Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетические механизмы нарушений иммунного статуса после алкогольной интоксикации и их фармакологическая коррекция

На правах рукописи

Гришин Владимир Александрович

Патогенетические механизмы нарушений иммунного статуса после алкогольной интоксикации и их фармакологическая коррекция

14.03.03 - патологическая физиология

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов -2011 2 4 (иД? ¿и",1

4841292

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» и в Государственном образовательном учреждении «Саратовский военный институт биологической и химической безопасности МО РФ».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Свистунов Андрей Алексеевич; доктор медицинских наук Лим Владимир Григорьевич.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Брилль Григорий Ефимович; доктор медицинских наук, профессор Ших Евгения Валерьевна.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « РЗ 2011 г. в « часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б.Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «/¥>> Л*^2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета у^^уч

доктор медицинских наук, профессор й^^л^^Кодочигова А.И.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Изучение патогенетических механизмов нарушений иммунного статуса после различных отравлений, в частности, при алкогольной интоксикации, а также возможностей коррекции нарушений иммунного статуса при помощи перспективных иммуномодуляторов является одной из наиболее актуальных проблем патофизиологии и фармакологии [Сидельникова Н.М., 2004; Василенко O.A., 2004; Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007; Серов В.В., 2007; Иванов Д.Ю., 2007; Schans М. J., 2004; Rosenberg Y.J., 2005].

Алкогольные отравления в течение многих лет занимают ведущее место среди бытовых отравлений по абсолютному числу смертельных исходов (в России более 60% всех смертельных отравлений обусловлены алкоголем) [Ливанов Г.А., 2000; Лужников Е.А., Костомарова Л.А., 2000]. Интоксикации алкоголем, занимая первое место среди интоксикаций другими химическими веществами по числу летальных исходов, характеризуются значительной тяжестью и высокой смертностью [Алиев H.A., 1991а, 19916; Кожемякин Л.А., Бонитенко Ю.Ю., Иванова Л.И., 1991; Алиев H.A., Мустафаев М.А., 1992; Лукомская М.И., 1992; Немцов A.B., 1995; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996; Ливанов Г.А., Бонитенко Е.Ю., Васильев С.А., 2001; Фридман К.Б., Лукьянова Ю.А., Ларина О.О., 2003; Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004; Нужный В.П., 2001; 2004; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007; Sepulveda R.T., 2002; Zhang P., 2002; Mokhlesi В., 2003].

Потребление этилового спирта в России постоянно увеличивается [Алиев H.A., 1991; 1992; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996; Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007]. С 2000 по 2004 год число больных, получивших острые отравления алкоголем и его суррогатами и поступивших в областные центры лечения отравлений Российской Федерации, возросло почти в 4 раза и составляет 25% от общего объема госпитализаций; изменилась структура потребляющих алкоголь в сторону преобладания лиц молодого и среднего возраста; увеличилось количество смертельных исходов; [Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004]. За последние 5 лет данная ситуация практически не изменилась; более того, поступление числа отравленных этанолом имеет тенденцию к увеличению [Bobrova N., West R„ Malutina D. et al., 2009].

За период 2000-2004 г.г. 53,6% летальных исходов от всего прироста смертности связаны с алкоголем. К факторам, определяющим тяжесть и уникальность алкогольной ситуации в России, относятся высокий уровень потребления алкоголя (более 12 литров чистого алкоголя на душу населения в год), потребление алкоголя в виде крепких напитков, прежде всего водки в высоких разовых дозах, фальсифицированной продукции и суррогатов алкоголя, отличающихся повышенной токсичностью [Нужный В.П., 2004].

Рост потребления алкоголя относится к числу ведущих факторов, обусловливающих демографический кризис в России [Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996; Бонитенко Ю.Ю., Нужный В.П., 2001; 2004; Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007]. Уровень отравлений спиртами высок и в зарубежных странах [Mokhlesi В., 2003а]. Таким образом, отравления алкоголем превращаются в серьезную социальную и клинико-экологическую проблему.

Смертность после интоксикаций этанолом может быть связана с инфекционными осложнениями и заболеваниями, обусловленными снижением показателей системы иммунитета [Лим В.Г., 2006]. При этом действие этанола на систему иммунитета изучено недостаточно [Алиев H.A., 1991; Забродский П. Ф„ 1998; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007; Descotes J., 1986; Luster М, Blank J. A., Dean J. H., 1987; Mokhlesi В., 2003a, 20036; Szabo G., Mandrekar P., 2009; Xu X., 2009]. Знание иммунопатогенеза действия этанола при остром, подостром и хроническом отравлениях необходимо для обоснования фармакологической коррекции постинтоксикационного нарушения иммунного статуса с целью профилактики различных инфекционных осложнений и заболеваний [Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007].

Изучение влияния перспективных иммуностимуляторов на систему иммунитета при интоксикациях этанолом имеет как теоретическое, раскрывая неизвестные механизмы регуляции иммуногенеза, так и практическое значение, позволяя проводить научно обоснованную иммунореабилитацию, способную снизить последствия вторичного иммунодефицита [Забродский П. Ф., 1998; Хаитов Р. М., 2002; Нестерова И.В., 2005; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007; Georgiev V. S, Yamaguuchi Н.,1993; 2007; Sepulveda R.T., 2002; Zhang P., 2002; Brown L.A., 2006; Waldschmidt T.J., Cook R.T., Kovacs E.J., 2008; Waszkiewicz N, 2008].

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту этанола, постоянный рост

его потребления, высокую летальность при отравлении им, следует заключить, что проблема изучения патогенетических механизмов нарушений иммунного статуса после алкогольной интоксикации и их фармакологической коррекции важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования: изучить механизмы и характер нарушения иммунного статуса при остром, подостром и хроническом отравлениях этанолом и оценить патогенетически обоснованную медикаментозную коррекцию выявленных нарушений.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом на гуморальные иммунные реакции (действие этанола и его метаболита на кооперацию Т- и В-лимфоцитов) и провести сравнительную оценку эффективности различных иммуномодуляторов (Т-активина, имунофана, полиоксидония) для восстановления данных реакций.

2. Определить характер изменения клеточных иммунных реакций (функции Thl-клеток, антителозависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров in vivo и in vitro) после острого, подострого и хронического воздействий этанола и оценить эффективность применения иммуностимуляторов для коррекции выявленных нарушений.

3. Оценить функцию Thl- и Th2-лимфоцитов, особенности цитокинового профиля, нарушение функции коры надпочечников, инициацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) при хронической интоксикации алкоголем. Исследовать возможность коррекции наиболее эффективным иммуномодулятором нарушений иммунного статуса и изменений цитокинового профиля.

4. Исследовать иммунный статус больных алкоголизмом II стадии и оценить эффективность препарата, обладающего максимальной иммуностимулирующей способностью в экспериментах на животных.

Научная новизна

Экспериментально установлено, что под влиянием острой, подострой и хронической интоксикации алкоголем происходит существенное снижение Т-зависимого антителообразования (синтез IgM и IgG), Т-независимой антителопродукции (оцениваемой по числу антителообразующих клеток

(АОК) в селезенке к Vi-антигену, отражающему функцию В-лимфоцитов и синтез IgM плазмоцитами), функцию Thl-клеток в реакции гиперчувствительности замедленного типа), активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) и антителозависимой клеточной цитотоксичности. Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем.

