Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование оптимальных способов доставки ростовых факторов при инфаркте миокарда

На правах рукописи

ЛЛ^у-

Великанов а Елена Анатольевна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ СПОСОБОВ ДОСТАВКИ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА (экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Иркутск-2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Лисаченко Геннадий Васильевич

Официальные оппоненты:

Лепехова Светлана Александровна - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, научный отдел экспериментальной хирургии с виварием, заведующая

Корытов Леонид Иннокентьевич — доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра нормальной физиологии, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е. Д. Гольдберга», г. Томск

Защита состоится «<£У » Л^^рх 2015 года в 12°- часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» и на сайте http://www.nzmedek.ru

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Шолохов Леонид Федорович

I РОССИЙСКАЯ ¡'ОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2015

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Ишемическая болезнь сердца и ее осложнения, в частности инфаркт миокарда, занимают лидирующее положение среди причин смертности и инвали-дизации населения развитых стран. Таким образом, актуальной остается проблема разработки новых и улучшения существующих методов лечения.

Среди новых подходов к лечению ишемических повреждений наиболее перспективным является терапевтический ангиогенез, который представляет собой тактику улучшения перфузии ишемизированной ткани за счет усиления естественных процессов неоваскуляризации (Chu H., 2012). В основе терапевтического ангиогенеза лежит воздействие на факторы-регуляторы образования кровеносных сосудов. В исследованиях наиболее часто используется сосуди-сто-эндотелиальный ростовой фактор (VEGF) как основной стимулятор неова-скулогенеза (Парфенова Е.В., 2007). Возможность использования VEGF для стимуляции ангиогенеза была показана ранее в многочисленных экспериментальных исследованиях на лабораторных животных. Введение ростовых факторов после моделированного инфаркта миокарда приводит к достоверному увеличению количества сосудов в миокарде, уменьшению зоны инфаркта, улучшению функции левого желудочка, стимуляции артериогенеза (Formiga F.R., 2010; Gao J., 2011). Однако клиническое применение VEGF ограничено низкой продолжительностью действия ростового фактора, что влечет за собой формирование незрелых и нестабильных кровеносных сосудов, а также возможные побочные действия. Потенциальные стратегии по решению этих проблем предполагают использование систем контролируемой доставки, которые позволяют осуществлять длительную ангиогенную стимуляцию для образования стабильных кровеносных сосудов (Chu H., 2012).

В качестве системы доставки для оптимизации терапевтического эффекта ростового фактора могут быть использованы липосомы. Потенциальная эффективность их использования обусловлена тем, что липосомы значимо изменяют фармакокинетику препарата, включенного в их состав. Они защищают инкапсулированное лекарственное вещество от инактивации под действием физиоло-

гичсской среды, а также увеличивают его биодоступность (Е1Ьауоигт Т.А., 2010). В сочетании с обеспечением направленного транспорта, это дает возможность снизить дозу используемого ростового фактора и таким образом избежать возможных осложнений при сохранении эффективности терапевтического действия препарата.

Степень разработанности темы

На сегодняшний день в ходе многочисленных экспериментов показана потенциальная возможность применения УЕвР для стимуляции неоваскуляри-зации ишсмизированной ткани (Парфенова Е.В., 2007). Однако неудовлетворительные результаты клинических испытаний продемонстрировали, что в этой области остается много нерешенных вопросов. В частности, не определена оптимальная доза ростового фактора, "слабо изучены пути доставки препарата к миокарду. Кроме того, дополнительные сложности создают возможные побочные действия ростового фактора и его нестабильность в кровотоке.

На сегодняшний день не разработана система доставки или оптимизация терапии УЕвР, которая позволила бы решить указанные проблемы. В качестве такой системы доставки в настоящем исследовании предложено использовать липосомы. Липосомы на сегодняшний день применяются достаточно широко, однако область их использования сосредоточена преимущественно в сфере терапии онкологических заболеваний. В области лечения сердечно-сосудистых заболеваний липосомы представлены слабо, большинство исследований направлено на разработку препаратов для антиоксидантной защиты миокарда (Вошеу К., 2012). Не существует разработок, в которых липосомы рассматривались бы как средство пролонгированной доставки ростовых факторов для стимуляции ангиогенсза в ишемизированной ткани.

Все вышеизложенное позволило сформулировать цель диссертационного исследования.

Цель исследования

Патогенетическое обоснование эффективности разных вариантов доставки сосудисто-эндотелиалыюго ростового фактора при экспериментальном инфаркте миокарда.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы взаимодействия липосом с клетками и их цитопро-тективное действие в зависимости от концентрации включенного в их состав сосудисто-эндотелиального ростового фактора.

