Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль морфофункциональных изменений альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов в патогенезе поражения легких мышей линии С57Bl/6 после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

005053СУ*

На правах рукописи

КОВНЕР АННА ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ АЛЬВЕОЛОЦИТОВ, МАКРОФАГОВ И ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ СОСУДОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПОРАЖЕНИЯ ЛЕГКИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ С57В1/6 ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГРИППА А/Н5Ш А/СОО8Е/КГ1Л5!ЧОО7ХК8КО\'Е/627/05

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, гистология, цитология

11 ОКТ 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2012

005053092

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шкурупий Вячеслав Алексеевич кандидат медицинских наук Потапова Оксана Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, гл. н. е., руководитель лаборатории цитологии и клеточных структур,

ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН Архипов Сергей Алексеевич

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии, факультета естественных наук, ФГБОУ ВПО Новосибирского

государственного университета Шестопалова Лидия Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита состоится «23» октября 2012 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д.001.048.01 при ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117; тел./факс (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

Автореферат разослан «Д^ » сентября 2012 г Ученый секретарь

диссертационного совета, -Ж

доктор биологических наук '0л^С> Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем занимают лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний человека. Вирус гриппа (ВГ) A/H5N1 наиболее патогенный среди других вирусов гриппа. По данным ВОЗ уже за 2010-2011 гг, в эпизоотию, вызванную вирусом гриппа A/H5N1, были вовлечены страны Африки, Азии и Европы и летальность среди людей остается по-прежнему высокой - от 60 до 73%; среди детей -до 15 лет-до 89%(www.who.iiit/ru/, 2010-2011).

Постоянная «эволюция» вирусов гриппа A/H5N1, возможность их реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции штаммами вируса гриппа А и лекарственная полирезистентность к имеющимся противовирусным препаратам являются факторами, обусловливающими опасность появления нового высокопатогенного и высококонтагиозного антропозоонозного вируса гриппа A/H5N1 и его распространения как пандемичного (ВОЗ, 2010; Shortridge K.F. et а!., 2000; Ilyushitia N.A. et al., 2010). Несмотря на высокую актуальность проблемы гриппа ряд аспектов патогенеза данного заболевания у млекопитающих и человека остается малоизученным.

Наиболее выраженные патологические изменения при вирусе гриппа A/H5N1 проявляются в дыхательных путях млекопитающих и человека, что связано с пневмотропностью вируса (Свирщевская Е.В. и др., 2005; van Riel D. et al., 2006). Поэтому ведущее значение в иммунопатогенезе гриппа A/H5N1 принадлежит альвеолоцитам, эндотелиоцитам сосудов легких и клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) - легочным макрофагам, как первой линии защиты, которые имеют свои функциональные особенности. Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности, макрофаги выполняют функцию барьера на пути проникновения в организм возбудителя, способствуя ограничению распространения вируса в организме, и играют ключевую роль в инициации и регуляции иммунного ответа при гриппе. Количественная и функциональная недостаточность исследуемых клеток является основой возникновения ряда тяжелых осложнений при инфекционных заболеваниях, в том числе и при вирусных инфекциях (Шкурупий В.А. и др., 1999; Li N. et al., 2008).

Комплексная иммуноморфологическая оценка структурно-функциональных особенностей исследуемых клеток при гриппе A/H5N1 позволит не только улучшить диагностику вирусных инфекций, научно обоснованно осуществить прогнозирование развития болезни и её осложнений, но и одновременно осуществить принципиально новые подходы к профилактике и лечению гриппа, направленные на снижение риска заболеваемости гриппом людей и уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

Цель исследования: изучить морфофункциональные и количественные изменения клеток легких (альвеолоцигов, эндотелиоцигов сосудов и макрофагов) мышей линии С57В1/6 в процессе формирования противовирусного ответа на инфицирование вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Задачи исследования:

1. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких у интакгных

мышей линии С57В1/6.

2. Методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии исследовать топологию вируса в клетках легких мышей линии С57В1/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 на разных сроках заболевания.

3. Изучить структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57В1/6 в динамике развития вирусной инфекции.

4. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких мышей линии С57В1/6 после инфицировании вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoya/627/05 и их вероятную регуляторную роль в развитии вирусной инфекции.

Научная новизна. Впервые на шгтактных мышах-самцах линии С57В1/6 методами морфометрии и иммуногистохимии было показано, что альвеолоциты, эндотелиоциты и макрофаги легких вне зависимости от специализированных функций клеток первых двух типов представляют собою единую структурно-функциональную систему поэлементно способную дополнять друг друга в выполнении функции поддержания гомеостаза в организме своими развитыми системами лизосомальных протеаз, NO-синтаз, экспрессией полипотентных провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6.

Впервые методами иммунофлуоресцентной микроскопии бьио показано персистирование вируса гриппа A/H5N1 штамма A/goose/Rrasnoozerskoye/627/05 в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов легких и макрофагах мышей линии С57В1/6. Было установлено, что первыми в противовирусную «борьбу» включаются и инфицируются альвеолоциты в связи с анатомическим расположением и наличием у них на клеточной поверхности сиаловых кислот, затем эндотелиальные клетки сосудов, что свидетельствует о диссеминации вируса и легочные макрофаги.

Вирус индуцирует в этих клетках процессы деструкции апоптозом, их пролиферацию, активацию экспрессии внутриклеточных энзимов (лизосомальные гидролазы — lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, NO-синтазы - eNOS и iNOS), a также цитокинов. Показано, что кроме цитопатического действия вирусов на эти клетки после интернирования в них, на увеличение масштаба деструктивных процессов в легких оказывают влияние развивающаяся патогенетически поэтапно -системная гипоксия и ишемия вследствие: деструкции сосудов с развитием геморрагических и тромбоэмболических осложнений, повышения проницаемости и развития отечного синдрома в интерстиции и альвеолах, деструкции альвеолярного эпителия и острой диффузной эмфиземы, активации синтеза оксида азота и создания условий для лабилизации мембран лизосом с последующей стимуляцией репаративной регенерации по типу substitucio, усугубляющей нарушение процессов газообмена. Впервые показано, что инфицирование этих клеток кроме деструкции сопряжено с выраженной активацией процессов пролиферации, восстанавливающей нарушенный структурный гомеостаз в легких, но расширяющих трофическую базу для вируса. Показано, что инфицирование вирусом гриппа A/H5N1 jVgoose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с существенной активацией клеточного звена иммунитета, резкого увеличения экспрессии провоспалительных полипотентных цитокинов TNF-a и IL-6, способных также усилить как процессы пролиферации и деструкции так и фиброзирования органа. Изучены масштабы и динамика экспрессии каждого из этих цитокинов клетками трех вышеупомянутых типов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные дополняют известные сведения о патогенезе гриппа A/H5N1 в легких млекопитающих (Шаркова Т.В. и др., 2008; Шестопалов A.M. и др., 2008; Uiprasertkul М.Р. et al., 2007; Zeng Н. Et al., 2012).

Масштабы, характер и динамика исследованных деструктивных последствий в легких после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1

A/goose/Krasnoozerskoyc/627/05 свидетельствуют о необходимости максимально ранних профилактики и лечения данного заболевания. Полученные результаты о роли альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцигов сосудов легких в патогенезе деструкции легких после инфицирования вирусом гриппа А могут быть использованы для разработки средств профилактики заболевания и лечения осложнении.

Полученные данные существенно дополняют плохо изученный патогенез вирусной инфекции, вызываемой новым штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что может бьггь внедрено в процесс преподавания, патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетической профилактики и терапии в соответствии с формирующимися

синдромами заболевания.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-техническои

«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 способен инфицировать альвеолоциты, эндотелиоцкш сосудов и макрофага легких, что сопряжено с их гибелью и персистенцией вируса в них на протяжении всего эксперимента. Инфицирование этим вирусом гриппа индуцирует развитие каскада патологических процессов, итогом, которых является создание условий для развития острой системной гипоксии и ишемии, следствием которых являются масштабные процессы деструкции, доминирующие в проявлениях ответной реакции организма (в частности

легких) на вирус.

2 Инфицирование мышей вирусом гриппа A/H5N1 сопряжено с активациеи репаративных процессов, проявляющихся пролиферацией альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов легких, способствующих восстановлению v-шаченных структур, но расширяющих трофическую базу для вируса, ини проявляются заместительным и постгипоксическим фиброзированием легких, ухудшающим условия для газообмена в интерстиции.

3 Альвеолоциты и эндотелиоциты вне связи с их специализированными функциями вместе с макрофагами легких формируют единую систему сохранения внутренней среды организма за счет высокой экспрессии ими протеаз и NO-синтаз, способности резко усиливать экспрессию TNF-a и IL-6. Вместе с тем, в условиях острой гипоксии, эти проявления защитной функции вышеуказанных клеток мотуг усугубить деструкцию легких в связи с возможной пермеабилизациеи лизосом, усилением образования активированных метаболитов кислорода. Инфицирование мышей вирусом гриппа A/H5N1 сопряжено с активацией клеточного звена иммунитета, однако недостаточной для его эффективной элиминации.

Внедрение результатов работы в практику. Основные положена работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ B11U НГМУ Минздрав России в раздел «Иммунопатологические процессы» и

«Инфекционные болезни». YT ,v

Апробация работы. Материалы исследовании доложены на ALIA Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-техническии пр^ГоГ (Новосибирск, 2011); IV Международной научно-практическои

конференции молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2012).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитированной литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 321 источник, в том числе 267 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа А/Н5Ы1 А/яооае/Кгавпоогегекоуе/бгТ/Об, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Кразноозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с вирусами гриппа АЛ15Ш были проведены на базе лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Работа выполнена на 90 мышах-самцах линии С57В1/6, в возрасте 2 месяцев с массой тела 20-25 г (питомник лабораторных животных НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище. Перед проведением эксперимента их адаптировали к условиям содержания. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации.

Для проведения эксперимента было сформировано 3 подопытных группы животных:

Первая группа - контрольная - была представлена интактными животными (20 мышей).

Вторая группа состояла из 50 мышей, которых инфицировали интраназально вирусом гриппа А/Н5М1 А/£оо8е/Кга8поо2ег5коуе/627/05 дозой 5 МЛД50, для изучения патогенеза инфекции данного процесса.

Третья группа состояла из 20 мышей, которых инфицировали ВГ А/Н5Ш А>%оо5е/Кга8поо2ег8коуе/627/05, у которых изучали патогенность штамма по показателю летальности животных, выраженного в процентах.

Для морфологического исследования животных первой и второй групп выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе. Сбор материала проводили на 1, 3, б, 10 и 14 сутки после инфицирования. Объектом исследования служили легкие.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН «Современные оптические системы».