Впервые показано, что применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливало антителопродукцию, кооперацию Т- и В-лимфоцитов крыс, активность Thl-лимфоцитов, ЕКК, АЗКЦ. По эффективности иммуностимулирующего эффекта (синтез IgM, IgG, кооперация лимфоцитов, функция Thl-лимфоцитов в клеточной реакции) в порядке его увеличения иммуностимуляторы в эквитерапевтических дозах располагались в последовательности: 'Г-активин, имунофан, полиоксидоний. Показатели эффективности иммуностимулирующих эффектов полиоксидония, Т-активина и имунофана при оценке ЕКК и АЗКЦ существенно не отличались.

Установлено, что редуцирующее действие этанола и его метаболита ацетальдегида на кооперацию Т- и В-лимфоцитов, активность ЕКК in vitro прямо зависит от его концентрации (50, 100 и 300 мМ), а иммунотоксичность этанола обусловлена преимущественно эффектом ацетальдегида.

В опытах на крысах показано, что подострая интоксикация этанолом вызывает поражение функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом вызывает супрессию активности Thl-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции Th2-клеток. Под влиянием подострой интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов у-интерферона (ИФу), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом снижение ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и увеличение ИЛ-6 более выражены; при этом редукция в крови содержания ИФу наблюдается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

Впервые экспериментально доказано, что применение полиоксидония (ежедневно, однократно, в течение 4 сут в дозе 700 мкг/кг) при хронической интоксикации этанолом (в суммарной дозе - 6,0 DL50) практически полностью восстанавливало функции Thl- и Th2-лимфоцитов, а также

синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2. Содержание ИЛ-10 в крови полиоксидоний восстанавливал частично.

Впервые показано, что при хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм П стадии) у больных снижаются все основные показатели иммунного статуса, за исключением В-лимфоцитов; формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, характеризующееся супрессией Т-системы иммунитета, АЗКЦ и активности ЕКК. Применение полиоксидония в течение 9 сут после поступления больных в стационар восстанавливало практически все исследованные показатели иммунного статуса. Результаты клинических наблюдений подтверждают полученные экспериментальные данные.

Практическая значимость

В результате острой, подострой и хронической интоксикации алкоголем развивается постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, требующее применения иммуностимуляторов для восстановления иммунного статуса. Наибольшая редукция параметров системы иммунитета возникает при хронической интоксикации алкоголем, при которой характерно преимущественное поражение клеточных иммунных реакций, которое увеличивает риск возникновения вирусных инфекционных заболеваний. Проведена сравнительная оценка эффективности иммуностимуляторов Т-активина, имунофана и полиоксидония и определена целесообразность применения полиоксидония у больных хроническим алкоголизмом для коррекции нарушений иммунного гомеостаза и снижения ПОЛ.

Положения, выносимые на защиту

1. Подострая и хроническая интоксикации алкоголем вызывают редукцию Т-зависимого и Т-независимого антителообразования, кооперацию Т- и В-клеток, снижает функцию ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимую клеточную цитотоксичность; существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. Редукция показателей наиболее выражена при хронической интоксикации этанолом.

2. Эффективность иммуностимуляторов при хронической интоксикации алкоголем возрастает в последовательности: Т-активин,

имунофан, полиоксидоний. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливает гуморальный и клеточный иммунный ответы, кооперацию Т- и В-клеток у крыс, функции ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов, а также синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2.

3. При хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм II стадии) у больных формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние. Применение полиоксидония восстанавливает практически все основные показатели иммунного статуса. Результаты клинических наблюдений подтверждают полученные экспериментальные данные.

Апробация и реализация работы; публикации

Результаты исследований были доложены на XV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (ОАЭ, Дубай, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2010); Саратовском отделении Всероссийского общества токсикологов (Саратов, 2008, 2009. 2010); совместном заседании кафедр токсикологии, радиологии и медицинской защиты ГОУ ВПО Саратовский военно-медицинский институт МО РФ, психиатрии и наркологии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава; технологии уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО Саратовский военный институт биологической и химической безопасности МО РФ (Саратов, 2009); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (Саратов, 2008, 2009, 2010); внедрены в учебный процесс кафедр психиатрии и наркологии, патологической физиологии, клинической фармакологии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава. Материалы исследований используются при лечении больных в отделение наркологии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации вошли в научные отчеты ГОУ ВПО Саратовский военный институт биологической и химической безопасности МО РФ.

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописи, состоит из обзора литературы (глава 1 ); материала и методов исследований (глава 2); собственных экспериментальных и клинических исследований (главы 3-5); заключения, выводов. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 289 источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследований

Исследования проводили на 734 беспородных и линейных (Aug/LacSto, August) крысах обоего пола массой 180-240г. Этанол вводили в виде 40%-ного раствора (растворитель - дистиллированная вода) перорально в различных дозах однократно (острое отравление - 0,75 DL50), в течение недели (0,2 DL50 ежедневно; лодострое отравление) и в течение 30 сут (0,2 DLso ежедневно, хроническая интоксикация). Среднелетальная доза этанола для крыс составляла 12,5+1,7 г/кг.

Гуморальную иммунную реакцию к Т-зависимому и Т-независимому антигенам оценивали на 5-е сут после внутрибрюшинной иммунизации крыс эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 2-108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и Vi-антигена (Vi-Ag) в дозе 8 мкг/кг (тест отражал синтез IgM плазмоцитами селезенки) по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [Jeme N.K., Nordin A.A., 1963]. АОК, характеризующие продукцию IgG, определяли в селезенке через 7 сут после иммунизации методом непрямого локального гемолиза в геле [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000; Dressler D.W., Wortis H.H., 1965]. При этом введение этанола при остром и подостром отравлениях проводили практически одновременно с иммунизацией ЭБ, а при хронической интоксикации иммунизацию осуществляли на 23-и сут после первого введения этанола. Гуморальный иммунный ответ Т-зависимому и Т-независимому антигенам при подострой и хронической интоксикациях оценивали через 7 и 30 сут после введения этанола. При этом иммунизацию проводили за 4 сут до последнего введения алкоголя.

Кооперацию Т- и B-лимфоцитов под влиянием этанола и его метаболита ацетальдегида для оценки роли Т- и B-лимфоцитов в продукции IgM оценивали ex vivo и in vitro по методу J. К. Thomas, Т. Imamura (1986).

Состояние клеточного звена системы иммунитета определяли по функции ТЫ-лимфоцитов путем исследования формирования гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Брюхин Г.В., Михайлова Г.И., 1990; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007], по антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Зимин Ю.И., Ляхов В.Ф., 1985] и функции естественных клеток-киллеров (ЕКК) [Гордиенко С. М., 1984]. Функцию ЕКК оценивали через 4 сут при остром отравлении этанолом и через 7 и 30 сут после подострой и хронической интоксикаций. В опытах in vitro до инкубации ЕКК подвергали действию этанола и его метаболита ацетальдегида в течение 3 ч.