2. Определить оптимальный путь доставки липосомальной формы сосу-дисто-эндотелиального ростового фактора к ишемизированному миокарду.

3. Оценить выраженность ангиогенеза в тканях миокарда при использовании свободной и липосомальной форм сосудисто-эндотелиального ростового фактора в терапии экспериментального инфаркта миокарда.

4. Оценить степень повреждения миокарда и выраженность процессов репарации после интрамиокардиального введения свободной и липосомальной форм сосудисто-эндотелиального ростового фактора на фоне моделированного инфаркта миокарда.

Научная новизна

Проведена оценка органного распределения липосом в зависимости от пути введения препарата. Показано, что при интрамиокардиальном введении липосом, содержащих УЕвР, они депонируются в межклеточном пространстве миокарда, обеспечивая пролонгированную доставку ростового фактора.

Изучена зависимость ангиогенного и аптиишемического эффекта от количества УЕйР в составе липосом. Липосомы, содержащие УЕвР в концентрации 25 иг/мл, обладают ярко выраженным аигиогенным действием, а также уменьшают ишемическое повреждение миокарда и выраженность апоптоза. При введении липосом, содержащих УЕвР в концентрации 5 пг/мл, требуемый терапевтический эффект не достигается.

Доказана возможность использования липосом, содержащих сосудисто-эндотелиальный ростовой фактор в концентрации 25 нг/мл, в терапии инфаркта миокарда в эксперименте. Показано, что липосомальная форма доставки УЕйР значительно увеличивает терапевтический (ангиогенный, противоише-мический) эффект по сравнению со свободной формой ростового фактора.

Теоретическая и практическая значимость работы

На экспериментальной модели ишемизированного миокарда определена оптимальная лекарственная форма, концентрация и путь введения сосудисто-эндотелиального ростового фактора для оказания ангиогенного, антиишемиче-ского и кардиопротективного эффекта в отношении постинфарктного миокарда. Оптимальным является интрамиокардиальное введение липосом, содержащих VEGF в концентрации 25 нг/мл. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях при разработке фармацевтических препаратов, обладающих ангиогениым и кардиопротсктивным эффектами.

Методология и методы исследования

Проведенное экспериментальное исследование включало в себя комплексную оценку препаратов сосудисто-эпдотелиалыгого ростового фактора в тестах in vivo и in vitro и базировалось на использовании цитологического, им-мунофлуорссцентного, люминесцентного, иммуноферментного, гистологических методов исследования. Эксперименты in vitro проводились на культуре фибробластоподобных клеток кожи и мезенхимальных стволовых клеток крыс. Эксперименты in vivo проводились па модели инфаркта миокарда у крыс субпопуляции Вистар.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер взаимодействия липосом с клетками зависит от количества включенного в их состав сосудисто-эндотслиального ростового фактора. Липо-сомы, содержащие сосудисто-эндотслиальный ростовой фактор в концентрации 25 нг/мл, преимущественно адсорбируются на мембране клеток и таким образом являются эффективной системой доставки препарата к тканям. Липосомы, содержащие сосудисто-эндотслиальный ростовой фактор, оказывают цитопро-тективпос действие in vitro.

2. Интрамиокардиальное введение липосом диаметром 100 мм является оптимальным способом доставки сосудисто-эндотелиального ростового фактора к ишемизированпому миокарду. При этом липосомы, содержащие сосуди-сто-эидотелиальный ростовой фактор в концентрации 25 нг/мл, образуют депо в межклеточном пространстве миокарда и таким образом обеспечивают пролонгированную доставку ростового фактора до 7 суток после инъекции.

3. Наиболее эффективным действием обладают липосомы, содержащие сосудисто-эндотелиальный ростовой фактор в концентрации 25 нг/мл. Интра-миокардиальное введение липосом, содержащих сосудисто-эндотелиальный ростовой фактор в концентрации 25 нг/мл, увеличивает плотность сосудистой сети, оказывает антиишемическое действие и уменьшает отек ткани, увеличивает количество жизнеспособных кардиомиоцитов.

Степень достоверности результатов проведенных исследований

Достоверность полученных результатов подтверждается достаточным объемом наблюдений (80 крыс), широким спектром выполненных исследований, использованием современных методов. Анализ полученных результатов, статистическая обработка данных проведены в соответствии с принципами доказательной медицины.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены на Областном молодежном форуме «СТАРТ-2010» (Кемерово, 2010), Ежегодной научной сессии молодых ученых НИИ КПССЗ СО РАМН «Наука практике!» (Кемерово, 2011), Второй научной сессии молодых ученых Кузбасса «Наука - Практике» в НИИ КПССЗ СО РАМН (Кемерово, 2012), Инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (Кемерово, 2013), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2014), Международной конференции «Materials, Methods and Technologies» (Elenitc, Bulgaria, 2014), Всероссийской конференции молодых ученых «Регенеративная медицииа - медицииа будущего» (Томск, 2014).

