Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетические особенности развития остеопороза у крыс линии OXYS и эффективность их лечения бисфосфонатами

МУРАЛЁВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ОСТЕОПОРОЗА У КРЫС ЛИНИИ ОХУв И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ЛЕЧЕНИЯ БИСФОСФОНАТАМИ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск -2011

1 4 АПР 2011

4844031

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) и Федеральном государственном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук Колосова Наталья Гориславовна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Садовой Михаил Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович доктор медицинских наук Ким Лена Борисовна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск)

Защита диссертации состоится « 26 » апреля 2011 г. в 12-00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Научном Центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел./факс 8-(383)-333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан «_» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук "ИЛлААЯ^ Пальчикова H.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Остеопороз — системное метаболическое заболевание скелета, приводящее к снижению костной массы, нарушению микроархитектоники костной ткани и повышению риска переломов. На фоне постарения населения развитых стран и увеличения доли пожилых людей заболеваемость растет, а неполноценное питание, гиподинамия и неблагоприятная экологическая обстановка способствуют омоложению остеопороза. В основе его патогенеза лежит нарушение ремоделирования костной ткани, обеспечивающее механическую прочность костной ткани постепенным замещением старой кости новой. Для прогноза развития остеопороза принципиальны две детерминанты: пик костной массы и скорость последующего её снижения. Формирование адеквагного пика костной массы рассматривается ВОЗ как наиболее эффективный путь профилактики остеопороза (WHO Geneva, 1999).

Оценка эффективности лечения остеопороза, основанного на длительном приёме препаратов, затруднена различиями в генетически детерминированных особенностях его развития, качестве жизни и приверженности пациентов к терапии. Структурно-функциональные изменения костной ткани при старении аналогичны тем, что происходят на _ранних стадиях остеопороза, лежат в основе его патогенеза, но не всегда приводят к развитию заболевания. Запускающие патологический процесс механизмы остаются не ясными в связи с невозможностью исследовать ранние бессимптомные стадии. Создание биологических моделей заболеваний - один из подходов к выяснению их патогенеза и к разработке новых способов лечения (Duque G., Troen B.R., 2008).

На момент планирования настоящей работы существовали аргументы в пользу того, что моделью остеопороза может служить линия преждевременно стареющих крыс OXYS, у которых признаки заболевания присутствуют в молодом возрасте и классифицировались как проявления сенильного остеопороза. Основанием такой трактовки послужили более низкая, чем у крыс Вистар, минеральная плотность костной ткани, её структурные особенности (Фаламеева О.В. и др., 2006) и высокая активность катепсина К (Бенедиктова A.A. и др., 2009). На развитие остеопороза указывали и нарушения минерализации, однако содержание Ca в кости (Колосова Н.Г. и др., 2002) и крови (Venediktova A.A. и др., 2009) крыс OXYS в период активного роста оказались повышенными. Вопрос о возрасте манифестации остеопороза у крыс OXYS, знание которого важно для понимания его патогенеза, оставался открытым. По одним данным снижение минеральной плотности костной ткани развивается к возрасту 6 мес. (Фаламеева О.В. и др., 2006), по другим - она снижена уже в 2 мес. на фоне изменений межклеточного матрикса кости (Ершов К.И. и др., 2009).

Необходимый критерий адекватности модели тому или иному заболеванию - возможность влиять на его течение методами стандартной терапии (Reinwald S., Burr D., 2008). С этих позиций крысы OXYS ранее не исследовались. В лечении и профилактике остеопороза широко используют препараты антирезорбтивного действия, прежде всего бисфосфонаты, арсенал которых пополняется. Их применяют как монопрепараты и в комплексе с анаболиками.

Наиболее изученный среди них - алендронат натрия (AJIH). Пример новых разработок - синтезированная в РХТУ им. Менделеева (Офицеров Е.Н. и др., 2010) глкжозаминовая соль алендроновой кислоты (ГАСАК). Глюкозамин способствует восстановлению эластичности связок и укрепляет межпозвоночные диски (Dahmer S., Schiller R.M., 2008), но крайне неустойчив. По замыслу авторов, устойчивый комплекс глюкозамина с алендроновой кислотой сможет повышать минеральную плотность костной ткани и позитивно влиять на связочно-хрящевой аппарат. Дополнение этого соединения дигидроквер-цетином (ДГК) - флавоноидом растительного происхождения, предположительно, может повысить эффективность лечения благодаря его антиокси-дантным свойствам (Vladimirov Y.A. et al., 2009) и доказанной в опытах in vitro способности активизировать синтез коллагена I типа - важного компонента костной ткани (Тараховский Ю.С. и др., 2007).

Максимально полная характеристика линии крыс OXYS как модели ос-теопороза имеет как фундаментальное, так и прикладное значение: выяснение патогенеза заболевания, анализ генетически детерминированных особенностей его развития у крыс OXYS и доказательство возможности объективной оценки эффективности терапевтических воздействий - актуальные задачи современной медико-биологической науки.

Цель работы: изучить патогенетические особенности развития остеопо-роза у крыс OXYS и возможность его коррекции алендронатом натрия как препаратом стандартной терапии и новым соединением из группы бисфос-фонатов - глюкозаминовой солью алендроновой кислоты - монопрепаратом и в комплексе с дигидрокверцетином.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности возрастных изменений метаболизма костной ткани крыс OXYS по содержанию маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови и моче, содержанию Са, Р и Sr в костной ткани и её морфологии.

2. Изучить влияние алендроната натрия на минеральную плотность костной ткани, маркеры костного обмена и прочностные характеристики кости самцов и самок крыс OXYS.

3. Исследовать влияние глюкозаминовой соли алендроновой кислоты (ГАСАК), а также её комплекса с дигидрокверцетином (ДГК) на состояние костной ткани и маркеры костного метаболизма у крыс OXYS.

4. Сравнить эффективность алендроната натрия и монопрепарата глюкозаминовой соли алендроновой кислоты, а также её комплекса с дигидрокверцетином в коррекции остеопороза у крыс OXYS.

Научная новизна

Впервые было показано, что для ранних стадий развития остеопороза у крыс OXYS характерно повышение содержания маркеров костной резорбции: С-концевого телопептида коллагена I типа в сыворотке крови начиная с возраста трех месяцев, пиридинолинов в моче начиная с полугодовалого возраста и снижение содержания остеокальцина - маркера костеобразования - в сыворотке крови в возрасте 12 мес.

Особенностями остеопороза у крыс ОХУБ являются: активное участие в костной резорбции остеоцитов, а не остеокластов, как в классическом варианте и формирование низких пиковых значений костной массы с пониженным накоплением Са, Р и Бг в костной ткани в период формирования пиковых значений костной массы.

Впервые было показано, что применение алендроната натрия у крыс ОХУБ приводит к снижению содержания пиридинолина и дезоксипиридино-лина в моче и повышает минеральную плотность костной ткани и площадь поперечного сечения кости, увеличивая прочность костной ткани.

Линия крыс ОХУБ была использована для исследования механизмов патогенеза раннего остеопороза и оценки эффективности терапевтических воздействий, что доказало адекватность крыс этой линии как модели данного заболевания.

Глюкозаминовая соль алендроновой кислоты в комплексе с дигидрок-верцетином повышает минеральную плотность и прочность бедренной кости эффективнее, чем при приёме алендроната натрия и монопрепарата глюкоза-миновой соли алендроновой кислоты.

Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс ОХУ5 критериям модели раннего остеопороза, возможности её использования для исследования патогенеза этого заболевания, в том числе на ранних доклинических стадиях его развития. Показано, что крысы ОХУБ могут быть использованы для оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику снижения МПКТ и хрупкости костей, связанных с остеопорозом.

Выявленные в работе эффекты глюкозаминовой соли алендроновой кислоты и её комплекса с дигидрокверцетином на течение остеопороза у крыс ОХУЭ и состояние костной ткани крыс Вистар позволяют рекомендовать комплексное соединение к дальнейшему исследованию с целью создания лекарственного средства для лечения остеопороза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие раннего остеопороза у крыс ОХУБ связано с нарушением процессов костного ремоделирования, которое приводит к формированию сниженной пиковой массы и минеральной плотности костной ткани на фоне снижения аккумуляции Са, Р и 5г в костях, усиленной экскреции Са и деградации коллагена 1 типа, снижения маркеров остеосинтеза - остеокальцина и щелочной фосфатазы.

