Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетические особенности воспаления у мышей при птичьем гриппе и его профилактике окисленным декстраном

На правах рукописи

ШАРКОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОСПАЛЕНИЯ У МЫШЕЙ ПРИ ПТИЧЬЕМ ГРИППЕ И ЕГО ПРОФИЛАКТИКЕ ОКИСЛЕННЫМ ДЕКСТРАНОМ

14.00.16-патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК - 2008

□03450370

003450370

Работа выполнена в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск), Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный университет», Федеральном государственном учреждении науки Государственном научном центре вирусологии и биохимии «Вектор» (Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич

доктор биологических наук,

доцент Шестопалова Лидия Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Макарова Ольга Петровна

доктор медицинских наук,

профессор Бгатова Наталья Петровна

Ведущая организация: ГУ НИИ Физиологии СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится " " ¡AX¿d!j>hsJ( 2008 года в УХ часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Гимакова, 2, Тел / факс 8(383) 3336456

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НЦКЭМ СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан " Q-l/^PbJL^Íf^vJi 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Пальчикова Н. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусы гриппа А относят к одним из самых значимых для человечества возбудителей инфекционных болезней. Появление высокопатогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей гриппа птиц человеку, очевидно, сопряжены с угрозой новой пандемии и необходимостью поиска новых средств профилактики и лечения заболевания (Shorfridge KI.etal., 2000).

В 2005 году в Новосибирской области Российской Федерации был зафиксирован падеж домашней птицы, который был вызван вирусом гриппа пгац субтипа H5N1 (Ониценко ГГ. и др., 2005). Выделенные штаммы, в частности изолят A/GooseKiasnoozefskoye/627/05, являются вьюокопагогенными для млекопитающих и обладают устойчивостью к действию основных препаратов, применяемых при лечении и профилактике гриппа (Evseenko VA. et al., 2007; latsyshina S.B., Shestopalov AM et al, 2008). Поскольку это были первые случаи выявления вирусов высокопагогенного гриппа ппщ су&гипа H5N1 на территории России, актуальным явилось получение данных о федагипических особенностях выделенных вирусов. В связи с реальной опасностью распространения вируса гриппа ппщ в человеческой популяции есть острая необходимость выявления механизмов патогенеза и морфогенеза инфекционного процесса для разработки средств его профилактики и лечения.

Для разработки новых подходов в борьбе с вирусными инфекциями необходимо отработать модели гриппа птиц cy6nmaH5Nl на экспериментальных животных (млекопитающих), изучить структуру вирионов и особенности их формирования в клетках млекопитающих. Поскольку высокая изменчивость, свойственная вирусам гриппа, приводит к появлению штаммов, резистентных к основным противовирусным препаратам (Cheung CL. et aL, 2006; Метаю N. et aL, 2006), актуальным явилось исследование препаратов, не оказывающих прямого действия на вирус, что исключает возможность возникновения резистшгаости. Такими препаратами являются иммуномодуляторы микробного происхождения, в частности декст-раны (Шкурупий В А, 2007), в связи с чем для данной работы был выбран химически окисленный декстран.

Цель исследования. Изучил, особенности проявления воспалительного процесса в легких и печени у мышей при гпичьем гриппе, вызываемом высокшатогенным штаммом гриппа ппщ субтипа H5N1 A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05, и его профилактике окисленным декстраном

Задачи исследования:

L Исследовать пагогенность вируса гриппа птиц субтипа H5N1 A/Goose/Krasnoozersko^/627/05 (далее ВГТ1) для мышей.

2. Исследовать эффективность окисленного декстрана при профилактике экспериментальной вирусной инфекции, вызываемой ВГТТу мышей.

3. Изучить особенности топологии ВГП и субклеточных изменений в легких и печени инфицированных мышей.

4. Изучил, морфологические изменения в легких и печени инфицированных ВГП мышей.

5. Изучшь роль провоспалигелшых цигокинов в патогенезе инфекционного процесса, вызываемого ВГП.

6. Изучить патогенетические особенности проявления гриппа птиц в легких экспериментально зараженных мышей при профилактическом введении им окисленного декстрана.

Научная новизна результатов исследования. В ходе эксперимента впервые получены данные о патогенетических особенностях воспаления при гриппе птиц, вызываемом ВГП, выделенным на территории Российской Федерации, у мышей. Подробно изучены особенности проявления инфекционного процесса и его осложнений в легких и печени мышей на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлены особенности морфотипов вирионов A/Goose/ Krasnoozerskoye/627/05, его топологии, а также его тропность к различным клеткам легких и печени. Получены данные об уровне экспрессии провоспалтеяьных цигокинов и факторов апопгоза в тканях легких и печени мышей, инфицированных ВГП.

Предложено средство (окисленный декстран) профилактики гриппа гггиц у млекопитающих и испытано в эксперименте на мышах. Показана его высокая эффективность.

Научно-практическая значимость работы. Исследованы патогенетические особенности проявлений у мышей птичьего гриппа, вызываемого новым штаммом вируса гриппа субга-naHSNl A/Goose/Krasnoozerdcoye/627/05, потенциально опасным для человека Предложено средство профилактики основных осложнений гпичьего гриппа у мышей, которое может быть перспективным для разработки средств профилактики гпичьего гриппа у человека в связи с неспецифичностью его эффекте®.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа тиц субгипа H5N1 A/Goose/fvrasnoozerskoye/627/05 обладает высокой пагогенноегью для мышей, обусловленной репликацией вируса в клетках легких и печени, развшием генерализованного инфекционного процесса с высокой легальностью.

2. Вирус гриппа шиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 обладает высокой тропностью к клеткам альвеолярного эпителия, макрофагам легких и печени, гепатоцигам, синусоидальным эццогелиоцигам печени, сопряженной с развитием тромбошческих осложнений, геморрагии, ингерегациального воспаления в легких, отечного синдрома, дистрофических и некротических изменений в печени и легких и раннего фиброза в них.

3. Окисленный декстран оказывает выраженное профилактическое действие при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей вирусом гриппа гпиц субтипа H5N1 A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05, которое проявляется снижением легальности и увеличением продолжительности жизни животных, зависит от сроков и дозы введения препарата и обусловлено значительным уменьшением тяжести основных патологических проявлений воспаления.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Третьей европейской конференции по гриппу, проход ившей 14-17 сентября 2008 года в Португалии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 5 из которых в журналах, включенных в список периодических научных изданий, рекомендованных ВАК

РФ дня опубликования материалов кандидатских и докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация излажена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с списанием материала и методов исследования, главы описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 62 рисунка, 15 таблиц. Список дотируемой литературы включает 32 работы отечественных и 153 - иностранных авторов. Материалы, излаженные в диссертации, получены, обработаны и цроана-лизированы лично автором. Работа поддержана грантом ФЦП, Государственный контракт от 28 сентября 2007 гсда№ 02.512.112193

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 240 беспородных белых мышах-самцах в возрасте 2 месяцев (питомник лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадюра). Беспородные белые мыши были выбраны с целью исключения влияния гегошпических особенностей линейных живслных на патологические проявления воспаления. Живогаых содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде.

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа ппщ субшпа Н5М А/Сооэе/1йаапоагшкоуе/627Ю5 (ВГП), вьщеленый из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа тиц в Новосибирской облает в 2005 году. Такой выбор основан на результатах, предварительных исследований по пяти штаммам вирусов субгипа Н5Ш, выделенным на территории РФ, результаты которых показали, что данный изоляг обладал высокой гшогенностыо и эффективно реплицировался во воех жследованных органах. Все вирусологические исследования и содержание животных были выполнены на базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автор выражает благодарность сотрудникам отдела зоонооных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» за проведение работ, связанных с заражением мышей и получением экспериментального материала, требующих высокого уровня биобезопасносш.

Исследование проводили в двух экспериментах. Первый эксперимент был направлен на изучение паюгенносга ВГП для мышей. Для этого было сформировано две экспериментальные группы. 30 мышам контрольной группы вводили 50 мкл стерильного фосфатного буфера рН=7Д. Вторая труппа состояла из 60 мышей, которых заражали ВГП. По 20 животных в каждой группе оставляли для определения средней продолжительности жизни (СТОК) и летальности. Взяше материала осуществляли через 1,3,6и 10 сутки после инфицирования от 10 животных на каждом сроке. Мышей контрольной группы выводили из эксперимента на 10 сутки методом дислокации позвонков в шейном отделе под эфирным наркозом. От них также получали образцы легких и печени. Учитывая, что в популяции млекопитающих и у человека основной путь передачи вируса гриппа А - воздушно-капельный, заражение мышей проводили ишраназально дозой равной 10 МИД»

Выбор легких в качестве объекта исследования обусловлен тем, что легкие являются первым и основным органом-мишенью для вирусов гриппа, в том числе су&пша Н5№ (Кшкеп N. а], 2003). Креме того, функциональное состояние органов дыхательной системы определяет степень оксигенапии всех тканей организма и, следовательно, жизнеспособность организма. Выбор печени как объекта исследования обусловлен тем, что она является центральным органом детоксикации, содержит наиболее крупный компарменг системы моно-

нуклеарных фагоцитов (СМФ), являясь барьером при распространении вирусов в организме, участвует в метаболизме многих гормонов. Кроме того, печень, являясь основным метаболическим центром у млекопитающих, определяет уровень трофики организма в целом.

Во втором эксперименте исследовали эффективность профилактики ВГТТ у мышей при применении окисленного дексграна (ОД) с молекулярной массой бОкДа (Шкурупий ВА, 2007). Выбор этого вещества обусловлен тем, что при гриппе птиц субтипа H5N1, происходит угнетение неспецифического противовирусного ингерферонового ответа с истощением лимфоидной ткани в центральных и периферических органах иммуногенеза (Pei F. et al, 2005). Помимо этого наблюдали успешную репликацию вирусов в макрофагах с задержкой их апоптша (Peiris М, 2006). ОД обладающие иммуномодулирующими свойствами, воздействуют на факторы естественной резистешносга - клетки моноцигарномакрофагальной системы, вызывая повышение их функциональней активности (Шкурупий В А.,2007).

Для второго эксперимента было сформировано 4 группы животных. Первая группа -контрольная - 20 ишактных мышей. Вторая группа (H5N1) - 60 мышей инфицированных без введения ОД Третья группа (Н5Ы1-ЮД-500) - 60 мышей, которых инфицировали после профилактического введения ОД в дозе 500 мгЛсг. Четвертая группа (Н51М1-ЮД-1000) - 60 мышей, которых инфицировали после профилактического введения ОД в дозе 1000 ж/кг. Доза заражения и сроки получения экспериментального материала соответствовали условиям первого эксперимента.