Публикации

По результатам диссертационного исследования опубликовано 10 работ в форме научных статей и тезисов в журналах, материалах научных съездов и конференций, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора наук.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах текста, содержит 5 таблиц и 14 рисунков. Указатель использованной литературы содержит 129 источников. Работа

состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов.

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в планировании исследования, определении цели и задач, выборе необходимых методов для их решения. Анализ данных литературы по теме диссертации, проведение исследований (флуоресцентная микроскопия, иммуноферментный анализ, TUNEL), обработка и интерпретация полученных данных, написание диссертации выполнены лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Терапевтические агенты. В исследовании были использованы «пустые» липосомы, свободная форма VEGF в концентрации 5 нг/мл и 25 нг/мл и липо-сомы, содержащие VEGF в аналогичных концентрациях. Концентрации VEGF, применяемые в работе, были определены эмпирически с учетом литературных данных.

Подготовка клеточного материала. Тесты in vitro проводили на культуре фибробластоподобных клеток кожи крысы и мезенхимальных стволовых клеток крысы. Мезенхимальпые стволовые клетки (МСК) выделяли из костного мозга бедренных и большеберцовых костей животных. Фибробластоподобныс клетки получали из образцов кожи методом миграции. Все культуры выращивали в питательной среде DMEM (Gibco, США), содержащей HEPES буфер, эмбриональную телячыо сыворотку (Gibco, США), L-глутамин, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В (Sigma Aldrich, США) при 37 °С и 5 % СО2, до получения конфлюэнтного слоя.

Оценка жизнеспособности клеток. Фибробластоподобиыс клетки кожи культивировали в присутствии липосом в нормальных условиях и в условиях депривации сыворотки. Уровень апоптоза и некроза в культурах определяли методом проточной цитофлуориметрии по окраске клеток аннексином V-PE и 7AAD с помощью Apoptosis detection Kit (Bekton Dickinson) согласно инструк-

ции производителя. Оценивали процентное содержание живых клеток (Аппехш V 7ААО ), уровень раннего апоптоза (Аппехш У+7АА0 ), позднего апоптоза (Аппехш У+7ААЭ+) и некроза (Аппехш V 7АА0+). Все образцы анализировали в дублях, вычисляли среднее значение.

Оценка взаимодействия в системе «липосома-клетка». МСК культивировали в течение I, 2 и 4 часов с липосомами различного состава, несущими флуоресцентную метку РКН2. Затем клетки отмывали физиологическим раствором, анализировали с помощью инвертированного микроскопа АхюОЬясгусг. Регистрировали интенсивность флуоресцентного сигнала клеток.

Моделирование инфаркта миокарда. Исследование проводилось на самцах лабораторных крыс субпопуляции Вистар массой 300-350 г. Все работы с животными были одобрены этическим комитетом ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН и соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Контролю за проведением работ с использованием экспериментальных животных» (Приказы № 742 и № 48 Министерства высшего и среднего специального образования СССР от 13.11.1984 г. и от 23.01.1985 г.) и «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в ииых научных целях» (Страсбург, 18.03.1986).

Оценка особенностей органного распределения липосомальной формы УЕСР на фоне инфаркта миокарда. Всем животным моделировали инфаркт миокарда. Через 3 суток флуоресцентно меченные липосомы размером 50 и 100 нм, содержащие УЕвР, вводили в периинфарктную зону или в хвостовую вену. Через 3 суток извлекали сердце, легкие, печень, почку, селезенку, головной мозг, изготовляли криостатные срезы, анализировали с помощью люминесцентного микроскопа Ахю1п^сг.А1.

Оценка эффективности применения свободной и липосомальной форм УЕСР при инфаркте миокарда. На первом этапе исследования всем животным моделировали инфаркт миокарда путем лигировапия коронарной артерии. Через 3 суток проводили повторную операцию с целью интрамиокарди-альной инъекции терапевтических препаратов. В эксперименте участвовали следующие группы животных: 1 - Контроль; на 3-й сутки после инфаркта мио-

карда проводили ложную повторную операцию. 2 - У5; интрамиокардиальное введение сосудисто-эндотелиального ростового фактора в концентрации 5 нг/мл (из расчета 7,7 нг/кг веса животного). 3 - У+Л5; интрамиокардиальное введение липосом, содержащих УЕОР в концентрации 5 нг/мл (из расчета 7,7 нг/кг веса животного). Концентрация липосом в препарате составила 2,5 мг/мл в пересчете на липиды (3,85 мг/кг веса животного). 4 - У25; интрамиокардиальное введение сосудисто-эндотелиалыюго ростового фактора в концентрации 25 нг/мл (из расчета 38,5 нг/кг веса животного). 5 - У+Л25; интрамиокардиальное введение липосом, содержащих УЕОР в концентрации 25 нг/мл (из расчета 38,5 нг/кг веса животного). Концентрация липосом в препарате составила 2,5 мг/мл в пересчете на липиды (3,85 мг/кг веса животного).