2. Усиление процесса резорбции матрикса костной ткани у крыс ОХУБ осуществляется не за счет повышенной активности остеокластов, как при се-нильном остеопорозе, а активное участие в нём принимают остеоциты. При этом очаги резорбции локализуются преимущественно периканаликулярно -вокруг сосудов эндоста и периоста.

3. Алендронат натрия - стандартный для лечения остеопороза препарат -снижает выраженность проявлений этого заболевания у крыс ОХУБ. Комплексный препарат глюкозаминовой соли алендроновой кислоты эффективнее,

чем алендронат натрия или монопрепарат глюкозаминовой соли алендроно-вой кислоты повышает минеральную плотность и прочность костной ткани у крыс ОХУБ, а у крыс Вистар способствует повышению пиковых значений костной массы в молодом возрасте.

Апробация результатов

Полученные результаты были представлены и обсуждены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008,2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы из 263 источников (15 отечественных и 248 -иностранных). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Эксперименты выполнены на 334 самцах и 32 самках крыс ОХУ5 и Вистар (возраст от 10 дней до 24 мес.) на базе Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» ИЦиГ СО РАН. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище группами по 5 особей в клетках размером 57x36x20 см при температуре 22±2°С.

Оценка влияния АЛН на состояние костной ткани выполнена на 32 самках и 32 самцах крыс ОХУБ и Вистар в возрасте 8 мес. Крысы опытных групп получали по 1,26 мг на кг массы тела АЛН 6 раз в неделю в течение 60 дней. В каждой группе п=8. Через 14 дней после окончания курса лечения исследовали МПКТ, прочность бедренной кости и маркеры костного ремоде-лирования в сыворотке крови и моче.

Влияние ГАСАК и её комплекса с ДГК на состояние костной ткани исследовали на 120 самцах крыс ОХУ8 и Вистар. С возраста 8 мес. в течение 60 дней 6 раз в неделю животные получали на кг массы тела: 1,26 мг ГАСАК или 1,26 мг ГАСАК и 5,06 мг ДГК; часть животных получала 1,26 мг препарата сравнения - АЛН. Контролем служили интактные крысы обеих линий. В каждой группе п=15.Эффективность оценивали, как описано выше.

Оценка состояния костной ткани

Минеральную плотность костной ткани (МПКТ) измеряли в возрасте от 3 до 17 мес. под легким эфирным наркозом методом дихроматической рент-

геновской абсорбциометрии (DEXA) на рентгеновском костном денситометре «HOLOGIC Discovery-A» (USA), используя специальную программу для мелких животных. Оценивали МПКТ всего скелета и его частей: позвоночника, бедренной и плечевой костей. Данные представлены в г/см2. В возрасте 10 дней МПКТ оценивали на дентальной рентгеновской установке «SIRONA» (Gemany), используя программу AnviDent 5.01.

Содержание Ca. Р и Sr в костной ткани определяли методом рентгено-флуоресцентного анализа на синхротронном излучении (РФА СИ) на станции элементного анализа Центра SR VEPP-3 в ИЯФ СО РАН (Гончар A.M. и др., 2003). Образцы бедренной кости после очистки от мягких тканей и обработки протеиназами высушивали, растирали в агатовой ступке, таблетирова-ли аликвоты и исследовали их эмиссионные спектры, которые анализировали с помощью программы AXIL, используя сертифицированный образец фосфорита BCR (Объединённое бюро стандартов ЕЭС, Брюссель) как стандарт. Результаты содержания Ca и Р представлены в процентном соотношении от общего содержания минеральных веществ.

Прочность костной ткани - стандартизованных образцов бедренной кости длиной 8 мм - испытывали на установке ZWICK TC-FR100TL.A4K (Германия). Приложенную силу измеряли нагрузочным модулем ТС-LC100kN.G02 (диапазон измерения от 0 до 100 Н, точность - 0,1 Н). Нагрузку по продольной оси осуществляли со скоростью деформации 0,1 мм/мин. Площадь поперечного сечения бедренной кости рассчитывали, используя программу Scion Image 4.0.2 Scion, США. Удельную силу вычисляли по формуле: F=Fmax/S, где Fmax - величина предельной нагрузки, приложенной по продольной оси (Н), S - площадь поперечного сечения бедренной кости (мм2). Модуль Юнга высчитывали по формуле: E=F L/S X, где F - сила в ньютонах, L - длина деформируемого образца (8мм); X - укорочение образца; S - площадь поперечного сечения кости, на которую действует сила.

Гистологическое исследование тел позвонков поясничного отдела выполнено методами световой микроскопии (микроскоп Axioskop 40, Carl Zeiss, Германия). Морфометрическую обработку данных проводили с использованием программы AxioVision 6.2. Образцы фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и в 4%-ном растворе параформа на растворе Хен-кса. Декальцинацию костной ткани проводили в забуференном растворе 14 % ЭДТА, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. Серийные срезы (3-5 мкм) получали на санном микротоме и окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Реакцию на содержание суммарных кислых гликоза-миногликанов (ГАГ) ставили с альциановым синим по методу С. Стидмена и коллаген - по Малори.

Биохимические методы исследования. В сыворотке крови определяли: активность щелочной фосфатазы (ЩФ) кинетическим методом с остановкой реакции (DGKC) на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир-400» (Tokyo Boeki Medical System, Япония), используя набор реактивов

«Вектор-Бест» (Россия); остеокальцин с помощью набора реактивов «Rat Gla-OC Competitive EIA Kit Manual» (Takara Bio Inc., Japan); паратиреодный гормон (ПТГ) в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов «РТН (Intact, Rat) ELISA» (ALPCO Immunoassays, USA) согласно протоколу; С-концевые телопептиды a-цепи коллагена I типа, используя набор реактивов «RatLaps™ EIA» (Immunodiagnostic Systems, UK) на аппарате иммуно-ферментного анализа TEKAN (GmbH Austria). Пиридинолин и дезоксипири-динолин в моче определяли набором реактивов «Pyridinium-Crosslinks» (Immunodiagnostik, Germany) согласно протоколу. Кальций в сыворотке крови и в моче определяли на автоматическом анализаторе «Biolis 24 i» (Tokyo Boeki Medical System. Japan) используя набор реактивов «Вектор-Бест» (Россия).

Статистический анализ результатов проводили, используя программы Statistica-6.0 для Windows, применяя однофакторный и дисперсионный ANOVA анализ с последующими post hoc сравнениями групповых средних (Newman Keul test). Как независимые рассматривали факторы «генотип», «возраст» и «препарат». Связи между параметрами выявляли корреляционным анализом с использованием критерия Спирмена. Данные представлены как M±S.D. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение состояния костной ткани и маркеров её метаболизма у крыс OXYS и Вистар с возрастом

Минеральная плотность костной ткани (МПKT) у крыс менялась с возрастом (Fi)58=124,6; р<0,000) и зависела от генотипа (I'\5a=47; р<0,000), что было обусловлено межлинейными различиями её возрастных изменений. Факторы «генотип» и «возраст» взаимодействовали (F3_5g=125; р<0,000). В возрасте 10 дней МПКТ крыс OXYS не отличалась от Вистар, а в период активного роста динамика её формирования различалась (рис. 1): у крыс обеих линий увеличивалась, но у крыс OXYS медленнее, чем у крыс Вистар и в возрасте 6 мес. она была у крыс OXYS ниже, чем у крыс Вистар. Пиковые значения МПКТ у крыс OXYS формировались к возрасту 6 мес., тогда как у крыс Вистар продолжали накапливаться до годовалого возраста (рис.1 а). У полугодовалых крыс OXYS, судя по данным денситометрии, уже сформированная пиковая костная масса была на 10% ниже той, которую достигали крысы Вистар к возрасту 12 мес. У годовалых животных межлинейные различия в МПКТ составили 11% (р<0,003) и сохранялись в дальнейшем. Таким образом, результаты настоящего исследования согласуются с полученными ранее данными в отношении возраста, в котором формируется пиковая масса костной ткани у крыс Вистар и OXYS.