В каждом эксперименте определяли летальность и СПЖ инфицированных животных. Выжившими считали мышей, проживших 14 суток. Также регистрировали внешние проявления инфекции и макроскопические изменения в исследуемых органах. Для определения уровня сывороточных цигокигов: TNF-a, IFN-a, 1Е№у применяли метод иммунофермент-ного анализа (ИФА): образцы сыворотки объемом 200мкл инкубировали м антителами 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, промывали буфером и дистиллированной водой, инкубировали со вторичными антителами также 1 час при +37°С. Активность связанной перокегдазы измеряли с использованием автоматического фотометра для микропланшетов.

Объектом морфологических исследований служили образцы тканей легких и печени мышей. Для свегооптического исследования образцы фиксировали в 10% растворе формалина, далее обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафиновую заливочную смесь «HISTAMIX» (Россия). Срезы толщиной 5 мкм готовили на ротационном микротоме НМ 340Е ("Carl Zeiss", Германия). Депарафинированные срезы образцов окрашивали по стандартным методикам гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону (Пирс Э, 1962) и заключали в канадский бальзам. От каждого объекта изготавливали по 5-6 микроскопических срезов. Полученные препараты исследовали с помощью микроскопа Axioskop 40 и документировали с использованием фотокамеры AxioCam MRc ("Carl Zeiss", Германия) и программного обеспечения AxioVision (tel. 4.6).

Для иммуногисгохимического (ИГХ) иследования проводили соответствующую подготовку парафиновых срезов, включающую: депарафинизацию, рещцрагацию, демаскировку выявляемых антигенов в микроволновой печи с мощностью 700W, блокирование эндогенной пероксидазы, инкубирование с блокирующей сывороткой, инкубирование со специфическими моноклональными ашителами к кластерам CD4+, CD8+, CD68+ (Novocastra). Время инкубации составило 1 час при комнатной температуре с последующим инкубирова-

нием со сгретавидиновым пероксидазным комплексом, ДАБчубсграгом и дополнительным докрашиванием препаратов гематоксилином. Для визуализации была применена система детекции NovoLink (Novocastra). По приведенной методике оценивали также механизмы апоптоза - с маркерами caspasa-3, TRAIL (TNF-relaied apcptosds-induring ligand) (Novocastra). Для изучения роли про- и противовоспалительных цикжинов использовали моноклональные ангагела к IL6, TNF-a. (Novocastra).

Для электронно-микроскопического исследования кусочки ткани аксло 1мкм3 фиксировали в 2$% растворе глутарового альдепда на фосфатном буфере рН 7,4 в течение 3,5-4 часов при 4°С, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в фосфатном буфере рН 7,4. Обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, смеси ацетона и абсолютного спирта, проводку завфшали в абсолютном ацетоне. Заключали в аралдит-эпоновую смесь (1:6). Тонкие и полугонкие срезы получали на упьтрамикрогоме LKB-8800. Улыраггонкие срезы толщиной 50-60 нм контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилаце-тата и водным раствором цитрата свинца в парах щелочи (по Рейнольдсу). Срезы исследовали и фотографировали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100CX ("Japan Electron", Япония) при ускоряющем напряжении 80кВ.

Морфомеггрический анализ проводили на светоошическом уровне с помощью закрытой тестовой системы из 100 точек площадью 1,68x10s мкм2 для легких и 4Дх104мкмг для печени (Автандилов ГГ, 1990). В легких учитывали объемную плотность (Vv) и клеточный состав, инфильтратов, объемную (Vv) и численную (Nai) плотность сосудов микроциркуляторного русла, долю тромбированных сосудов (%), объемную плошость (Vv) кровоизлияний, воспалительных инфильтратов, фиброзной ткани. В печени подсчитывали объемные платности (Vv) дистрофических и некротических изменений в паренхиме органа, объемную плотность (Vv) и клеточный состав инфильтратов, а также численную плотность (Nai) двуядерных ге-пагоцитов как отражение репаративной активности в паренхиме печени. Вычисление средних величин проводили методами вариационной статистики. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин оценивали по критерию Сгьюдегпа, достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИСС.ПКГТОВ АНИЙ И ИХ ОКСУЖ ПЕНИЕ 1. Средняя продолжительность жизни и легальность мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц, и влияние на них окисленного декстрана

После заражения белых беспородных мышей ВГП наблюдали высокую летальность. Первые внешние признаки заболевания у животных появлялись на 3 сутки после инфицирования. Огмечали значительное снижение активности, апатию, снижение потребления пищи, слизисго-гнойные выделения из носа. Живсгшые подолгу лежали без движения, не реагируя на внешние раздражители. С 6 суток наблюдали появление признаков острей дыхательной недостаточности, церебральных нарушений: потери координации движений, парезов. Гибель мышей наступала на 7-10 сутки. СПЖ инфицированных мышей составила 9*37 суток посде заражения (табл. 1). Полученные данные свидетельствуют, что ВГП, использованный в данной работе является высокопатогенным для мышей и вызывает у них заболевание с высокой частотой летальных исходов. Применение препарата в дозе 500мг/кг приводило к снижению легальности на 20%. В экспериментальной группе, в копрой ОД вводили в дозе ЮООмгУкг,

наблюдай увеличение СПЖ на 24,2% и уменьшение легальности на 50% по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе мышей, не получавших препарат (табл. 2).

Кроме того, наблюдали ошичия в проявлении внешних признаков инфекции у экспериментальных животных разных групп. У мышей, получавших ОД отмечали появление признаков заболевания на ранних сроках после инфицирования (1-3 сутки), однако затем многое живогные демонстрировали значительное улучшение состояния, что, видимо, отчасти, сопряжено стройностью ОД к вакуолярному аппарату макрофагов, гепатоцишв, клеток эндотелия синусовдов печени и их пролонгированносшю в легких и печени до 7 суток (Шкуру-пий В.А., 2007). Исходя из приведенных данных, можно сделать вывод о том, что ОД оказывает црофшхакгаческое действие при экспериментальном инфицировании мышей ВГП.

Таблица!

Результаты исследования патогенное™ ВГП для мышей (М ± т)

Параметры Летальность по супом (количество животных) СПЖ Летальность, %

7 8 9 10 11 12 13

Эксперименг№1 0 4 2 1 0 1 0 9,5 70

Экспфимент№2 1 3 1 2 0 0 1 9,5 70

Экшерименг№3 3 3 2 0 1 0 0 9Д 80

Итоговое значение 4 10 5 3 1 1 1 937±0,13 7333 ± 033

Примечание: в таблице СПЖ - средняя продолжительность жизни инфицированных животных. Исследование проведено в трех независимых экспериментах.

Таблица2

Результаты исследования профилактической эффективности препарата ОД при экспериментальном инфицировании мышей ВГП (М ± т)__

Экспериментальная группа Доза препарата СПЖ Легальность, %

Н5Ш — 733±5,8

1Ш1+ОД-500 500мг/кг 10,7 ±03 533 ±5,8°

Н5Ы1+ОД-ЮОО ЮООмгУкг 12,4 ±03м 233 ±5,8™

Примечание: в таблице СПЖ - средняя продолжительность жизни инфицированных животных; Н5Ы1+ОД-500 и Н5Ы1-ЮД-1000 обозначены группы животных, которым перед инфицированием вводили ОД в дозах 500мг/кг и 1000мг/кг, соответственно; Н5Ы1 - инфицированные животные без грофилакшческош введения ОД; буквой «с» отмечены величины достоверно отличающихся параметров групп с профилактическим введением ОД по сравнению с величинами аналогичных параметре» в группе Н5Ы1; буквой <«Ь> отмечены величины достоверно отличающихся параметров группы Н5Ы1+ОД-ЮОО по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н5Ы1+ОД-500. Данные о стандартных ошибках получены на основании сопоставления результатов трех независимых экспериментов. ОД - окисленный декстран.

2. Исследование щпокинового профиля в сыворотке крови инфицированных мышей В исследовании были изучены профили цигокинов - ЮТ-а, эндогенных интерферонов №N-0, ЖМ-у. Поскольку применение ОД в дозе 1000мг/кг приводило к более выраженному профилактическому эффекту по сравнению с дозой 500 мг/кг, именно эта группа была вы-

брата доя изучения эффекте« профилактического введения ОД на уровень цигокинов в сыворотке крови животных.

Уровень 1РЫ-а у мышей, инфицированных ВГП без профилактического введения ОД был повышен на 1 сутки после инфицирования со снижением к 3 суткам в 2 раза На 6 сутки наблюдали повторное повышение уровня ВРМ-а, который на 10 суши не отличался от величины аналогичного параметра в контрольной группе. Профилактическое введение ОД приводило к значительному повышению уровня ¡РЫ-а в крови на всех сроках наблюдения. Уже на 1 сутки после заражения он составил 25пг/мл, превышая в 1,7 раза аналогичный параметр у мышей, не получавших ОД. С1 по 10 сутки отмечали равномерное снижение величины данного параметра на 40%. Значительное снижение уровня Ш№а в крови мышей, не получавших ОД , на 3 сутки может бьпь обусловлено ТОТ-шздуцированным апопшзом лимфоцитов. Уровень Ш№у у мышей, которым вводили ОД был значительно выше величин аналогичного параметра в группе мышей, не получавших препарат. Эта отличия были наиболее значимыми (в 12 раз) наб сутки после заражения.

Уровень ТМчх у инфицированных мышей, не получавших препарат был достоверно выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в кешроле и у мышей, которым вводили ОД на всех сроках наблюдения. При этом отмечали его повышение с 1 по 3 сутки послезараженияв 1,65 раза с последующим снижением на 24%. У мышей, получавших ОД уровень ЮТ-а был повышен только на 1 сутки после заражения в 1,1 раза по сравнению с контролем. Затем наблюдали его постепенное снижение к 10 суткам на 34%.

3. Особенности развития инфекционного процессау инфицированных мышей 3.1. Топология вируса в легких и печени мышей

При исследовании в элекгршном микроскопе легких вирус был выявлен в альвеолярном эпителии, эндотелии легочных капилляров и просвете альвеол уже через сутки после заражения. Встречались вирионы свальной и цилиндрической формы, а также незрелые вирусные частицы. Наличие вироплазмы в ядрах и цигоплазме клеток, а также отпочковывающиеся вирионы свидетельствуют о репродукции вируса в легких уже на начальных стадиях инфекционного процесса, а также о тропносщ вируса к эпителию нижних отделов дыхательных путей. В области гранулярной эвдоплазматической сели (гЭПС) и цнгоплазмаггиче-ских свободных полисом альвеалоцигов ошечали осмиофильные скопления капевдных белков. К 6 суткам после инфицирования наблюдали из клеток зрелых втфионов, способных проникал, в новые клепси, вызывая вторичную вирусемшо. На 10 суп® вирус все еще продолжал персистировать в организме мышей. Большое количество вирионов наблюдали в очагах некроза.