Лекарственные препараты в объеме 0,5 мл вводили в периинфарктнуга зону посредством 3-4 инъекций. Животных выводили из эксперимента на 3-й, 7-е и 14-е сутки после повторной операции. Проводили забор крови. Извлекали сердце, разделяли на 2 части по продольной линии через зону инфаркта. Одну часть замораживали в жидком азоте, вторую фиксировали в формалине для гистологического исследования по стандартной методике.

Гистологическое исследование миокарда. Оценка морфологических изменений миокарда после введения препаратов УЕОР выполнялась по гистологическим срезам после окраски гематоксилином-эозином и по Ван-Гизон по стандартной методике.

Оценка васкуляризации миокарда. Проводили иммунофлуоресцентное специфическое окрашивание на С031. Для оценки васкуляризации миокарда подсчитывали количество сосудов в поле зрения при увеличении в 200 раз, анализировали 10 случайно выбранных полей зрения.

Оценка экспрессии сосудисто-эндотелиального ростового фактора в миокарде. Проводили иммунофлуоресцентное специфическое окрашивание на УЕОР. Выраженность экспрессии УЕОР оценивали на основании измерения интенсивности свечения флуоресцентной метки с помощью программного обеспечения АхкМвюп. Измерение проводили в 10 случайно выбранных полях зрения, для анализа использовали среднее значение измерений.

Анализ апоптоза кардиомиоцитов методом TUNEL. Исследование апоптоза кардиомиоцитов проводили путем постановки на криостатных срезах миокарда реакции TUNEL (метод TdT-опосредованной метки dUTP-конца разрыва цепи ДНК) с использованием стандартного набора реактивов Millipore (США). Дополнительно проводили окрашивание ядер клеток красителем DAPI. Анализировали препараты с помощью люминесцентного микроскопа «Axio Imager.Al» (Carl Zeiss, Германия). Для оценки выраженности апоптоза рассчитывали индекс апоптоза по формуле: ИА = Na : N ,

где Na - количество TUNEL-позитивных клеток в поле зрения, N - общее количество клеток в поле зрения.

Иммуноферментный анализ. В сыворотке крови определяли количественное содержание сосудисто-эндотелиального ростового фактора, белка, связывающего жирные кислоты (БСЖК), трансформирующего ростового фактора-ß (TGF-ß), фактора некроза опухоли-a (TNF-a), интерлейкина-lß (IL-lß) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Для оценки нормальности распределения данных использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Указывали медиану и 25-й и 75-й про-цептили (Me (25%; 75%)) для описания признаков с отличным от нормального распределением и среднее значенис±стапдартнос отклонение для описания признаков с нормальным распределением. Для оценки межгрупповых различий использовали критерии Маниа-Уитни и Краскела-Уоллиса. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка взаимодействия клеток с липосомами различного состава.

Показано, что включение VEGF в состав липосом значимо изменяет характер их взаимодействия с клетками. При длительной инкубации «пустых» липосом с клетками наблюдалось значительное их поглощение и внутриклеточное пакоп-

ление. При включении VEGF в состав липосом сохранялся эффект поглощения липосом, однако в большей степени наблюдалась их адгезия к клеточной мембране. При этом наблюдался дозоэависимый эффект: для липосом, содержащих VEGF в концентрации 25 нг/мл, более характерно прилипание к поверхности клеточной мембраны, однако также наблюдается незначительное поглощение или обмен липидами между липосомой и клеточной мембраной.

Протективный эффект липосом в условиях сывороточной деприва-ции. В тестах in vitro было показано, что как «пустые» липосомы, так и липо-сомы с VEGF увеличивают выживаемость клеток в неблагоприятных условиях (таблица 1).