Для светооптического исследования, полученный материал, после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ксилолов и заключали в синтетическую парафиновую смесь «НВТОМ1Х» (ВюУкгшп). Срезы изготавливали на микротоме («МГС110М»,

Германия) толщиной 3,5 мкм. Окраску проводили по стандартной методике гематоксилином и эозином (обзорная), пикрофуксином по методу ван Гизон (выявление волокон соединительной ткани).

Проводили ИГХ-анализ с использованием непрямого АБС (стрептавидин-пероксидазного) метода для оценки: пролиферативной (PCNA («Novocastra»)), функциональной и профибротической активности легочных макрофагов, альвеолоцитов и эндотелиоцитов (Cathepsin D («DBS»), Myeloperoxidase («DBS»), Lysozyme («DBS»), iNOS («Spring BioScience»), eNOS («Abcam»), TNF-a («DBS»), IL-6 («Novocastra»)); степени выраженности неоангиогенеза (CD-31 («BioCare Medicine»), CD-34 («Spring Bioscience»)); фенотипирования клеточного состава интерстициальных инфильтратов (CD-la («Spring BioScience»), CD-4 («Spring BioScience»), CD-8 («Abcam»), CD-68 («DBS»), Fibroblast («DBS»)); механизмов клеточной смерти (Caspase-3 («Abcam»)).

Для проведения ИГХ-исследования срезы легких толщиной в 3 мкм подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере (PBS), производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Время экспозиции с первичными антителами составляло 30-45 минут при температуре 37°С. Затем срезы инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Затем проводили по спиртам возрастающей концентрации и ксилолам, покрывали синтетической покровной средой «Bio Mount» (Bio Vitrum) и заключали под покровное стекло.

Для исследования топологии вируса гриппа A/H5N1 использовали непрямой метод иммунофлуоресценции, который основан на связывании антитела Inf А («Abcam»), меченных флуорохромом (FITC), с антигеном на поверхности или внутри микроорганизмов. Связавшиеся антитела выявляли в люминесцентном микроскопе (флуорохром поглощает ультрафиолетовые лучи и излучает волны видимого диапазона). В качестве контроля использовали нативную ткань, которую предварительно депарафинизировали стандартным методом. Исследование проводили на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss).

Анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе Axiolmager Al с фотокамерой AxioCam MRe (Carl Zeiss). Морфометрию структурных элементов тканей осуществляли с помощью окулярной сетки на 100 точек площадью 3,64x10 мкм2 (при определении численной (Nai) и/или объемной (Vv) плотности структур) (Автандилов, 2000) и инструментов программы AxioVision (reí. 4.7.).

В ходе данной работы определяли численную плотность (Nai) исследуемых клеток легких в тестовой площади. Оценивали объемную плотность инфильтратов и их клеточный состав, объемную плотность кровоизлияний, зон отека в органе и деструктивных изменений; численную и объемную плотности сосудов, их просвета и толщину стенок сосудов, долю тромбированных сосудов, кроме того объемную плотность фиброзной ткани. Изучали численную плотность (Nai) клеток легких, экспрессирующих исследуемые маркеры, в закрытой тестовой системе - 3,64x10 мкм.

Статистический анализ результатов выполняли с использованием стандартного пакета программ STATISTICA v.6. Определяли средние арифметические величины (М), стандартную ошибку средней (m). Вероятность достоверности различий между средними величинами определяли с помощью t-критерия Стьюдента, а также

проводили корреляционный анализ по Пирсону. Статистически значимыми считали различия при 5% уровне значимости (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфологические и количественные параметры эндотелиоцитов, альвеолоцитов и макрофагов легких интактных мышей линии С57В1/6

Известно, что мыши линии С57В1/6 существенно отличаются от мышей других линий по ряду структурно-функциональных параметров органов и регуляторных систем. Можно полагать, что и альвеолоциты, эндотелиоциты и легочный компаргмент СМФ у интактных мышей этой линии будут иметь особенности, что представляет интерес для исследователей, изучающих данные о линейных мышах для дальнейшего использования их, как специфических моделей.

Методом обзорной световой микроскопии изучали топологию легочных макрофагов у мышей линии С57В1/6. При этом отмечали, что большая часть из них -68% - были представлены альвеолярными макрофагами, расположенными на поверхности альвеол, другие - макрофаги интерстиция - были распределены в межальвеолярных перегородках перибронхиально и периваскулярно.

Популяция легочных макрофагов интактных мышей линии С57В1/6, как интерстиция, так и альвеол обладает высокой функциональной активностью. Из общей численной плотности более 40% экспрессируют: эндотелиальную ЫО-синтазу: еКОЗ - 45 7%, саШервш Б - 48,1%, 11-6 - 43,8%, ТОТ-а - 48,9% и сазраве-З - 40%

Результаты ИГХ-исследования клеток легких интактных мышей линии С57В1/6

(М±т)

Объекты и параметры исследования Типы клеток

Альвеолоциты Макрофаги Эндотелиоциты

Численная плотность клеток легких (Тч'а!) 79,4 ±0,15 10,1 ±0,96 13,2 ±0,75

Содержание от общей численности этих клеток: РСЫА+- клетки (Ш) 5,2 ± 0,36 (6,5%) 1,2 ±0,54 (12,3%) 2,7 ± 0,62 (20%)

¡N05+ клетки (№1) 6,1 ± 0,21 (7,7%) 3,6 ± 0,39 (36%) 2,1 ±0,31 (16%)

е№8+ клетки (Ш) 6,7 ± 0,33 (8,4%) 5,1 ±0,21 (45,7%) 2,1 ±0,32 (15%)

СаЛерэт Б+ клетки (ЫаГ) 9Д±0,31 (11,5%) 4,9 ± 0,84 (48,1%) 2,7 ±0,33 (20,2%)

Муе1орелшс1а5е+ клетки ОЫ) 10,1 ±0,30 (12,8%) 3,6 ±0,63 (35, Г/о) 2,6 ± 0,38 (19,9%)

Ьузогуте+ клетки (ИаО 9,8 ± 0,25 (12,3%) 3,7 ±0,55 (36,5%) 1,8 ±0,48 (13,2%)

11-6+ клетки (ЫаО 7,8 ±0,63 (9,8%) 4,4 ±0,26 (43,8%) 2,3 ±0,25 (17,6%)

тар-а+ клетки (КаО 8,1 ± 0,48 (10,2%) 4,9 ± 0,39 (48,9%) 2,8 ±0,32 (21%)

Сазра8е-3+ клетки (ЫаГ) 4,1 ± 0,48 (5,2%) 4,1 ±0,17 (40%) 2,9 ±0,26 (21,6%)

Примечание: % - процентное содержание клеток от общего числа.

Согласно полученным данным 20% эндотелиоцитов сосудов легких экспрессируют: PCNA - 20%, cathepsin D - 20,2%, TNF-a - 21%, caspase-3 - 21, 6% (табл. 1). Таким образом, у взрослых интактных мышей линии С57В1/6 во всей сосудистой системе эндотелиальные клетки очевидно сохраняли способность к делению и передвижению, демонстрируя экспрессию ядерного фактора пролиферации PCNA, маркера новообразованных сосудов CD-34 и триггерной каспазы.

Кроме этого примечательно, что по численной плотности макрофаги и эндотелиоциты сосудов были достаточно близки.

Более чем в 10% популяции альвеолоцитов регистрировали цитоплазматическую экспрессию: cathepsin D - 11,5%, myeloperoxidase - 12,8%, lysozyme - 12,3% и TNF-a - 10,2% (см. табл. 1). Поскольку легкие являются наиболее открытой системой организма, видимо, поэтому все три типа клеток демонстрируют достаточно высокий уровень секреции факторов, которые можно отнести к элементам системы защиты внутренней среды организма.

Все три типа клеток, кроме специальных функций, формируют защитный барьер, прежде всего, от бактерий, грибов и вирусов.

Летальность и средняя продолжительность жизни мышей линии C57BI/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При совместной работе с нашими коллегами из лаборатории «Зоонозных инфекций и гриппа» под руководством д.б.н. Шестопалова A.M. были проведены исследования патогенности вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей линии С57В1/6 при дозе в 5 МЛД50. В результате, наблюдали гибель животных, начиная с 10 суток после инфицирования. По окончании срока наблюдения летальность инфицированных животных составила 70% при показателе средней продолжительности жизни животных - 12,3 суток. Гибели интактных мышей не наблюдали. Полученные данные указывают на высокую патогенность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей, показанную также в ранее проведенных исследованиях на белых беспородных лабораторных мышах (Шестопалов A.M. и др., 2008).

Особенности топологии вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетках легких мышей линии С57В1/6

При исследовании образцов легких мышей методом флуоресцентной микроскопии и с помощью ИГХ-анализа с использованием Inf А - антитела к антигену вируса гриппа A/H5N1, меченного FITC, уже через сутки после инфицирования выявляли вирусы в альвеолярном эпителии, эндотелиоцитах микроциркуляторного русла и макрофагах легких.

Поскольку адгезия вирусов гриппа А и их проникновение в клетки макроорганизма связаны с наличием на их поверхности определенного типа рецепторов сиаловых кислот (Russella L. et al., 2008), первичными клетками-мишенями для вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 являются альвеолоциты, располагающие этими рецепторами, и расположенными на путях проникновения вируса.

Однако, уже через сутки после инфицирования, количество эндотелиальных клеток иммунопозитивных к Inf А было достаточно велико, что свидетельствует об успешной репликации вирусов в альвеолоцитах и выходе их в кровеносное русло с

развитием виремии, приводящей к генерализации инфекционного процесса, на что указывает инфицированность сосудов легких.

Максимальным количество эндотелиоцитов сосудов легких, экспрессирующих маркер на антиген вируса гриппа (Inf А) было в 1 сутки эксперимента с дальнейшим уменьшением к 14 суткам в 5,2 раза. Максимальное количество Inf А+альвеолоцитов было в 3 сутки эксперимента с уменьшением к 10 суткам в 2,6 раза с увеличением к 14 суткам эксперимента на 50%, что может свидетельствовать о новой «волне» репликации вируса в этих клетках. Количество инфицированных макрофагов также было максимальным на 3 сутки эксперимента и в дальнейшем уменьшалось к 14

суткам в 3,3 раза (табл. 2).

Таким образом, при иммуногистохимическом исследовании особенностей топологии ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в легких инфицированных мышей линии С57В1/6, вирусный антиген Inf А наблюдали в клетках различного гистогенеза (альвеолоцитах, макрофагах, эндотелиоцитах) респираторного отдела легких. Численная плотность иммунопозитивных к Inf А+ клеток всех изученных

типов была наибольшей на ранние сроки после инфицирования (1 и 3 сутки).