Роль Thl-, Т!12-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов И Фу и ИЛ-4 в супрессии гуморальных и клеточных иммунных реакций оценивали при подострой и хронической интоксикациях этанолом. Иммунизацию проводили ЭБ (2-108) за 4 сут до последнего введения алкоголя. Концентрацию цитокинов - (у-интерферона - ИФ-у и ИЛ-4) - определяли в плазме крови крыс после первой инъекции этанолом через 7 и 30 сут при подострой и хронической интоксикаций методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) [Ройт А., Бростофф Дж., МейлД., 2000], используя реактивы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Кроме того, определяли концентрацию ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10 в плазме крови крыс после подострой и хронической интоксикациях методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000], используя реактивы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int.

Уровень кортикостерона в плазме крови крыс исследовали флюорометрическим методом [Давыдов В.В., 1970] через 1, 7, 15 и 30 сут после ежедневного введения этанола в дозе 0,2 DL50. ПОЛ оценивали по активности катапазы и пероксидазы, содержанию малонового диальдегида (МДА) в крови спектрофотометрически [Клинцевич А.Д., Баулин С.И., Головков В.Ф., 1994; Валеева И.Х., Зиганшина Л.Е., Бурнашова З.А., 2002] после хронической интоксикации этанолом.

В качестве иммуностимуляторов использовали Т-активин (20 мкг/кг), имунофан (20 мкг/кг), полиоксидоний (700 мкг/кг) в эквитерапевтических дозах, которые вводили крысам внутримышечно однократно, ежедневно в течение 7 сут при хронической интоксикации этанолом, начиная с 24-х сут.

Нарушения иммунного гомеостаза и возможность его коррекции полиоксидонием при хронической интоксикации этанолом оценивали у

ю

38 больных мужчин с диагнозом «алкоголизм II стадии». Контрольная группа включала 30 человек того же возраста (40-55 лет).

Исследования показателей иммунного статуса у больных с хроническим алкоголизмом II стадии (38 человек) приводили с использованием общепринятых методов. Контрольная группа включала практически здоровых лиц в возрасте 40-55 лет (30 человек). Полиоксидоний применяли ежедневно внутримышечно в дозе 12 мг один раз в сутки ежедневно, через день, общим курсом 9 инъекций, начиная с первых суток поступления больного в стационар.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом на гуморальные иммунные реакции. Коррекция нарушений

Под влиянием острой, подострой и хронической интоксикаций алкоголем происходит существенное снижение Т-зависимого антителообразования (оцениваемого по числу АОК в селезенке, отражающему синтез IgM). Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной — при хронической интоксикациях алкоголем. Так, при исследовании гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену у крыс после острого отравления этанолом (0,75 DL50), а также при подострой и хронической интоксикациях алкоголем, было установлено (рис. 1) существенное уменьшение числа АОК в селезенке животных соответственно в 1,32; 1,41 и 3,31 раза (р<0,05).

К 1 2 3

Рис. 1 Влияние острой (0,75 ЛД^о), подострой и хронической интоксикаций этанолом на число антителообразугощих клеток к эритроцитам барана ПО3), синтезирующим ^М, в селезенке белых крыс (М+т; 11=8-10).

Примечание по оси абсцисс К -контроль, 1, 2, 3 - острая, подострая и хроническая интоксикации этанолом; по оси ординал: число антителообразующих клеток к эритроцитам барана (10'), * — различие с контролем достоверно - р- 0,05

В экспериментах на белых крысах установлено (рис. 2), что при хронической

60 л

К 1 2 3 4

Рис 2 Влияние иммуностимуляторов на число антителообразуюших клеток к эритроцитам барана (К)'), синтезирующим ^М, в селезенке белых крыс, при хронической интоксикации этанолом (М+т; п=9-10).

Примечание по оси абсцисс К - контроль. 1 — хроническая интоксикация этанолом. 2 -хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением Т-акгивина, 3 - хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением имунофана, 4 - хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением полиоксидония, по оси ординат число антителообразующих клеток к эритроцитам барана (10'), 0 — различие с контролем достоверно — р<0.05.к - различие достоверно по сравнению с показателем при интоксикации -р<0.05.

интоксикации алкоголем Т-активин, имунофан, полиоксидоний увеличивали число АОК в селезенке, синтезирующих ^М, соответственно в 1,97; 2,38 и 2,85 раза (р<0,05) по сравнению с показателями при интоксикации.

Таким образом, максимальный иммуностимулирующий эффект был выявлен у полиоксидония. Применение этого препарата практически полностью восстанавливало функцию синтеза 1§.М АОК селезенки. У имунофана эффект был несущественно ниже, чем у полиоксидония. Т-активин значительно повышал продукцию однако она оставалась

ниже контрольных значений.

Исследование числа АОК в селезенке крыс, синтезирующих 1§С, через 7 сут после иммунизации при подостром и хроническом воздействиях этанола (через 30 сут после первого введения алкоголя) показало, что алкоголь снижает исследованный показатель соответственно в 1,40 и 2,21 раза (р<0,05). Острая интоксикация этанолом практически не влияла на синтез !п,0 в селезенке крыс; отмечалось несущественное снижение данного показателя на 16% (р>0,05).

При хронической интоксикации алкоголем Т-активин, имунофан, полиоксидоний увеличивали число АОК в селезенке, синтезирующих соответственно в 1,44; 1,73 и 1,99 раза (р<0,05) по сравнению с параметрами при отравлении (рис. 3). Максимальный иммуностимулирующий эффект был выявлен у полиоксидония.

Рис. 3. Влияние острой (0,75 О1_5о), подострой и хронический интоксикаций этанолом на число антотелообразуюших клеток к фитроцитам барана (10'), синтезирующим в селезенке крыс через 7 сут (М+тп; п=9-12).

Примечание по оси абсцисс К - контроль, 1,2. 3 - острая полос грая и хроническая интоксикация зтанодом. по оси ординат число антителообраз\ющих клеток к »ритроцитам барана (10!): * - различие с контролем достоверно — р-Ю,05

Использование полиоксидония практически полностью восстанавливало функцию синтез lgG АОК селезенки крыс. Эффект имунофана был несущественно ниже, чем у полиоксидония. Т-активин достоверно (р<0,05) повышал число АОК, продуцирующих lgG, однако оно оставалась ниже контрольного уровня.

В опытах in vitro этанол и его метаболит ацетальдегид в прямой зависимости от концентрации вызывали редукцию кооперации Т- и В-клеток как одного из ключевых этапов в реализации Т-завис.имого гуморального иммунного ответа. В наших исследованиях in vitro показано (табл. 1), что этанол (50, 100 и 300 мМ) в прямой зависимости от концентрации уменьшает функцию Т- и В-клеток в кооперации соответственно с В- и Т-лимфоцитами. Эффект ацетальдегида существенно превосходит действие этанола в эквимолярных концентрациях.

Таблица 1

Влияние этанола на кооперацию Г- и В-лимфоцитов белых крыс in vitro (число АОК на 10'' В-клеток) (М+m, п=7-8)

Токсиканты В1'+Т ■ В+Т°

С.мМ 50 100 300 50 100 300

Э 310+32" Г 235+23' 170+14" 246+26"" 189+20 "ь 114+12,ь

АДГ 205+2 Гс 162+17"= 103+10" 148+15"" U7+10abc 6l+6abc

Примечание ') и АДГ - этанол и ацетальдегид соответственно; С - концентрация, контроль1 В' Т - 455J.35 на I О1' В-клеток. В", Т" - В- и Т-клетки в течение 3 ч до добавления ЭБ инкубировали с этанолом.