Таблица 1 - Показатели жизнеспособности культуры фибробластоподоб-иых клеток при различных условиях культивирования, % (Ме (25%; 75%))

Условия эксперимента AnV~7AAD Живые клетки AnV'7AAD~ Ранний апоптоз AnV'7AAD' Поздний апоптоз AnV 7AAD1 Некроз

Контроль 92,70 (84,80;93,00) 2,40 (2,30;6,80) 3,65 (3,14;7,80) 1,20 (1,00; 1,30)

Депривация сыворотки 40,25 (16,20;6,30) 48,00 (32,50;63,50) 9,05 (2,00; 16,10) 2,70 (1,20;4,20)

Депривация сыворотки + «пустые» липосомы 66,30 (60,10;83,20) 27,20 (12,50;28,20) 4,90 (1,80; 11,20) 1,60 (0,50;2,50)

Депривация сыворотки + липосомы с УЕСР 53,10 (51,90;82,10) 19,70 (14,90;36,10) 9,60 (1,60;21,90) 2,40 (1,40;5,30)

Добавление «пустых» липосом к культуральной среде значительно увеличивало выживаемость клеток в условиях сывороточной дспривации. Липосомы, содержащие УЕвР, обладали несколько менее выраженным цитопротск-тивным действием, предположительно, по причиие меньшего их поглощения клетками. Таким образом, применение липосом является средством сохранения жизнеспособности ткани.

Сравнительная оценка способов доставки липосомальной формы УЕвР. Проведен анализ органного распределения липосом разного размера,

содержащих УЕОР, после их местного и системного введения. Показано, что при любом способе введения значительная часть липосом накапливается в печени, селезенке, почках. Однако при интрамиокардиальном введении липосом размером 100 нм они также депонировались в межклеточном пространстве миокарда. По-видимому, это связано с особенностями их взаимодействия с клетками: липосомы относительно слабо поглощались близлежащими кар-диомиоцитами и таким образом сохранялись в межклеточном пространстве миокарда па срок, по меньшей мере, до 3 суток после инъекции. Интересно, что данный эффект зависел от размера липосом: депонирование в миокарде наблюдалось при использовании липосом диаметром 100 нм, по пс 50 пм. Очевидно, липосомы меньшего размера более интенсивно взаимодействуют с клетками, поэтому при введении в миокард в значительной степеии поглощались кардиомиоцитами. Также было показано, что при введении липосом в системный кровоток вне зависимости от их размера не наблюдалось их накопления в миокарде.

Таким образом, интрамиокардиалытое введение липосом размером 100 нм, содержащих УЕОР, следует считать оптимальным путем доставки ростового фактора.

Оценка экспрессии УЕвР в образцах миокарда крыс. Депонированные в миокарде липосомы постепенно разрушаются, и заключенный в их внутренней фазе УЕОР выходит в окружающие ткани. Таким образом обеспечивается пролонгированная доставка ростового фактора, которая способствует длительному повышению уровня УЕОР в миокарде. Это подтверждается анализом экспрессии УЕОР в миокарде, который показал, что при введении липосом, содержащих УЕОР в концентрации 25 нг/мл, наблюдается повышение уровня ростового фактора па срок до 7 суток после инъекции (таблица 2).

Для сравнения: при введении свободной формы УЕОР в аналогичной концентрации, и свободной и липосомалыюй форм УЕОР в низкой концентрации (5нг/мл) отмечалось увеличение содержания УЕОР в отдаленные сроки наблюдения (начиная с 7-х суток), что предположительно является следствием

ишемии или воспаления. Необходимо отметить, что очень высокая экспрессия УЕОР в позднем периоде наблюдения отмечалась в группе контроля, что говорит о высоком уровне ишемии миокарда.

Таблица 2 - Экспрессия УЕОР в миокарде, усл. ед.

Группы Сроки наблюдения

3-й сутки 7-е сутки 14-е сутки

Контроль 0,00 (0,00; 0,00)"" 107,50 (71,87; 139,18) *'"" 15,73 (0,00; 156,53)"

У5 26,35 (19,94; 31,64)*"'"" 1,40 (0,00; 2,08)*''" 0,00 (0,00; 0,00)*'""

У+Л5 0,00 (0,00; 3,11) ' *'* "* 6,87 (3,51; 9,22)........... 0,00 (0,00; 0,00)

У25 0,00 (0,00; 0,00)"" 15,68(15,13; 17,50Г" 0,00 (0,00; 1,21) .......

У+Л25 19,10 (10,35; 22,71)"' 8,00(7,06; 10,19Г" 0,00 (0,00; 0,12)''"

Примечания: * - р<0,05 по сравнению с 3-ми сутками наблюдения;

**- р<0,05 по сравнению с предыдущим сроком наблюдения; *** - р<0,05 по сравнению с группой контроля; *+** - р<0,05 по сравнению с группой У+Л25; ***** _ р<0>05 по сравнению с предыдущей группой.

Таким образом, липосомы, содержащие УЕОР в концентрации 25 нг/мл, являются эффективным способом доставки ростового фактора в ишемизиро-ванный миокард, обеспечивающим пролонгированную доставку ростового фактора.

