабельности «Орозин» оказывает антиагрегангный эффект На сроке 24 часа «Орозин» практически не влияет на количественный состав и функциональную активность тромбоцитов, за исключением достоверного повышения адгезивной способности Эж данные отражены в таблице 4

Влияние «Орозина» на состояние СРО в плазме является стереотипным и проявляется в снижении содержания всех продуктов ПОЛ, повышении общей антиокислительной активности плазмы и повышении активности кагалазы На сроке 24 часа снижается активность це-рулоплазмина, что отражает подавление «Орозином» острофазовой реакции, либо снижение потребности в церулоплазмине за счет собственной антиоксидантной активности «Орозина» (таблица 5)

Влияние «Орозина» на уровень эндогенной интоксикации характеризуется снижением Л11В (олигопептидов) плазмы в раннем периоде и снижением ЛИВ эритроцитов в позднем периоде (таблица 6)

Согласно результатам корреляционного анали за между показаниями функциональной активности тромбоцитов и состоянием СРО в плазме, «Орозин» уменьшает количество положительных взаимосвязей на

Таблица 4

Влияние «Орозина» на состояние системы тромбоцитов при игаемии-

реперфузии

Показатель Ишемия-реперфузия 1 час Ишемия-реперфузия 24 часа

Физ раствор Орозин Физ раствор Орозин

Число ТЦ, •10% 595±23,4 688±26,3 * 740±69,6 747±31,5

Адгезия тромбоцитов, % 12,95±1,86 10,95±1,89 7,10±2,08 11,96±1,31 *

МА агрегации, мм 34,17±1,25 22,40±1,29 *** 22,50±2,06 20,33±1,72

Время агрегации, мин 21,01±2,21 16,20±2,25 * 13,12±0,70 10,88±0,83

СС' АДФ-инд, у е «мин 7,17±3,18 2,29±0,56 # 3,43±0,66 2,52±0,27

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, # - тенденция (по сравнению с соответствующей группой по ^критерию)

сроке 1 час и дополнительно повышает количество отрицательных взаимосвязей на сроке 24 часа. Также под действием «Орозина» снижается влияние показателей эндогенной интоксикации на функциональную активность тромбоцитов

Согласно результатам двухфакторного дисперсионного анализа, влияние «Орозина» на максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов является достоверным и составляет 30% от общей со-

Таблица 5

Влияние «Орозина» на активность АОС в плазме при синдроме ишемии-

реперфузии

Показатель Ишемия-реперфузия 1 час Ишемия-реперфузия 24 часа

Физ раствор Орозин Физ раствор Орозин

АО А, % 15,61±1,42 77?76±1^59^ "" 50.84±3,19 *** 40,28±1,05 49,81 ±2,82 **

сод, % 68.30±7,77 38,76±6,23 31,08±3,50

Каталаза, мкат ПП, у е 26,38±1,05 ~48,16±2^82^ " 33.73 ±0,69 *** 32,55±0,52 37,32±0,67

52.50±2,56 61,00±1,93 53,33±2,16 *

* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001

(по сравнению с соответствующей группой по ^критерию)

Таблица 6

Состояние эндогенной интоксикации в динамике синдрома ишемии-реперфузии и влияние «Орозина»

Показатель ЛПВ плазмы, г/л Ишемия-реперфузия 1 час Ишемия-реперфузия 24 часа

Физ раствор 0,15510,04 Орозин 0,08Ю,03 * Физ раствор 0,13±0,01 Орозин 0,096 Ю,02

ЛПВ эритроцитов, г/л 0,095±0,01 0,124^0,02 0,33±0,01 5 0,26±0,024 *

* - р'0,05, ** - р<0,01, *** - р^0,001 (по сравнению с соответствующей группой по t-критерию)

вокупности действующих факторов, взаимодействие факторов составляет 14% от общей совокупности (рисунок 5) Таким образом, дисперсионный анализ подт верждает то г факт, что действие «Орозина» на максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов существенно зависит от срока реперфузии.

«Орозин» оказывает комплексное воздействие на систему коа-гуляционною гемостаза и антикоагулянтов Па сроке 1 час удлиняется время рекальцификации, однако одновременно укорачивается АЧТВ

MA агрегации

Рисунок 5. Влияние «Орозина» на максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов по данным двухфакторного дисперсионного

анализа

На сроке 24 часа удлиняется до нормальных значений протромбиновое время, что расценено как ингибирование секреции тканевого фактора в кровоток, а также повышается активность анти фомбина и снижае гея уровень Г1ДФ.