Направленность возрастных изменений МПКТ была общей для всех исследованных отделов скелета. Исключением стала МПКТ плечевой кости, которая уже в возрасте 3 мес. у крыс OXYS была на 20% ниже, чем у крыс Вистар (р<0,000). Межлинейные различия с возрастом сохранялись (рис. 1 б).

Таким образом, к возрасту 6 мес. у крыс ОХУ5 было выявлено снижение МПКТ относительно контрольных крыс Вистар по всем отделам скелета более чем на 10%, что служит диагностическим признаком остеопороза.

Рис. 1. Минеральная плотность костной ткани крыс Вистар и ОХУБ разного возраста: а) всего скелета; б) плечевой кости (М±8.0.). Различия значимы: А - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУБ (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

Возрастные особенности ремоделирования костной ткани у крыс ОХУЯ и Вистар

Определение содержания метаболитов коллагена в моче и сыворотке крови включено в диагностику остеопороза у людей для определения активности костной резорбции. Содержание пиридинолина (ПН), маркёра костной резорбции, зависело от возраста (Р4>64=51,0; р<0,000) и генотипа (р1>64=28,1; р<0,000) животных, при этом факторы взаимодействовали (р4>12о=2,1; р<0,030), что обусловлено межлинейными различиями его содержания в моче с возрастом. Максимальное содержание ПН у крыс обеих линий выявлен в возрасте 3 мес., когда его содержание у крыс ОХУБ было несколько выше, чем у Вистар. Направленность возрастных изменений этого показателя сходна у крыс Вистар и ОХУ8, но их темпы отличались (рис. 2 а). К возрасту 6 мес. содержание ПН в моче крыс Вистар снижалось, что привело к нарастанию межлинейных различий, которые сохранялись до возраста 17 мес., что свидетельствует о повышенной интенсивности костного ремоделирования в этот период. К возрасту 24 мес. межлинейные различия нивелировались (рис. 2 а).

Содержание в моче дезоксипиридинолина (ДПН), маркера резорбции, менялось с возрастом (Р4>64=28,6; р<0,000) и на него влиял генотип (Р164=48,1; р<0,000). Динамика возрастных изменений ДПН у крыс обеих линий была аналогичной динамике изменений содержания ПН в моче (рис. 2): в возрасте 3 мес. выявлено максимальное содержание ДПН у крыс обеих линий и несколько более высокие значения - у крыс ОХУ8. С возраста 6 мес. ДПН был снижен в моче крыс ОХУ8 относительно Вистар. Межлинейные различия сохранялись до возраста 17 мес., а к возрасту 24 мес. исчезали (рис. 2 б). В

соответствии с литературными данными, у животных всех исследованных групп содержание ДПН было в 4 раза ниже содержания ПН.

Рис. 2. Изменения содержания метаболитов коллагена в моче крыс Вис- ' тар и ОХУ8 с возрастом: а) пиридинолина; б) дезоксипиридинолина (М±8.В.). Различия значимы: л - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУБ (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

Содержание С-концевых телопептидов коллагена I типа - специфичных продуктов деградации — было выше у крыс ОХУБ (р1140=12,0; р<0,001) и изменялось с возрастом (Р?(,4=90,9; р<0,000). Максимальные значения показателя зарегистрированы у 10-дневных крыс ОХУБ и Вистар (рис. 3). К возрасту 3 мес. содержание С-концевых телопептидов в сыворотке крови резко снижалось и в возрасте 3 мес. и 12 мес. у крыс ОХУ8 было достоверно выше, чем у крыс Вистар (р<0,023 и р<0,035, соответственно), что свидетельствует о повышенной активности резорбции кости.

Рис. 3. Содержание С-концевого телопептида в сыворотке крови крыс Вистар и ОХУБ разного возраста (М±8.0.). Различия значимы: л - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУБ (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

ОХУЭ

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ| (относительного маркера косте-образования) с возрастом снижалась (Р4,12о=33; р<0,000) и во всех исследованных возрастных группах за исключением 10-дневных животных была ниже, чем у крыс Вистар соответствующего возраста (рис. 4 а). В возрасте 10 дней активность ЩФ была у крыс ОХУБ выше, а в 3 мес. становилась, напротив, в 1,7 раза ниже, чем у крыс Вистар. В возрасте 6 мес., когда у крыс

ОХУБ завершается формирование пиковых значений МПКТ, активность ЩФ в сыворотке крови была у них вдвое ниже, чем у крыс Вистар, в возрасте 12 мес. - в 2,4, в 17 мес. - в 2, а в возрасте 24 мес. - в 1,8 раза.

1500-

а)

б)

300-

-»- Вистар - ОХУЭ

Л*

Л

Л

А

о

0,3 ' 3 6 ' 12 ' 17 _Возраст, мес.

о

24

0,3 3

12

Возраст, мес.

Рис. 4. Изменение с возрастом активности щелочной фосфатазы (а) и содержания остеокальцина (б) в сыворотке крови крыс Вистар и ОХУЯ (М±8.0.). Различия достоверны: л - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУ8 (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

Содержание остеокальцина. маркёра костеобразования, в сыворотке крови, изменялось с возрастом (Р2,48=50,0; р<0,000). Его минимальные значения выявлены у 10-дневных животных (рис. 4 б) и с возрастом увеличивались. Только в возрасте 12 мес. межлинейные различия в содержании остеокальцина в сыворотке крови были значимыми (р<0,015), что свидетельствует о снижении активности формирования костной ткани у крыс ОХ УЯ за счет уменьшения количества и/или активности остеобластов.

Содержание Са в сыворотке крови и моче с возрастом у крыс ОХУ8 и Вистар изменялось (рис. 5). В возрасте 10 дней содержание Са в сыворотке крови крыс Вистар и ОХУ8 не различалось, а в возрасте 3 и 6 мес. у крыс ОХУ8 было ниже, чем у Вистар (рис. 5 а).

К возрасту 12 мес. содержание Са в сыворотке крыс ОХУ8 увеличивалось до уровня крыс Вистар, в этом возрасте, и в 17 мес. межлинейные различия по этому показателю отсутствовали (рис. 5 а). Но у годовалых крыс ОХУЭ на фоне нормализации содержания Са в сыворотке крови нарастало его выведение с мочой и было выше, чем у крыс Вистар как в 12 мес. (р<0,02), так и в 17 мес. (р<0,027) и, как показано на рис. 5 б, не различалось у 24-месячных животных (р<0,09). Усиленная экскреция Са, можно полагать, явилась одной из причин пониженного по сравнению с крысами Вистар содержания этого элемента в сыворотке крови крыс ОХУ8 в возрасте 24 мес.

Рис. 5. Возрастные изменения содержания Са а) в сыворотке крови и б) моче крыс Вистар и OXYS (M±S.D.). Различия значимы: Л - между одновозраст-ными крысами Вистар и OXYS (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

Содержание паратиреодного гормона ШТП в сыворотке крови значительно изменялось с возрастом (F5i4o=28,2; р<0,000). В возрасте 10 дней межлинейные различий в содержании ПТГ отсутствовали (рис. 6). В возрасте 3 мес. содержание Г1ТГ у крыс Вистар и OXYS несколько выше у крыс OXYS (р<0,06). У крыс Вистар содержание ПТГ в сыворотке крови постепенно снижалось до возраста 17 мес., а у крыс OXYS практически не менялся до года, но к возрасту 17 мес. - достоверно выросло и стало выше, чем у крыс Вистар. Однако к возрасту 24 мес. и по этому показателю межлинейные различия нивелировались (рис. 6).

400 п

зоо

t-с

Вистар OXYS

Рис. 6. Содержание ПТГ в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS разного возраста (M±S.D.). Различия достоверны: Л - между одно-возрастными крысами Вистар и OXYS (р<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05).

0,3 3

12 17

Возраст, мес.