Анализ содержания УЕСР в сыворотке крови крыс. Для исключения возможного системного действия УЕОР, введенного в миокард, оценивали содержание ростового фактора в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (таблица 3).

По результатам анализа можно заключить, что во всех экспериментальных группах па разных сроках наблюдения отмечалось умеренное увеличение содержания УЕОР в сыворотке крови, которое значимо не превышало максимальные его значения у контрольных животных. Таким образом, введение в миокард ростового фактора не приводит к дополнительному увеличеиию его

уровня в сыворотке крови выше физиологических значений в условиях инфаркта миокарда. Следовательно, нет оснований предполагать проявление негативного системного действия УЕОР.

Таблица 3 - Содержание УЕОР в сыворотке крови крыс (пг/мл)

Группа Сроки наблюдения

3-й сутки 7-е сутки 14-е сутки

Контроль 0,00 (0,00;0,00) 0,00 (0,00;0,00) 2,70 (1,35; 8,31)

У5 3,87 (1,36; 12,00) 0,00 (0,00; 4,68) 0,00(0,00; 14,19)

У+Л5 7,40 (3,53; 9,27) 0,00 (0,00;0,00)* 0,00 (0,00;0,00)*/**

У25 0,00 (0,00; 4,68) 5,46 (3,42; 6,76)**/*** 0,00 (0,00;0,00)

У+Л25 0,00 (0,00; 0,58) 6,33 (1,66; 11,00) 0,00 (0,00; 2,04)

Примечания: * - р<0,05 по сравнению с 3-ми сутками наблюдения;

** - р<0,05 по сравнению с контрольной группой; *** _ р<0,05 по сравнению с предыдущей группой

Васкуляризация миокарда после введения препаратов УЕСР. Следствием длительного увеличения содержания УЕОР является стимуляция процесса ангиогенеза. По результатам наших исследований было показано, что интрамио-кардиальное введение липосом, содержащих УЕОР в концентрации 25 нг/мл, вызывает значимое увеличение сосудистой плотности уже на 3-й сутки (в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой, р<0,05) (рисунок 1). Подобный результат мы не наблюдали при введении свободной формы УЕОР в аналогичной концентрации и при использовании более низкой дозы УЕОР. Таким образом, интра-миокардиальное введение липосом, содержащих УЕОР в концентрации 25 нг/мл, в сочетании с естественным повышением уровня УЕОР после инфаркта, обеспечивает значительную активацию процесса образования сосудов и, следовательно, является эффективным средством улучшения кровоснабжения ишеми-зированной ткани.

ед./поле зрения

3,5 3,0 2,5 -

*

*

□ контроль ♦ ШУ5

ШУ25 I □ У+Л25

3 сутки

7 сутки

14 сутки

* -р<0,05 по сравнению со всеми группами

** - р<0,05 по сравнению с группой контроля

*** - р<0,05 по сравнению с первыми сутками наблюдения

Рисунок 1 — Количество сосудов в миокарде, ед/поле зрения

Оценка степени повреждения миокарда после инграмиокардиально-10 введении препаратов \TXil' на фоне инфаркта миокарда. При сравнении результатов динамики содержания БСЖК и выраженности апоптоза в миокарде очевидно, что повышение уровня БСЖК не всегда сопровождается увеличением количества пежизнеспособых клеток. Поскольку молекулы БСЖК могут проходить через мембрану живых клеток, находящихся в условиях ишемии, увеличение БСЖК следует рассматривать как маркер неблагоприятного состояния миокарда, и прогностический маркер ухудшения ситуации, даже в тех случаях, когда он не сопровождается увеличением уровня апоптоза. С этой точки зрения, неэффективным является применение липосомальпой формы УЕОР в низкой концентрации, которое сопровождается повышенным уровнем БСЖК в течение всего периода наблюдения (рисунок 2). На последних сроках наблюдения также увеличивается содержание клеток в состоянии апоптоза (таблица 4), а по результатам гистологического анализа наблюдаются признаки ишемии (рисунок 3), что, в общем, говорит о неблагоприятном течении постипфарктной репарации миокарда.

нг/мп

3 сутки 7 сутки 14 сутки

* - р<0,05 по сравнению с У5 ** - р<0,05 по сравнению с У+Л25

Рисунок 2 - Содержание белка, связывающего жирные кислоты, в сыворотке крови крыс, нг/мл

Введение свободного УЕвР в концентрации 25 нг/мл оказывает повреждающее действие на миокард, о чем свидетельствует повышение уровней апоп-тоза и БСЖК на раннем этапе наблюдения. При этом на отдаленном этапе наблюдения, так же как и в контрольной группе, наблюдалось повышение уровня БСЖК, что говорит также о неэффективности противоишемичсского действия ростового фактора в данной концентрации.