Для оценки влияния «Орозина» на активность антитромбина в плазме был применен двухфакторный дисперсионный анализ Его

результаты отражены на рисунке 6

Таким образом, существенную долю в общей совокупности занимает взаимодействие факторов, следовательно, действие «Оро-зина» зависит от срока реперфузии

В целом действие «Орозина» на состояние организма при син-

22%

Антитромбин

21%

I

'ЕЭСрок 1®* В КГП

□ Взаимод

□ Прочие

Рисунок 6 Влияние срока реперфузии и введения КГП на активность

антитромбина

дроме ишемии-реперфузии может быть охарактеризовано следующим образом

- препятствует развитию гиперреактивности тромбоцитов,

- оказывает антиоксидантный и антирадикальный эффект;

- снижает выраженность нейтрофильного лейкоцитоза,

- снижает уровень эндогенной интоксикации;

- препятст вует чрезмерной активации свертывания;

- предотвращает истощение антикоагулянтных механизмов Для дальнейшего уточнения механизмов действия «Орозина»

был проведен ряд исследований в условиях in vitro на крови здоровых доноров, с применением типичной для острофазового ответа организма дозы 3 мг/мл плазмы При изучении влияния на ад!е-зивную способность тромбоцитов было обнаружено, что «Орозин»

и 50

| 40

^ ЭО

| 20

1 'О

2 „ 3 О

□ КГП ■ Прочие

Рисунок 7 Влияние препарата «Орозин» (3 мг/мл) на адгезивную способность тромбоцитов in vitro

Амплитуда II волны 58%

Длительность II волны

69%

ЕЭ КГ П

Я Инкубация □ Друмефаморы

9%

' пк гГ "

ИИнкубация □Дэугие фэкторы

Рисунок В Влияние «Орозина» (3 мг/мл) на показатели агрегациотшой способности тромбоцитов m vitro

Рисунок 9 Схема нарушений гомеостаза органиша на сроке 1 час реперфузии и влияние препарата «Орозин»

Рисунок 10 Схема нарушений гомеостаза организма на сроке 24 часа реперфузии и влияние препарата «Орозин»

достоверно снижает ее, показатель силы влияния составляет 66% от общей совокупности действующих факторов (рисунок 7)

Вне зависимости о г условий инкубации, «Орозин» оказывал инги-бирующее влияние на агрегабельность тромбоцитов, снижая амплитуду и длительность второй волны агрегации По данным двухфакторного дисперсионно! о анализа, влияние «Орозина» является достоверным, при этом взаимодейсI вие факторов от сутствует (рисунок 8)

Результаты исследований обобщены в виде итоговых схем, приведенных на рисунках 9 и 10

ВЫВОДЫ

1 Разработана и апробирована адекватная модель массивною синдрома ишемии-реперфузии, приводящая к выраженным изменениям состояния организма.

2 Массивный синдром ишемии-реперф> зии сопровождав 1СЯ изменениями системы гемостаза, аналогичными ДВСК-синдро-му Гиперкоагуляния в раннюю фазу синдрома (1 час ре перфузии) ишемии-реперфузии опосредована за счег «внутреннего» механизма, в позднюю фазу (24 часа реперфузии) - за счет «внешнего» механизма Одновременно происходит прогрессивное снижение показателей ангикоагулянтной системы и активации фибринолиза

3. Число тромбоцитов снижается в раннюю стадию и нормализуется через 24 часа Изменения агрегационной способности тромбоцитов в динамике реперфузионного повреждения носят фазный характер, с повышением в ранней фазе и со снижением в более поздний период Адгезивная способное 1Ь тромбоцитов в динамике синдроме ишемии-реперфузии протрессивно снижается

4 Реперфузионное повреждение сопровождается развитием острофазовой реакции организма, что подтверждается повышением уровня фибриногена и церулоплазмина через 24 часа

5 Ранняя фаза синдрома ишемии-реперфузии характери ?ует ся снижением антиоксидантной защиты и повышением уровня продуктов ПОЛ, поздняя с тадия - обратными соотношениями

6 Синдром ишемии-реперфузии сопровождается реакцией системы лейкоцитов, выраженной в виде палочкоядерного нейтрофильного сдвига влево (только на сроке 1 час) на фоне абсолютной лейкопении (все сроки)

7 Изменения функциональной активност и тромбоцитов в значительной степени опосредованы за сче г изменений процессов СРО в плазме и уровня эндогенной интоксикации

8 Препарат «Орозин» оказывает ан I икоатулят пный эффект, препятствует снижению активности анчигромбина и чрезмерной активации фибринолиза, снижает повышенную агретационнуюспособностьтром-