В печени мышей уже через 1 сутки после заражение в просвете центральных вен и сину-соидов отмечали значительное количество вирионов, ассоциированных с клеточным детритом и фибрином. На клеточной мембране печеночных макрофатов наблюд али формирование вирионов. Гепагоцшы также имели признаки репродукции вируса' наличие осмиофиль-ного материала в области тЭПС, формирующиеся полные и неполные нуклеокапевды. На более поздних сроках в гепагоцитах формировались поликапсидные комплексы.

Таким образом, исследование тканевых структур легких и печени мышей, зараженных ВГП, выявило наличие большого количества вируса в тканевых структурах легких и печени

на всех сроках эксперимента и его способность эффективно реплицироваться в тканях белых беспородных мышей, использованных для моделирования инфекции гриппа гпиц субпта Н5Ы1 у млекопитающих.

3.2. Структурные изменения в легких и печати инфиц ированных мышей

При макроскопическом исследовании легких мышей, инфицированных ВГП, начиная с первых суток, наблюдали увеличение объема легких за счет отека, мелкошчечные кровоизлияния, на срезе легкого в просвете некоторых сосудов были ввдны тромбсггаческие массы.

При микроскопическом исследовании трахеи и бронхов наблюдали стек подслизисгой основы, умеренное полнокровие сосудов с мелкими даапедезными кровоизлияниями. Отсутствие выраженных изменений в тканях верхних дыхательных путей позволяет предположить, что ВГП имеет тропность к альвеолярному эпителию с преимущественным поражением нижних респираторных отделов легких.

При гистологическом исследовании образцов легких мышей обнаружены парешческое расширение сосудов, ингерстициальный и альвеолярный стек легких, множественные кровоизлияния, многочисленные воспалительные инфильтраты в интерстиции, прогрессирующий перибронхиальный и периваскулярный фиброз. Кроме того, начиная с 3 суток после инфицирования, в периферичских участках срезов легкого отмечали участки острой эмфиземы легких, что, вероятно, является компенсаторной реакцией в ответ на функциональную недостаточность органа, возникающую вследствие альвеолярного отека ткани и большого количества воспалительных инфильтратов. В бронхах и альвеолах некоторые клетки были некрогизированы. Эта данные подтверждают тропность ВГП к эпителиальной выстилке нижних отделов респираторного тракта.

При морфометрическом анализе образцов легких регистрировали увеличение численной и объемной платности сосудов во все сроки наблюдения и прогрессирование дистрофических изменений в виде фибриновдных изменений в стенке сосудов с признаками гиперкоагуляции. Численная доля тромбированных сосудов на 3 сутки была в 2 раза выше по сравнению с величиной аналогичного параметра в 1 сутки после заражения и в 7 раз выше по сравнению с величиной аналогичного параметра у мышей контрольной группы. Объемная плотность кровоизлияний в ингерсшций легкого к 10 супом была в 4 раза большей, чем на первые сутки (табл. 3). Это свидетельствует о повреждении стенки сосудов, приводящем к повышению их проницаемости.

Объемная плотность инфильтратов, состоящих преимущественно из макрофагов и лимфоцитов, в интерстиции легких была высокой уже на первые сутки после инфицирования с последующим увеличением величины данного параметра к 10 суткам на47,7% (табл. 4). При ИГХ-исследовании клеточного состава инфильтратов отмечали преобладание (выше 80%) С068-положигельных клеток - макрофагов. Также наблюдали многоядерные клетки с положительной реакцией с антителом к СЕ)68. Численная плотность таких клеток увеличилась с 1 по 6 сутки после инфицирования в 1,57 раза. В период с 6 по 10 сутки наблюдали уменьшение величины д анного параметра (табл. 4). Это может свидетельствовать о существовании механизмов элиминации вируса у выживших мышей, возможно, за счет гибели содержащих его многоядерных клеток. Поскольку многоядерные клетки экспрессировали молекулярный маркер, характерный дан клеток макрофагального ряда, можно предположить, что они про-

изошли путем слияния макрофагов. Клетки, составляющие от 15% до 18% от общего числа клеток инфильтратов у инфицированных мышей, были представлены преимущественно С08+-лимфоинтами (супреосоры/ципшжсические лимфоциты), в то время как у животных контрольной труппы единичные лимфоциты, встречающиеся в альвеолярных перегородках, имели положительное окрашивание с СМ+ (хелперы).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в патогенезе изменений в легком при вирусной инфекции, вызванной ВЩ преобладают деструктивные изменения. Изначально под воздействием вируса в тканях органа возникают нарушения кровообращения, проявляющиеся, прежде всего, тромбозом и повышенной проницаемостью стенок кровеносных сосудов. В результате развивается отек, сочетающийся с кровоизлияниями и образованием гиалиновых мембран в альвеолах. Вследствие этого, происходит изменение оксиге-нации и трофики, развивается деструкция тканевых структур, которая приводит к воэшкно-вению дисфункции органа и развигаю острого респираторного дистресс-синдрома

При макроскопическом исследовании печени мышей, инфицированных ВГП, наблюдали ее увеличение уже на 3 сутки после инфицирования. При светоошическом исследовании в паренхиме печени инфицированных животных в первые шесть суток обнаружены парети-ческое расширение и полнокровие крупных вен и синусовдов с явлениями стаза и гемолиза эритроцитов, фибриноидные изменения в сосудистой стенке. С первых суток после заражения отмечали дистрофические изменения гепагоципов: гидропическая дистрофия с переходом в баллонную. Зоны некроза наблюдали преимущественно центролобулярно. Объемная плотность деструктивных изменений в печени на б сутки после инфицирования была максимальной и составила 93,78%, что свидетельствует о субготальном повреждении гепагоци-тов и развитии печеночной недостаточности. К10 суткам от начала эксперимента величина данного показателя уменьшилась на 17,6%, оставаясь на высоком уровне (табл. 6).

Таблица3

Параметры Срок после зараже- Экспериментальные группы

ния, сутки Контроль (интактные) Н5Ы1

Объемная плотность сосудов (Уу),% 1 — 8,74±0ДГ

3 — 8,80±0,15а

6 — 8,68±0,1(?

10 6,64 ±0Д4 8,53 ±0,16®

Численная плот- 1 — 17,54 ±038а

ность 3 — 20,42±032*

сосудов (Кш) в 6 — 1938 ±031*

1,68x105 мкм2 10 14,84±0,14 19,20*0,18*

Численная доля тромбированных сосудов, % 1 — 10,56*0,66"

3 — 21,87 ±0,63®

6 ' — 15,97±033а

10 3,17±0Д6 15,25±0,45а

Объемная плот- 1 — 1Д0±031а

ность 3 — 3,93 ±0,23*

кровоизлияний 6 — 4,09 ± 0,31а

(Уу),% 10 0,20 ±0,13 4,41 ± 0,22*

Примечание: в таблице буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров контрольной группы, буквой «Ь» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего срока наблюдения.

Таблица4

Результаты исследования воспалительных инфильтратов в легких инфицированных мышей (Шта)__

Параметры Срок после зараже- Экспериментальные группы

ния, сутки Кон1рояь(ингак1ные) Н5Ы1

1 — 23^6±0,12а

Объемная плотность 3 — 24,86 ±0,60"

инфильтратов (Уу), % 6 — 27,22±0,73*

10 0,16±0,04 3436± 1,18*

Клеточный состав инфильтратов, %:

1 '— 83,24+3,13/ 4,85+0,88"

Макрофаги/ 3 — 81,18±2,97/ 6,^1,13*

многоядерные клетки 6 — 78,99±3,01/ 7,63±1,18а

10 78,•46+3,18/— 77,08+3,15/

4,56+0,74*

1 — 14,79±0,73а

Лимфоциты 3 — 15,56+0,61*

6 — 17,44+0,64а

10 1235+0,46 17,8510,58

1 — 1,44+0,18"

Нейтрофилы 3 — 136+0,16а

6 — 1Д7±035а

10 0,38±0,13 1,12±031а

1 — одаодб

Фибробласты 3 — 13&А20

6 — 1,56+0,16а

10 0,84±0Д1 2,13±032а

Примечание: в таблице буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся пат раметров по сравнению с величинами аналогичных параметров у мышей контрольной груп-

пы, буквой «Ь» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего срока наблюдения. Общее количество клеток в инфильтрате принято за 100%.

Таблица5

Объемная плотность фтйрозной ткани в легких мышей инфицированных мышей (М ± т)

Срок после Экспериментальные группы

заражения, сутки Контроль (шпактные) Н5№

1 — 031 ±0,15

3 — 2,6240,52*

6 — 4,60 ±0,47®

10 0,10±0,10 8,11 ±1,49*

Примечание: в таблице буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров контрольной группы, буквой «Ь» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предьдоущего срока наблюдения.

Таблицаб

Морфометрические показатели структурных изменений в печени инфицированных мышей (М±т)_

Парамефы Срок после зараже- Экспериментальные группы

ния, сутки Контроль (интакгные) Н5№

Объемная плотность деструктивных изменений (Уу),% 1 — 86,34±0,62"

3 — 90,8 ±0,48"

6 — 93,78 ±0,43*

10 1,8±0,06 773 ±0,76*

1 — 0,06±0,06

Объемная плотность 3 — 0,06± 0,04

инфильтратов (Уу), % 6 — 0,07 ±0,07

10 0,00 0,53 ±0,17*

Численная плотность 1 — ззо±оХ

лимфоцитов в сину- 3 ' — 0,84 ±0,08*

соидах (Ыш")в4Дх104 6 — 0,82 ±0,12"

мкм2 10 2,45±0,15 14^0 ±0,85*

Численная плотность двуадерных гепагоци-тов(Ш)в4,2х104мкм2 1 — 1,98*0,17"

3 — 134±0,1Г

6 — 1,03±0,15а

10 9,64 ±0,26 8,02 ±0,51*

Примечание: в таблице буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметре® по равнению с величинами аналогичных параметров контрольной группы, буквой «Ь» ошечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего срока наблюдения.

Помимо деструктивных изменений оценивали репаративную активность паренхимы печени, показателем которой служила численная плотность двуядерных гепатшигов. В группе инфицированных животных в первые сутки после заражения численная плотность двувдер-ных гепатоцитов была почти в 5 раз меньше по сравнению с величиной аналогичного параметра у мышей контрольной труппы, что свидетельствует о резком угнетении репаративных процессов. В период с 1 по 6 сутки численная плотность двуядерных гепатоцитов продолжала снижаться, однако, с 6 по 10 сутки после инфицирования регистрировали увеличение данного параметра в 8 раз (табл. 6), что свидетельствует об активации регенераторных процессов у выживших животных. Это, по-ввдмому, обусловило относительное уменьшение доли деструктивно измененных гепатоцитов к 10 суткам развития воспаления.