Минеральные элементы костной ткани. Содержание Са в костной ткани у крыс OXYS и Вистар зависело от генотипа (Fl?i08=9,4; р<0,003) и изменялось с возрастом (F3>io8=23,7; р<0,000). В возрасте 3 мес. межлинейные различия в содержании Са не выявлены (табл. 1). Активное накопление Са у крыс Вистар продолжалось до 12 мес., у OXYS - до 6 мес. Его содержание в костной ткани полугодовалых крыс OXYS было достоверно ниже, чем у крыс Вистар этого возраста на 8%. В возрасте 12 мес. различия сохранялись лишь на уровне тенденции, а к 24 мес. межлинейные различия отсутствовали

12

(табл.1). Анализ результатов исследования возрастных изменений содержания Са в костной ткани крыс ОХУБ и Вистар показал, что они сопоставимы и соответствуют динамике формирования пика костной массы.

Динамика изменений содержания фосфора (Р) была сходна в костной ткани крыс обеих линий (табл.1) и зависела от возраста животных (Р3,108=8,6; р<0,000), но на него не влиял генотип (Р1,ю8=8,6; р<0,1). Максимальных значений содержание Р у крыс ОХУЭ достигало к возрасту 6 мес., а у крыс Вистар накопление Р продолжалось до возраста 12 мес. После достижения пиковых значений содержание Р в костной ткани крыс ОХУЯ и Вистар снижалось, и в возрасте 24 мес. достигало уровня 3-месячных животных.

Таблица 1.

Возрастные изменения содержания Са, РиБгв бедренной кости крыс ОХУБ и Вистар__._

Вистар ОХУЭ

Возраст Са, % Р,% 8г, мкг/г Са, % Р,% Бг, мкг/г

(мес.) (п=15) (п=15) (п=15) (п=15) (п=15) (п=15)

3 18,5±0,7 6,5±0,5 163±11 16,7±0,8 5,6±0,4 139±7

6 23,7±0,6* 7,2±0,6* 204±24 21,8±0,6Л* 7,9±0,6* 96±5Л*

12 24,6±1,2 8,7±0,7* 160±16* 20,9±1,5 7,1±1,2 95±3Л

24 16,7±1,4* 6,4±0,3* 91±б* 16,4±1,0* 5,7±0,35* 98±2

11римечание: л - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУБ, * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (р<0,05), % - от общего содержания минеральных веществ (М+8.0.).

Содержание стронция (5У) в костях с возрастом менялось (Р5ю8=9; р<0,000) и зависело от генотипа животных (р1,ю8=Ю,8; р<0,001). При этом факторы взаимодействовали (Р5>108==6,4; р<0,000), поскольку с возрастом этот показатель у крыс Вистар и ОХУБ изменялся не одинаково (табл. 1). В возрасте 3 мес. содержание 5г в костной ткани крыс не различалось. В возрасте 6 и 12 мес. этот показатель был достоверно ниже у крыс ОХУ8, чем у Вистар. К возрасту 24 мес. содержание Бг в костях крыс Вистар становилось таким же, как у крыс ОХУБ.

Прочность костной ткани. Анализ полученных результатов показал, что абсолютная величина предельной нагрузки, приводящая к нарушению структуры бедренной кости - максимальная сила (Рмах) - зависит от генотипа, и у крыс Вистар она в 1,5 выше, чем у крыс ОХУ8 (РЬ16=19,3, р<0,001). Площадь поперечного сечения бедренной кости зависела от генотипа (р1,1б~ 410,0; р<0,000): у крыс Вистар она была в 1,7 раза больше, чем у ОХУЯ (табл. 2). В пересчете предельной нагрузки на площадь поперечного сечения прочность бедренной кости, на которую производилась нагрузка, крыс ОХУ5 и Вистар не различались, так же как Модуль Юнга - величина, характеризующая упругость материала, в нашем случае - кости животных (табл. 2).

Таблица 2.

Значения максимальной силы, площади поперечного сечения и модуля Юнга бедренной кости крыс Вистар и ОХУБ в возрасте 12 мес. __

Линия Мах сила, Н Удельная сила, Н/мм2 Площадь сечения кости, мм2 Модуль Юнга

Вистар 1415±308 141±19 11,1±1,31 7,32±1,13

ОХУБ 892±148л 132±20 6,73±0,29Л 7,16±1,15

Примечание: Л - между одновозрастными крысами Вистар и ОХУБ (р<0,05). М±5.В.

Гистологическое исследование тел позвонков показало, что в возрасте 6 мес. у крыс обеих линий резорбция матрикса костной ткани преимущественно затрагивает вертикальные трабекулы губчатого слоя (рис.7 А, Б). Отличительная особенность костной ткани крыс ОХУБ - отсутствие гаушиптовых лакун на поверхности костных балок. Интенсивность остеолиза костных тра-бекул у крыс ОХУБ в возрасте 6 мес. более выражена, чем у крыс Вистар. Однако присутствие в поле зрения единичных малоактивных остеокластов указывает на отсутствие доминирования остеокластического типа резорбции костной ткани крыс ОХУБ. Ведущим механизмом резорбции матрикса костной ткани у крыс ОХУ8 является периканаликулярный с локализацией процесса вокруг сосудов эндоста и периоста.

В возрасте 21 месяца различия в структурной организации костной ткани тел позвонков крыс ОХУБ и Вистар ярко выражены. На обзорных препаратах у крыс ОХУ8 выявляются истончение и лизис вертикальных трабекул губчатого слоя компактной костной ткани, а объем губчатой костной ткани и ширина трабекул у крыс ОХУЭ меньше, чем у крыс Вистар на 74 и 39%, соответственно (р<0,05). Согласно данным гистохимического анализа, основными механизмами остеолиза и в этом возрасте у крыс ОХУБ остается гладкая резорбция, которая реализуется без участия остеокластов и обеспечивает аутолиз костных структур в области расположения кровеносных сосудов периоста (рис. 8 А). Гистохимическое исследование выявило у крыс ОХУБ отчетливое расширение лакун остеоцитов и локальные участки костного матрикса с демаскированным коллагеном, что является морфологическим проявлением остеоцитарного остеолиза. У крыс Вистар в возрасте 21 мес. выявлено усиление резорбции костной ткани за счет повышенной активности остеокластов (рис. 8 Б). На поверхности кортикальной кости среди клеток внутреннего слоя периоста идентифицируются функционально активные остеобласты и остеокласты, расположенные в гаушиптовых лакунах.

) ^ • . 4 100 мкм ' | р 100 мкм

Рис. 7. Тела позвонков крыс ОХУБ (А) и Вистар (Б) в возрасте 6 мес. Темной стрелкой обозначены костные балки; двойной темной - дорсальная кортикальная пластинка; двойной белой — вентральная кортикальная пластинка. Гематоксилин и эозин. Ув. 40 х.

А

20 мкм

,20 мкм

Рис. 8. Кортикальная пластинка тел позвонков крыс ОХУ8 (А) и Вистар (Б) в возрасте 21 мес. (дорсальная поверхность). А - темная стрелка - резорбция костного матрикса на периферии кровеносного сосуда. Б - темная стрелка - гаушиптовы лакуны, светлая - остеокласт. Гематоксилин и эозин. Ув. 400 х.

Термином «остеопороз» на сегодня обозначают заболевания разной этио логии, общим для которых становится уменьшение массы костной ткани н единицу ее объёма, препятствующее осуществлению адекватной механиче ской функции скелета. Этому критерию, без сомнения, соответствует остеопо роз, развивающийся у крыс ОХУв, однако результаты наших исследований н позволяют рассматривать его как сенильный. Развитие остеопороза у кры ОХУБ, как и у людей, тесно связано с нарушениями процессов костного ремо делирования. Пиковые значения костной массы у крыс ОХУБ достигаются возрасту 6 мес., и в этом же возрасте появляются значимые отличия от кры Вистар в МПКТ. Формирование пиковых значений у крыс ОХУБ происходи на фоне снижения накопления в костной ткани минеральных компонентов Са, Р и а также снижения содержания Са в сыворотке крови, что определя ет его вымывание из костной ткани. По времени это совпадает с усиление дисбаланса в процессах костного ремоделирования: нарастанием экскреци продуктов распада коллагена с мочой (ПН и ДПН) и снижением, по сравне нию с крысами Вистар, содержания остеокальцина в крови, что косвенно ука зывает на уменьшение количества активных остеобластов. Нарушение ремо делирования костной ткани, лежащего в основе остеопороза, у крыс ОХУБ н носит врожденного характера. В возрасте 10 дней по ряду ключевых маркеро костного метаболизма крысы ОХУБ не отличаются от крыс Вистар. Так, со держание остеокальцина и С-концевых телопептидов а-цепи коллагена I тип одинаковы. Однако уже в возрасте 3 мес., когда у крыс ОХУ8 ещё отсутствуе основной признак остеопороза - снижение МПКТ, процессы резорбции проте кают интенсивнее, чем у крыс Вистар. Об этом свидетельствуют повышенно содержание в крови С-концевых телопептидов коллагена I типа, а также неко торое увеличение экскреции с мочой ПН - продуктов распада коллагена, возрастом дисбаланс процессов ремоделирования у крыс ОХУБ продолжа нарастать, и структурные изменения костной ткани приобретают необратимы характер. Принципиально важно, что остеолиз матрикса костной ткани у н не осуществляется по механизму классической резорбции за счет повышенно активности остеокластов, а за счет остеоцитов.