Таблица 2

Численная плотность клеток легких мышей линии С57В1/6, зкепрессирующих маркер _на антцген вируса A/H5Nl(M±m)__

Сроки эксперимента, (сутки)

Типы клеток

Inf А+ Эндотепиоциты (Nai)

InfА+ Алыеолоциты (Nai)

InfА+Макрофаги (Nai)

1

26,5+1,26°

17,2+0,91

19,7±1,44

22,1±0,39

21,5±0,57

23,2±0,42

14,5±0,36

13,2+1,01"

И,2*0,5*

10

11,2+1,02"

8,2±0,48

10,6±0,9

14

5,¡±0,49

12,3±1,21

6^0,62^

Примечания: «Ъ» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с величинами предыдущего срока исследования у мышей линии С57В1/6 «с» -достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров между группами попарно. * Inf А - антитело на антиген вируса гриппа A/H5N1.

В период с 3 по 10 сутки эксперимента наблюдали уменьшение численной плотности содержащих вирусный антиген клеток всех типов в 2 и более раза, что свидетельствует о частичной элиминации вируса, возможно, за счет апоптоза. При этом наименьшую скорость снижения величины данного показателя отмечали для эндотелиальных клеток, что, по-видимому, связано с продолжающейся циркуляцией вируса в крови экспериментальных животных. Следует также принимать во внимание, что персистенция вируса, хотя и в существенно меньшем количестве клеток сохранялась вплоть до 14 суток эксперимента.

Структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57В1/6 в динамике развития вирусной инфекции

1. Структурная организация сосудов легких мышей в динамике разлития вирусной инфекции А/Н51Ч1 А^оо5с/Кга5поогег5коус/627/05

При инфицировании мышей вирусом гриппа А/Н5Ж А^оо5е/Кга5поогег5коуе/627/05 наблюдали полнокровие сосудов, а также тромбоз мелких сосудов. Количество тромбированных сосудов было максимальным на 14 сутки эксперимента (увеличение с 1 по 14 сутки составило 2,4 раза).

При морфометрическом анализе образцов легких животных, в динамике развития гриппа А/ГОШ А/^оо5е/Кгазпоогеп>коуе/627/05, к 3 суткам инфекционного процесса отмечали увеличение показателя численной плотности сосудов по сравнению с контрольной группой на 23,6% (табл. 3).

Таблица 3

Результаты исследования структурных изменений сосудов легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования вирусом гриппа А/Н5М А^оо8е/Кга8поогег8коуе/627/05

(М±т)

Объекты и параметры исследования Сроки Экспериментальные группы

эксперимента, (сутки) Интактпые Инфицированные

Численная плотность сосудов легких - CD31, (Nai) 1 10,9 ± 0,86 12,1 ±0,71

3 13,5 ±0,51аь

6 11,5 ±0,64"

10 10.4 ±0,49

14 10,3 ± 0,64

- Ill них доля тромбированных сосудов,% 1 0,8 ±0,13 14,1 ±0,52'

3 20,1 ± 0,61аь

б 24,7 ± 0,84ah

10 18,9± 1,03аЬ

14 23,56 ± 1,38аЬ

Численная плотность сосудов легких - CD34, (Nai) 1 4,1 ±0,15 5.4 ±0,51"

3 6.7 ± 0,74'

6 7.6 ±0,68"

10 7,9 ± 0,79'

14 7.8 ± 0,37'

Объемная плотность сосудов легких (Vv), % 1 10,9 ±0,56 13.1 ±0,66'

3 16,2 ± 0,71аЬ

6 19.9 ±0,72'"

10 21,1 ±0,52*

14 13.3 ±1,07'"

Толщина стенки сосудов, мкм 1 12,5 ±1,46 13.8 ± 1,26

3 15,5 ±0,98'

6 18,2 ± 1Д6аЬ

10 21,4 ± 1,04аЬ

14 18.1 ± 1,25ав

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параме!ров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования у мышей линии С57В1/6.

В последующем с 6 по 10 сутки после инфицирования у мьгшей экспериментальной группы регистрировали уменьшение численной плотности сосудов в 1,3 раза, выявленные с помощью эндотелиального маркера СБ-31 с одновременным повышением величины показателя их объемной плотности на 30% (см. табл. 3), что указывает на застойные процессы, способствующие развитию отеков. Объемная плотность сосудов уменьшалась от 10 суток к 14 суткам эксперимента в 1,6 раза, тогда как численная плотность оставалась неизменной (см. табл. 3), что указывает на процесс начала восстановления микроциркуляции.

Наблюдали фибриноидное набухание и зоны фибриноидного некроза стенок сосудов с одновременной активацией неоангиогенеза - толщина стенки сосудов с 1 по 10 сутки заболевания увеличилась в 1,5 раза, превышая значение аналогичного параметра у интактных животных на 71%. К 14 суткам наблюдали уменьшение толщины стенки сосудов в 1,5 раза (см. табл. 3). Начиная с 6 суток после инфицирования часть визуализируемых сосудов была представлена новообразованными СБ34+ сосудами, с увеличением данного параметра к 14 суткам в 1,31 раза (см. табл. 3). Однако, по-видимому, их доля была недостаточной для эффективного восстановления трофики органов (об этом свидетельствовали деструктивные процессы в органах макроорганизма).

2. Процессы деструкции клеток легких мышей при вирусной инфекции А/Н51Ч1 А^оо8е/Кга$поо2егекоуе/627/05

В ходе исследования было установлено, что после инфицирования мышей линии С57В1/6 вирусом гриппа А Н5Ш А^оозе/Кгазпоо2егзкоуе/627/05 развивались деструктивные изменения в легких, которые были представлены очагами некроза и апоптоза. Для исследования масштабов апоптоза, изучали численную плотность клеток легких, позитивных на маркер сазраве-З.

Максимальное количество альвеолоцитсв, в цитоплазме которых регистрировали экспрессию савразе-З, было на 6 сутки эксперимента - увеличение составило 20% (табл. 4).

Таблица 4

Численная плотность клеток легких мышей линии С57В1/6 в состоянии апоптоза после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования Срок после инфицирования, сутки Типы клеток

Альвеолоциты Макрофаги Эндотелиоциты

Численная плотность клеток, в состояанн деструкции, (N81) 1 42,9 ± 3,75 16,8 ±0,85 8,9 ±0,47

3 47,8 ± 2,44ь 19,8 ± 0,83ь 12,3 ± 0,86ь

6 63,5 ± 6,72ь 26,4 ± 1,83ь 17 ± 0,91ъ

10 51,4 ± 2,76ь 17,4 ± 1,45ь 10,6 ± 0,75ь

14 43,9 ± 3,17ь 15,8 ± 0,65ь 6,9 ± 0,87ь

Процентное содержание Са$ра5еЗ+ клеток, % 1 61,9 ±2,64 52,4 ± 1,53 48,9 ± 0,98

3 64,6 ± 1,86 62,8 ± 2,25ъ 53,1 ± 1,74"

6 72,6 ± 2,75ь 68,4+ 1,73ь 59 ±2,18"

10 66,1 ± 1,74" 59,2 ± 2,02ь 58,6 ±2,37

14 59,4 ± 1,61ь 59,3 ±1,84 53,8 ± 1,86ь

Примечание: «Ь» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров по сравнению с предыдущим сроком исследования.

Максимальное количество сазраэс-З позитивных легочных макрофагов у мышей линии С57В1/6 было также на 6 сутки - увеличение составило 30% (см. табл. 4).

Количество эндотелиоцитов сосудов легких, в цитоплазме которых экспрессировалась савраве-З, было максимальным на 6 и 10 сутки эксперимента (увеличение составило 20%) (см. табл. 4).

Следует отметить, что у всех трех типов клеток на всех сроках исследования клеточная гибель путем апоптоза преобладала над некрозом (см. табл. 4).

В структуре деструктивных изменений в легких превалировали апоптотически-измененные альвеолоциты, что связано с повреждением альвеолярного эпителия за счет прямого цитолитического эффекта вирусной инфекции (см. табл. 2).

3. Структурная организация легких мышей в динамике развития вирусной инфекции А/Н5Ш ^оо8е/Кга5поо2егвкоуе/627/05

Структурные изменения сосудистого русла в легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ш А/§оо5е/КгазпоогегБкоуе/627/05, сопровождались обширными кровоизлияниями. Величина показателя объемной плотности зон кровоизлияний увеличивалась с 1 по 6 сутки эксперимента в 1,8 раза с последующим уменьшением к 14 суткам после инфицирования (табл. 5).

Уже в 1 сутки эксперимента наблюдали масштабные деструктивные изменения в паренхиме легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ш А^оо8е/Кга5поогег8коуе/627/05 (см. табл. 5). С 3 по 6 сутки эксперимента их объемная плотность составляла около 60% паренхимы легких (см. табл. 5).

Таблица 5

Результаты исследования патологических изменений в легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования Срок эксперимента, сутки Мыши линии С57В1/6

Интактные Инфицированные

Объемная плотность деструктивных изменений (Уу), % 1 0,3 ±0,12 16,6 ± 1,44а

3 20,3 ± 2,03аО

6 59,2 ±2,54®

10 59,9 ± 1,58"

14 27,7 ± 1,3 9>0

Объемная плотность кровоизлиянии (Уу),% 1 5,6 ± 0,8 17,4± 1,59а

3 24,3 ± 2,05'"

6 31,7±2,52аЬ

10 20,2 ± 2,59аЬ

14 10.5 ± 0,67"°

Объемная плотность зон отека (Уу), % 1 0,3 ± 0,09 15,4 ± 1,15"

3 24,8 ±1,61*

6 39,2 ± 1,44аЬ

10 63,5 ± 0,85аЬ

14 29,4 ± 1,21*"

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отлячия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

По мере развития инфекционного процесса с 1 по 10 сутки после инфицирования в легких мышей регистрировали увеличение объемной плотности зон отека в 4,1 раза,

с дальнейшим уменьшением к 14 суткам заболевания в 2,2 раза (см. табл. 5), за счет процессов восстановления сосудистого русла.

Таким образом, повреждение обоих типов альвеолоцитов способствует образованию и накапливанию отечной жидкости внутри альвеол, что, вместе со всеми деструктивными осложнениями, может иметь серьезные последствия для функции газообмена в респираторном тракте в виде нарастающей гипоксии.

В интерстиции легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5М А^оо8е/Кгазпоогег5коуе/627/05, в процессе заболевания наблюдали распространенные инфильтративные изменения: показатель объемной плотности инфильтратов был максимален на 6 сутки эксперимента (табл. 6).