Воспалительные клеточные реакции были представлены инфильтрацией портальных трактов лимфоцитами и макрофагами, цепочками лимфоцитов в синусоидах. Объемная плотность инфильтратов составила менее 1% на всех ершах наблюдения. Наблюдали уменьшение величины данного параметра с 1 по 6 сутки после инфицирования в 4 раза (табл. 6), что может свидетельствовать об угнетении клеточного звена иммунитета при репликации ВГП. Выраженное увеличение численной плотности лимфоцитов в синусоидах - в 17,5 раз происходило в период с 6 по 10 сутки после заражения (табл. 6).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в патогенезе изменений в печени при вирусной инфекции, вызванной ВГП, преобладают деструктивные изменения с угнетением клеточного звена иммунного ответа и репаративных процессов.

33. Улираструктурные изменения в легких и печени инфицированных мышей.

В1 сутки после заражения ткань легкого выглядит электронноплогной. Воздухоносные пути заполнены слизистым содержимым и спущенным эпителием. В полости альвеол встречались единичные вирионы и комплексы, состоящие из полных и неполных нуклеокапси-дов, окруженных мембраной, кристалловидные структуры. Легочные капилляры кровена-полненны, их эндотелиальная стенка разрушена. Ядра эндотелиоцитов пикношзированы, в цитоплазме наблюдали вакуолярные структуры с низкой электронной плотности хлопьевидным содержимым. Повреждение эндотелия объясняет повышение проницаемости стенок сосудов, последствия которого наблюдали на светооптическом уровне в виде отеков и кровоизлияний. Отмечали появление гиалиноподобных мембран на внутренней поверхности стенок альвеол вследствие выпотевания белков плазмы в просвет альвеол, что также связано с повышением проницаемости стенки сосудов (Струков АЛ, Серов В.В., 1985). -Ядра альвеолощпот имели неправильную форму, что, вероятно, связано с интенсивной репликацией вируса, гетерохроматин образовывал глыбки. Цитоплазма содержала множество везикулярных структур, большое количество свободных и прикрепленных к профилям гЭПС полисом с признаками образования нуклеопрогевдщых тяжей, разрушенные мтоховдрии. Альвеолярные макрофаги находились в состоянии фагоцитоза, плазмолемма клеток образовывала многочисленные выросты. В ядрах и цитоплазме наблюдали много вироплазмы, что свидетельствует о том, что макрофаги также являются клетками-мишенями для ВГП.

На 3 сутки просветы альвеол были заполнены хлопьевидным содержимым, электронно-платными миелиноподобными структурами. Межльвеолярные перегородки были утолщены за счет развития стромального стека. Здесь наблюдали очаги некроза, в которых отмечали

небольшое количество вируса В легочных капиллярах чаще встречали окклюзии клеточным детритом, фибрином, тромбоцитами и гемсяизированными эритроцитами. Эндсггелиальные клеши имели признаки некроза: пикнсггазированные ядра, вакуолизированную цитоплазму, содержащую редкие разрушенные митохондрии.

Основные изменения, наблюдаемые в легком на 6 сутки, свод ились к: запустению легочных капилляров и повышению в них количества вируса; появлению очагов кровоизлияний и мультифокальных некрозов с большим количеством эозинофилов и нейгрофилов в утолщенных межальвеолярных перегородках; утолщению базальных мембран; деструкции и десквамации альвеолоиигов; заполнению альвеол клеточными остатками. К10 супам после инфицирования происходило усугубление деструкшвных изменений в ткани легкого.

На 1 сутки после заражения в центральных венах и синусоидах печени отмечали присутствие вируса, фифиновых нитей, гемолизированных эртроцигов и активно фагоцитирующих макрофагов. Нередко в синусоидах можно было наблюдать сладж эритроцитов и окклюзию тромбами, состоящими из гемолизированных эртроцигов, фибриновых скоплений, лейкоцитов. Эндотелий сосудов выглядел отечным, часто была нарушена его целостность. В цитоплазме эвдотелиальньк клеток отмечали большое количество вакуолярных структур, пиноцигозных пузырьке», встречались сетчалые структуры, которые обнаруживали и в просветах синусоидов. Цигоплазмапическая мембрана эндотелиоцитов была местами разрушена. В ядрах наблюдали гетерохроматиновые птыбки, миелиноподобные структуры, свидетельствующие о начале деструктивных изменений клеток. Подандотелиальное пространство было расширено, в нем обнаруживали вирионы. Синусоидальные макрофаги находились в состоянии активного фагоцитоза Плазмолемма клеток образовывала многочисленные отростки. В цитоплазме наблюдали большое количество фагосом, апаптотических телец, лизосо-мальных структур, скопления вироплазмы. Гепатоцшы в большинстве случаев наход ились в состоянии щдропической дистрофии, в них отмечали скопления митохондрий с плотным матриксом, окруженные профилями тЭПС, на рибосомах которой образовывались компоненты нуклеокапсидов. Наблюдали много липвдных включений, миелиноподобные структуры, многочисленные профили вакуализированной эццоплазматической сети.

На 3 сутки после инфицирования ультраструюура стромальных и паренхиматозных клеточных элементов, в целом, мало изменялась по сравнению с предыдущим сроком исследования. Наблюдали кровоизлияния в паренхиму, окклюзию сосудов в результате формирования тромбоцитарно-^зшроцитарных тромбов. К б суткам после инфицирования наблюдали ухудшение состояния паренхимы печени. Отмечали очаги некроза, обширные участки кровоизлияний. На 10 сутки после наблюдали некоторое улучшение состояния гепагоцигав, в цитоплазме которых снижалось количество вакуолей, являющихся признаком щдропической дистрофии.

Таким образом, с 1 по 6 супси после заражения в печени происходит усугубление некро-бшгачшшх процессов вследствие генерализации воспаления и активной репродукции вируса. Однако, на 10 сутки наблюдали активацию рапаративных процессов на фоне продолжающейся персисгенции вируса Анализируя полученные данные, можно заключить, что электроино-микроскопическое изучение образцов легких и печени лабораторных мышей, выбранных в качестве модели млекопитающих, зараженных ВГП, выявило выраженные изменения ультраструкгуры этих органов. Репродукция вируса в эгшелиоцигах сопро-

* вождаетея их повреждением и гибелью. При этом возбудитель высвобождается и попадает в кровоток, вследствие чего происходит ало диссеминация.

3.4. Исследование цитокинового профиля в легких и печени мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц

Были изучены профили цигокинов - TNF-a, IL-6 - в легких мышей на 1,3,6,10 сутки после инфицирования. Исследование показало положительную реакцию с TNF-a в образцах уже на первые сутки после заражения. При этом экспрессию данного цигокина определяли в альведаоцигах уже на 1 сутки, а в геткщитах - на 3 сутки после инфицирования, что может свидетельствовать о репликации вируса в данных клетках с инициацией острой фазы воспаления. Начиная с 3 суток, экспрессия обоих определяемых провоспалигельных цигокинов (IL-6, TNF-a) в тканях нарастала, проявляясь положительным окрашиванием иммунокомпе-тенгаых клеток, в большей степени - макрофагального ряда При ИГХ-исследовании в цитоплазме лимфоцитов легких и печени мышей на всех сроках наблюдения отмечали положительную реакцию с маркерами апогггоза: caspasa-3, TRAIL, что свидетельствует об активации проапошозного TNF-каскада (Gordon S., 2003). Это приводит к массовой гибели лимфоците» и, как следствие, к истощению лимфевдной ткани в органах иммуногенеза с угнетением клеточного иммунитета. С данным феноменом, по-ввдимому, связано отсутствие воспалительных инфильтратов в печени.

Из полученных результатов следует, что высокая пагогенность ВГП для мышей связана с цшотюксическими эффектами самих вирусов и с длительной гиперпродукцией провоспалигельных цигокинов в ответ на инфицирование, капрая приводит к усугублению нарушений кровообращения с явлениями гиперкоагуляции и увеличению цигогоксического потенциала СМФ с развитием необратимых изменений в органах и, как следствие, к смерти животных. Доказательством этому служат структурные изменения в органах млекопитающих, инфицированных ВГП, обнаруженные при пагоморфологических исследованиях.

Обобщая полученные данные можно вьщепть несколько ведущих патогенетических признаков, характерных для развитая вирусной инфекции:

1. Гемодинамические нарушения с многочисленными кровоизлияниями, явлениями гиперкоагуляции и тромбоза микроциркуляторного русла по типу сивдрома диссеминирован-ного внутрисосудистого свертывания, которые приводили к недостаточности кровоснабжения тканей органов.

2. Гиперплазия клеток макрофагального ряда и развитее гемофагоцигарного синдрома, связанного, возможно, с блокадой кагпазо-зависимого апогггоза макрофагов, что приводит к успешной репликации вируса с последующей диссеминацией.

3. Распространенные дистрофические и некротические процессы, обусловленные репродукцией вируса в эгапелиощпах и макрофагах, гемодинамическими нарушениями и циго-токсическими повреждениями за счет активации макрофагов, связанные с акгавной репродукцией вируса в клетках хозяина и токсическими эффектами, вызванными реакцией клеточного звена иммунитета животных на проникновение вируса Это обусловливает полиорганные нарушения, которые наблюдали в клинической картине инфекционного процесса с явлениями острой дыхательной недостаточности, церебральных нарушений, приводящих к

высокой летальности животных (73,3%).

4. Ранняя активация фибропластических процессов с развигаем фибротических осложнений в легких млекопитающих, вызывающих легочную недостаточность.

5. Цитотоксическое действие вирусов и длительная гиперпродукция провоспалигельных цитокинов приводят к усугублению нарушений кровообращения с явлениями гиперкоагуляции и увеличению циготоксического потенциала СМФ с развитием необратимых изменений в органах и, как следствие, к смерти животных.

6. Повышение уровня провоспалигельных цитокинов в тканях поражаемых органов, апотта лимфоцитов и, как следствие, угнетение клеточного звена иммунитета.

4. Особенности инфекционного процесса в легких мышей, инфицированных вирусом

гриппа ппщ после профилактическоговведения окисленного декстрана 4.1. Структурные изменения в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц после профилактического введения окисленного декстрана

При макроскопическом исследовании легких экспериментальных животных, инфицированных ВГП после профилактического введения ОД, экссудативные явления были менее выражены по сравнению с группой инфицированных животных без профилактического введения ОД. При гистшогическом исследовании образцов легких инфицированных животных всех трех экспериментальных групп обнаружены морфологические признаки острого респираторного дистресс-синдрома. При этом наибольшие повреждения наблюдали в группе животных, не получавших ОД а наименьшие - в группе с дозой препарата ЮООмгУкг.