Влияние стандартной антирезорбтивной терапии - алендроната натрия (АЛН) - на состояние костной ткани

Терапевтический эффект АЛН оценивали у самок и самцов крыс ОХУ в возрасте 8 мес., когда клиническая картина остеопороза уже сформирована и контрольных крыс Вистар. Положительными критериями служили повы шение или стабилизация МПКТ и снижение концентрации маркеров резорб ции кости в биологических образцах, определяемых лабораторными метода ми.

Изменение минеральной плотности костной ткани на фоне приёма АЛН Эффект препарата на МПКТ проявился у крыс обеих линий (Р4,72=3,3 р<0,017), он зависел от генотипа (Р4,72=5,7; р<0,001) и пола животных. А! максимально повлиял на самок крыс ОХУБ (табл. 3): повысил МПКТ всег

скелета на 5% (р<0,034) и на 18% (р<0,000) - бедра (табл. 3), а у самцов - повысил МПКТ бедра на 11% (р<0,015). Ни у самцов, ни у самок крыс Вистар значимого повышения МПКТ всего скелета не произошло, и АЛН повысил только МПКТ бедра у самцов крыс Вистар (на 10%, р<0,013).

Таблица 3.

МПКТ всего скелета, бедренной кости и содержание Са в сыворотке крови и моче контрольных и получавших АЛН крыс ОХУБ и Вистар_

Самцы Самки

Показатель Контроль АЛН Контроль АЛН

Вистар МПКТ всего скелета, г/см2 0,180±0,003 0,181±0,002 0,170±0,002# 0,174±0,003

МПКТ бедренной кости, г/см2 0,181 ±0,004 0,202±0,006* 0,229±0,007# 0,211 ±0,013

Са сыворотки, ммоль/'л 2,62±0,03 2,59±0,02 2,51±0,03# 2,57±0,03

Са мочи, ммоль/л 3,8±0,98 9,8±1,68* 5,7±1,05# 19,9±3,24*

SAXO МПКТ всего скелета, г/см2 0,162±0,004л 0,163±0,003 0,154±0,001л# 0,161±0,002*

МПКТ бедренной кости, г/см2 0,164±0,011 0,181±0,007* 0,131±0,030л 0,161±0,005*

Са сыворотки, ммоль/л 2,36±0,03л 2,39±0,04 2,46±0,05 2,37±0,02

Са мочи, ммоль/л 6,3±1,39 10,7±3,59 7,6±1,32 12,9±1,77*

Примечание: # - между самцами и самками крыс одной линии (р<0,05), л - между крысами Вистар и ОХУЭ одного пола (р<0,05), * - значимый эффект препарата (р<0,05).

Влияние АЛН на содержание Са в сыворотке крови и моче крыс ОХУ8 и Вистар. АЛН не повлиял на содержание Са в сыворотке крови (Р, 72=0,02; р<0,9), однако факторы «генотип» и «препарат» взаимодействовали (р1,72=5,12; р<0,028), что было обусловлено более низким, чем у крыс Вистар, содержанием Са в крови крыс ОХУБ (^1,40=57,7; р<0,000). У самок крыс Вистар этот показатель был ниже, чем у самцов (р<0,042), в то время как у крыс ОХУБ от пола животных не зависел (табл. 3). Экскреция Са с мочой у самок крыс обеих линий была выше, чем у самцов (р140=7,4; р<0,009). АЛН существенно повлиял на этот показатель (Р|-72=27,4; р<0,000). На фоне приёма препарата произошло повышение экскреции Са и у самцов (в 2,5 раза), и у самок (в 3,5 раза) крыс Вистар, в то время как у крыс ОХУ8 она увеличилась только у самок (р<0,036) и не изменилась у самцов (р<0,23) (табл. 3).

Изменение прочностных характеристик бедренной кости, содержания пиридинолина и дезоксипиридинолина на фоне приёма АЛН. АЛН повысил Имах бедренной кости крыс ОХУБ (р<0,04). На фоне приёма АЛН также произошло увеличение площади поперечного сечения бедренной кости у крыс Вистар на 12% и ОХУБ - на 9% за счет сужения костномозгового канала, что свидетельствует о замедлении резорбции костной ткани (табл. 4).

Содержание маркера костной резорбции - ПН в моче крыс зависело от генотипа (Р2,з2=13,2; р<0,001) и изменялось под влиянием препарата (р2,з2='1.0; р<0,003). В контрольных группах содержание ПН в моче крыс Вистар был ниже, чем у крыс ОХУБ (р<0,032) (табл.4). АЛН повлиял на данный показатель у всех экспериментальных животных: у крыс ОХУ8 понизил его (р<0,014), а у крыс Вистар выявил тенденцию к снижению (р<0,067).

Таблица 4.

Влияние АЛН на прочность и площадь поперечного сечения бедренной кости, модуль Юнга и содержание пиридинолина в моче самцов крыс ОХУ8 и Вистар

Показатель Вистар ОХУБ

Контроль АЛН Контроль АЛН

Удельная прочность, Н/мм2 141,0±19,1 130,8±15,6 132,3±20,2 151,7±32,08

Площадь сечения кости, мм2 11,1±1,3 12,5±1,2* 6,7±0,3А 7,4±0,5*

Модуль Юнга 7,3±1,1 6,5±0,9 7,2±1,2 8,2±2,4

Пиридинолин пмоль/мл 317,9±11,5 292,3±6,9 356,4±11,3Л 320,9±3,4*

Примечание:* - между крысами Вистар и ОХ У 8 (р<0,05), * - значимый эффект препарата (р<0,05). ЛШ.О.

Таким образом, АЛН положительно повлиял на крыс ОХУ8 с характерными признаками нарушения процессов ремоделирования костной ткани и с уже сформированной пиковой костной массой. Эффект АНЛ проявился у самок крыс ОХУ8 с минимальной исходной МПКТ повышением этого показателя, а так же и у самцов повышением активности костной резорбции и повышением прочности костной ткани.

Реакция на воздействие стандартного для лечения остеопороза препарата свидетельствует о том, что крысы ОХУБ могут служить моделью этого заболевания и использоваться для оценки эффективности новых методов лечения.

Сравнение эффективности новых препаратов с влиянием препарата стандартной терапии

Влияние препаратов на минеральную плотность костной ткани. МПКТ всего скелета зависела от факторов «генотип» (Би 17=20; р<0,000) и «препарат» (Рз.ц^б^и р<0,001), также факторы взаимодействовали между собой (1г1,117==3,28; р<0,024), что указывает на межлинейные различия в реакции на лечение. В экспериментальных группах крыс Вистар МПКТ повысили все исследуемые препараты: ГАСАК - на 7,5%, АЛН - на 5,9% и ГАСАК + ДГК - на 5%, соответственно (табл. 5). Комплекс ГАСАК+ДГК повысил МПКТ позвоночника у крыс Вистар на 8%, АЛН - на 10,7%, ГАСАК - на 15% (табл. 5). МПКТ плечевой кости у крыс Вистар повысили все препараты, а МПКТ бедренной кости - повысили ГАСАК на 10% и АЛН - на 7%. (табл. 5).

Таблица 5.