В клеточном составе инфильтратов с 1 по 3 сутки эксперимента преобладали макрофаги с признаками гипертрофии. К 6 суткам после инфицирования количество макрофагов уменьшилось в 1,4 раза, что, вероятно, было обусловлено их гибелью в результате цитопатического действия вируса гриппа. К 10 суткам эксперимента происходило увеличение численности клеток СМФ на 25%, с дальнейшим уменьшением к 14 суткам на 20% (см. табл. 6).

На всех сроках исследования у мышей С57В1/6 СО-8+ цитотоксические лимфоциты преобладали над СЭ-4+ лимфоцитами (Т-хелперами), видимо, потому, что инфицирование вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/ёоо8е/Кга5Поо2ег5коуе/627/05 мобилизует, в первую очередь, СО-8+ цитотоксические лимфоциты (Вппскв Е.Ь. е1

а1., 2008) (см. табл. 6).

Так, с 1 по 14 сутки эксперимента количество СП8+ Т-лимфоцитов уменьшилось на 20% и на 6 сутки заболевания в инфильтратах легких инфицированных мышей СП8+ Т-лимфоциты количественно преобладали над СБ68+ макрофагами на 20%. Это, вероятно, свидетельствует об их причастности к элиминации вирусов.

Количество С04+ Т-лимфоцитов уменьшалось к 3 суткам эксперимента с максимумом на 6 сутки эксперимента (увеличение составило 40%) (см. табл. 6).

Во все сроки эксперимента в легких наблюдали СО-1а+ дендритные клетки -источника 1 типа. Их количество увеличивалось с 1 по 14 сутки эксперимента в

2,9 раза (см. табл. 6).

С 1 по 14 сутки инфекционного процесса в инфильтратах легких инфицированных мышей в 2,3 раза нарастало количество фибробластов (табл. 6), увеличение количества этих клеток коррелировало с увеличением показателя объемной плотности волокнистой соединительной ткани у мышей линии С57В1/6, инфицированных вирусом гриппа А/115141, уже с 1 суток эксперимента, г = +0,93. Этот показатель увеличивался по сравнению с таковым у интакгных животных в 5 раз и далее к 14 суткам эксперимента более чем в 16 раз (см. табл. 6).

Таблица 6

Объемная плотность к клеточный состав инфильтратов в легких мышей после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoorerskoye/627/0S (Mim)

Объекты н параметры Срок после Мыши липни С57В1/6

исследования инфнцнровапня, суткн Иптактные Инфицированные

Объемная плотность 1 22 ±2,16'

инфильтратов (Vv), % 3 29,6 ±3,46*"

6 4,1 ±0,06 33,8 ± 3,24'

10 21,4 ± 3,3 Гь

14 16,5 ± 1,21аЬ

Клеточный состав инфильтратов (*):

1 43,2 ± 1,56'

3 46,9 ± 0,86аЬ

CD-68* макрофаги, 6 6,6 ± 0,53 33,5 ± l,08sb

10 41,9 ±3,34""

14 36,1 ± 0,52'ь

1 —

- из них многоядерных клеток, % 3 3,5 ± 0,28

6 ___ 8,2 ± 0,33ь

10 7,5 ±0,25°

14 6,1 ±0,16ъ

1 34,6 ± 0,73'

CD-8+ Т-лнмфоцнты, 3 35,5 ± 0,69'

6 3,7 + 0,25 40,9 ± 1,33'"

% 10 34,4 ± 0,89"ь

14 29,4 ± 0,77,ь

1 15,6 ±0,93'

CD-4+ Т-лимфоцнты, 3 12,2 ± 1,63*ь

6 3,3 ±0,37 17,6±2,08'ь

% 10 13,4 ±0,59"°

14 13,4 ± 1,02"

1 2,5 ± 0,35'

CD-la+дендритные 3 3,2 ± 0,42'

6 1 ±0,18 4,3 ± 0,37аЬ

клетки, % 10 5,4 ± 0,26'ь

14 7,3 ± 0,3 9аЪ

1 2,9 ± 0,57*

3 2,2 ± 0,48'

Фибробласты, % 6 1,4 ± 0,10 3,4 ± 0,45'"

10 5 ± 0,37™

14 6,8 ± 0,42аЬ

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таховыми в контроле; «Ь» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования. (*) - содержание относительно всех клеток, входящих в состав инфильтратов.

4. Исследование клеток легких мышей при развитии вирусной инфекции

А/Н5М

При исследовании методом световой микроскопии численной плотности легочных макрофагов, инфицированных мышей отмечали, что величина исследуемого параметра увеличивалась с 1 по 6 сутки эксперимента в 1,4 раза с последующим уменьшением к 14 суткам, оставаясь по-прежнему высокой (табл. 7).

Таблица 7

Результаты исследования клеток легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования вирусом гриппа А/Н5М А^оо5е/Кга8поогег5коуе/627/05 (М±ш)

Объекты и параметры исследовании Срок после Мыши лнвии С57В1/6

инфицирования, сутки Интактные Инфицированные

Численная плотность макрофагов 1 10,1 ±0,96 32 ±3,17"

3 35,2±2,41"ъ

6 44,2 ± 2,52*ь

10 28,1 ±3,2аЬ

14 24,9 ± 1,69*

Численная плотность альвеолоцитов (N31) 1 79,4 ±0,15 111,5 ±3,63'

3 116,6 ±3,19"

6 131,3 ±4,24аЬ

10 113,5 ± 2,74аЬ

14 107,7 ±3,71*

Численная плотность эндотелиоцитов 1 13,2 ±0,75 22,5 ±0,73'

3 24,9 ± 0,79й1

6 27,8 ±1,45,ь

10 16,7 ± 0,78*ь

14 11,9±0,85*ь

РС^+ макрофаги 1 1,2 ±0,54 11,3 ±0,47*

3 23,3 ± 1,88*ь

6 _ 29 ± 2,18"ь

10 17,4 ± 2,5*ь

14 1314±1,32*ь

альвеолоциты 1 5,2 ±0,36 10,5 ± 0,48*

3 15,6 ± 1,15"'

б 13,8 ± 1,07'ь

10 9,7 ± 1,38аЬ

14 10,2 ±0,93*

эндотелиоциты сосудов 1 7 ±0,59*

3 8,4 ± 026'"

6 2,7 ±0,62 9,5 ±0,69*"

10 6,5 ±0,51'ь

14 6,3 ±0,73*

Примечания: «а» - достоверность отличи* средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке эксперимента.

Накопление большого количества моноцитов/макрофагов в легочном интерстиции, перибронхиально и интра-альвеолярно, наряду с раннее приведенными данными о клеточном составе инфильтратов, а также увеличении количества дендритных клеток в них (см. табл. 6), свидетельствует об активации клеточного

звена иммунитета на ранних стадиях вирусной инфекции (Hofmann P. et al., 1997; Jiang М. et al., 2011), в частности и у мышей линии С57В1/6.

Численная плотность альвеолоцитов с 1 по 6 сутки эксперимента увеличивалась в 1,2 раза с дальнейшим уменьшением к 14 суткам в 1,2 раза, оставаясь достаточно высокой по сравнению с интакгными животными - превышая таковое значение на 26,2% (см. табл. 7).

Относительно такую же тенденцию можно проследить и у эндотелиоцитов: максимальное количество этих клеток, экспрессирующих PCNA, было на 6 сутки исследования - увеличение составило 35%, и в дальнейшем их количество уменьшалось к 14 суткам. На основе проведенного корреляционного анализа между общей численностью эндотелиоцитов и PCNA+ эндотелиоцитов, можно сделать предположение, что в поддержании численности этих клеток вносят вклад в процессы пролиферации этих клеток - г = +0,89 (см. табл. 7).

В отличие от эндотелиоцитов и макрофагов максимальное количество клеток с экспрессией этого фактора у альвеолоцитов было на 3 сутки эксперимента (см. табл. 7), что можно объяснить их более ранним контактом с вирусами (см. табл. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что инфицирование ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/O5 в клетках различного гистогенеза легких мышей инициируют в них процессы пролиферации. С позиции представлений о биологическом феномене симбиоза в форме паразитирования, это «выгодно» обоим организмам. Вирусу - для расширения трофической базы, макроорганизму - для усиленной репарации поврежденных клеток и тканей, в целом. Однако остается открытым вопрос достаточности и «качества» вновь образованных клеток.

Результаты исследования кислород-независимых и кислород-зависимых клеток легких мышей линии С57В1/6 при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

1. Исследование кислород-независимых факторов защиты клеток легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Фагоцитоз и последующая деградация микроорганизмов происходят в фаголизосомах клеток легких с помощью специализированных ферментных систем (Шкурупий В.А. и др., 1999), наиболее значимыми из которых при вирусных инфекциях являются протеолитические ферменты из группы эндопептидаз -lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, осуществляющие внутриклеточное расщепление белковых структур вирусов (Burster Т. et al., 2007).

В легочных макрофагах, цитоплазматическая экспрессия lysozyme была максимальной в 1 сутки эксперимента и превышала таковую в контрольной группе в 6,6 раза и к 10 суткам она уменьшалась в 3,6 раза (табл. 8).

К 14 суткам после инфицирования количество позитивных по данному маркеру макрофагов было увеличено на 49%, что может быть связано с продолжающейся циркуляцией вируса в легких и их клиринговой функцией в отношении продуктов некроза и апоптоза клеток легких (см. табл. 2).

Экспрессия cathepsin D в цитоплазме легочных макрофагов была максимальной в 1 и 6 сутки после инфицирования и превышала таковую в контрольной группе в 3 и 3,6 раза соответственно. Величина данного параметра уменьшалась с 1 по 3 сутки эксперимента в 2,2 раза, затем увеличивалась к 6 суткам эксперимента в 2,6 раза и уменьшалась к 14 суткам в 2 раза (см. табл. 8).

Таблица 8

Результаты исследования численных плотностей легочных макрофагов, экспрессирующвх внутриклеточные лиюсомальные энзимы после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/0S (М±т)__

Объекты и параметры исследования Срак после инфицирования, сутки Мыши линии С57В1У6

Интактные Инфицированные

Численная плотность Р<Ы) Ьуг+ макрофагов 1 3,7 + 0,55 24,2 ±1,42*

3 16,3 ±0,73"ь

6 6.7 ±0,71*°

10 3,9±0,35ь

14 5,8 ± 0,83*ь

Численпая плотность (N30 Са№ 1)+ макрофагов 1 4,9 ± 0,84 14,б ±1,02*

3 6,7 ± Ода"

6 17,6 ±1,89"

10 14,1 ±0,42"

14 8,5 ± йог""

Численная плотность (N»0 Муе1+ макрофагов 1 3,6 ± 0,63 20,8 ± 2,00*

3 25,6 ±0,63"'

6 18,8 ±0,52""

10 9,2±0,7"ь

14 9,5 ±0,63"

Примечания- «а» - достоверность отличи» средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отличил средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

Экспрессия myeloperoxidase в цитоплазме легочных макрофагов была максимальной на 3 сутки эксперимента - увеличение величины параметра составило 25% в дальнейшем величина этого параметра уменьшилась к 14 суткам после инфицирования в 2 раза. Но в 1 сутки заболевания она превышала контрольное

значение почти в 6 раз (см. табл. 8).