При морфомегрическом анализе образцов легких в динамике развитая инфекционного процесса во всех трех экспериментальных группах регистрировали увеличение численной плотности сосудов микроциркугогшрного русла с достижением максимальных величин на 3 сутки после инфицирования и последующим снижением. При этом изменения в группах с профилактическим введением ОД были достоверно меньшими по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе инфицированных животных, не получавших препарат (табл. 7). Доля тромбированных сосудов также была достоверно ниже в группах с профилактическим введением ОД. Величина данного параметра в группе без прюфилакгики составила на 3 сутки после инфицтрования 19,54% (табл. 7) от общей численности сосудов и была в 5,2 раза и в 6 раз выше по сравнению с величинами аналогичных параметров у мышей экспериментальных групп, получавших ОД в дозах 500мгУкг и 1000мг/кг, соответственно. В период с 3 по 10 сутки во всех экспериментальных группах наблюдали уменьшение величины данного показателя. На 10 сутки после инфицирования доля тромбированных сосудов в ткани легкого мышей, инфицированных ВГП без профилактического введения ОД была в 11,9 раза большей по сравнению с величиной аналогичного параметра в контрольной группе. В группах, подвергавшихся профилактическому введению ОД доля тромбе® сосудов на 10 сутки после инфицирования превышала величину аналогичного показателя в контрольной группе всего в 225 и 1,8 раза (табл. 7). Снижение интенсивности процессов образования тромбошческих масс при профилактическом введении ОД может быть связано с лучшей сохранностью эвдотелиальной выстилки сосудов вследствие противовирусного влияния препарша Кроме того, способность декстринов улучшать реологические свойства крови и стимулировать репаративные процессы (Шкурупий В.А. и.др, 1989) также способствует снижению интенсивности процесса образования тромбошческих масс в сосудах микроцир-

куляторного русла.

Темпы увеличения объемной плотности кровоизлияний в сгроме легких также были различны. Наибольшие темпы роста величины данного показателя наблюдали у животных экспериментальной группы, не получавшей ОД, а наименьшие - в группе с профилактическим введением ОД в дозе 1000мг/кг (табл. 7). Возможно, уменьшение объемной плотности кровоизлияний при профилактическом введении ОД связано с противовирусным влиянием препарата (Шкурупий В А, 2007), вследствие которого уменьшается повреждение эцдотали-альной выстилки сосудов.

Таблица7

Результаты исследования состояния кровеносных сосудов в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа гпиц после профилактического введения ОД (М ± т)_

Параметры Срокпосле заражения, суши Экспериментальные группы

Контроль (итжтые) Н5М Н5М1+ОД-500 Н5М1-ЮД-1000

Объемная плотность сосудов (Уу),% 1 — 8,62±0,1Г 6,81 ±0,35° 7£6±0522а°1

3 — 8,86±0Д1а 6^»2±0Д9С 8,06 ±0^1"

6 — 8,71±0,18а 7^8±0^6Лс 7^7±0,17ас

10 6,54±0,19 8,68 ±0Х 7,74^0,16* 734±0ЖС

Численная плотность сосудов (№) в 1,68x10® мкм2 1 — 17,04±0ДГ 15,82± 0,71е 15Д2± 0,44я1

3 — 19,74 ±030^ 16,01 ±0,66* 18,82±0,49аи

6 — 19,29 ±034а 17,89 ±0,58®° 17,75 ±038®

10 15,13±0,17 18,61 ±0^2^ 16,62 ±0,53^ 15,88 ± 0,55ю

Численная доля тромбирован-ных сосудов, % 1 — 11,72±0^6а 2,13 ± 0,11ж 3,07±0Д1аШ

3 — 19^4 ±0,58* 3,76 ±0^ ЗД7±0^4ас

6 — 15,45 ¿0,23* 3,46 ±034* 2,86+022*°

10 1,26 ±0,34 14,97 ±0,43а 2,84±0,15аЬс 2Д7±0Ж

Объемная плотность ГфОВОИЗ-лияний(Уу),% 1 — 1,12±0ДГ 0,68 ±0,10? 0,40 ±0,15е

3 — 4,02 ±0,25* 1,01 ±0,15® 0,71 ±0,16*

6 — 4,17 ±02? 1,73±0,12аЬс 132±0,16аьс

10 0,18±0,11 4,50±0Д4а 1,41±0,06аЬс 1^27 ±0,14"

Примечание: в таблице Н5Ы1-ЮД-500 и Н5Ш+ОД-ЮОО обозначеньг группы животных, которым перед инфицированием вводили ОД в дозах 500мг/кг в 0,2мл и 1000 мпкг в 0,4мл, соответственно; Н5Ы1 - инфицированные животные без профилактического введения ОД буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров контрольной группы; буквой «Ь» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предагущего срока наблюдения; буквой «с» отмечены величины достоверно отличающихся параметров групп с профилактическим введением ОД по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н51Ч1; буквой «сЬ> огмечены величины достоверно отличающихся параметров группы Н5Ы1-ЮД-1000 по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н5М+ОД-5СЮ. ОД - окисленный декстран.

Таблицу8

Результаты исследований воспалительных инфильтратов в легких мышей, инфицированных

Срок после заражения, сутки Экспериментальные группы

Параметры Контроль (интактные) Н5И1 Н5М+ОД-500 ЮМ+ОД-ЮОО

Объемная 1 — 21,8640,60* 14,14 ± 0,47х 9,42 ± 03

плотность 3 — 23,2640,52" 17,03±0,77*° 11,4540,66**

инфильтратов 6 — 26,82 ±0,61* 10,68±0,67*° 10,4240,72*

(Уу),% 10 0,17±0,09 32,88±0,98* 10Д5 40,46х 8,8940,67х

Клеточный состав инфильтратов, %:

1 — 83,54±3,15/ 4,76+0^ 82,12+2,89/ 2,45+032х 8234+3,02/ 233+0,44*

Макрофаги/ многоядерньге клетки 3 — 82,0913,17/ 6,031133* 80,9512,77/ 2,16+0,48го 79,62+2,68/ 2,0410,41*

6 — 79,87+3,11/ 7,54+1,15" 79,8212,09/ 2,08+039* 79,45^2,817 1,921037*

10 77,9413,48 78,49+339/ 527+0,69^ 79,7413,17/ 130+037* 783213,047 131+034*

1 — 14,79±0,63а 14,87+0,86" 14,43+0,76"

Лимфоциты 3 — 15,68+0,72* 1436±0,65а 15,06+0,59"

6 — 17,74±0,67ь 16,67+0,57* 16,83+0,79

10 19,43+0,37 17,8110,78 1632+0,48а 16,91+0,73

1 — 1,4710,19" ь 13310,19" 1,60+0,1^

Нейгрофилы 3 — 139+0,15" 13110,21" 1,45+032"

6 — 132+0,28" 131±0Х 139+038"

10 0,41+0,15 1,17±0Д1 1ДЗ+0372 1Д7+0Д1"

1 — 0,964038 0,Ш)22 1,01+0,19

Фибробласты 3 — 1,4310,23 134±0Д5 132Ю34

6 — 1,5710,16" 1,44+038 1,54+032

10 0,88+0,23 2.0&+035" 1,91+031* 1,78+033"

Примечание: в таблице Н5Ы1+ОД-5СЮ и Н5Ы1+ОД-1(ХЮ обозначены группы животных, которым перед инфицированием вводили ОД в дозах 500мг/кг в 0,2мл и 1000 мг/'кг в 0,4мл, соответственно; Н5Ы1 - инфицированные животные без профилактического введения ОД буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметре® контрольной группы; буквой «Ь» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего срока наблюдения; буквой «с» отмечены величины достоверно отличающихся параметров групп с профилактическим введением ОД по сравнению с величинами

аналогичных параметров в группе H5N1; буквой «d» отмечены величины достоверно отличающихся параметров группы Н5Ы1-ЮД-1000 по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н5Ы1+ОД-5(Ю. ОД - окисленный дексгран. Общее количество клеток в инфильтрате принято за 100%. .

Величина показателя объемной плотности фиброзной ткани в легких мышей, не получавших ОД увеличивалась в течение всего периода эксперимента и была на всех сроках достоверно вьгше величины аналогичного параметра у мышей контрольной группы. В легких мышей, получавших ОД напротив, объемная плотность фиброзной ткани увеличивалась незначительно и лишь на самых поздних сроках достигала значений, достоверно отличающихся по сравнению с величиной аналогичного параметра в контрольной группе (табл. 9), что может свидетельствовать как о повышении уровня IFN-y (Duncan R, Berman В., 1985), так и о проявлении аншфиброгаческого действия ОД которое ранее было показано в экспериментах на мышах, инфицированных М. tuberculosis (Шкурупий В А, 2007).

Таким образом, анализ структурных изменений в легких экспериментальных животных, подшервдаег профилактическое действие ОД на развитие вирусной инфекции, вызванной ВГП A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Таблица9

Объемная плотность фиброзной ткани в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа

птиц после профилактического введения ОД (М ± т)

Срок после заражения, супси Экспериментальные группы

Котроль (итакшые) H5N1 Н5Ы1+ОД-5(Ю Н5М-ЮД-1000

1 — 0,28 ±0,16 032±0,19 032 ±0,12

3 • — 2^6 ±0,45* 0,40± 0,17е 034± 0,15е

6 — 4,22 ±0,5 Ia" 0,54±0,17ас 0,41 ±0,16е

10 0,09 ±0,08 7,91 ± 1,37a" 0,79±0Д2Х 0,61 ± 0,21х

Примечание: в таблице Н5Ы1-ЮД-5(Ю и ШШ-ЮД-ЮОО обозначены группы животных, которым перед инфицированием вводили ОД в дозах 500мг/кг в 0,2мл и 1000мг/кг в 0,4мл, соответственно; Н5М - инфицированные животные без профилактического введения ОД ; буквой «а» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров у мышей контрольной группы; буквой <Ф» отмечены величины достоверно отличающихся параметров по сравнению с величинами аналогичных параметров предыдущего ерша наблюдения; буквой «с» отмечены величины достоверно отличающихся параметров групп с профилактическим введением ОД по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н5№; буквой <«1» отмечены величины достоверно отличающихся параметров группы ШМ+ОД-ЮОО по сравнению с величинами аналогичных параметров в группе Н5М+ОД-500. ОД- окисленный дексгран.

4.2. Исследование гштокинового профиля в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа гпш после профилактического введения ОД

Исследование уровня цигокинов в легких мышей, инфицированных ВГП после профилактического введения ОД показало уменьшение положительной реакции с Т№-а и 1Ы> по

сравнению с величиной аналогичного показателя в образцах органов мышей, не получавших препарат, на всех сроках наблюдения. Это свидетельствует о снижении экспрессии провос-палительных цитокинов, что согласуется со снижением объемной плотности воспалительных инфильтратов, наблюдавшимся при светооптическом изучении легких. Также отмечали снижение реакции цитоплазмы лимфоците® с маркерами апопгоза: caspasa-3, TRAIL, что, возможно объясняет значительный ашифибрсгшческий эффект, наблюдавшийся при профилактическом введении ОД. Уменьшение интенсивности реакции с этими маркерами свидетельствует о снижении гибели лимфоцитов, что должно приводить к увеличению вьгра-бегпда IFN-y, ингибируюгцего образование фиброзной ткани (Duncan R., Веппап В., 1985).