МПКТ, прочностные характеристики бедренной кости, содержание Са, ос-теокальцина, С-концевых телопептидов коллагена I типа и активность ЩФ в сыворотке крови после лечения препаратами ГАСАК, АЛН и ГАСАК + ДГК

Показатель Контроль ГАСАК АЛН ГАСАК+ДГК

Вистар МПКТ общая, г/см2 0,187±0,01 0,201±0,01* 0,198±0,009* 0,197±0,012*

МПКТ позвоночника, г/см2 0,215±0,012 0,248±0,016* 0,238±0,014* 0,232±0,017*

МПКТ бедренной кости, г/см' 0,216±0,02 0,237±0,018* 0,231±0,018* 0,226±0,022

Прочность кости, Н/мм2 141,0±19,1 151,4±17,0 130,8±15,6 138,5±27;9

Модуль Юнга 7,32±1,13 7,8±0,69 6,52±0,85 6,94±1,53

Площадь сечения кости (мм2) 11,12±1,31 11,42±1,39 12,47±1,19* 12,14±0,42

Остеокальцин (нг/мл) 256±8 257±14 254±14 254±б

Са сыворотки, (ммоль/л) 2,61±0,17 2,54±0,25 2,63±0,14 2,57±0,11

С-концевые те-лопептиды коллагена I типа (пмоль/мл) 13,8±1,1 13,9±0,9 14,4±1,3 14,9±0,9

ОХУ8 МПКТ общая, г/см2 0,171±0,007л 0,17±0,004 0,174±0,005 0,177±0,01*

МПКТ позвоночника, г/см2 0,197±0,012л 0,207±0,009* 0,205±0,008* 0,212±0,016*

МПКТ бедренной кости, г/см2 0,172±0,018л 0,171±0,011 0,177±0,011 0,179±0,02

Прочность кости, Н/мм2 132,3±20,2 144,7±25,6 151,7±32,1 158,5±16,5*

Модуль Юнга 7,16±1,15 7,67±1,58 8,20±2,42 8,33±1,34

Площадь сечения кости (мм2) 6,73±0,29л 6,63±0,24 7,35±0,45* 6,9±0,71

Остеокальцин (нг/мл) 212±13л 248±8* 220±11 237±24

Са сыворотки, (ммоль/л) 2,5±0,05л 2,5±0,07* 2,48±0,16 2,50±0,06

С-концевые те-лопептиды коллагена I типа (пмоль/мл) 17,3±1,3Л 16,8±1,5 13,2±1,3 * 13,(Ш,8*

Примечание: л - между крысами Вистар и ОХУЭ, * - значимый эффект препарата (р<0,05). М±8.0.

Влияние препаратов на МПКТ у крыс ОХУБ было менее выражено: только ГАСАК + ДГК повысили МПКТ всего скелета на 3,5%. МПКТ позвоночника увеличили все препараты: композиция ГАСАК+ДГК повысила на 7,6%, ГАСАК - на 5%, а АЛН - на 4%, соответственно (табл. 5). ГАСАК + ДГК достоверно увеличили МПКТ плечевой кости крыс ОХУв (р<0,034). Различия с интактными крысами по этому отделу скелета были максимальными и оставили 20% (табл. 5).

Влияние препаратов на маркеры костного обмена, содержание Са в сыворотке крови и прочностные характеристики бедренной кости. Выявлены межлинейные различия влияния препаратов на содержание С-концевых те-лопептидов коллагена I типа в сыворотке крови: АЛН и ГАСАК + ДГК снизили его уровень, но только у крыс ОХУЭ. У крыс Вистар эффекта препаратов не выявлено. Препараты не оказали влияния на содержание Са и остео-кальцина в сыворотке (р1,12о=0,4; р<0,76), только ГАСАК у крыс ОХУБ достоверно повысила эти показатели у крыс ОХУ8.

АЛН повысил площадь поперечного сечения бедренной кости у крыс Вистар на 12%, у ОХУ8 - на 9%. У крыс Вистар препараты не повлияли на прочность кости. И только у крыс ОХУ8 на фоне приёма комплекса ГАСАК+ДГК произошло повышение прочности бедренной кости (р<0,000).

Таким образом, комбинация ГАСАК + ДГК более эффективно увеличила МПКТ и повысила прочность кости у крыс ОХУБ по сравнению с монопрепаратом ГАСАК и АЛН.

Выводы

1. Развитие остеопороза у крыс ОХУ8 сопряжено с нарушением баланса в процессах остеосинтеза и костной резорбции. Активация резорбции костной ткани проявляется повышением содержания С-концевых телопепти-дов коллагена I типа в сыворотке крови начиная с возраста 3 мес., усилением экскреции с мочой пиридинолина и дезоксипиридинолина - с возраста 6 мес. и угнетением остеосинтеза, о чем свидетельствует снижение содержания ос-теокальцина в крови.

2. Повышенная по сравнению с контролем (крысы Вистар) резорбция костной ткани у крыс ОХУ8 осуществляется остеокластами как при се-нильном остеопорозе, а остеоцитами.

3. Формирование у крыс ОХУ8 низкой пиковой костной массы и минеральной плотности костной ткани связано с недостаточным накоплением в ней минеральных компонентов (Са и 8г) на фоне сниженного содержания Са в крови и усиленной его экскреции с мочой в период активного роста.

4. Алендронат натрия, препарат стандартной терапии, снижает выраженность проявлений остеопороза у самок крыс ОХУЭ - повышает минеральную плотность, а у самцов крыс ОХУ8 - повышает прочность костной ткани, снижая содержание маркеров резорбции.

5. Глюкозаминовая соль алендроновой кислоты обладает способностью эффективно повышать минеральную плотность костной ткани и содержание маркера костеобразования остеокальцина у крыс OXYS.

6. Комплексное соединение глюкозаминовой соли алендроновой кислоты в комплексе с дигидрокверцетином обладает более выраженным терапевтическим эффектом, как по сравнению с монопрепаратом глюкозаминовой соли алендроновой кислоты, так и препаратом стандартной терапии алендро-натом натрия: увеличило минеральную плотность и прочность костной ткани, снизив активность процесса резорбции кости у крыс OXYS.

7. Линия крыс OXYS является адекватной моделью для исследования механизмов развития раннего остеопороза и оценки эффективности терапевтических воздействий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Муралёва Н.А. Особенности минерального обмена и развитие остеопороза у преждевременно стареющих крыс OXYS / Н.А. Муралёва, А.М. Гончар // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С.455.

2. Муралёва Н.А. Крысы OXYS - возможности и перспективы использования для оценки эффективности терапии и профилактики остеопороза / Н.А. Муралёва, А.М. Гончар, М.А. Садовой, Н.Г. Колосова // Сборник тезисов ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки

- медицине» и научно-практической конференции «Новые материалы и методы для медицины». - Новосибирск, 2008. - С.41.

3. Муралёва Н.А. Крысы OXYS - возможности и перспективы использования для оценки эффективности терапии и профилактики остеопороза / Н.А. Муралёва, А.М. Гончар, Н.Г. Колосова, М.А. Садовой, О.В. Фаламеева // III Российский конгресс по остеопорозу: Тезисы докладов.

- Екатеринбург, 2008. - С.69-70.

4. Муралёва Н.А. Признаки пластической недостаточности костной ткани в раннем возрасте и развитие остеопороза у крыс OXYS / Н.А. Муралёва, Н.Г. Колосова // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы Четвертой Всероссийской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2009.-С. 157-158.

5. Муралёва Н.А. Признаки пластической недостаточности костной ткани в раннем онтогенезе и развитие остеопороза у крыс OXYS / Н.А. Муралёва, Н.Г. Колосова // Остеопороз и остеоартроз - проблема XXI века: морфофункциональные аспекты диагностики, лечения и профилактики: Материалы международной научно-практической конференции. - Курган, 2009.-С. 162-164.

6. Muraleva N. Osteoporosis of OXYS rats - capability and prospects to evaluate the effectiveness of therapy and prévention / N. Muraleva, N. Kolosova // Osteoporos Int. - 2010. - Vol. 21, Suppl. 1. - P. 338.

7. Крысы OXYS - возможности и перспективы использования для

оценки эффективности терапии и профилактики остеопороза / H.A. Муралёва, М.А. Садовой, НЕ. Офицеров, Н.Г. Колосова // Сборник тезисов ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки -медицине» - Новосибирск, 2010. - С. 23.