Активную роль в неспецифическом противовирусном иммунитете играют альвеолоциты и эндотелиоциты сосудов легких за счет их внутриклеточные эндопептидаз.

Максимальная концентрация альвеолоцитов, в которых регистрировал! экспрессию lysozyme, была в 1 сутки эксперимента (превышая аналогичный параметт в контроле в 10 раз). В дальнейшем она уменьшилась к 6 суткам более чем в 2 раз; (табл. 9). Однако, к 14 суткам после инфицирования, вновь возросла на 50% i превышала аналогичную величину в контроле в 6,7 раза (см. табл. 9).

Максимальное количество эндотелиоцитов, в которых регистрировал! цитоплазматическую экспрессию lysozyme, была также на 3 сутки эксперимент (увеличение составило 1,7 раза) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам поел инфицирования в 2,1 раза (см. табл. 9).

Количество альвеолоцитов, положительных на маркер myeloperoxidase бьин максимальным в 1 сутки эксперимента, око превышало таковое у интактны животных в 5,6 раза и оставалось высоким до 14 суток эксперимента. Исключени составили 6 сутки эксперимента, где экспрессия в целом снижалась в 2,2 раз относительно максимальной (см. табл. 9).

Максимальное количество эндотелиоцитов сосудов легких мышей лини С57В1/6, инфицированных ВГ A/H5N1, в цитоплазме которых регистрировал экспрессию myeloperoxidase, было в 6 и 10 сутки эксперимента (увеличени

экспрессии с 1 по 10 сутки составило 70%) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам эксперимента на 30% (см. табл. 9).

Таблица 9

Результаты исследования численных плотностей альвеолоцитов и эндотелиоцитов сосудов легких, экспрессирующих внутриклеточные энзимы при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования Срок после инфицирования, сутки Мыши линии С57В1/6

Интактные Инфицированные

Численная плотность (N81) Ьуг+ альвеолоцитов 1 1,8 ±0,25 17,7 ± 1,27*

3 10,1 ± 1,15а"

6 7,7 ± 0,57ав

10 11,3 ± 1,67*"

14 11,7± 1,19*

Численная плотность (N81) СаЙ1 0+ альвеолоцитов 1 2,2 ±0,31 11,5 ±0,76"

3 9,9 ± 1,18аЬ

6 8,4 ± 0,92а

10 9,3 ± 1,18*

14 11,5 ±1,2 Г"

Численная плотность (N81) Муе1+ альвеолоцитов 1 2,1 ±0,30 11,9 ± 0,81а

3 11,4 ±0,94*

6 5,3 ± 0,21*"

10 11,6 ±1,01"'

14 11,4 ±0,72*

Численная плотность (N81) Ьуг+ эндотелиоцитов 1 1,8 ±0,48 6,7 ± 0,67*

3 11,4 ± 0,75аЬ

6 5,6 ± 0,93ао

10 6,3 ± 0,88*

14 5,4 ±0,45*

Численная плотность (N81) Са1Ь Р+ эндотелиоцитов 1 2,7 ±0,33 5,8 ± 0,36*

3 10,8 ± l,78aD

6 7,7 ± 1,15*"

10 7,2 ± 0,55*

14 7,4 ±0,58*

Численная плотность (1\а1) Муе1+ эндотелиоцитов 1 2,6 ± 0,38 5,7 ± 0,42*

3 7± 1,65"

6 9,5 ± 1,74аЬ

10 9,4± 1,19*

14 7,4 ± 0,49аЬ

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

Концентрация альвеолоцитов, в которых регистрировали экспрессию саЛервт В, была существенно повышена во все периоды исследования по сравнению с таковой у ингактных животных (см. табл. 9). В эндотелиоцитах цитоплазматическая экспрессия СаШервш О была максимальной на 3 сутки эксперимента (увеличение составило 86%) с дальнейшим уменьшением к 14 суткам на 47% (см. табл. 9).

Несмотря на то, что через сутки после инфицирования большинство визуализируемых клеток на антиген вируса гриппа A/H5N1 были эндотелиоцитами (см. табл. 2), максимальная концентрация клеток, экспрессируюцщх факторы неспецифической защиты - лизосомальные гидролазы, отвечающих за уничтожение вирусных частиц была в популяциях макрофагов и альвеолоцитов. Анатомическое положение трех исследуемых типов клеток на границе внешней и внутренней сред организма, видимо, определяло их сходство в «оснащенности» внутриклеточной системой протеолиза, несмотря на существенные различия в их специализированных функциях.

2. Исследование кислород-зависимых факторов защиты клеток легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Важную роль в противовирусной защите отводят системе оксида азота, которая через активацию индуцибельной и эндотелиальной NO-синтаз (iNOS и eNOS) ингибирует электрон-транспортные группы ферментов вирусов, участвующих в цикле Кребса и синтезе ДНК (Gutierrez G. et al., 1995; Львова A.B. и др., 2010).

Количество макрофагов, в которых регистрировали экспрессию eNOS, было максимальным в 1 сутки эксперимента и по сравнению с контролем оно было большим в 4,1 раза. К 10 и 14 суткам эксперимента концентрация eNOS+ клеток уменьшилась, но все еще превышала таковую в группе интактных животных на 44% и 92% соответственно (табл. 10). Это, возможно, может быть связано с «переключением» на продукцию iNOS, как более сильного индуктора оксида азота. Активация экспрессии eNOS альвеолоцитами - проявление неспецифичной кислород-зависимой защитной реакции. Максимальное количество альвеолоцитов, в которых регистрировали экспрессию eNOS было в 1 сутки эксперимента. К 3 суткам заболевания количество этих клеток уменьшилось на 44% и на протяжении всех оставшихся сроков оставалось одинаковым (см. табл. 10). Количество эндотелиоцитов с цитоплазматической экспрессией eNOS было максимальным в 1 сутки эксперимента, с уменьшением к 6 суткам эксперимента в 2,5 раза с дальнейшим, незначительным повышением величины данного параметра к 14 суткам заболевания на 42% (см. табл. 10). Изменения величин этих параметров характеризовалось сильной прямой корреляционной связью с динамикой клиренса вируса в этих клетках (г= +0,95). Эти данные свидетельствуют о том, что поддержание на постоянном уровне количества клеток, экспрессирующих eNOS, сопряжено либо с элиминацией клеток с вирусом, либо с элиминацией вируса из клеток.

В проявлениях экспрессии eNOS и iNOS исследованными клетками проявлялась закономерность. Экспрессия eNOS была максимальной на ранних сроках после инфицирования и была большей, чем iNOS, экспрессия последней у макрофагов и альвеолоцитов усиливалась по мере снижения экспрессии eNOS (см. табл. 10). Количество легочных макрофагов, в которых регистрировали экспрессию iNOS, увеличивалось с 1 по 10 сутки эксперимента в 6,9 раза с дальнейшим уменьшением к 14 суткам эксперимента в 3,4 раза (см. табл. 10). С 1 по 3 сутки эксперимента количество альвеолоцитов, «положительных» на маркер iNOS, увеличивалось на 58% с дальнейшим уменьшением к 10 суткам на 68% и вновь увеличивалось к 14 суткам в 2,2 раза (см. табл. 10). Это может быть связано с изменением динамики персистенции вируса в альвеолоцитах легких, когда в поздние периоды после инфицирования

происходит повторное увеличение количества клеток, позитивных на маркер ВГ A/H5N1. Это вероятнее всего является следствием повторного цикла репродукции и персистенции вируса (см. табл. 2).

Таблица 10

Результаты псследоваиия численных плотностей клеток легких, экспрессирующих NO-синтазы после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/OS

(М±ш)

Объекты и параметры исследования Срок после инфицирования, сутки Мыши линии С57В1/6

Интактные Инфицированные

Численная плотность (Nai) INOS+ макрофагов 1 3,6 ±0,39 4,1 ±0,59

3 9,4 ±0,8 Г"

6 15,7 ± 1,22"ь

10 27,9 ± 2,78аЬ

14 8,1 ± 0,67аЬ

Численная плотность (Nai) eNOS+ макрофагов 1 5 ±0,21 20,7 ± 2,66'

3 15,4±2,78*ь

6 10,4 ± 0,42аЬ

10 7,3 ± 0,31*ь

14 9,6 ± 0,76*ь

Численная плотность (Nai) ÍNOS+ альвеолоцитов 1 2,1 ±0,21 5,7 ± 0,79a

3 9 ± 0,76аЬ

6 8,8 ± 0,91a

10 5,4 ± 0,63,ь

14 11,8 ± 1,66аЬ

Численная плотность (Nai) eNOS+ альвеолоцитов 1 1,7 ±0,33 10,4 ±0,76"

3 7,2±0,72,ъ

6 6,2 ± 0,54"

10 6 ± 0,54a

14 7,1 ±0,59'ь

Численная плотность (Nal) ¡NOS+ знаотелиоцитов 1 2,1 ±0,31 6,7 ± 0,80a

3 7,6 ± 0,78"

6 6,1 ±0,64"

10 5,8 ± 0,58"

14 6,3 ± 0,48a

Численная плотность (Nai) eNOS+ 1 10,9 ±0,79*

3 8,3 ± 0,561Ь

6 2 ± 0,32 4,4 ± 0,22аЬ

10 5,2 ± 0,28"

эндотелиоциты 1 14 6,2 ± 1,01a

Примечания: «а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в контроле; «Ь» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров по сравнению с таковыми в предыдущем сроке исследования.

Экспрессия ¡NOS в цитоплазме эндотелиоцитов сосудов легких на протяжении всего эксперимента остается примерно одинаковой и в среднем превышает как таковую величину у интактных мышей в 3 раза (см. табл. 10). Видимо, это сопряжено с постоянным и более частым контактом эндотелиоцитов с циркулирующими в крови вирусами. При этом наблюдается средняя сила корреляционной связи с количеством инфицированных эндотелиоцитов (г = +0,64) и с эндотелиоцитами, в которых регистрировали экспрессию iNOS (г = + 0,62).