" различие с контролем (ВКГ) достоверно - р-^0,05:ь -рМ),05 по сравнению с В"+Т;' - р<0,05 по сравнению с'}

Острая, подострая и хроническая интоксикации алкоголем снижают кооперацию Т- и В-клеток ex vivo. Этанол поражает Т-клетки в большей степени, чем В-лимфоциты. Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем.

Использование полиоксидония практически полностью восстанавливало кооперацию Т- и В-лимфоцитов крыс ex vivo при хронической интоксикации этанолом. По степени эффективности иммуностимулирующего эффекта в порядке его увеличения иммуностимуляторы располагались в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Так, установлено (табл. 2), что Т-активин, имунофан, полиоксидоний увеличивали реакцию кооперации

Т- и В-лимфоцитов соответственно в 2,62; 3,71 и 5,46 раза (р<0,05) по сравнению с параметрами при хроническом отравлении этанолом. Эффект кооперации Т- и В-лимфоцитов при использовании Т-активина и имунофана оставался ниже контрольного уровня.

Под влиянием острой, подострой и хронической интоксикаций алкоголем происходит существенное снижение Т-независимого антителообразования (оцениваемого по числу АОК к Vi-Ag в селезенке, отражающему синтез IgM). Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем. Так, после острого отравления этанолом (0,75 ЛД50), а также при подострой и хронической интоксикациях алкоголем было установлено существенное уменьшение числа АОК к Vi-антигену в селезенке животных соответственно в 1,21 (р>0,05), 1,43 и 1,96 раза (р<0,05).

Таблица 2

Влияние иммуностимуляторов на кооперацию Т- и В-лимфоцитов крыс ex vivo при хронической интоксикации этанолом (число АОК на 106 В-клеток) (М+т, п=7-8)

Серия опытов Реакция кооперации Т- и В-

лимфоцитов

Контроль 513+54

Хроническая интоксикация 8418'

Хроническая интоксикация + Т-активин 220+21аЬ

Хроническая интоксикация + имунофан 312+33 аЬ

Хроническая интоксикация + полиоксидоний 459+45 Ьс

Примечание: * - различие с контролем достоверно - р<0,05; - различие достоверно по сравнению с показателем при интоксикации - р<0,05,' - различие достоверно по сравнению с показателями при использовании других иммуностимуляторов - р<0.05.

Применение имунофана и полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливало Т-независимое антителообразование. Использование Т-активина не повышало сниженную алкоголем функцию В-клеток (плазмоцитов).

Таким образом, под влиянием острой, подострой и хронической интоксикаций алкоголем происходит существенное снижение Т-зависимого и в меньшей степени - Т-независимого антителообразования. Супрессия гуморального иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем. По степени эффективности

иммуностимулирующего эффекта в отношении антителообразования и одного из его этапов кооперации Т- В-лимфоцитов в порядке его увеличения препараты располагались в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний.

2. Влияние острого, подострого и хронического отравлений алкоголем на клеточные иммунные реакции. Коррекция нарушений

При исследовании функции ТЫ-лимфоцитов по реакции ГЗТ у белых крыс после острого отравления этанолом (0,75 ВЬ5о), а также при подострой и хронической интоксикациях алкоголем было установлено (рис. 4) уменьшение реакции соответственно в 1,23 (р>0,05); 1,49 и 2,98 раза (р<0,05).

45

3026 -20-1S-10 ■ 5 ■ 0 ■

К 1 2 3

Рис 4 Влияние острой (0,75 DL5o), подострой и хронической интоксикаций этанолом на функцию Thl-лимфоцитов по формированию гиперчувствительности замедленного типа у крыс (прирост массы задней стопы. % ) (М+ш. п=7-12)

Примечание по оси абсцисс: К - контроль, 1, 2. 3 - острая, подострая и хроническая интоксикации этанолом, по оси ординат реакция ГЗТ v крыс (прирост массы задней стопы, %'). * — различие с контролем достоверно — р<0,05,ь — различие достоверно по сравнению с показателями при острой и подострой интоксикациях - р<0,05

Известно, что Thl-лимфоциты обеспечивают реализацию реакции ГЗТ путем активации макрофагов и моноцитов. В основном Thl-лимфоцяты регулируют физиологические механизмы, обеспечивающие функцию клеточного иммунитета [Хаитов P.M., 2006; Georgiev V.St., Albright J.E., 1993; Kimber I., 1996]. Полученные нами результаты косвенно свидетельствуют о том, что этанол уменьшает способность ThI-лимфоцитов синтезировать ИЛ-3, ИФу и ФНОр (лимфотоксин), участвующих в формировании ГЗТ [Шуршалина Л.В., Верясов В.Н., Сухих Г.Т., 2001;

Kimber I.. 1996]. Кроме того, алкоголь путем реализации различных иммунотропных механизмов, вероятно, снижает активность и других клеток, обеспечивающих формирование ГЗТ, в частности, 7-клеток памяти и макрофагов [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000].

При хронической интоксикации алкоголем "Г-активин, имунофан. полиоксидоний увеличивали активность Thl-лимфоцитов (а также рекрутируемых ими макрофагов и моноцитов) [Хаитов P.M., 2006] соответственно в 1,77; 2,03 и 2,30 раза (р<0,05) по сравнению с показателями при интоксикации (рис. 5).

Наибольший иммуностимулирующий эффект был выявлен у полиоксидония. Применение этого препарата практически полностью восстанавливало функцию Thl-лимфоцитов. У имунофана и Г-активина эффект был несущественно ниже, чем у полиоксидония. При этом исследованный параметр не восстанавливался до контрольного уровня.

К 1 2 3 4

Рис 5. Влияние иммуностимуляторов на функцию Thl-лимфоцитов по формированию гиперчувствительности замедленного тина у крыс при хронической интоксикации этанолом (прирост массы задней стопы, % ) (М+т, п'6-7)

Примечание, по оси абсцисс К - контроль. 1 - хроническая интоксикация этанолом. 2 -хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением Т-активина. 3 - хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением имунофана, 4 - хроническая интоксикация этанолом в комбинации с применением полиоксидония, по оси ординат реакция ГЗТ у крыс (прирост массы задней стопы. %'). " - различие с контролем достоверно - p^O OS. ь- различие достоверно по сравнению с показателем при интоксикации — р<0.05

После острого, подострого и хронического воздействий этанола происходит уменьшение функции ЕКК клеток соответственно в 1,39; ¡,70 и 3,03 раза (р<0,05). Редуцирующее действие этанола и его метаболита ацетальдегида на активность ЕКК in vitro прямо завист от концентрации, а

иммунотоксичность алкоголя обусловлена преимущественно эффектом ацетальдегида.

Острое, подострое и хроническое воздействия этанола снижают АЗКЦ соответственно в 1,35 (р>0,05); 1,75 и 2,98 раза (р<0,05).