Таблица 4 - Индекс апоптоза кардиомиоцитов сердца крысы (отношение числа Ти^ЕЬ-позитивных ядер к общему количеству ядер)

Группа Сроки наблюдения

3-й сутки 7-е сутки 14-е сутки

Контроль 0,00 0,35±0,11** 0,27±0,10**

У5 0,00 0,04±0,02* 0,06±0,04*

У+Л5 0,02±0,01 0,00* 0,15±0,06

У25 0,24±0,11 * 0,29±0,12 0,11 ±0,85

У+Л25 0,12±0,06 0,00* 0,05±0,04*

Ингактные животные 0,00

Примечания: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой;

** - р<0,05 по сравнению с 3-ми сутками наблюдения

Наиболее благоприятные результаты были получены в результате применения свободного УЕвР в концентрации 5 нг/мл и липосомальной формы УЕОР в высокой концентрации. На протяжении всего периода наблюдения отмечалось умеренное повышение уровня апоптоза и содержания БСЖК. При этом в случае липосомальной формы наблюдалось выраженное снижение уровня этих показателей по сравнению со свободной формой ростового фактора в аналогичной концентрации. Таким образом, применение липосомальной формы доставки уменьшает проявление токсичности включенного в ее состав препарата.

А —контроль; Г-У25;

Б - Д - У+Л25

В - У+Л5;

Рисунок 3 - Гистологическая картина миокарда па 3-й сутки после повторной операции в пограничной зоне инфаркта. Окраска гематоксилин-эозином, ув. х200

В отдаленный период наблюдения отмечалось снижение показателей апоптоза и БСЖК в группах с введением У5 и У+Л25 по сравнению с остальными экспериментальными группами и группой контроля. Также в них не отмечалось признаков ишемии. Таким образом, по итогам 14 суток наблюдения, в

этих группах наблюдается более успешное течение процессов репарации миокарда после инфаркта.

Содержание некоторых про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс. При анализе уровня про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови было отмечено, что введение низких концентраций VEGF сопровождается повышенной секрецией TGF-ß по сравнению с группой контроля. Введение V25 приводит к ингибированию TGF-ß на ранних этапах наблюдения. Использование липосомалыюй формы VEGF в той же концентрации обеспечивает поступление в миокард VEGF в течение более длительного промежутка времени, и, таким образом, приводит к более длительному ингибирующему эффекту в отношении TGF-ß.

Не было получено данных о влиянии введения VEGF на содержание в сыворотке крови интсрлейкина-lß и трансформирующего фактора роста-lß.

Заключение. Полученные в ходе данного исследования результаты демонстрируют, что интрамиокардиальное введение липосом, содержащих VEGF в концентрации 25 нг/мл, позволяет создать депо препарата в миокарде, обеспечивающее пролонгированную доставку VEGF. Показано, что липосомы, содержащие VEGF в концентрации 25 нг/мл, обладает ярко выраженным аи-гиогенным действием, а также уменьшает ишемическое повреждение миокарда и выраженность апоптоза. Доказан дозозависимый эффект VEGF в составе липосом; показано, что большей эффективностью обладают липосомы, содержащие VEGF в концентрации 25 нг/мл. Свободная форма VEGF в концентрации 25 иг/мл не обладает эффективностью в отношении стимуляции ангиогс-иеза, однако оказывает повреждающее действие па миокард. Применение липосомалыюй формы VEGF той же концентрации позволяет значительно увеличить его эффективность и при этом уменьшить токсическое действие. Полученные результаты позволили сформулировать гипотезу о механизме действия липосомалыюй формы VEGF па миокард в условиях экспериментального инфаркта (рисунок 4).

Рисунок 4 - Схема механизма кардиопротективного действия липосо-мальной формы УЕвР на постинфарктный миокард

ВЫВОДЫ

1. «Пустые» липосомы активно поглощаются клетками; при увеличении содержания УЕвР липосомы в большей степени агрегируются на клеточной мембране. Как «пустые», так и липосомы с УЕйР оказывают цитопротектив-ный эффект в отношении клеток, находящихся в неблагоприятных условиях культивирования.

2. Интрамиокардиальная инъекция является оптимальным путем доставки липосом к миокарду, при этом накопление липосом в тканях миокарда максимально, а в отдаленных органах минимально. При интрамиокардиальном введении липосом, содержащих УЕвР в концентрации 25 иг/мл, создастся депо в межклеточном пространстве миокарда, обеспечивая пролонгированный выход ростового фактора в окружающие ткани.