Таким образом, профилакгачесжое введение ОД оказывает выраженное действие на уровни цитокинов в ткани легкого, что приводит к нормализации цитокинового ответа и, как следствие, уменьшению деструктивных изменений в поражаемых органах. Полученные данные позволили вьщелить ключевые аспекты в развигаи экспериментальной вирусной инфещии фиппа тггиц субгипа H5N1.

Анализ полученных данных свидетельствует, что одной из причин высокой патогенно-сги ВГТ1 для млекопитающих является воздействие белков вируса на иммунную систему. Известно, что неструктурный белок NS2 ВГТТ опосредованно нетрализуег синтез и эффекты IFN-y. Это приводит к угнетению неспецифического противовирусного интерферонового ответа (Кузнецов, В Л, 2007; Cauthen AN. et al, 2000). Угнетение вирусом выработки IFN-y эффекторными клетками приводит к продуктивной репликации вируса в клетках хозяина и, учитывая тропность ко многим органам, к генерализации инфекции. Под действием вирусной РНК в эпиюлиоцигах и макрофагах происходит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (IL-2, ILr6, TNF-a), уровни которых в тканях легкого были повышены уже с 1 суток после инфицирования. Цикжины вызывают острый иммунный ответ с выраженной реакцией сосудистого русла Они стимулируют мобилизацию нейтрофилов, моноцитов из костного мозга, активацию полиморфноядерных лейкоцитов, макрофагов, тромбоцитов (Durum SJL, Schmidt JA, 1985; Beufler B., Cerami A, 1989), что приводит к истощению лим-фоидной ткани центральных и периферических органов иммуногенеза (Pei F. etaL, 2005).

Зарегистрированная в данной работе блокада каспазо-зависимого апопгоза клеток СМФ, еввдетельствует о снижении микробицвдного потенциала магфофагов за счет угнетения NO-сишазной активности (Squadrito G.L, Piycr WA, 1998) и приводит к успешной репликации вируса Развитие лимфопении (Pei F. etaL, 2005) и, как следствие, недостаток IFN-y, синтезируемого лимфоцитами, по-видимому, связано с Т№-индуцированным апогпозом лимфоцитов: в их цитоплазме на всех сроках наблюдения отмечали наличие маркеров апопгоза: caspasa-3, TRAIL. Массовая гибель лимфоцитов объясняет отмеченный в данном исследовании низкий процент лимфоцитов в составе воспалительных инфильтратов в легких.

Важным моментом в генезе нарастающей функциональней недостаточности дыхательной системы экспериментальных животных является быстропрогрессирующий фиброз тканей, что может свидетельствовал, об активации фибробласгов в условиях ишемии и под влиянием провоспалительных цитокинов. Ранний, по срокам развития воспаления, процесс фиброзирования наблюдали преимущественно перибронхиально и периваскулярно на месте инфильтратов, где было сосредоточено большое количество мдаонуклеаров. Это может

быль связано с тем, что вырабатываемый макрофагами фибронекган стимулирует хемотаксис фибробласгов в зону воспаления и их пролиферацию (Bitterman PJB. et al., 1983; Whale SM, 1985). Лимфощпарный цитокин IFN-7 иншбируег синтез коллагена и снижает стимулирующее влияние на фибробласлы других цигокинов (Duncan R, Berman В, 1985), следователи^ его недостаток способствует образованию ф1Йрозной ткани.

Стабилизация процесса к 10 суткам после заражения с незначительным снижением деструктивных изменений в органах выживших животных к 10 сушам после инфицирования, возможно, связана с возрастающей секрецией противовоспалительных цигокинов: ИЛ-10, ИЛ-12 (Зенков Н.К., Меныцикова Е£, Штсурупий В А, 2007), и альтернативной акгавацией макрофагов, что приводит к снижению их циштоксического действия и усилению эндоцщо-за продуктов клеточной деструкции (Durum SJC, Schmidt JA, 1985), а также с повышением репаративной активности в поврежденных тканях.

Таким образом, в основе патогенеза вирусной инфекции гриппа H5N1 (A/Goos©Krasnoo2^skoy&'627Ä)5) лежит, прежде всего, неполноценный противовирусный ингерфероновый ответ, запускающий каскад цигокин-опосредованных реакций, приводящих к необратимым структурно-функциональным изменениям в системах органов экспериментальных животных.

При профилактическом введении ОД наблюдали улучшение состояния легких экспериментальных животных по всем морфологическим показателям. При этом эффект ОД проявлялся в каждой из групп, подвергавшихся профилактике, но был более выражен в группе, получавшей ОД в дозе 1000мг/кг. Следует отметить, что профилактическое введение ОД в дозе 500мг/кг оказывало значительное положительное воздействие на состояние легких экспериментальных животных. В связи с этим можно предположить, что отсутствие влияния данной дозы препарата на показатель СПЖ и небольшое снижение летальности может бьпь связано с дисфункцией других жизненно важных органов, которая и становится причиной гибели животных при удовлетворительном состоянии легких.

Таким образом, исходя из приведенных выше данных, можно сделать вывод о том, что ОД оказывает профилактическое действие при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей ВГП при двукратном внутривенном введении заЗи 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 500мпкг. При введении препарата в дозе КЮ0мг/кг наблюдается выраженный профилактический эффект, который проявился увеличением показателя СПЖ на 24.2% и уменьшения легальности на 50% по сравнению с контролем.

Эффективность профилактического введения ОД подтверждается снижением объемной плотности воспалительных инфильтратов, кровоизлияний, доли тромбированных сосудов, объемной плотности фиброзной ткани. При ИГХ-исследовании уровней цигокинов в легочной ткани у мышей, получавших ОД отмечали значительное снижение количества иммуно-компетенгных клеток (макрофагов), экспрессирующих провоспалигельные цитокины IL-6 и TNF-«, по сравнению с группой инфицированных животных без профилактического введения ОД. Можно предположить, что под действием ОД происходит альтернативная активация макрофагов. Это приводит к снижению их цитотоксического действия, усилению эццо-цигоза продуктов клеточной деструкции (Claas ЕС. et al., 1998) и выработке противовоспалительных цигокинов. Об активации макрофагов под действием ОД свидетельствуют и проведенные ранее эксперименты по изучению влияния ОД на их NO-симпазную и аргиназную

активность. Показано, что введение ОД интакшым животным за 48 часов до выделения макрофагов приводило к существенному увеличению продукции ими оксида азота, что можно объяснить активацией в макрофагах суперсжсид-продуцирующей системы, которая является одним из наиболее важных физиологических регуляторов микробицвдной активности. Кроме того, увеличивалась активность аргиназы в клетках, физиологическая роль наблюдаемой в данном случае стимуляции артиназной активности состоит в предотвращении избыточной продукции оксида азота, способного в высоких концентрациях оказывать неблагоприятные эффекты на клетки (Ткачев В.О. и др., 2008), что отражено в уменьшении деструктивных процессов в легких мышей, инфицированных ВГП, при профилактике ОД.

С активацией клеток СМФ по альтернативному пуш, возможно, связано и снижение интенсивности процесса фиброзирования легких. При этом макрофаги способны не только стимулировать фиброгенез, но и тормозтпь его через вырабатываемые лимфокины, относящиеся к классу IFN-y, и монокины - IFN-p (Duncan М, Berman В., 1985). Известно, что лим-фоцигарный цигокин IFN-y ингибируег синтез коллагена и снижает стимулирующее влияние на фибробласш других цигокинов (Duncan R, Berman В., 1985). Возможно, ОД способствует стимуляции ингеферон-ицдуцирующей функции клеток мишеней, прежде всего мо-нонутслеаров, что объясняет значительные снижение величины показателя объемной плотности фиброзной ткани в группах мышей, получавших ОД.

Таким образом, вышеописанные эффекты ОД позволяют предположить перспективность использования окисленных крупномотекулярных полисахаридов в качестве иммуно-модулируюгцих средств, воздействующих на клетки моноцигарн&макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности, механизм действия которых требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Вирус гриппа птиц субгипа H5N1 A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 обладает высокой пагогенностью для млекопитающих, вызывая системный инфекционный процесс с высокой частотой летальных исходов.

2. Различные морфотшы вируса способны персистировать в клетках альвеолярного эпителия, резидентных макрофагах, гепаггоцигах, эвдотелиоцитах и во внеклеточных пространствах.

3. В патогенезе вирусной инфекции гриппа птиц субгипа H5N1 у млекопитающих преобладали: а) гемодинамические нарушения с явлениями гиперкоагуляции и тромбоза микроциркуляторного русла по типу синдрома дассеминированного внутрисосудисгого свертывания; б) гиперплазия клеток макрофагального рада с формированием многовдерных клего^ в) распространенные дистрофические и некротические процессы, обусловленные активной репродукцией вируса в эпиюлиоцитах и макрофагах, гемодинамическими нарушениями и токсическими эффектами, вызванными реакцией клеточного звена иммунитета животных на проникновение вируса

4. Высокая патогенность вируса гриппа птиц субгипа H5N1 A/Goose/ Krasnoozerskoye/627/05 для млекопитающих (мышей) обусловлена деструктивными процессами в легких и печени, связанными с репродукцией и персистенцией вируса, и гиперпродукцией провоспалительных цигокинов в ответ на инфшдфование.

5. Инфицирование мышей вирусом хрипла птиц субгапа H5N1 сопряжено с ранней активацией фибропластических процессов и развитием фиброгаческих осложнений в легких и печени млекопитающих.

6. Окисленый дексгран с молекулярной массой бОкДа оказьшаег выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспфиментальдам инфицировании беспородных белых мышей вирусом гриппа птиц субшпа H5N1 A/Goosei/KrasnooraBle>ye'627A)5, ксггорый проявляется значительным увеличением средней продолжительности жизни животных и уменьшением их летальности, что, видимо, обусловлено существенным снижением масштабов осложнений - гемод инамических, воспалительного ответа, фиброза, угнетения репаративных процессов.

Рекомендации по практическому применению

Полученные данные могут бьпь использованы для формулирования представлений об особенностях патогенетических проявлений инфекционного процесса у мышей (млекопитающих), вызванного новым штаммом вируса гриппа гаиц субшпа H5N1 A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05, потенциально опасным для человека Полученные данные по использованию окисленного декстрана при вирусной инфекции, вызванной вирусом гриппа тпиц субтипа H5N1 A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 указывают на возможность профилактики его осложнений и этам средством, в частности.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Морфологические изменения внутренних органов гпиц при экспериментальном заражении вькхжопатогенным вирусом птичьего гриппа H5N1 / JIB. Шесгопалова, ВА. Шкурупий, ТВ. Шаркова, АМШесгоеапов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. -Приложение №1. - С. 56-59.