При хронической интоксикации алкоголем Т-активин, имунофан, полиоксидоний увеличивали АЗКЦ соответственно в 1,95; 2,06 и 2,54 раза (р<0,05), а активность ЕКК - в 2,14; 2,35 и 2,63 раза (р<0,05) соответственно по сравнению с показателями при интоксикации.

Таким образом, острое, подострое и хроническое отравления алкоголем снижают функцию ТЫ-клеток, оцениваемую по реакции ГЗТ, активность ЕКК и АЗКЦ. Редукция клеточных иммунных реакций в наименьшей степени выражена при остром отравлении этанолом, в наибольшей - при хронической интоксикации этиловым спиртом. По степени эффективности иммуностимулирующего эффекта в отношении ТЫ-лимфоцитов в порядке его увеличения препараты располагались в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Существенных различий между стимулирующим действием Т-активина, имунофана, полиоксидония на активность ЕКК и АЗКЦ не выявлено.

3. Изучение патогенетического значения нарушений функций ТЫ-, Т112-лимфоцитов, цитокинового профиля, коры надпочечников,

перекисного окисления липидов при интоксикации алкоголем в формировании иммунодефицита. Коррекция нарушений

При подострой и хронической интоксикациях этанолом параметры, характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию ТЫ-лимфоцитов, в среднем снижались соответственно в 1,45 и 3,15 раза, а показатели, связанные с функцией ТЬ2-клеток, - в 1,40 и 2,21 раза соответственно.

Установлено уменьшение содержания И Фу и ИЛ-4 в плазме крови крыс через 7 сут при действии этанола соответственно в 1,38 и 1,40 раза (р<0,05), а через 30 сут - в 3,82 и 2,85 раза соответственно (р<0,05) (табл. 3).

Таблица 3

Влияние по дострой и хронической интоксикации этанолом на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М+гп, п = 7)

Цитокины Контроль Этанол (1) Этанол (2)

ИФу 1032±98 750+73* 270+25*

ИЛ-4 137± 14 98±9* 48±5*

ИФт /ИЛ-4 7,5±0,7 7,7+0,7 5,6+0,6*

ИЛ-2 1369+101 998+97* 442+32*

ИЛ-6 58±5 78+7* 89+8*

ИЛ-10 383+39 275+26* 205±19*

Примечание: 1,2- подострая и хроническая интоксикации соответственно, * - р<0,05 по

сравнению с контролем.

Соотношение ИФу/ИЛ-4 при подострой интоксикации этанолом практически не изменялось по сравнению с контрольным значением. Это характеризует поражение ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов в равной степени.

Снижение соотношения ИФу/ИЛ-4 при хронической интоксикации алкоголем (5,6) по сравнению с контролем (7,5) свидетельствует о большей супрессии активности ТЫ- лимфоцитов по сравнению с функцией ТЬ2-клеток (р<0,05) [Сухих Г.Т., 2005].

Содержание в плазме крови ИЛ-2 и ИЛ-10 при подострой интоксикации этанолом снижалось соответственно в 1,37 и 1,45 раза (р<0,05), а при хронической - в 3,10 и 2,05раза соответственно (р<0,05). Концентрация ИЛ-6 при подостром и хроническом воздействиях этанола увеличивалась в 1,34 и 1,53 раза (р<0,05) соответственно.

Таким образом, подострая интоксикация этанолом вызывает поражение функций ТЫ- и Т112-л1шфоцитов в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом вызывает супрессию активности ТЫ-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции ТЬ2-клеток. Под влиянием подострой интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов И Фу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом снижение ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и "увеличение ИЛ-6 более выражены, при этом редукция в крови содержания ИФу отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

Применение полиоксидония ежедневно, однократно, в течение 7 сут в дозе 700 мкг/кг при хронической интоксикации этанолом (в суммарной дозе 6,0 ЭЬ5о) практически полностью восстанавливало функции ТЫ- и ТЬ2-

лимфоцитов, а также синтез цитокинов И Фу, ИЛ-4, ИЛ-2. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-6 в крови полиоксидоний восстанавливал частично.

Действие Т-активина обусловлено его способностью повышать активность Thl-лимфоцитов (продукцию ими И Фу) и макрофагов [Арион В.Я., Иванушкин Е.Ф., 1991; Большаков, 1991; Ханафиева И.В., Добржанская P.C., Хусейнова Х.Х., 1992; Базарный В.В., Ястребов Ф.П., 1993]. Стимулирующей эффект имунофана в отношении Thl-клеток при хронической интоксикации этанолом связан с детоксикационными свойствами препарата, а также его способностью активировать Т-лимфоциты и снижать ПОЛ [Лебедев В.В., Покровский В.И., 1999, 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2005].

Под влиянием подострой и хронической интоксикации этанолом через 7 и 15 сут концентрация кортикостерона в крови увеличивалась соответственно в 2,35 и 2,72 раза (р<0,05), а через 30 сут снижалась в 1,49 раза (р<0,05) по сравнению с контрольным уровнем. Через 1 сут концентрация кортикостерона в крови практически не увеличивалась.

Полученные нами результаты, свидетельствующие о длительном повышении кортикостерона в крови, позволяют считать, что стресс-реакция на ежедневное поступление этанола является одним из факторов, снижающим гуморальные и клеточные иммунные реакции [Забродский П.Ф., Мындыч В.Г., 2007; Glover М., 2009; Pruett S.B., 2009].

Полиоксидоний не оказывал влияния на стресс-индуцированные изменения концентрации кортикостерона в крови крыс при хронической интоксикации алкоголем.

При хроническом действии этанола повышалось содержание малонового диальдегида (МДА) в крови в 1,33 раза (р<0,05) и снижалась активность каталазы и пероксидазы соответственно в 1,56 и 1,57 раза (р<0,05). Применение после хронической интоксикации алкоголем полиоксидония практически полностью восстанавливало показатели антиоксидантной защиты (каталазы и пероксидазы) и снижало до контрольного уровня содержание в крови МДА.

При хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм II стадии) у больных снижались все основные показатели иммунного статуса, за исключением содержания B-лимфоцитов в крови (при этом синтез плазмоцитами IgA, IgM, IgG уменьшался, формировалось вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, характеризующееся супрессией Т-системы иммунитета, АЗКЦ и активности

ЕКК, депрессией лимфоидного ростка кроветворения. Лечение алкоголизма общепринятыми методами не восстанавливало иммунный гомеостаз. Применение полиоксидония в течение 18 сут (через день) после поступления больных в стационар восстанавливало практически все исследованные показатели иммунного статуса. Результаты клинических наблюдений подтверждают полученные экспериментальные данные.

Таким образом, подострое и хроническое отравления алкоголем вызывает различное по степени выраженности изменение цитокинового профиля; подострая интоксикация этанолом вызывает поражение функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов в равной степени, а хроническая - вызывает большую супрессию активности Thl-лимфоцитов. Полиоксидоний не оказывал влияния на стресс-индуцированные изменения концентрации кортикостерона в крови крыс при воздействии этанола и снижал инициированные интоксикацией алкоголем параметры пероксидации липидов.