3. Липосомы являются эффективным средством доставки УЕйР к миокарду и обеспечивают повышение уровня УЕйР в миокарде на срок до 7 суток после инъекции, что приводит к стимулированию ангиогенеза и увеличению плотности сосудистой сети в постинфарктном миокарде.

4. Интрамиокардиалыюе введение липосом, содержащих УЕвР в концентрации 25 нг/мл, уменьшает степень повреждения миокарда после инфаркта.

Это выражается в увеличении количества жизнеспособных кардиомиоцитов, снижении показателей ишемии миокарда (уровень БСЖК, полнокровие сосудов); уменьшении отека ткани.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Депонирование липосом, содержащих VEGF, после интрамиокарди-ального и системного введения при экспериментальном инфаркте миокарда / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, Р. А. Мухамадияров и др. // Вестник Кемеровского государственного университета. - 2013. - № 1 (53). - С. 8-12 (0,42 п. л.).

2. Великанова, Е. А. Влияние сосудисто-эндотелиального ростового фактора в свободной и липосомальной форме на ангиогенез в условиях экспериментального инфаркта миокарда / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, Р. А. Мухамадияров // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 10 (3). - С. 482-486 (0,42 п. л.).

Публикации в других журналах

3. Evaluation of intracellular distribution of liposomes using the methods of fluorescence and confocal microscopy / R. A. Mukhamadiyrov, E. A. Velikanova, I. G. Khaliulin ct al. // Journal of International Scientific Publications: Materials, Methods ¿¿.Technologies. - 2013. -№ 7 (2). - P. 234-244 (0,83 п. л.).

4. Methodological approaches to evaluation of intracellular distribution of lipid and aqueous phase of liposomes using fluorescent probes / R. A. Mukhamadiyarov, I. G. Khaliulin, E. A. Velikanova et al. // Journal of International Scientific Publications: Materials, Methods and Technologies. - 2014. - Vol. 8. - P. 218-227 (0,83 п. л.).

Материалы конференций

5. Тихонова, А. С. Внутриклеточная доставка гидрофильных и гидрофобных веществ в составе липосом / А. С. Тихонова, М. А. Паутова, Е. А. Великанова// «Студент и научно-технический прогресс»: материалы 51-й международной научной студенческой конференции. - Кемерово, 2014. - С. 211 (0,08 п. л.).

6. Цитопротективный эффект везикулярных наноструктур / Е. А. Велика-нова, В. Г. Матвеева, Л. В. Антонова и др. // «Кузбасс: образование, наука, инновации»: сборник трудов инновационного конвента. - Кемерово, 2011. - Т. 2. -С. 26-28 (0,25 п. л.).

7. Мухамадияров, Р. А. Визуализация липосом с использованием люминесцентной метки для изучения их распределения во внутренних органах / Р. А. Мухамадияров, Е. А. Великанова, М. А. Круч // «Современные наукоемкие технологии»: материалы конференции. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012. - № 4. - С. 29-30 (0,16 п. л.).

8. Применение липосомальной формы VEGF для регуляции ангиогенеза при экспериментальном инфаркте миокарда крыс / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, Р. А. Мухамадияров и др. // «Кузбасс: образование, наука, инновации»: сборник тезисов инновационного конвента. - Кемерово, 2013. - С. 247 (0,08 п. л.).

9. Эффективность липосомальной формы доставки VEGF при инфаркте миокарда / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, Р. А. Мухамадияров и др. // «Проблемы медицины и биологии»: материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов. - Кемерово, 2014. -С. 199 (0,08 п. л.).

10. Эффективность применения липосомальной формы VEGF в терапии экспериментального инфаркта миокарда / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, Р. А. Мухамадияров и др. // «Регенеративная медицина - медицина будущего»: материалы всероссийской конференции молодых ученых. - Томск, 2014. -С. 6-10(0,33 п. л.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

VEGF - сосудисто-эндотелиальный ростовой фактор

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

TUNEL - метод TdT-опосредованной метки dUTP-конца разрыва цепи ДНК

БСЖК - белок, связывающий жирные кислоты

TGF-P - трансформирующий ростовой фактор

TNF-a - фактор некроза опухоли

IL-ip- интерлейкин-ip

Подписано в печать 15.12.2014. Тираж 120 экз. Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60х84'/16. Усл.-печ. л. 1,2, Заказ № 370.

Адрес издательства и типографии «АИ Кузбассвузиздат»: 650099, г. Кемерово, пр. Советский, 60Б. Тел. 8 (3842) 58-29-34, т/факс 36-83-77. E-mail: 58293469@mail.ru, vuzizdat@gmail.com

'5- 2955

2014270798