2. Структурные изменения в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа гпиц субтипа H5N1 / ТВ. Шаркова, ОБ. Потапова, ВА. Шкурупий, А.М. Шесгопалов, ИГ. .Дроздов, ЛВ. Шесгопалова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. - Т. 146,№8.-С. 210-212.

3. Структурные изменения легких у мышей, инфицированных вирусом гриппа гпиц H5N1 субшпа / JLB. Шесгопалова, ВА Шкурупий, ТВ. Шаркова, О.В. Потапова, А.В. Зай-ковская, AM Шесгопалов //Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина.-2006. Т. 6, № 3, ч2. - С. 3-10.

4. Morphological changes in the bird viscera in experimental infection by highly pathogenic H5N1 avian influenzavirus / L.V. Shestopalova, VA. Shkurupii, Т.V. Sharkova, AM Shestepalov // Bulletin ofExrerimental Biology mid Medicine. -2008. - Supplement 1. - P. 56-59.

5. Structural changes in the liver of mice infected with avian influenza virus subtype H5N1 / T.V. Sharkova, O.V. Potapova, VA. Shkurupii, AM Shestepalov, LG. Drozdov, L.V. Shestopalova //Bulletin ofExrerimental Biology and Medicine. -2008. - Vol 146, № 8. - P. 230-232.

6. Characteristics of morphogenesis of pathological changes of mice target organs developing under the influence of highly pathogenic influenza virus of H5N1 subtype / AM Shestepalov, L.V. Shestopalova, T.V. Sharkova, VA Shkurupij, A.V. Zajkovskaya, Y.N. Rassadkin, O.V. Potapova, LG. Drazdov // The Third European Influenza Conference, Vilamoura, Portugal: Addenum& Participants list - 2008.-P. 6-7.

ггтитк- ткРАптний

IFN-итерферон

IL-интерлейкин

TNF - фактор некроза опухолей

TRAXL - TNF-related apoptosis-inducmg Iigand

ВГТТ- вирус(ы) гриппа ппщ

1ЭПС - гранулярная эвдоплазмагшческая сеть

ДАБ - диамннобензидин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИГХ- иммуногистохимический

ОД- окисленный джстран

МЛДя - мышиная легальная доза, при применении которой погибает 50% мышей СМФ - система мононуклеарных фагоцитов СПЖ-средняя продолжительность жизни

Соискатель ШарковаТ. В.

Подписано в печать 8.10.2008 г. Уч.-иэд. л. 1 Офсетная печать. Формат 60x 84 1/16 3аказ№393 Тираж 100 экз.

Редакционно-издагельский цетрНГУ; 630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2

Актуальность проблемы

Вирусы гриппа А относят к одним из самых значимых для человечества возбудителей инфекционных болезней. Появление высокопатогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей гриппа птиц человеку, очевидно, сопряжены с угрозой новой пандемии и необходимостью поиска новых средств профилактики и лечения заболевания (Shortridge K.F. et al., 2000).

Основные эпидемии гриппа XX века были вызваны вирусами, произошедшими непосредственно от вирусов птиц путем генетической реассорта-ции между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг.) или адаптации птичьего штамма к человеку («испанка» 1918-1919 гг.) (Всемирная организация здравоохранения [ВОЗ], 2006; Suzuki, Y., 2005).

В последнее время всё большее значение приобретает прямая передача вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц. По данным ВОЗ на 30 июня 2008 общее количество подтвержденных случаев заболевания людей, вызванного вирусами гриппа А субтипа H5N1 составляет 385, из которых 243 (63%) закончились летальным исходом (ВОЗ).

Особый интерес представляет возбудитель гриппа птиц субтипа H5N1, поскольку можно провести некоторые параллели между данным вирусом и вирусом «испанки» (субтип H1N1), явившимся причиной гибели до 40 миллионов людей во время пандемии 1918-1919 годов. Подобно вирусу «испанки» вирус гриппа А субтипа H5N1 может передаваться непосредственно от инфицированных птиц людям, обладает необычайно высокой патогенностыо и способностью вызывать генерализованную инфекцию в отсутствии ранее сформировавшегося специфического иммунитета у человеческой популяции (То K.F. et al., 2001; De Jong M.D. et al., 2005; Pei F. et al., 2005; Suzuki Y., 2005; Uiprasertkul M., et al., 2005).

Исследования циркулирующих штаммов возбудителя демонстрируют продолжающуюся эволюцию вируса и увеличение видового спектра организмов-хозяев. Все эти обстоятельства заставляют рассматривать вирус А субтипа H5N1 в качестве наиболее вероятной причины будущих пандемий гриппа (ВОЗ, 2006).

В 2005 году в с. Суздалка Новосибирской области Российской Федерации был зафиксирован падеж домашней птицы, который был вызван вирусом гриппа птиц субтипа H5N1. В кратчайшее время вирусы распространились по территории Западной Сибири, а в последствии - в центральных регионах и на юго-западе России. Эпизоотии среди домашних и диких птиц имели место в Новосибирской, Омской, Тюменской, Курганской, Челябинской областях и Алтайском крае. К концу августа того же года общее количество вспышек гриппа птиц в России достигло 53. Эпизоотии гриппа птиц привели к большим экономическим потерям, связанным с гибелью и уничтожением птиц. В результате распространения инфекции погибло или было уничтожено более 1 млн. голов домашней птицы (Онищенко Г.Г. и др., 2005).

На территории России до сих пор не было зарегистрировано ни одного случая заражения людей гриппом птиц. Однако, показано, что вирусы субтипа H5N1, выделенные в 2005 году в Новосибирской области, являются высокопатогенными для млекопитающих (Onishchenko G.G. et al., 2006; Evseenko V.A. et al., 2007).

Поскольку это были первые случаи выявления вирусов высокопатогенного гриппа птиц субтипа H5N1 на территории России, актуальным явилось получение данных о фенотипических особенностях выделенных вирусов, их патогенности для птиц и млекопитающих, филогенетическом положении, серологических свойствах.

Кроме того, доказано, что за последние годы вирусы гриппа птиц субтипа H5N1 приобрели устойчивость к действию основных препаратов, применяемых для лечения и профилактики гриппа. Штаммы, выделенные на территории Новосибирской области во время эпизоотии 2005 года, не стали исключением (Iatsyshina S.B., Shestopalov A.M. et al., 2008).

Наряду с вирусологическими исследованиями, позволяющими выявить субтип циркулирующего вируса и его молекулярно-генетические свойства, требуется изучение особенностей патологических процессов, возникающих в организме животных в результате воздействия на них нового вирусного агента. В связи с реальной опасностью распространения вируса гриппа птиц в человеческой популяции есть острая необходимость выявления механизмов патогенеза и морфогенеза инфекционного заболевания. Для этого необходимо исследовать особенности отношения «вирус-клетка» как на светооптическом, так и ультраструктурном уровнях.

Анализ структурных и ультраструктурных изменений органов-мишеней во время инфекции позволяет выявить онтогенетические особенности вируса, связанные со способами его проникновения в клетки, репродукции и циркуляции в организме животного, и, следовательно, причины развития патогенетических событий, приводящих к тяжелым последствиям для пораженного вирусом организма. Использование микроскопических методов, таким образом, является необходимым условием для понимания основных механизмов развития и важнейших проявлений инфекции гриппа птиц и, в частности, субтипа Н5Ш.

Для разработки новых подходов в борьбе с вирусными инфекциями необходимо отработать модели гриппа птиц субтипа Н5Ш на экспериментальных животных (млекопитающих), изучить структуру вирионов и особенности их формирования в клетках млекопитающих с целью поиска новых профилактических средств, направленных на снижение уровня риска заболеваемости гриппом у людей и его тяжелых осложнений.

В связи с вышесказанным, были сформулированы цель и задачи данного исследования.

Цель исследования

Изучить особенности проявления воспалительного процесса в легких и печени у мышей при птичьем гриппе, вызываемом высокопатогенным штаммом гриппа птиц субтипа Н5Ы1 А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05, и его профилактике окисленным декстраном.

Задачи исследования:

1. Исследовать патогенность вируса гриппа птиц субтипа Н5Ш А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05 для мышей.

2. Исследовать эффективность окисленного декстрана при профилактике экспериментальной вирусной инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа Н5Ш А/^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05у мышей.

3. Изучить особенности топологии вируса гриппа птиц субтипа Н5Ш А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05 и субклеточных изменений в легких и печени инфицированных мышей.

4. Изучить морфологические изменения в легких и печени инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа Н5Ш А/^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05 мышей.

5. Изучить роль провоспалительных цитокинов в патогенезе инфекционного процесса, вызываемого вирусом гриппа птиц субтипа Н5Ш А/^оозе/Кгазпоогегзкоуе/627/05.

6. Изучить патогенетические особенности проявления гриппа птиц в легких экспериментально зараженных мышей при профилактическом введении им окисленного декстрана.

Научная новизна результатов исследования

В ходе эксперимента впервые получены данные о патогенетических особенностях воспаления при гриппе птиц, вызываемом вирусом гриппа птиц, выделенным на территории Российской Федерации, у мышей. Подробно изучены особенности проявления инфекционного процесса и его осложнений в легких и печени мышей на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлены особенности морфотипов вирионов А/goose/ Krasnoozerskoye/627/05, его топологии, а также его тропность к различным клеткам легких и печени.

Получены данные об уровне экспрессии провоспалительных цитокинов и факторов апоптоза в тканях легких и печени мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа H5N1.

Предложено средство (окисленный декстран) профилактики гриппа птиц у млекопитающих и испытано в эксперименте на мышах. Показана его высокая эффективность.

Научно-практическая значимость работы

Исследованы патогенетические особенности проявлений у мышей птичьего гриппа, вызываемого новым штаммом вируса гриппа птиц субтипа H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, потенциально опасным для человека. Предложено средство профилактики основных осложнений птичьего гриппа у мышей, которое может быть перспективным для разработки средств профилактики птичьего гриппа у человека в связи с неспецифичностью его эффектов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Вирус гриппа птиц субтипа H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 обладает высокой патогенностью для мышей, обусловленной репликацией вируса в клетках легких и печени, развитием генерализованного инфекционного процесса с высокой летальностью.

2. Вирус гриппа птиц A/goose^rasnoozerskoye/627/05 обладает высокой тропностью к клеткам альвеолярного эпителия, макрофагам легких и печени, гепатоцитам, синусоидальным эндотелиоцитам печени, сопряженной с развитием тромботических осложнений, геморрагий, интерстициального воспаления в легких, отечного синдрома, дистрофических и некротических изменений в печени и легких и раннего фиброза в них.

3. Окисленный декстран оказывает выраженное профилактическое действие при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей вирусом гриппа птиц субтипа Н5Ш А^оо8е/Кга8поо2ег8коуе/627/05, которое проявляется снижением летальности и увеличением продолжительности жизни животных, зависит от сроков и дозы введения препарата и обусловлено значительным уменьшением тяжести основных патологических проявлений воспаления.