ВЫВОДЫ

1. Интоксикация алкоголем вызывает редукцию Т-зависимого и Т-независимого антителообразования, кооперации Т- и В-клеток. Ацетальдегид в прямой зависимости от концентрации in vitro вызывает снижение кооперации Т- и В-лимфоцитов, поражая преимущественно Т-клетки, и значительно превышает действие этанола в эквимолярных концентрациях. Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем. Эффективность иммуностимуляторов возрастает в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливает гуморальный иммунный ответ и кооперацию Т- и В-клеток.

2. Отравление этанолом снижает функцию Till-клеток, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимую клеточную цитотоксичность. Редукция показателей наиболее выражена при хронической интоксикации этанолом. Супрессирующий эффект этанола и его метаболита ацетальдегида на активность естественных клеток-киллеров in vitro прямо зависит от концентрации, а иммунотоксичносгь алкоголя обусловлена преимущественно действием ацетальдегида. Иммуностимулирующие

эффекты полиоксидония и имунофана при оценке клеточных иммунных реакций существенно не отличаются. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливает клеточный иммунный ответ.

3. Интоксикация этанолом вызывает поражение функции ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов; при этом хроническое действие алкоголя приводит к большей супрессии активности ТЫ-клеток. Под влиянием подострой и хронической интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов И Фу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом редукция в крови содержания И Фу отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10. Применение полиоксидония при хронической интоксикации этанолом практически полностью восстанавливает функции ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов, а также синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-6 в крови полиоксидоний восстанавливает частично.

4. Полиоксидоний не оказывает влияния на стресс-индуцированные изменения концентрации кортикостерона в крови крыс при воздействии этанола и снижает до контрольного значения инициированные интоксикацией алкоголем параметры пероксидации липидов.

5. При хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм 11 стадии) у больных снижаются все основные показатели иммунного статуса, за исключением содержания В-лимфоцитов в крови, формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние. Применение полиоксидония восстанавливает практически все основные показатели иммунного статуса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки иммунотоксичности этанола в экспериментах на животных наиболее информативными тестами рекомендованы: определение Т-зависимого антителообразования, функции ТЬ-клеток, оцениваемой по реакции ГЗТ, активность ЕКК и АЗКЦ, содержание в крови цитокинов (ИФу и ИЛ-4).

2. Учитывая, что после острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом существенно снижаются показатели гуморального и клеточного звеньев системы иммунитета, функции ЕКК, для их коррекции рекомендовано применение средств профилактики и лечения возможных постинтоксикационных инфекционных осложнений и заболеваний. При

иммунореабилитации следует учитывать, что редукция иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем.

3. При иммунореабилитации следует учитывать, что хроническая интоксикация этанолом вызывает супрессию активности ТЫ -лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции ТИ2-клеток, что предполагает большую вероятность возникновения вирусных инфекций по сравнению с микробными.

4. После острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом для восстановления основных показателей иммунного гомеостаза и снижения ПОЛ целесообразно применение наиболее эффективного иммуностимулятора - полиоксидония.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние хронической интоксикации этанолом на функции субпопуляций Т-лимфоцитов и содержание в крови цитокинов / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, АЛ. Свистунов // Международный журнал по иммунореабилитации. 2010. Т. 12, № 2. С. 230.

2. Изменение функции ТЫ - и Th2- лимфоцитов и цитокинового профиля при хронической интоксикации этанолом / A.A. Свистунов, П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, В.А. Гришин // Саратовский научно-медицинский журнал. 2010. Т.6, № 2. С. 307-309.

3. Фармакологическая коррекция активности Thl- и ТЬ2-лимфоцитов и цитокинового профиля при интоксикации этанолом / П.Ф. Забродский, В.А. Гришин, A.A. Свистунов, В.Г. Лим // Экспериментальная и клиническая фармаколошя. 2010. Т. 73. № 11. С. 19-21.

4. Коррекция нарушения функции Thl-, ТЬ2-лимфоцитов при интоксикации фосфорорганическими соединениями / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, В.К. Бородавко и др. // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях: Сб. науч. тр.-СПБ, 2010.С. 179-181.

5. Нарушение функции лимфоцитов при остром отравлении этанолом / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, Кузьмин A.B. и др. // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях: Сб. науч. тр. - СПБ, 2010. С. 208-210.

6. Влияние острой интоксикации стиролом на показатели иммунного статуса и перекисного окисления липидов / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, A.B. Кузьмин и др. // Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях: Сб. науч. тр. СПБ. 2010. С.210-2П.

7. Нарушения функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов при остром отравлении этанолом / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, И.Х. Яфарова // Доклады академии военных наук. 2010. №2 (42). С. 124-127.

8. Изменения цитокинового профиля и редукция функции субпопуляций лимфоцитов при подостром отравлении этанолом / В.А. Гришин, П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, И.Х. Яфарова //Доклады академии военных наук. 2010. №2 (42). С. 127-129.

Список принятых сокращений

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность.

АОК - антителообразующие клетки.

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа.

ИФ-у, ИЛ-1 (2 и т.д.) - у-интерферон; интерлейкин-1 (2 и т.д.).

ТЫ, ТЬ2, ТЬЗ - Т-лимфоциты - хелперы типа 1, 2, 3.

ЭБ - эритроциты барана.

ВЬ50 (ЛД50) - средняя летальная доза, вызывающая смертельный исход у 50% отравленных животных.

Уьантиген (Vi-Ag) - Т-независимый, VI - антиген брюшнотифозной вакцины.

Выражаю глубокую признательность и благодарность за помощь в выполнении данной работы, ценные советы и замечания заслуженному деятелю науки РФ, доктору медицинских наук, профессору Забродскому Павлу Францевичу.

Подписано в печать 10.02.2011 Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем - 1 печ. л. Тираж 100. Заказ № 133

Отпечатано в Саратовском государственном техническом университете по адресу: 410054, г.Саратов, ул. Политехническая, 77. Копипринтер СГТУ, 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, 77.

Актуальность темы. Изучение патогенетических механизмов нарушений иммунного статуса после различных отравлений, в частности, при алкогольной интоксикации, а также возможностей коррекции нарушений иммунного статуса при помощи перспективных иммуномодуляторов является одной из наиболее актуальных проблем патофизиологии и фармакологии [Сидельникова Н.М., 2004; I

Василенко O.A., 2004; Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Серов В.В., 2007; Иванов-Д.Ю:, 2007; Schans М. J. et al, 2004; Rosenberg Y.J., 2005].