8. Сравнение эффективности бисфосфонатов в эксперименте: исследование на преждевременно стареющих крысах OXYS / H.A. Муралёва, Н.Е. Офицеров, В.П. Тихонов, Н.Г. Колосова // Остеопороз и остеопатии: Тезисы IV Российского конгресса по остеопорозу. Приложение к научно-практическому медицинскому журналу. - 2010. - №1,- С.130-131.

9. Муралёва H.A. Особенности развития остеопороза у преждевременно стареющих крыс OXYS / H.A. Муралёва, М.А. Садовой, Н.Г. Колосова // Успехи геронтологии. - 2010.- Т. 23, № 2. - С. 233-342. (Журнал ВАК)

10. Муралёва H.A. Остеопороз как проявление генетически детерминированного синдрома преждевременного старения у крыс OXYS / H.A. Муралёва, A.A. Макеев, Н.Г. Колосова // Инф. вестник ВОГиС. - 2010. -Т. 14, № 4. - С. 706-712. (Журнал ВАК)

11. Muraleva N.A. The Features of Development of Osteoporosis in Senescence Accelerated OXYS Rats / N.A. Muraleva, M.A. Sadovoy and N.G. Kolosova//Adv. Gerontol.-2011.-Vol. 1,№. 2. - P. 171-178.

12. Муралёва H.A. Влияние алендроната натрия на состояние костной ткани преждевременно стареющих крыс OXYS / H.A. Муралёва, М.А. Садовой, Н.Г. Колосова // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1. - С. 143-146. (Журнал ВАК)

Список сокращений

АЛН - алендронат натрия

ГАСАК - глюкозаминовая соль алендроновой кислоты

ГАСАК + ДГК - комплексное соединение ГАСАК и ДГК

ДГК - дигидрокверцетин

ДПН - дезоксипиридинолин

МПКТ - минеральная плотность костной ткани

ГШ - пиридинолин

ПТГ - паратиреоидный гормон

ЩФ - щелочная фосфатаза

Подписано к печати 21.03.2011г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1,25, уч. изд. л. 1,23 Тираж 100 Заказ № 17

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Актуальность темы. Термином «остеопороз» на сегодня обозначают заболевания разной этиологии, общим для которых становится уменьшение массы костной ткани на единицу ее объёма, препятствующее осуществлению адекватной механической функции скелета. Изменение демографической обстановки - постарение населения и увеличение доли пожилых людей -способствует распространению заболевания. Некоторые авторы рассматривают его как естественное проявление старения (Pietschmann Р., 2008), однако критический возраст развития клинических проявлений остеопороза существенно различается. Изменения окружающей среды и образа жизни (неполноценное питание, гиподинамия, экологическая обстановка) способствуют омоложению остеопороза, основой которого становятся нарушение формирования скелета в период его активного роста. В основе патогенеза остеопороза лежит нарушение ремоделирования костной ткани, обеспечивающее, с одной стороны, поддержание минерального обмена путем пополнения запасов кальция, с другой - поддержание механической прочности постепенным замещением старой кости новой. Для прогноза течения остеопороза принципиальны две детерминанты: пик костной массы и скорость последующего ее снижения. Формирование адекватного пика костной массы, по данным ВОЗ, - эффективный путь профилактики развития заболевания в последующие годы (WHO Geneva, 1999; Baroncelli G.I., Saggese G. 2000).

Лечение остеопороза основано на длительном приёме препаратов, оценка эффективности которых затруднена различиями в генетически детерминированных особенностях течения заболевания и приверженности пациентов к терапии. Характерные для старения структурнофункциональные изменения костной ткани аналогичны тем, что происходят на ранних стадиях остеопороза, лежат в основе его патогенеза, но не всегда приводят к развитию заболевания. Механизмы, запускающие переход б возрастных изменений в патологический процесс, остаются не ясными, что связано с невозможностью исследовать ранние стадии заболевания, протекающие у людей бессимптомно. Создание биологических моделей заболеваний человека - один из подходов^ к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения (Duque G., Troen B.R. 2008).

На момент планирования настоящей работы уже существовали веские аргументы в пользу того, что моделью остеопороза может служить линия преждевременно стареющих крыс OXYS, у которых признаки заболевания регистрируются в молодом возрасте и классифицировались ранее как проявления сенильного остеопороза. О справедливости такой трактовки свидетельствовали значительное снижение в 6 мес. возрасте МПКТ у крыс OXYS в сравнении с крысами Вистар, результаты морфологического исследования костной ткани (Фаламеева О.В. и др., 2006) и повышенная активность катепсина К - маркёра костной резорбции (Venediktova A.A. и др., 2009). В костной ткани крыс OXYS были выявлены косвенные признаки раннего нарушения минерализации (Колосова Н.Г. и др., 2002): повышение доли железа, фосфора, снижение кальций-фосфорного потенциала и содержания органического компонента, что указывало на раннее завершение формирования скелета. Но при этом в период накопления пиковых значений костной массы содержание Ca ив кости (Колосова Н.Г. и др., 2002), и в крови (Venediktova A.A. и др., 2009) у крыс OXYS было выше, чем у контрольных крыс Вистар. По одним данным различия в МПКТ между двухмесячными крысами Вистар и OXYS отсутствуют (Фаламеева О.В. и др., 2006). По другим (Ершов К.И. и др., 2009) - в этом возрасте она уже снижена на фоне изменений межклеточного матрикса костной ткани: содержания и состава протеогликанов, вносящих существенный вклад в процессы минерализации.

Необходимым критерием адекватности биологической модели тому или иному заболеванию является возможность влиять на его течение 7 методами стандартной терапии (Reinwald S., Burr D., 2008). Только удовлетворяющая этому критерию модель может быть использована для оценки эффективности новых способов лечения, однако такого плана исследования на крысах OXYS не проводились. В настоящее время наиболее перспективными в лечении и профилактике остеопороза . считаются препараты антирезорбтивного действия, прежде всего - бисфосфонаты. Их арсенал постоянно пополняется, бисфосфонаты применяют как монопрепараты и в комплексе с анаболиками. Наиболее изученный среди них алендронат натрия (AJIH) (Iwamoto J., Takeda T. et al., 2007; Duque G., 2009), ингибитор активности остеокластов, избирательно действующий на костную ткань, повышая её минеральную плотность (Но Y.V. et al., 2000; Iwamoto J. et al., 2007; Orwoll E. et al., 2000; Ringe J.D. et al., 2001). Примером новых разработок может стать, синтезированная в РХТУ им. Менделеева, глюкозаминовая соль алендроновой кислоты (ГАСАК). Глюкозамин способствует восстановлению эластичности связок и укрепляет межпозвоночные диски (Dahmer S., Schiller R.M., 2008), но крайне неустойчив. По замыслу авторов, устойчивый комплекс глюкозамина с алендроновой кислотой сможет повышать минеральную плотность костной ткани и позитивно влиять на связочно-хрящевой аппарат. Дополнение этого соединения дигидрокверцетином (ДГК) - флавоноидом растительного происхождения, предположительно, может повысить эффективность лечения благодаря его антиоксидантным свойствам (Vladimirov Y.A. et al., 2009) и доказанной в опытах in vitro способности активизировать синтез коллагена I типа - важного компонента костной ткани (Тараховский Ю.С. и др., 2007).

Максимально полная характеристика линии крыс OXYS как модели остеопороза имеет как фундаментальное, так и прикладное значение: выяснение патогенеза заболевания, анализ генетически детерминированных особенностей его течения и выяснение возможности давать объективную оценку эффективности терапевтических воздействий - актуальные задачи современной медико-биологической науки. 8

Цель работы: изучить патогенетические особенности развития остеопороза у крыс ОХУЭ и возможность его коррекции алендронатом натрия как препаратом стандартной терапии и новым соединением из группы бисфосфонатов - глюкозаминовой солью алендроновой кислоты -монопрепаратом и в комплексе с дигидрокверцетином.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности возрастных изменений метаболизма костной ткани крыс ОХУБ по содержанию маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови и моче, содержанию Са, Р и Бг в костной ткани и её морфологии.

2. Изучить влияние алендроната натрия на минеральную плотность костной ткани, маркеры костного обмена и прочностные характеристики кости самцов и самок крыс ОХУ8.