3. Исследование цитокинового статуса легочных макрофагов, альвеолоцитов и эндотелиоцитов сосудов легких мышей линии C57BI/6 после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

Иммунопатогенез гриппа, вызываемого ВГ A/H5N1 проявляется, в первую очередь, гиперпродукцией и гиперсекрецией, а также гиперцитокинемией провоспалительных цитокинов, среди которых важную роль отводят IL-6 и TNF-a. Максимальное количество легочных макрофагов экспрессирующих IL-6 было на 3 сутки исследования - увеличение составило 44% (табл. 11).

Таблица 11

Результаты исследования клеток легких, экспрессирующих провоспалительные цитокнаы, мышей лввни С57В1/6, инфицированные вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объекты и параметры исследования Срок после инфицирования, сутки Мыши линии С57В1/6

Иптакгные Инфицированные

Численная плотность (Nai) IL-6+ макрофагов 1 4,4 ± 0,26 18,2 ±2,96"

3 26,3 ±2,1 Г"

6 21,1 ±2,35'"

10 15,4 ± 1,86*"

14 14,3 ± 1,55*

Численная плотность (Nai) TNF-a+ макрофагов 1 4,9 ± 0,39 13,9 ±1,2'

3 18,9 ± 1,62"ь

6 25,3 ±1,5""

10 20,5 ± 1,44""

14 12 ± 1,45a"

Численная плотность (Nai) IL-6+ альвеолоцитов 1 7,8 ±0,63 9,5 ± 0,64*

3 10,6 ±0,94'

6 6,2 ±0,92*"

10 11,6±0,96*ь

14 13,5 ±1,29*

Численная плотность (Nai) TNF-a+ альвеолоцитов 1 4,1 ±0,48 7,7 ±0,41*

3 14,2 ±0,65*"

6 17,9 ±0,94°"

10 15,3 ± 1,02°ь

14 10,5 ±0,93*"

Численная плотность (Nai) IL-6+ эндотелиоцитов 1 2,3 ±0,25 10,9 ±0,73*

3 15,2 ± 1,03a"

6 8,7 ± 0,39*"

10 7,3 ± 0,42'"

14 7,7 ± 0,63'

Численная плотность (Nai) TNF-CL+ Эндотели оцитов 1 2,8 ± 0,32 4,3 ±0,18*

3 7,6 ±0,38*"

6 13,5 ±0, 52a"

10 7,8 ± 0,43*"

14 7,4 ± 0,64*

Примечания: «а» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров контроля с таковыми у инфицированных мышей; «Ь» - достоверность отличия величин рассматриваемых параметров с предыдущим сроком исследования.

Максимальное количество альвеолоцитов, экспрессирующих IL-6 было на 14 сутки исследования, что указывает на продолжающееся усиление воспаления (см. табл. 11).

Количество эндотелиоцитов сосудов легких, в которых регистрировали экспрессию IL-6, через сутки после инфицирования превышало величину таковой в контроле в 4,7 раза (см. табл. 11). На 3 сутки после инфицирования - увеличение данных клеток составило 38% и в дальнейшем оно уменьшалось к 14 суткам эксперимента в 2,2 раза (см. табл. 11).

Максимальное количество клеток, с цитоплазматической экспрессией второго рассматриваемого «противовирусного» цитокина — фактора некроза опухоли - TNF-a было на 6 сутки эксперимента. Это наблюдали во всех трех типах исследованных клеток - альвеолоцитах, макрофагах и эндотелиоцитах сосудов легких. В среднем увеличение данного параметра у мышей линии С57В1/6 по сравнению с таковыми у мышей в контрольной группе было в 4 - 5 раза. (см. табл. И). Эти данные свидетельствуют о том, что TNF-a начинает медиировать процессы воспаления несколько раньше, нежели IL-6.

Выявленные уровни провоспалительных цитокинов и каскадные кислород-зависимые и кислород-независимые защитные реакции у всех трех типов рассматриваемых клеток являются одновременно и факторами риска деструктивных осложнений «подстегивающих» воспаление.

ВЫВОДЫ

1. Альвеолоциты и эндотелиоциты сосудов интактных мышей линии С57В1/6 вне связи со специфичностью выполняемых ими функций, совместно с макрофага* и легких представляют собой единую поэлементно взаимодополняемую систему защиты внутренней среды организма в связи с особенностями их топологии в легких и определенного цитофизиологического сходства, проявляющегося высоким уровнем экспрессии ими лизосомальных протеаз (lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase); NO-синтаз (eNOS и iNOS), а также провоспалительных цитокинов - TNF-a и IL-6.

2. Высокая вирулентность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его способностью инфицировать и персистировать в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагах легких мышей, поскольку его экспрессия отмечена в этих клетках и достигает пика к 3 суткам после инфицирования и затем, после резкого ее снижения, он остается в них на постоянном, существенно более низком, уровне. Наибольший уровень экспрессии антигена вируса гриппа А альвеолоцитами, очевидно, связан с аэрогенным способом и более ранним, чем у других клеток, контактом с вирусом, обусловленным их анатомическим положением в легких.

3. Высокая тропность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 к альвеолоцитам и эндотелиоцитам легких мышей линии С57В1/6, его цитотоксичность детерминируют цепь последовательно развивающихся патологических структурных изменений: деструкцию сосудов, увеличение их проницаемости, тромбоэмболические и геморрагические осложнения, масштабные интерстициальный и внутриальвеолярный отек, десквамацию альвеолярного эпителия с развитием очагов ателектазов и диффузной острой эмфиземы, создающих патогенетические условия для острой гипоксии — фактору риска усиления процессов деструкции вне прямой связи с цитопатичностью вируса.

4 Вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 индуцировал масштабную гибель альвеолоцитов, эндотелиоцитов и макрофагов легких механизмами некроза и апоптоза, с доминированием последнего. Можно полагать, что к индукции апоптоза причастно и состояние острой гипоксии, с последующей ишемией, обусловливающими развитие некроза. Апоптоз как вероятный, но катастрофичный для организма способ элиминации вируса, очевидно, «предпочтителен» для обоих участников инфекционного процесса, поскольку в меньшей степени индуцирует воспаление с его рисками деструкции клеток.

5 Для вирусной инфекции A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 характерна картина раннего развития высокой активности и масштабных репаративных процессов в легких, проявляющаяся пролиферативной активностью альвеолоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров, заместительной репаративнои регенераций в системе соединительной волокнистой ткани, образованием многоядерных (полиплоидных) макрофагов. Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер -способствует восстановлению утраченных структур, но как классическое проявление паразитизма в симбиозе - расширяет трофическую базу вируса, способствуя прогрессированию инфекции.

6 Инфицирование вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 ведет к активации кислород-независимых (протеазы) и кислород-зависимых (NO-сштгазы) факторов защиты в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагов легких, вне зависимости от выполняемых ими специфических функций, что характеризует их как единую систему противовирусной защиты легких организма. Отсроченный характер активации экспрессии iNOS, после максимума проявления eNOS, видимо, носит компенсационный характер, тогда как экспрессия индуцибельной синтазы эндотелиоцитами сосудов была ранней и сохранялась на высоком уровне в течение всего эксперимента, возможно, в связи с постоянным контактом этих клеток с циркулирующим вирусом.

7 Инфицирование мышей вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с активацией иммунного ответа в легких, о чем свидетельствуют массивные инфильтраты в легких, представленные CD-68+ легочными макрофагами, CD-la+ дендритными клетками, CD-8+ цитотоксическими лимфоцитами, но очевидно недостаточной для элиминации вируса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Морфофункциональные особенности легочных макрофагов у мышей оппозйтных линий СВА и C57Bl/6g / O.B. Потапова, Л.А. Черданцева, Т.В. Шаркова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгана, A.B. Ковнер // Фундаментальные исследования. -

2010. - № 10. - С. 34-39. (Из списка ВАК)

2 Ковнер A.B. Функциональная активность легочных макрофагов мышей, инфицированных вирусом гриппа А/ H5N1 / A.B. Ковнер, О.В. Потапова //Студент и научно-технический прогресс: Материалы XLIX Международной научная студенческой конференции - 2011, Новосибирск. - С. 28.

3 Структурно-функциональные изменения легочных макрофагов и легких мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/krasnoozerskoye/627/05 / А В Ковнер А.Г. Аникина, О.В. Потапова, Т.В. Шаркова, Л.А. Черданцева, В.А.

Шкурупий, A.M. Шестопалов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № 2. - С. 196-199. (Из списка ВАК)

4. Ковнер A.B. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе A/H5N1 у млекопитающих / A.B. Ковнер, А.Г. Аникина, О.В. Потапова // Клинические и теоретические аспекты современной медицины: Материалы IV Международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых. - 2012, Москва. - С. 49-50.

5. Ковнер A.B. Морфофункциональные изменения эндотелиоцитов сосудов легких при гриппе A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей / A.B. Ковнер, О.В.Потапова, В.А.Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № 10. - С. 472-475. (Из списка ВАК)

Автор благодарит сотрудников лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа под руководством Шестопалова A.M., ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) за ведение совместного эксперимента.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГ - вирус гриппа

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ИГХ - иммуногистохимический

МЛД50- мышиная летальная доза, при которой погибает 50% мышей

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

Cath D — катепсин Д

CD - кластер дифференцировки

DAB - 3,3' - диаминобензидин

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

FITC - флуоресцина изотиоционат

IFN - интерферон

11-6 - интерлейкин-6

Inf А - антитела к антигену вируса гриппа A/H5N1

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

Lyz — лизоцим

Myel - миелопероксидаза

Nai - численная плотность

NO - оксид азота

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток TNF-a - фактор некроза опухоли a Vv - объемная плотность

Соискатель Ковнер A.B.

Подписано к печати 18.09.2012 формат - 60x84 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 550 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56,225-04-47

В настоящее время инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем, занимают лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний человека. Вирус гриппа (ВГ) A/H5N1 наиболее патогенный среди других вирусов гриппа. По данным ВОЗ уже за 2010-2011 гг., в эпизоотию, вызванную ВГ A/H5N1, были вовлечены страны Африки, Азии и Европы и летальность среди людей остается по-прежнему высокой - от 60 до 73%; среди детей - до 15 лет - до 89% (www.who.int/ru/, 2010-2011). Высокая патогенность вирусов гриппа А связана с воздействием белков вируса на иммунную систему хозяина и, в частности, с угнетением клеточного звена иммунитета (Chan Р.К., 2002; Korteweg С., Gu J., 2008).

Грипп и другие респираторные вирусные инфекции являются наиболее массовыми заболеваниями, которые, по данным многих специалистов, занимают ведущее место в структуре инфекционных болезней и составляют 80-90% от всех случаев инфекционной патологии. Если учитывать способность вируса гриппа вызывать частые эпидемии и даже пандемии, можно утверждать, что он является проблемой мирового значения. В период эпидемии болеет от 5 до 20% населения. При пандемиях, когда возникает резкое изменение свойств вируса (в частности контагиозность), может заболеть каждый второй человек (Малый В.П. и др., 2007; Ющук Н.Д. и др., 2007).