Алкогольные отравления в. течение многих лет занимают ведущее место среди бытовых отравлений по абсолютному числу смертельных исходов (в России более 60% всех смертельных отравлений обусловлены алкоголем)' [Ливанов Г.А., 2000; Лужников, Е.А. Костомарова Л.А., 2000]. Интоксикации алкоголем, занимая первое место среди интоксикаций другими химическими* веществами по числу летальных исходов, характеризуются значительной тяжестью и высокой смертностью [Алиев H.A., 1991а, 19916; Кожемякин Л.А. и соавт., 1991; Алиев H.A., Мустафаев М.А., 1992; Лукомская М.И., 1992; Немцов А.В!., 1995; Нужный-В:П., Прихожан Л.М1, 1996; Ливанов Г.А. и соавт. 2001'; Фридман К.Б. и соавт., 2003; Бонитенко Ю.Ю., Куценко* С.А., 2004; Нужный» В.П., 2001; 2004; Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Sepulveda R.T. et al. 2002; Zhang P. et al., 2002; Mokhlesi B: et al, 2003a, 20036]:

Потребление этилового спирта в России постоянно увеличивается [Алиев H.A., 1991; 1992; Нужный В .П., Прихожан Л.М., 1996; Бонитенко Ю:Ю:, Куценко С.А., 2004; Забродский П;Ф: и соавт., 2007]. С 2000 по 2004 год число больных, получивших острые отравления алкоголем и его суррогатами, поступивших в областные центры лечения отравлений Российской Федерации, возросло1 почти в 4 раза и составляет

25% от общего объема госпитализаций, изменилась структура в сторону преобладания лиц молодого и среднего возраста, увеличилось количество смертельных исходов [Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004]. За последние 5 лет данная ситуация практически не изменилась, более того, поступление числа отравленных этанолом имеет тенденцию к увеличению [BobrovaN. et al., 2009].

За период с 2000 по 2004 годы 53,6% летальных исходов от всего прироста смертности связана с алкоголем. К факторам, определяющим тяжесть и уникальность алкогольной ситуации в России, относится высокий уровень потребления алкоголя (более 12 литров чистого алкоголя на душу населения в год), потребление алкоголя в виде крепких напитков, прежде всего водки в высоких разовых дозах, фальсифицированной продукции и суррогатов алкоголя, отличающихся повышенной токсичностью [Нужный В.П., 2004].

Рост потребления алкоголя относится к числу ведущих факторов, обусловливающих демографический кризис в России [Нужный В.П., Прихожан JI.M., 1996; Бонитенко Ю.Ю., Куценко С.А., 2004; Нужный В.П., 2001; 2004; Забродский П.Ф. и соавт., 2007].

Уровень отравлений спиртами высок и в зарубежных странах. Так, по данным Европейской ассоциации центров отравлений и клинических токсикологов, в странах Европейского Содружества в 2000 году 37451 человек были госпитализированы после острых отравлений спиртами, а их частота среди отравлений другими веществами составила 5,4% [Mokhlesi В. et al., 2003а]. Таким образом, отравления алкоголем превращаются в серьезную социальную и клинико-экологическую проблему.

Смертность после интоксикаций этанолом может быть связана с инфекционными осложнениями и заболеваниями, обусловленными снижением показателей системы иммунитета [Лим В.Г., 2006]. При этом действие этанола на систему иммунитета изучено недостаточно [Алиев H.A.,

1991; Забродский П. Ф., 1998; Descotes J., 1986; Luster М. I. et al., 1987; Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Mokhlesi В. et al., 2003а, 20036; Szabo G, Mandrekar P., 2009; Xu X. et al., 2009]. Знание иммунопатогенеза действия этанола при остром, подостром и хроническом отравлениях необходимо для обоснования фармакологической коррекции постинтоксикационного нарушения иммунного статуса с целью профилактики различных инфекционных осложнений и заболеваний [Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф. и соавт., 2007].

Изучение влияния перспективных иммуностимуляторов на систему иммунитета при интоксикациях этанолом имеет как теоретическое значение, раскрывая неизвестные механизмы регуляции иммуногенеза, так и практическое, позволяя проводить научно обоснованную иммунореабилитацию, способную снизить последствия вторичного иммунодефицита [Забродский П. Ф., 1998; Хаитов Р. М. и соавт., 2002; Нестерова И.В., 2005; Georgiev V. S, Yamaguuchi Н.,1993; Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Sepulveda R.T. et al. 2002; Zhang P. et al., 2002; Brown L.A. et al., 2006; Waldschmidt T.J. et al., 2008; Waszkiewicz N. et al., 2008].

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту этанола, постоянный рост его потребления, высокую летальность при отравлении им, следует заключить, что проблема изучения патогенетических механизмов нарушений иммунного статуса после алкогольной интоксикации и их фармакологической коррекции важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования: изучить механизмы и характер нарушения иммунного статуса при остром, подостром и хроническом отравлении этанолом и оценить патогенетически обоснованную медикаментозную коррекцию выявленных нарушений.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние острой, подострой и хронической интоксикации этанолом на гуморальные иммунные реакции (действие этанола и его метаболита на кооперацию Т- и В-лимфоцитов) и провести сравнительную оценку эффективности различных иммуномодуляторов (Т-активина, имунофана, полиоксидония) для восстановления данных реакций.

2. Определить характер изменения клеточных иммунных реакций (функции Thl-клеток, антител озависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров in vivo и in vitro) после острого, подострого и хронического воздействия этанола и оценить эффективность применения иммуностимуляторов для коррекции выявленных нарушений.

3. Оценить функцию Thl- и ТЬ2-лимфоцитов, особенности цитокинового профиля, нарушение функции коры надпочечников, перекисное окисление липидов при хронической интоксикации алкоголем. Исследовать возможность коррекции наиболее эффективным иммуномодулятором нарушений иммунного статуса и изменений цитокинового профиля.

4. Исследовать иммунный статус больных алкоголизмом II стадии и оценить эффективность препарата, обладающего максимальной иммуностимулирующей способностью в экспериментах на животных.

Научная новизна. Экспериментально установлено, что под влиянием острой, подострой и хронической интоксикации алкоголем происходит существенное снижение Т-зависимого антителообразования (синтез IgM и IgG), Т-независимой антителопродукции (оцениваемой по числу антителообразующих клеток в селезенке (АОК) к Vi-антигену, отражающему функцию В-лимфоцитов и синтез IgM плазмоцитами), функцию Thl-клеток в реакции гиперчувствительности замедленного типа), активность естественных клеток-киллеров (ЕКК) и антителозависимой клеточной цитотоксичности. Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем.

Впервые показано, что применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливало антителопродукцию, кооперацию Т- и В-лимфоцитов крыс, активность Thl-лифоцитов, ЕКК, АЗКЦ. По эффективности иммуностимулирующего эффекта (синтез IgM, IgG, кооперация лимфоцитов, функция Thl-лимфоцитов в клеточной реакции) в порядке его увеличения иммуностимуляторы в эквитерапевтических дозах располагались в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Показатели эффективности иммуностимулирующих эффектов полиоксидония, Т-активина и имунофана при оценке ЕКК и АЗКЦ и существенно не различались.

Установлено, что редуцирующее действие этанола и его метаболита ацетальдегида на кооперацию Т- и В-лимфоцитов, активность ЕКК in vitro прямо зависит от концентрации (50, 100 и 300 мМ), а иммунотоксичность этанола обусловлена преимущественно эффектом ацетальдегида.

В опытах на крысах показано, что подострая интоксикация этанолом вызывает поражение функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом вызывает супрессию активности Thl-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции Th2-клеток. Под влиянием подострой интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом снижение ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и увеличение ИЛ-6 более выражено, при этом редукция в крови содержания ИФу, отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

Впервые экспериментально доказано, что применение полиоксидония (ежедневно, однократно, в течение 4 сут в дозе 700 мкг/кг) при хронической интоксикации этанолом (в суммарной дозе 6,0 DL50) практически полностью восстанавливало функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов, а также синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2. Содержание ИЛ-10 в крови полиоксидоний восстанавливал частично.