боцитов до уровня ниже нормальных значений, ингибирует адгезивную способность тромбоцитов и блокирует секреторную реакцию

9 Действие препарата «Орозин» на функциональное состояние 1ром-боцитов опосредовано через регуляцию процессов СРО и уровня эндо! енной интоксикации в плазме

10 Действие препарата «Орозин» на состояние СРО в плазме является стереотипным и характеризуется снижением уровня продуктов ПОЛ и повышением активности кагалазы и общей АОА; снижает уровень эндогенной интоксикации и выраженность нейтрофильного лейкоцитоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Макаров Е В О влиянии альфа-1 -кислого гликопротеина на АДФ-индуцированную агрегацию громбоцитов человека / Е В Макаров, Л В Кривохижина, В В Саломатин // Медицинский академический журнал, 2003 Т.З, №3, Прил. 4 с 98-99

2 Макаров ЕВ Влияние препарата «Орозин» на АДФ-индуцированную хемилюминесценцию тромбоцитов /ЕВ Макаров // Материалы I итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА - Челябинск, 2003 с 64-65

3 Макаров ЕВ Зависимость влияния альфа-1-кислого гликопротеина на агрегацию тромбоцшов человека от условий инкубации /ЕВ Макаров, Л В Кривохижина, В В Саломатин,С А Кашюков//Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья Оренбург, 2003. с. 496-499

4 Макаров Е В Влияние препарата «Орозин» на некоторые показатели гомеос /аза организма при экс1 юриментальном синдроме ишемии-ре-перфузии / Е.В Макаров// Материалы II итоговой научно-пракшчес-кой конференции молодых ученых ЧелЕМА - Челябинск, 2004. с 57-58

5 Макаров Е В Состояние тромбоцитарного гемостаза в динамике массивного синдрома ишемии-реперфузии /ЕВ Макаров // Материалы II итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА - Челябинск, 2004 с 58-60

6 Кривохижина Л В Коагуляционный гемостаз при эксперимент аль-

ном синдроме ишемии-реперфу ?ии / Л В Кривохижина, Е В Макаров // Актуальные вопросы кардиологии и внутренней патологии Материалы научно-практической конференции, посвященной 70-летнему юбилею ЮУЖД - Челябинск, 2004 с 26-28

7 Макаров Е В Состояние сис темы тромбоцитов, свободнорадикаль-ных процессов и антиокислительной защиты при син-дроме ише-мии-реперфузии/Е В Макаров, Л В Кривохижина, С А Кантюков, В И Сергиенко // Эфферентная терапия, 2004, т 10, №2 с 57-60

8 Кривохижина Л. В Перспективы применения белков острой фазы для коррекции нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при экстремальных состояниях организма ^ Л В Кривохижина,ЕII Ермолаева, Е В Макаров, С А Кантюков VПатофизиология и современная медицина Материалы II Международной конференции -Москва, 2004 с 228-230

9 Кривохижина Л В Альфа-1 -кислый гликопротеин как регули юр функционального сос юяния тромбоцитов / Л В. Кривохижина, Е В Макаров//Омский научный вестник, 2005, №3 с 163-166

Макаров Евгений Владимирович

ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА ПРИ СИНДГОМЕ ИШЕМИИ-РЕПЕ РФУЗИИ И ИХ КОРРЕКЦИЯ БЕЛКОМ ОСТРОЙ ФАЗЫ АЛЬФА-1-КИСЛЫМ ГЛИКОПРОТЕИНОМ

14 00.16 - Патологическая физиология 03 00 04 - Биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2005

Отпечатано в издательстве ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию» Лицензия №01906 Подписано к печати 11 05 05 г Объем 1 п л Формат 64x84 Гарнитура «Times New Roman суг» Бумага для офисной техники, 80 мг/м2 Тираж 100 экз

»12082

РНБ Русский фонд

2006-4 5597

Актуальность исследования. Синдром ишемии-реперфузии, лежащий в основе таких патологических процессов, как стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт, в настоящее время привлекает внимание большого числа исследовательских групп. Целый ряд работ посвящен изучению местного состояния тканей, вовлеченных в реперфузионное повреждение и поиску возможных способов их защиты от таких отрицательных факторов, как гипоксии, лейкоцитарной инфильтрации, цитокиновой агрессии [79,93,175,182,219]. В то же время недостаточно изучена роль в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии одной из наиболее значимых и динамичных гомеостатических систем организма - системы регуляции агрегатного состояния крови (PACK). Имеются работы, в которых рассматривается значение ее функциональных составляющих в локальных проявлениях синдрома ишемии-реперфузии [52,69,74,152], ряд авторов указывают на развитие местного ДВС-синдрома [201]. Однако комплексная оценка функционального состояния системы гемостаза и активности регулирующих ее факторов, в частности процессов свободнорадикального окисления (окислительный стресс), эндогенной интоксикации, лейкоцитарной реакции, при синдроме ишемии-реперфузии до настоящего момента не производилась.