3. Исследовать влияние глюкозаминовой соли алендроновой кислоты (ГАСАК), а также её комплекса с дигидрокверцетином (ДГК) на состояние костной ткани и маркеры костного метаболизма у крыс ОХУБ.

4. Сравнить эффективность алендроната натрия и монопрепарата глюкозаминовой соли алендроновой кислоты, а также её комплекса с дигидрокверцетином в коррекции остеопороза у крыс ОХУБ.

Научная новизна

Впервые было показано, что для ранних стадий развития остеопороза у крыс ОХУБ характерно повышение содержания маркеров костной резорбции: С-концевого телопептида коллагена I типа в сыворотке крови начиная с возраста трех месяцев, пиридинолинов в моче начиная с полугодовалого возраста и снижение содержания остеокальцина - маркера костеобразования - в сыворотке крови в возрасте 12 мес.

Особенностями остеопороза у крыс ОХУБ являются: активное участие в костной резорбции остеоцитов; а не остеокластов, как в классическом 9 варианте и формирование низких пиковых значений костной массы с пониженным накоплением Са, Р и ¿V в костной ткани в период формирования пиковых значений костной массы.

Впервые было показано, что применение алендроната натрия у крыс ОХУБ приводит к снижению содержания пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче и повышает минеральную плотность костной ткани и площадь поперечного сечения кости, увеличивая прочность костной ткани.

Линия крыс ОХУЭ была использована для исследования механизмов патогенеза раннего остеопороза и оценки эффективности терапевтических воздействий, что доказало адекватность крыс этой линии как модели данного заболевания.

Глюкозаминовая соль алендроновой кислоты в комплексе с дигидрокверцетином повышает минеральную плотность и прочность бедренной кости эффективнее, чем при приёме алендроната натрия и монопрепарата глюкозаминовой соли алендроновой кислоты.

Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс ОХУ8 критериям модели раннего остеопороза, возможности её использования для исследования патогенеза этого заболевания, в том числе на ранних доклинических стадиях его развития. Показано, что крысы ОХУЭ могут быть использованы для оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику снижения МПКТ и хрупкости костей, связанных с остеопорозом.

Выявленные в работе эффекты глюкозаминовой соли алендроновой кислоты и её комплекса с дигидрокверцетином на течение остеопороза у крыс ОХУБ и состояние костной ткани крыс Вистар позволяют рекомендовать комплексное соединение к дальнейшему исследованию с целью создания лекарственного средства для лечения остеопороза. ю

Положения, выносимые на защиту;

1. Развитие раннего остеопороза у крыс ОХУБ связано с нарушением процессов костного ремоделирования, которое приводит к формированию сниженной пиковой массы и минеральной плотности костной ткани на фоне снижения аккумуляции Са, Р и Бг в костях, усиленной экскреции Са и деградации коллагена I типа, снижения маркеров остеосинтеза - остеокальцина и щелочной фосфатазы.

2. Усиление процесса резорбции матрикса костной ткани у крыс ОХУ8 осуществляется не за счет повышенной активности остеокластов, как при сенильном остеопорозе, а активное участие в нём принимают остеоциты. При этом очаги резорбции локализуются преимущественно периканаликулярно - вокруг сосудов эндоста и периоста.

3. Алендронат натрия - стандартный для. лечения остеопороза препарат - снижает выраженность проявлений этого заболевания у крыс ОХУ8. Комплексный препарат глюкозаминовой соли алендроновой кислоты эффективнее, чем алендронат натрия или монопрепарат глюкозаминовой соли алендроновой кислоты повышает минеральную плотность и прочность костной ткани у крыс ОХУБ, а у крыс Вистар способствует повышению пиковых значений костной массы в молодом возрасте.

Апробация результатов

Полученные результаты были представлены и обсуждены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.

Структура и объем работы

ВЫВОДЫ:

1. Развитие остеопороза у крыс ОХУЭ сопряжено с нарушением баланса в процессах остеосинтеза и костной резорбции. Активация резорбции костной ткани проявляется повышением содержания С-концевых телопептидов коллагена I типа в сыворотке крови начиная с возраста 3 мес., усилением экскреции с мочой пиридинолина и дезоксипиридинолина — с возраста 6 мес. и угнетением остеосинтеза, о чем свидетельствует снижение содержания остеокальцина в крови.

2. Повышенная по сравнению с контролем (крысы Вистар) резорбция костной ткани у крыс ОХУ8 осуществляется не остеокластами как при сенильном остеопорозе, а остеоцитами.

3. Формирование у крыс ОХУЭ низкой пиковой .костной массы и минеральной плотности костной ткани связано с недостаточным накоплением в ней минеральных компонентов (Са и £г) на фоне сниженного содержания Са в крови и усиленной его экскреции с мочой в период активного роста.

4. Алендронат натрия, препарат стандартной терапии, снижает выраженность проявлений остеопороза у самок крыс ОХУ8 — повышает минеральную плотность, а у самцов крыс ОХУБ - повышает прочность костной ткани, снижая содержание маркеров резорбции.

5. Глюкозаминовая соль алендроновой кислоты обладает способностью эффективно повышать минеральную плотность костной ткани и содержание маркера костеобразования остеокальцина у крыс ОХУБ.

6. Комплексное соединение глюкозаминовой соли алендроновой кислоты в комплексе с дигидрокверцетином обладает более выраженным терапевтическим эффектом, как по сравнению с монопрепаратом глюкозаминовой соли алендроновой кислоты, так и препаратом стандартной терапии алендронатом натрия: увеличило минеральную плотность и прочность костной ткани, снизив активность процесса резорбции кости у крыс ОХУ8.

7. Линия крыс ОХУБ является адекватной моделью для исследования механизмов развития раннего остеопороза и оценки эффективности терапевтических воздействий.

Заключение

В условиях прогрессирующего увеличения продолжительности жизни и связанного с ним риска развития остеопороза, выяснение механизмов N преждевременного старения и разработка способов его коррекции приобрели особую актуальность. Бисфосфонаты широко используются для снижения риска переломов при остеопорозе, однако сложности их приёма и нежелательные побочные явления негативно влияют на приверженность пациентов к терапии и оценку эффективности их влияния на состояние костной ткани.

В такой ситуации необходимым условием объективной оценки эффективности бисфосфонатов, в том числе и вновь созданных, становится проведение всесторонних фундаментальных исследований, для которых необходимы биологические модели. В связи с этим цель настоящего исследования - исследовать особенности развития остеопороза у крыс ОХУБ и изучить возможность его коррекции алендронатом натрия как препаратом стандартной терапии и новым соединением из группы бисфосфонатов -глюкозаминовой солью алендроновой кислоты - монопрепаратом и в комплексе с дигидрокверцетином.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Животные и схема эксперимента

Работа выполнена на 332 самцах и 32 самках крыс OXYS и крыс Вистар (контроль) в возрасте от 10 дней до 24 мес. на базе Центра коллективного пользовании ИЦиГ СО РАН «Генофонды экспериментальных животных». Для проведения различных исследований использовали группы по 8-15 особей. Животных содержали при естественном освещении. Они получали стандартный гранулированный корм «Чара» (Ассортимент - АГРО, Россия) и воду без ограничений. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 года №755) и международными нормами (Council of the European Communities Directive 86/609/EES).

Животных из эксперимента выводили в утренние часы (10-12 часов). Для проведения биохимических исследований и испытания на прочность после декапитации забирали бедренные кости животных. Кровь собирали в сухие пробирки и хранили при +4°С до центрифугирования. Сыворотку получали центрифугированием цельной крови при 3000g и температуре +4°С. До проведения исследования образцы сыворотки крови хранили при температуре -70°С.

Работа включает три этапа:

1 этап. Изучение влияния генетически детерминированных особенностей костного ремоделирования у крыс OXYS на развитие остеопороза проводили на самцах крыс этой линии, контролем служили крысы Вистар соответствующих возрастных групп (талб.1). В ходе эксперимента проводили измерение МПКТ в возрасте 3, 6, 12 и 17 мес., В возрасте 10 дней, 3, 6, 12, 17 и 24 мес. у животных был произведен забор крови для проведения исследований показателей метаболизма костной ткани.

В возрасте 3, 6, 12 и 24 мес. были взяты образцы бедренной кости для определения содержания в них Са, Р и микроэлементов.