В экспериментах на крысах установлено, что подострая и хроническая интоксикация алкоголем увеличивает содержание кортикостерона в плазме крови крыс до 15 сут. После хронической интоксикации этанолом через 30 сут концентрация в крови кортикостерона у крыс уменьшается. Хроническая интоксикация алкоголем инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ), а полиоксидоний восстанавливает показатели антиоксидантной защиты и параметры пероксидации липидов до контрольного значения.

Впервые показано, что при хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм II стадии) у больных снижаются все основные показатели иммунного статуса, за исключение В-лимфоцитов, формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, характеризующееся супрессией Т-системы иммунитета, АЗКЦ и активности ЕКК. Применение полиоксидония в течение 18 сут после поступления больных в стационар восстанавливало практически все исследованные показатели иммунного статуса. Результаты клинических наблюдений подтверждают полученные экспериментальные данные.

Практическая значимость. В результате острой, подострой и хронической интоксикации алкоголем развивается постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, требующее применения иммуностимуляторов для восстановления иммунного статуса. Наибольшая редукция параметров системы иммунитета возникает при хронической интоксикации алкоголем, для которой характерно преимущественное поражение клеточных иммунных реакций, увеличивающее риск возникновения вирусных инфекционных заболеваний. Проведена сравнительная оценка эффективности иммуностимуляторов Т-активина, имунофана и полиоксидония и определена целесообразность применения полиоксидония у больных хроническим алкоголизмом для коррекции нарушений иммунного гомеостаза и снижения ПОЛ.

Положения, выносимые на защиту

1. Подострая и хроническая интоксикации алкоголем вызывают редукцию Т-зависимого и Т-независимого антитело образования, кооперации Т- и В-клеток, снижают функцию ТЫ- и ТИ2-лимфоцитов, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимую клеточную цитотоксичность, существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. Редукция показателей наиболее выражена при хронической интоксикации этанолом.

2. Эффективность иммуностимуляторов при хронической интоксикации алкоголем возрастает в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливает гуморальный и клеточный иммунный ответ, кооперацию Т- и В-клеток у крыс, функции ТЫ-и ТЬ2-лимфоцитов, а также синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2.

3. При хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм II стадии) у больных формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние. Применение полиоксидония восстанавливает практически все основные показатели иммунного статуса. Результаты клинических наблюдений подтверждают полученные экспериментальные данные.

Апробация и реализация работы, публикации

Результаты исследований были доложены на XV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (ОАЭ, Дубай, апрель 2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 27-28 мая 2010 г.), Саратовском отделении

Всероссийского общества токсикологов (апрель 2008 г., февраль 2009, февраль 2010 г.), совместном заседании кафедр токсикологии, радиологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ», психиатрии и наркологии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава», технологии уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военного институт биологической и химической безопасности МО РФ» (май 2009 г.), заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (май 2008 г., апрель 2009 г., январь 2010 г.) и внедрены в учебный процесс кафедр внедрены в учебный процесс кафедр психиатрии и наркологии, патологической физиологии, клинической фармакологии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава. Материалы исследований используются при лечении больных в отделение наркологии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации вошли в научные отчеты ГОУ ВПО «Саратовский военного институт биологической и химической безопасности МО РФ».

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописи, состоит из обзора литературы (глава 1); материала и методов исследований (глава 2); собственных экспериментальных и клинических исследований (главы 3-5); заключения, выводов. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 289 источников отечественной и зарубежной литературы.

ВЫВОДЫ

1. Интоксикация алкоголем вызывает редукцию Т-зависимого и Т-независимого антителообразования, кооперации Т- и В-клеток. Ацетальдегид в прямой зависимости от концентрации in vitro вызывают снижение кооперации Т- и В-лимфоцитов, поражая преимущественно Т-клетки, и значительно превышает действие этанола в эквимолярных концентрациях. Супрессия иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем. Эффективность иммуностимуляторов возрастала в последовательности: Т-активин, имунофан, полиоксидоний. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливало гуморальный иммунный ответ и кооперацию Т- и В-клеток.

2. Отравление этанолом снижает функцию Thl-клеток, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимую клеточную цитотоксичность. Редукция показателей наиболее выражена при хронической интоксикации этанолом. Супрессирующий эффект этанола и его метаболита ацетальдегида на активность естественных клеток-киллеров in vitro прямо зависит от концентрации, а иммунотоксичность алкоголя обусловлена преимущественно действием ацетальдегида. Иммуностимулирующие эффекты полиоксидония и имунофана при оценке клеточных иммунных реакций существенно не отличались. Применение полиоксидония при хронической интоксикации алкоголем практически полностью восстанавливало клеточный иммунный ответ.

3. Интоксикация этанолом вызывает поражение функции Thl- и ТЬ2-лимфоцитов, при этом хроническое действие алкоголя приводит к большей супрессии активности Thl-клеток. Под влиянием подострой и хронической интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФу, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом редукция в крови содержания ИФу отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10. Применение полиоксидония при хронической интоксикации этанолом практически полностью восстанавливало функции ТЫ- и Т112-лимфоцитов, а также синтез цитокинов ИФу, ИЛ-4, ИЛ-2. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-6 в крови полиоксидоний восстанавливал частично.

4. Полиоксидоний не оказывал влияния на стресс-индуцированные изменения концентрации кортикостерона в крови крыс при воздействии этанола и снижал до контрольного значения инициированные интоксикацией алкоголем параметры пероксидации липидов.

5. При хронической интоксикации алкоголем (диагноз - хронический алкоголизм II стадии) у больных снижаются все основные показатели иммунного статуса, за исключением содержания В-лимфоцитов в крови, формируется вторичное постинтоксикационное иммунодефицитное состояние. Применение полиоксидония восстанавливало практически все основные показатели иммунного статуса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки иммунотоксичности этанола в экспериментах на животных наиболее информативными тестами рекомендованы: определение Т-зависимого антителообразования, функции ТЬ-клеток, оцениваемой по реакции ГЗТ, активность ЕКК и АЗКЦ, содержание в крови цитокинов (ИФу и ИЛ-4).

2. Учитывая, что после острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом существенно снижаются показатели гуморального и клеточного 'звеньев системы иммунитета, функции ЕКК, для их коррекции рекомендовано применение средств профилактики и лечения возможных постинтоксикационных инфекционных осложнений и заболеваний. При иммунореабилитации следует учитывать, что редукция иммунного ответа в минимальной степени выражена при остром отравлении этанолом, а в максимальной - при хронической интоксикации алкоголем.

3. При иммунореабилитации следует учитывать, что хроническая интоксикация этанолом вызывает супрессию активности ТЫ-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции ТЬ2-клеток, что предполагает большую вероятность возникновения вирусных инфекций по сравнению с микробными.

4. После острой, подострой и хронической интоксикаций этанолом для восстановления основных показателей иммунного гомеостаза и снижения ПОЛ целесообразно применение наиболее эффективного иммуностимулятора - полиоксидония.