Особый интерес в плане коррекции нарушений гомеостаза организма в настоящее время привлекают «естественные» факторы, в том числе вещества, относимые к группе так называемых «острофазовых белков». Одним из перспективных представителей данной группы является белок II эшелона альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид, серомукоид, КГП), существующий в виде лекарственной формы - препарата «Орозин». Приоритет в разработке данного препарата принадлежит кафедре биохимии ЧелГМА, а технология производства освоена Челябинской областной станцией переливания крови. Спектр возможных показаний для применения данного препарата требует расширения. Концентрация альфа-Скислого гликопротеина в плазме нарастает в 3-5 раз при различных экстремальных воздействиях на организм уже через 18-24 часа

95,203]. Данные литературы позволяют характеризовать орозомукоид как нормальный компонент сосудистой стенки, участвующий в регуляции ее проницаемости, как регулятор функционального состояния нейтрофилов и других клеток крови [29,33,211,212]. Имеются указания на наличие антиоксидантной и антицитокиновой активности [140,226]. В последние годы орозомукоид привлекает внимание исследователей как корректор состояния организма при экстремальных состояниях (шок, бактериальная инфекция) [111,124], а также как фактор местной защиты тканей при ишемии-реперфузии [80]. В то же время информация о системном влиянии альфа-1-кислого гликопротеина, в том числе и при ишемии-реперфузии не формирует целостной картины. Исходя из этих предпосылок, были определена цель и задачи исследования.

Цель исследования.

Определить патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекцию белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеи-ном

Задачи исследования.

1. Разработать адекватную модель синдрома ишемии-реперфузии, позволяющую получить выраженные изменения гомеостаза целостного организма.

2. Изучить нарушения системы гемостаза при ишемии-реперфузии: системы тромбоцитов, свертывающей, антикоагулянтной и фибринолитической систем.

3. Определить возможные механизмы нарушений системы гемостаза: изменения свободнорадикальных процессов в плазме и тромбоцитах, состояния эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов, выявить взаимосвязи между нарушениями системы гемостаза и факторами, регулирующими гемостатические процессы.

4. Выявить влияние «Орозина» на основные патогенетические механизмы, наблюдаемые при синдроме ишемии-реперфузии: состояние системы гемостаза, состояние свободнорадикальных процессов, состояние эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов.

5. Выявить влияние «Орозина» на состояние компонентов системы гемостаза в условиях in vitro.

Научная новизна. Впервые показано, что изменения системы гемостаза в динамике экспериментального синдрома ишемии-реперфузии носят фазный характер. Ранняя стадия характеризуется изменениями, подобными ДВСК-синдрому. Функциональная активность тромбоцитов повышается в раннем периоде синдрома и снижается в позднем. В ранней фазе (1 час реперфузии) активация свертывающей системы происходит по внутреннему пути, а в позднем периоде (24 часа) - по внешнему пути. Одновременно происходят фазные согласованные изменения активности процессов СРО в плазме и тромбоцитах. Показано, что синдром ишемии-реперфузии сопровождается развитием острофазовой реакции организма, а также преходящей реакцией системы лейкоцитов, проявляющейся нейтрофильным палочкоядерным лейкоцитозом на фоне лейкопении.

Впервые изучено действие препарата «Орозин» на состояние организма при ишемии-реперфузии. Показано, что белок снижает повышенную агрегаци-онную способность тромбоцитов и не оказывает эффекта при пониженной агре-гационной активности, нормализует адгезивную способность тромбоцитов. В условиях ишемии-реперфузии препарат оказывает антиоксидантный эффект вне зависимости от срока, опосредованный через повышение общего антиокси-дантного потенциала плазмы и активности каталазы; снижает выраженность лейкоцитарной реакции.