Постоянная «эволюция» вирусов гриппа A/H5N1, возможность их реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции штаммами ВГ А и лекарственная полирезистентность к имеющимся противовирусным препаратам являются факторами, обусловливающими опасность появления нового высокопатогенного и высококонтагиозного антропозоонозного ВГ A/H5N1 и его распространения как пандемичного (ВОЗ, 2010; Shortridge K.F. et al., 2000; Ilyushina N.A. et al., 2010). Несмотря на высокую актуальность проблемы гриппа, ряд аспектов патогенеза данного заболевания у млекопитающих и человека остается малоизученным.

Наиболее выраженные патологические изменения при ВГ A/H5N1 зарегистрированы в дыхательных путях млекопитающих и человека, что связано с пневмотропностыо вируса (Свирщевская Е.В. и др., 2005; van Riel D. et al., 2006; Gu J. et al., 2007). Поэтому ведущее значение в иммунопатогенезе гриппа A/H5N1 принадлежит эндотелиоцитам сосудов легких, альвеолоцитам и клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) - легочным макрофагам, как первой линии защиты, которые имеют свои функциональные особенности. Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности, макрофаги выполняют функцию барьера на пути проникновения в организм возбудителя, способствуя ограничению распространения вируса в организме, и играют ключевую роль в инициации и регуляции иммунного ответа при гриппе. Функциональная недостаточность данных клеток, не обеспечивающая барьерной функции при инфицировании, является основой возможных тяжелых осложнений при респираторных вирусных заболеваниях, в том числе и при гриппе A/H5N1 (Шкурупий В.А. и др., 1999; Li N. et al., 2008).

Анализ научной литературы не позволяет составить полного представления о морфофункциональных характеристиках клеток легких при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1. Известны лишь единичные работы по выявлению ультраструктурных изменений макрофагов млекопитающих при их инфицировании вирусами гриппа (Потапова О.В. и др., 2008;

Шестопалова JI.B. и др., 2011; Woo Р.С. et al., 2010; Sakabe S. et al., 2011; Lee

S.M. et al., 2011), альвеолоцитов (Шестопалова JI.B. и др., 2011: van Riel D. et al., 2006; Baskin C.R. et al., 2009; Chan M.C. et al., 2009), эндотелиоцитов сосудов легких (Chan M.C. et al., 2009; Viemann D. et al., 2011; Zeng PI. et al.,

2012). Однако комплексная иммуноморфологическая оценка структурнофункциональных особенностей исследуемых клеток при гриппе A/H5N1 позволит не только улучшить диагностику вирусных инфекций, научно обоснованно осуществить прогнозирование развития болезни и её осложнений, но и одновременно осуществить принципиально новые подходы 6 к профилактике и лечению гриппа, направленные на снижение риска заболеваемости гриппом людей и уменьшение частоты и тяжести его осложнений.

В связи с вышеизложенным были определены цель и задачи исследования.

Цель исследования: изучить морфофункциональные и количественные изменения клеток легких (альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов) мышей линии С57В1/6 в процессе формирования противовирусного ответа на инфицирование вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оозе/Кга8поо2егзкоуе/627/05.

Задачи исследования:

1. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких у интактных мышей линии С57В1/6.

2. Методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии исследовать топологию вируса в клетках легких мышей линии С57В1/6, инфицированных штаммом вируса гриппа А/Н5Ы1 А^оо8е/Кгазпоо2ег8коуе/627/05 на разных сроках заболевания.

3. Изучить структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57В1/6 в динамике развития вирусной инфекции.

4. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких мышей линии С57В1/6 после инфицирования вирусом гриппа А/Н51Ч1 А/£оозе/Кгазпоо2ег8коуе/627/05 и их вероятную регуляторную роль в развитии вирусной инфекции.

Научная новизна результатов исследования

Впервые на интактных мышах-самцах линии С57В1/6 методами морфометрии и иммуногистохимии было показано, что альвеолоциты, эндотелиоциты и макрофаги легких вне зависимости от специализированных функций клеток первых двух типов представляют собою единую структурнофункциональную систему поэлементно способную дополнять друг друга в 7 выполнении функции поддержания гомеостаза в организме своими развитыми системами лизосомальных протеаз, NO-синтаз, экспрессией полипотентных провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6.

Впервые методами иммунофлуоресцентной микроскопии было показано персистирование вируса гриппа A/H5N1 штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов легких и макрофагах мышей линии С57В1/6. Было установлено, что первыми в противовирусную «борьбу» включаются и инфицируются альвеолоциты в связи с анатомическим расположением и наличием у них на клеточной поверхности сиаловых кислот, затем эндотелиальные клетки сосудов, что свидетельствует о диссеминации вируса и легочные макрофаги.

Вирус индуцирует в этих клетках процессы деструкции апоптозом, их пролиферацию, активацию экспрессии внутриклеточных энзимов лизосомальные гидролазы - lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, N0синтазы - eNOS и iNOS), а также цитокинов. Показано, что кроме цитопатического действия вирусов на эти клетки после интернирования в них, на увеличение масштаба деструктивных процессов в легких оказывают влияние развивающаяся патогенетически поэтапно - системная гипоксия и ишемия вследствие: деструкции сосудов с развитием геморрагических и тромбоэмболических осложнений, повышения проницаемости и развития отечного синдрома в интерстиции и альвеолах, деструкции альвеолярного эпителия и острой диффузной эмфиземы, активации синтеза оксида азота и создания условий для лабилизации мембран лизосом с последующей стимуляцией репаративной регенерации по типу substitucio, усугубляющей нарушение процессов газообмена. Впервые показано, что инфицирование этих клеток кроме деструкции сопряжено с выраженной активацией процессов пролиферации, восстанавливающей нарушенный структурный гомеостаз в легких, но расширяющих трофическую базу для вируса.

Показано, что инфицирование вирусом гриппа A/H5N1

A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с существенной активацией 8 клеточного звена иммунитета, резкого увеличения экспрессии провоспалительных полипотентных цитокинов TNF-a и IL-6, способных также усилить как процессы пролиферации и деструкции так и фиброзирования органа. Изучены масштабы и динамика экспрессии каждого из этих цитокинов клетками трех вышеупомянутых типов.

Научно-практическое значение работы

Полученные данные дополняют известные сведения о патогенезе гриппа A H5N1 в легких млекопитающих (Шаркова Т.В. и др., 2008; Шестопалов A.M. и др., 2008; Uiprasertkul М.Р. et al., 2007; Zeng Н. et al., 2012).

Масштабы, характер и динамика исследованных деструктивных последствий в легких после инфицирования ВГ A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 свидетельствуют о необходимости максимально раннего лечения и профилактики данного заболевания. Полученные результаты о роли альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов легких в патогенезе деструкции легких после инфицирования ВГ А могут быть использованы для разработки средств профилактики заболевания и лечения осложнений.

Полученные данные существенно дополняют плохо изученный патогенез вирусной инфекции, вызываемой новым штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что может быть внедрено в процесс преподавания патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетической терапии в соответствии с формирующимися синдромами заболевания.

По материалам исследования опубликовано 3 научных работы и 2 тезисов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа АН5Ы1 А/£оозе/Кгазпоогег8коуе/627/05 способен инфицировать альвеолоциты, эндотелиоциты сосудов и макрофаги легких, что сопряжено с их гибелью и персистенцией вируса в них на протяжении всего эксперимента. Инфицирование этим вирусом гриппа индуцирует развитие каскада патологических процессов, итогом, которых является создание условий для развития острой системной гипоксии и ишемии, следствием которых являются масштабные процессы деструкции, доминирующие в проявлениях ответной реакции организма (в частности легких) на вирус.

2. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5Ы1 сопряжено с активацией репаративных процессов, проявляющихся пролиферацией альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов легких, способствующих восстановлению утраченных структур, но расширяющих трофическую базу для вируса. Они проявляются заместительным и постгипоксическим фиброзированием легких, ухудшающим условия для газообмена в интерстиции.

3. Альвеолоциты и эндотелиоциты вне связи с их специализированными функциями вместе с макрофагами легких формируют единую систему сохранения внутренней среды организма за счет высокой экспрессии ими протеаз и ЫО-синтаз, способности резко усиливать экспрессию ТКР-а и 1Ь-6. Вместе с тем, в условиях острой гипоксии, эти проявления защитной функции вышеуказанных клеток могут усугубить деструкцию легких в связи с возможной пермеабилизацией лизосом, усилением образования активированных метаболитов кислорода. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5М1 сопряжено с активацией клеточного звена иммунитета, однако недостаточной для его эффективной элиминации.

выводы

1. Алызеолоциты и эндотелиоциты сосудов интактных мышей линии С57В1/6 вне связи со специфичностью выполняемых ими функций, совместно с макрофагами легких представляют собой единую поэлементно взаимодополняемую систему защиты внутренней среды организма в связи с особенностями их топологии в легких и определенного цитофизиологического сходства, проявляющегося высоким уровнем экспрессии ими лизосомальных протеаз (lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase); NO-синтаз (eNOS и iNOS), a также провоспалительных цитокинов - TNF-a и IL-6.

2. Высокая вирулентность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 связана с его способностью инфицировать и персистировать в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагах легких мышей, поскольку его экспрессия отмечена в этих клетках и достигает пика к 3 суткам после инфицирования и затем, после резкого ее снижения, он остается в них на постоянном, существенно более низком, уровне. Наибольший уровень экспрессии антигена вируса гриппа А альвеолоцитами, очевидно, связан с аэрогенным способом и более ранним, чем у других клеток, контактом с вирусом, обусловленным их анатомическим положением в легких.

3. Высокая тропность вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 к альвеолоцитам и эндотелиоцитам легких мышей линии С57В1/6, его цитотоксичность детерминируют цепь последовательно развивающихся патологических структурных изменений: деструкцию сосудов, увеличение их проницаемости, тромбоэмболические и геморрагические осложнения, масштабные интерстициальный и внутриальвеолярный отек, десквамацию альвеолярного эпителия с развитием очагов ателектазов и диффузной острой эмфиземы, создающих патогенетические условия для острой гипоксии - фактора риска усиления процессов деструкции вне прямой связи с цитопатичностыо вируса.

4. Вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 индуцировал масштабную гибель альвеолоцитов, эндотелиоцитов и макрофагов легких

95 механизмами некроза и апоптоза, с доминированием последнего. Можно полагать, что к индукции апоптоза причастно и состояние острой гипоксии, с последующей ишемией, обусловливающими развитие некроза. Апоптоз как вероятный, но катастрофичный для организма способ элиминации вируса, очевидно, «предпочтителен» для обоих участников инфекционного процесса, поскольку в меньшей степени индуцирует воспаление с его рисками деструкции клеток.