ВЫВОДЫ

1. Вирус гриппа птиц субтипа ГОШ А^оозе/Кга8гюо2егзкоуе/627/05 обладает высокой патогенностыо для млекопитающих, вызывая системный инфекционный процесс с высокой частотой летальных исходов.

2. Различные морфотипы вируса способны персистировать в клетках альвеолярного эпителия, резидентных макрофагах, гепатоцитах, эндоте-лиоцитах и во внеклеточных пространствах.

3. В патогенезе вирусной инфекции гриппа птиц субтипа ГОШ у млекопитающих преобладали: а) гемодинамические нарушения с явлениями гиперкоагуляции и тромбоза микроциркуляторного русла по типу синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания; б) гиперплазия клеток макрофагального ряда с формированием многоядерных клеток; в) распространенные дистрофические и некротические процессы, обусловленные активной репродукцией вируса в эпителиоцитах и макрофагах, гемодинамическими нарушениями и токсическими эффектами, вызванными реакцией клеточного звена иммунитета животных на проникновение вируса.

4. Высокая патогенность вируса гриппа птиц субтипа ГОШ А^оозе/Кга5поогег8коуе/627/05 для млекопитающих (мышей) обусловлена деструктивными процессами в легких и печени, связанными с репродукцией и персистенцией вируса, и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов в ответ на инфицирование.

5. Инфицирование мышей вирусом гриппа птиц субтипа ГОШ сопряжено с ранней активацией фибропластических процессов и развитием фибротических осложнений в легких и печени млекопитающих.

6. Окисленый декстран с молекулярной массой бОкДа оказывает выраженный профилактический дозозависимый эффект при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей вирусом гриппа птиц субтипа Н5Ш А/доо8е/Кга8поо2егзкоуе/627/05, который проявляется значительным увеличением средней продолжительности жизни животных и уменьшением их летальности, что, видимо, обусловлено существенным снижением масштабов осложнений - гемодинамических, воспалительного ответа, фиброза, угнетения репаративных процессов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных результатов позволил выделить ключевые аспекты в развитии экспериментальной вирусной инфекции гриппа птиц субтипа H5N1.

Одной из причин высокой патогенности вируса гриппа птиц для млекопитающих является воздействие белков вируса на иммунную систему. Известно, что неструктурный белок NS2 вируса гриппа птиц опосредованно нейтрализует синтез и эффекты IFN-y, что приводит к угнетению неспецифического противовирусного интерферонового ответа (Кузнецов В.П., 2007; Евсеенко В.А. и др., 2008; Munder M. et al., 1998; Cauthen A.N. et al., 2000). Угнетение вирусом субтипа H5N1 выработки IFN-y эффекторными клетками приводит к продуктивной репликации вируса в клетках хозяина и, учитывая тропность ко многим органам, к генерализации инфекции. Под действием вирусной РНК в эпителиоцитах и макрофагах происходит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-a), уровни которых в тканях легкого были повышены уже с 1 суток после инфицирования. Цитокины вызывают острый иммунный ответ с выраженной реакцией сосудистого русла. Они стимулируют мобилизацию нейтрофилов, моноцитов из костного мозга, активацию полиморфноядерных лейкоцитов, макрофагов, тромбоцитов (Durum S.K., Schmidt J.A., 1985; Beutler В., Cerami А., 1989), что приводит к истощению лимфоидной ткани центральных и периферических органов иммуногенеза (Pei F. et al., 2005).???

Зарегистрированная в легких блокада каспазо-зависимого апоптоза клеток системы мононуклеарных фагоцитов, так называемый гемофагоци-тарный синдром, возникающий в результате недостатка IFN-y (Cauthen A.N. et al., 2000), свидетельствует о снижении микробицидного потенциала макрофагов за счет угнетения NO-синтазной активности (Squadrito G.L., Pryor W.A., 1998) и приводит к успешной репликации вируса.

Развитие лимфопении (Pei F. et al., 2005) и, как следствие, недостаток IFN-y, синтезируемого лимфоцитами, по-видимому, связано с TNFиндуцированным апоптозом лимфоцитов, который обнаружен при иммуно-гистохимическом исследовании: в цитоплазме лимфоцитов на всех| сроках наблюдения отмечали наличие маркеров апоптоза: caspasa-3, TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). Это приводит к массовой гибели лимфоцитов и истощению лимфоидной ткани, что объясняет низкий процент лимфоцитов в составе воспалительных инфильтратов в легких.

Важным моментом в генезе нарастающей функциональной недостаточности дыхательной системы экспериментальных животных является быстро-прогрессирующий фиброз тканей, выявленный при гистохимическом окрашивании (по Ван-Гизону), что может свидетельствовать об активации фиб-робластов в условиях ишемии и под влиянием провоспалительных цитоки-нов. Ранний по срокам развития воспаления процесс фиброзирования наблюдали преимущественно перибронхиально и периваскулярно на месте инфильтратов, где было сосредоточено большое количество мононуклеаров. Это может быль связано с тем, что вырабатываемый макрофагами фибронек-тин стимулирует хемотаксис фибробластов в зону воспаления и стимулирует их пролиферацию (Bitterman P.B. et al., 1983; Whal S.M., 1985). Лимфоцитар-ный цитокин IFN-y, наоборот, ингибирует синтез коллагена и снижает стимулирующее влияние на фибробласты других цитокинов (Duncan R., Berman В., 1985), следовательно, его недостаток также способствует образованию фиброзной ткани.

Кроме того, концентрирование основной массы новообразованной соединительной ткани в легких периваскулярно и перибронхиально на местег мононуклеарных инфильтратов, по-видимому, приводит к тому, что в межальвеолярных перегородках, составляющих большую часть легочной ткани, происходит уменьшение объема аргирофильных волокон, подобно тому, как это показано при туберкулезе (Филимонов П.Н. и др., 1999). Это способствует увеличению объема альвеол и повышению воздушности легких, в результате чего развивается острая эмфизема легких.

Стабилизация процесса с незначительным снижением деструктивных изменений в органах выживших животных к 10 суткам после инфицирования, возможно, связана с возрастающей секрецией противовоспалительных цитокинов: IL-10, IL-12 (Зенков Н.К. и др., 2007), и альтернативной активацией макрофагов, что приводит к снижению их цитотоксического действия и усилению эндоцитоза продуктов клеточной деструкции (Durum S.K., Schmidt J.A., 1985), а также с повышением репаративной активности в поврежденных тканях.

Таким образом, в основе патогенеза вирусной инфекции гриппа H5N1 (A/goose/Krasnoozerskoye/627/05) лежит, прежде всего, неполноценный противовирусный интерфероновый ответ, запускающий каскад цитокин-опосредованных реакций, приводящих к необратимым структурно-функциональным изменениям в системах органов экспериментальных животных.

При профилактическом введении ОД наблюдали улучшение состояния легких экспериментальных животных по всем морфометрическим показателям. При этом эффект препарата проявлялся в каждой из групп, подвергавшихся профилактике, но был более выражен в группе, получавшей препарат в дозе 1000мг/кг.

Следует отметить, что профилактическое введение ОД в дозе 500мг/кг оказывало значительное положительное воздействие на состояние легких экспериментальных животных. В связи с этим можно предположить, что отсутствие влияния данной дозы препарата на показатель средней продолжительности жизни и небольшое снижение процента летальности может быть связано с дисфункцией других жизненно важных органов, которая и становится причиной гибели животных при удовлетворительном состоянии легких.

Таким образом, исходя из приведенных выше данных, можно сделать вывод о том, что препарат ОД оказывает профилактическое действие при экспериментальном инфицировании беспородных белых мышей вирусом гриппа птиц субтипа H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 при двукратном внутривенном введении за 3 и 1 сутки до инфицирования в дозе превышающей 500мг/кг. При введении препарата в дозе 1000мг/кг наблюдается выраженный профилактический эффект, который проявляется увеличением показателя СПЖ на 24,2 % и уменьшения процента летальности на 50 % по сравнению с контролем.

Эффективность профилактического введения ОД подтверждается снижением объемной плотности воспалительных инфильтратов, кровоизлияний, доли тромбированных сосудов, объемной плотности фиброзной ткани. При иммуногистохимическом исследовании уровней цитокинов в легочной ткани у мышей, получавших ОД, отмечали значительное снижение количества им-мунокомпетентных клеток (макрофагов), экспрессирующих провоспалитель-ные цитокины IL-6 и TNF-a, по сравнению с группой инфицированных животных без профилактического введения ОД.

Можно предположить, что под действием ОД происходит альтернативная активация макрофагов. Это приводит к снижению их цитотоксического действия, усилению эндоцитоза продуктов клеточной деструкции (Claas Е.С. et al., 1998) и выработке противовоспалительных цитокинов.

Об активации макрофагов под действием ОД свидетельствуют и проведенные ранее эксперименты по изучению влияния ОД на их NO-синтазную и аргиназную активность. Результаты исследований показали, что введение ОД интактным животным за 24 и 48 часов до выделения макрофагов приводило к существенному увеличению LPS-стимулированной продукции ими оксида азота, что можно объяснить активацией в макрофагах супероксид-продуцирующей системы, которая является одним из наиболее важных физиологических регуляторов микробицидной активности (Ткачев В.О. и др., 2008), возможно оказывая и противовирусный эффект.

Введение животным за 48 часов до выделения макрофагов ОД увеличивало активность аргиназы в клетках, Молено предположить, что физиологическая роль наблюдаемой в данном случае стимуляции аргиназной активности состоит в предотвращении избыточной продукции оксида азота, в высоких концентрациях способного оказывать неблагоприятные эффекты на клетки (Ткачев В.О. и др., 2008), что отражено в уменьшении деструктивных процессов в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, при профилактике ОД.

С активацией клеток системы мононуклеарных фагоцитов по альтернативному пути, возможно, связано и снижение интенсивности процесса фиб-розирования легких. При этом макрофаги способны не только стимулировать фиброгенез, но и тормозить его через вырабатывемые лимфокины, относящиеся к классу IFN-y, и монокины - IFN-P (Duncan М., Berman В., 1985). Известно, что лимфоцитарный цитокин IFN-y ингибирует синтез коллагена и снижает стимулирующее влияние на фибробласты других цитокинов (Duncan R., Berman В., 1985). Возможно, ОД способствует стимуляции интеферон-индуцирующей функции клеток мишеней, прежде всего мононуклеаров, что объясняет значительные снижение величины показателя объемной плотности фиброзной ткани в группах мышей, получавших ОД.

Таким образом, вышеописанные эффекты ОД позволяют предположить перспективность использования окисленных крупномолекулярных полисахаридов в качестве иммуномодулирующих средств, воздействующих на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, вызывая повышение их функциональной активности, механизм действия которых требует дальнейших исследований.