В условиях in vitro впервые показано, что альфа-1-кислый гликопротеин игибирует функциональную активность тромбоцитов за счет второй волны агрегации. Влияние на адгезивную способность и продукцию свободных радикалов в тромбоцитах различно в условиях in vitro и in vivo при синдроме ишемии-реперфузии.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты диссертационного исследования уточняют роль нарушений системы гемостаза, изменений свободнорадикальных процессов, уровня эндогенной интоксикации в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии, а также патофизиологическую значимость альфа-1-кислого гликопротеина как фактора неспецифической защиты организма. Экспериментально обосновано применение препарата «Орозин» при состояниях, в основе которых лежит синдром ишемии-реперфузии, с целью коррекции нарушений тромбоцитарного, коагу-ляционного гемостаза и антикоагулянтной системы, нормализации свободнорадикальных процессов за счет усиления мощности антиоксидантной системы. Разработанная модель синдрома ишемии-реперфузии является аналогом ряда ситуаций в клинике сосудистой хирургии и может применяться для проведения дальнейших научных исследований.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология системы крови», «Обмен белков» в Челябинской государственной медицинской академии.

Разработанный «Способ моделирования синдрома ишемии-реперфузии» внедрен на кафедру патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии для проведения дальнейших научных исследований.

Положения, выносимые на защиту.

1. Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается фазными изменениями состояния системы гемостаза, которые могут быть расценены как ДВСК-синдром и включают как процессы нарушения гемостаза, так и процессы компенсации.

2. Изменения системы гемостаза опосредованы за счет изменения состояния свободнорадикальных процессов и эндогенной интоксикации.

3. Препарат «Орозин» оказывает антиагрегантное и антикоагулянтное действие в условиях синдрома ишемии-реперфузии, опосредованное через изменение состояния свободнорадикальных процессов и уровня эндогенной интоксикации.

4. Препарат «Орозин» оказывает стереотипное антиоксидантное действие, опосредованное за счет повышения активности каталазы и общей антиокислительной активности.

5. В условия ишемии-реперфузии препарат «Орозин» снижает выраженность лейкоцитарной реакции и уровень эндогенной интоксикации.

Апробация работы.

Основные положения работы изложены на научной конференции «Молекулярные основы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию со дня рождения П.М. Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), I итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск,2003), научно-практической конференции «Актуальные вопросы кардиологии и внутренней патологии», посвященной 70-летнему юбилею ЮУЖД (Челябинск, 2004), II итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2004), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), II конференции «Гемостаз и патология сосудов» (Омск, 2005).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, со-стояит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, библиографического указателя. Диссертация иллюстрирована 62 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 194 - зарубежных авторов.

1. Разработана и апробирована адекватная модель массивного синдрома ише мии-реперфузии, приводящая к выраженным изменениям состояния орга низма.2. Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается изменениями сис темы гемостаза, аналогичными ДВСК-синдрому. Гиперкоагуляция в ран нюю фазу синдрома (1 час реперфузии) ишемии-реперфузии опосредована за счет «внутреннего» механизма, в позднюю фазу (24 часа реперфузии) - за счет «внешнего» механизма. Одновременно происходит прогрессивное сни жение показателей антикоагулянтной системы и активации фибринолиза

3. Число тромбоцитов снижается в раннюю стадию и нормализуется через 24 часа. Изменения агрегационной способности тромбоцитов в динамике ре перфузионного повреждения носят фазный характер, с повышением в ран ней фазе и со снижением в более поздний период. Адгезивная способность тромбоцитов в динамике синдроме ишемии-реперфузии прогрессивно сни жается.4. Реперфузионное повреждение сопровождается развитием острофазовой ре акции организма, что подтверждается повышением уровня фибриногена и церулоплазмина через 24 часа.5. Ранняя фаза синдрома ишемии-реперфузии характеризуется снижением ан тиоксидантной защиты и повышением уровня продуктов ПОЛ, поздняя ста дия — обратными соотношениями.6. Синдром ишемии-реперфузии сопровождается реакцией системы лейкоци тов, выраженной в виде палочкоядерного нейтрофильного сдвига влево (только на сроке 1 час) на фоне абсолютной лейкопении (все сроки).7. Изменения функциональной активности тромбоцитов в значительной степе ни опосредованы за счет изменений процессов СРО в плазме и уровня эндо генной интоксикации.8. Препарат «Орозин» оказывает антикоагулянтный эффект, препятствует снижению активности антитромбина и чрезмерной активации фибринолиза.Препарат «Орозин» снижает повышенную агрегационную способность тромбоцитов до уровня ниже нормальных значений, ингибирует адгезивную способность тромбоцитов и блокирует секреторную реакцию.9. Действие препарата «Орозин» на функциональное состояние тромбоцитов опосредовано через регуляцию процессов СРО и уровня эндогенной инток сикации в плазме.10.Действие препарата «Орозин» на состояние СРО в плазме является стерео типным и характеризуется снижением уровня продуктов ПОЛ и повышени ем активности каталазы и общей АОА. Препарат «Орозин» снижает уровень эндогенной интоксикации и выраженность нейтрофильного лейкоцитоза.