5. Для вирусной инфекции А/Н5Ш А/^оозе/Кгазпоо2ег8коуе/627/05 характерна картина раннего развития высокой активности и масштабных репаративных процессов в легких, проявляющаяся пролиферативной активностью альвеолоцитов и эндотелиоцитов, новообразованием капилляров, заместительной репаративной регенераций в системе соединительной волокнистой ткани, образованием многоядерных (полиплоидных) макрофагов. Высокий уровень пролиферации в рассматриваемых экспериментальных условиях носит двойственный характер - способствует восстановлению утраченных структур, но как классическое проявление паразитизма в симбиозе - расширяет трофическую базу вируса, способствуя прогрессированию инфекции.

6. Инфицирование вирусом гриппа А/Н5Ы1 А/§оозе/Кгазпоо2егзкоуе/627/05 ведет к активации кислород-независимых (протеазы) и кислород-зависимых (№Э-сшггазы) факторов защиты в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагов легких, вне зависимости от выполняемых ими специфических функций, что характеризует их как единую систему противовирусной защиты легких организма. Отсроченный характер активации экспрессии ¡N08, после максимума проявления еИОЗ, видимо, носит компенсационный характер, тогда как экспрессия индуцибельной синтазы эндотелиоцитами сосудов была ранней и сохранялась на высоком уровне в течение всего эксперимента, возможно, в связи с постоянным контактом этих клеток с циркулирующим вирусом.

7. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5М1 А^оо8е/Кгазпоо2егзкоуе/627/()5 сопряжено с активацией иммунного ответа в легких, о чем свидетельствуют массивные инфильтраты в легких, представленные СО-68+ легочными макрофагами, СО-1а+ дендритными клетками, СБ-8+ цитотоксическими лимфоцитами, но очевидно недостаточной для элиминации вируса.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время большинство исследований в связи с проблемой гриппа А/Н5№ посвящены описанию клинических и патогенетических особенностей легких, созданию средств профилактики и лечения на основе данных о патогенезе вируса гриппа А/Н5Ш. К сожалению, вирус гриппа А/Н5И1, в том числе А^оо8е/Кга8Поогегекоуе/627/05, имеет высокий потенциал к генной рекомбинации и реассортации фрагментов генома, что позволяет ему достаточно быстро приобретать устойчивость к различному типу существующих противоинфекционных средств. Однако полного понимания патогенеза ВГ А/Н51Ч1 нет, что обусловливает необходимость дальнейшего его изучения и, в частности, роли: альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и легочных макрофагов, как системы клеток в легких, находящихся первыми на пути проникновения вируса.

ВГ А успешно реплицируется в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов и макрофагах легких уже в 1 сутки после инфицирования (табл. 3). Ранняя репликация ВГ А в альвеолоцитах и альвеолярных макрофагах объясняется их анатомическим расположением и выполняемыми функциями. Успешная репликация вируса гриппа и последующая его персистенция в эндотелиоцитах свидетельствует о недостаточности противовирусной защиты двух других типов клеток и дальнейшей диссеминации вируса через кровеносные сосуды.

В легких инфицированных мышей во все сроки эксперимента наблюдали признаки интерстициальной пневмонии с формированием воспалительных инфильтратов, преимущественно лимфоцитарно-макрофагального характера (с преобладанием СЭ8+ Т-клеток), очаги ателектазов, альвеолярного и интерстициального отека с формированием гиалиновых мембран, множественные кровоизлияния. Во все сроки исследования выявляли морфологические признаки геморрагического синдрома в виде выраженного полнокровия сосудов, кровоизлияний, сладж-эффекта со склонностью к тромбозу мелких сосудов в сочетании с формированием деструктивных изменений стенок сосудов в виде фибриноидного набухания и зон

90 фибриноидного микронекроза, что сопровождалось развитием альвеолярного и межтканевого отека легких с заполнением просвета альвеол десквамированными альвеолоцитами, легочными макрофагами, эритроцитами, лимфоцитами и небольшим количеством фибрина.

Наряду с нарушением кровообращения в легких мышей начиная с 1 суток инфицирования наблюдали процессы масштабной деструкции, связанные с цитопатическим действием вируса гриппа A/H5N1

A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что приводило к гибели альвеолярного эпителия с формированием очагов ателектазов и острой эмфиземы. Также наблюдали и другой «затратный» для организма способ элиминации вируса из инфицированных клеток легких уже с 1 суток эксперимента в виде апоптоза клеток, который, как полагают, блокирует вирусную инфекцию.

На 3 сутки эксперимента репликация вируса в легочных макрофагах и альвеолоцитах достигала своего пика. По сравнению с остальными клетками, количество зараженных альвеолоцитов было меньшим, очевидно, из-за их масштабной гибели - апоптозом (49,7%).

Ранний и масштабный каспазо-зависимый апоптоз наблюдали также в эндотелиоцитах и легочных макрофагах, его активность имела прямую корреляцию с экспрессией других противовирусных факторов. Также, начиная с 1 суток инфекционного процесса, наблюдали увеличение численной плотности всех трех типов исследуемых клеток у инфицированных животных, по сравнению с интактными, за счет процессов пролиферации: макрофагов в 3 раза, у альвеолоцитов на 40% и у эндотелиоцитов сосудов на 70%). Из них большинство клеток, являясь инфицированными, вероятно, теряли способность к адекватному вирусному клиренсу.

Начиная с 1 суток эксперимента в цитоплазме всех трех типов исследуемых клеток наблюдали экспрессию внутриклеточных гидролаз: myeloperoxidase, lysozyme и cathepsin D - важнейших факторов неспецифической защиты, которые обеспечивают внутриклеточное расщепление белковых структур вируса. Альвеолоциты и эндотелиоциты сосудов не являются

91 профессиональными» фагоцитами, но при гриппе A/H5N1, в цитоплазме этих клеток наблюдали экспрессию всех трех типов протеаз, преимущественно на ранних сроках, что может свидетельствовать о реализации неспецифических факторов противовирусной защиты. Начиная с 3 суток эксперимента экспрессию lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase могли оказывать уже пролонгированный эффект, возможно и на окружающие ткани. Экспрессия myeloperoxidase в этих условиях может обусловить также цитотоксический эффект и внести свой вклад в пролонгированные деструктивные изменения.

Все эти факторы способствуют нарастанию количества и масштаба инфильтратов в легких, с высоким содержанием CD-68+макрофагов и CD-8+ Т-клеток, оказывающих протекторную роль в виде секреции различных хемокинов, способствующих увеличению вирусного клиренса. Однако, из-за гибели эндотелиоцитов и цитопатического действия чрезмерно-экскретированных гидролаз, а также N0 и ассоциированных с ним различных цитотоксических радикалов - видимо происходило нарушение структуры стенки сосудов, что приводило к их тромбированию, а также фибриноидному набуханию, повышению проницаемости и некрозу с кровоизлияниями.

Неблагоприятные эффекты, оказываемые вирусами гриппа A/H5N1 в итоге приводят к развитию различных процессов ведущих к появлению и усилению гипоксии:

1) патологические изменения в легких (кровоизлияния, альвеолярный отек и тромбозы);

2) сохранившиеся клетки в высоких дозах секретируют IL-6 и TNF-a, приводящих к усилению проявлений воспаления и отягощению деструктивных изменений как в самих клетках, так и в легких;

3) массовая клеточная гибель альвеолоцитов в сочетании с поражением сосудов в интерстиции, ведет к образованию и накоплению отечной жидкости внутри альвеол, в силу нарушения функционирования этих клеток, что, вместе со всеми деструктивными осложнениями, может иметь серьезные последствия для функции газообмена респираторного тракта;

4) выявленные количественные и, в большей степени, качественные изменения сосудов, а также ателектазы и диффузные микроэмфиматозные очаги.

Успешная репликация ВГ А в клетках легких инфицированных мышей линии С57В1/6, значительное повышение секреции клетками легких провоспалительных цитокинов и 1\Ю-синтаз в сочетании с гипоксией и формированием острофазового иммунного ответа сопряжено с активацией системы комплимента и расширением сосудов с повышением сосудистой проницаемости, в сочетании с их деструкцией.

Начиная с 6 сутки эксперимента, экспрессия ВГ А/Н5М1 А/§оо8е/ЬСга8поогегБкоуе/627/05 во всех трех типах исследованных клеток уменьшалась, что может быть связано с интенсивным синтезом ДНК и активацией пролиферативной активности. Уменьшается количество экспрессируемой еЖ)8, что влечет за собой уменьшение эндогенного оксида азота и стимулирует увеличение экспрессии другой изоформы - ¡МЖ

В составе инфильтратов начинают появляться фибробласты, которые способствуют уменьшению зон деструкции.

Тем не менее, видимо, из-за продолжающейся гипоксии остаются высокими масштабы деструктивных изменений ткани легкого и интерстициального отека. Экспрессия провоспалительных цитокинов оставалась по-прежнему высокой, однако уже наблюдали признаки стимуляции неоангиогенеза, который уменьшил гипоксию и все связанные с ней негативные эффекты.

На 10 сутки после инфицирования, в макрофагах происходит полное переключение на экспрессию ПчЮБ вместо еМЖ Однако, следует отметить, что в эндотелиоцитах экспрессия данной ЫО-синтазы носит конститутивный характер, вероятно из-за постоянного контакта этих клеток с вирусом в связи с ранней виремией. Выровнявшиеся концентрации N0 позволяют ему оказывать его обычные физиологические эффекты - регулировать биосинтезирующую функцию эндотелия и его функциональное состояние и поддержание баланса про- и антиапоптических механизмов (Курашвили А.Н. и др., 2003). К 10 суткам

93 во всех трех типах исследуемых клеток уменьшалась экспрессия РСЫА и количество инфильтратов уменьшалось до показателей 1 суток эксперимента, уменьшалось количество зон кровоизлияний и практически не наблюдался альвеолярный отек.

Гипоксия вызывает изменения в синтезе и высвобождении вазоактивных веществ, стимулирует клеточную пролиферацию в стенках сосудов, синтез внеклеточного матрикса и пониженную сократимость легочных артерий. С другой стороны, нарастающие деструктивно-отечные изменения ведут к изменению объема легких, что способствует механическому сдавлению сосудов и это в свою очередь поддерживает гипоксию. Все эти факторы приводят к нарастанию полиорганной недостаточности и, даже несмотря на уменьшающиеся деструктивные изменения на 14 сутки эксперимента, полного выздоровления не происходит, так как активизируются процессы фиброгенеза (прил. 1).