Автореферат и диссертация по медицине (14.01.27) на тему:Нарушение функции иммунной системы при острой алкогольной интоксикации и алкоголизме

На правах рукописи

УЛЬЯНОВА Людмила Ивановна

НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И АЛКОГОЛИЗМЕ

14.01.27. — Наркология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

31 ОКТ 2013

Москва 2013

005536781

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальный научный центр наркологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Гамалея Наталия Борисовна

Официальные оппоненты:

Морозов Сергей Георгиевич - член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор заместитель директора института по научной работе, заведующий лабораторией нейроиммунопатологии Федерального государственного бюджетного учреждения «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН

Коган Борис Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой клинической и специальной психологии Государственного бюджетного учреждения ВПО «Московский городской педагогический университет»

Орадовская Ида Васильевна — доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿¿У» 13 г. в 10 часов утра на заседании

диссертационного совета Д 208.651.01 при ФГБУ «Национальный научный центр наркологаи» Минздрава России, по адресу: 119002, Москва, Малый Могильцевский переулок, дом 3

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «Национальный научный центр наркологии» Минздрава России

■ Автореферат разослан « »_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Усманова Нилуфар Ниматжановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Алкогольная зависимость представляет собой серьезнейшую медицинскую и социальную проблему [Кошкина Е.А., Киржанова В.В., 2011]. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире алкоголизмом страдает более пяти миллионов человек. В России на сегодняшний день зарегистрировано более 2,5 миллионов человек, болеющих алкоголизмом, а с 2000 года по темпам роста алкоголизма Россия обогнала большинство развитых стран мира [Кошкина Е.А., Киржанова В.В., 2008]. Алкогольная зависимость всё чаще поражает людей в расцвете физических, творческих и духовных сил, лиц разного возраста и разных социальных групп. Злоупотребление алкоголем часто является причиной нетрудоспособности молодых и деятельных слоёв населения, приводит к росту смертности, увеличению травматизма и количества преступлений на бытовой и профессиональной почве [Альтшулер В.Б., 2011; Арзуманов Ю.Л. идр.,2011; Кошкина Е.А. идр.,2011].

Злоупотребление алкоголем в целом негативно сказывается на функционировании практически всех органов и систем организма в результате токсического действия этанола. Стержневым в клинической картине алкоголизма является синдром зависимости, вызванный воздействием чрезмерного употребления алкоголя на определенные системы и структуры мозга [Анохина И.П., 2011].

Хроническая алкогольная интоксикация приводит к возникновению органной и системной патологии. Чаще всего при этом поражаются такие важнейшие органы как печень [Огурцов П.П. и др., 2011; Donohue Т.М. Jr., 2009]; почки [Тарасова Н.С., 2001; Frank J. et al., 2004]; сердце [Кошкин И.В., Букач Т.А., 2001; Огурцов П.П. и др., 2011; Imhof A., Koenig W., 2003]; легкие поджелудочная железа [Огурцов П.П. и др., 2011; Thomson G. S., 2001]; периферическая и центральная нервная система [Анохина И.П., 2011; Арзуманов Ю.Л., 2011; Мартынов М.Ю. и др., 2011]. Лица, злоупотребляющие алкоголем, входят в группу повышенного риска возникновения туберкулеза [Mason С.М. et al., 2004] и онкологических заболеваний [Dossow V. et al., 2004], а также вирусных гепатитов В и С [Zhang Т., 2006] и ВИЧ-инфекции [Должанская Н.А., Бузина Т.С., 2011; Aloma С. et al., 2007]. Наконец, они чаще чем, кто-либо, страдают острыми респираторными инфекциями [BoyadjievaN.I. et al., 2004].

Иммунная система, как и другие системы организма, подвергается пагубному воздействию алкогольной интоксикации. Однако до сих пор не определено место, иммунной системы в патогенетических механизмах алкогольной интоксикации, особенно у лиц без сопутствующей патологии органов и систем, не страдающих аллергическими, аутоиммунными, онкологическими заболеваниями, туберкулёзом и другими инфекциями.

Несмотря на значительный интерес исследователей к проблеме алкогольной интоксикации, остаются спорными вопросы механизмов влияния этанола на иммунокомпетентные клетки организма человека и их роли в патогенезе органной и системной патологии. И, наконец, практически отсутствуют данные о влиянии алкогольной интоксикации на основные

показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, а также у больных алкоголизмом до назначения медикаментозного лечения. Исходя из вышесказанного, проблема влияния алкогольной интоксикации на иммунную систему и её роли в механизмах развития органной патологии чрезвычайно актуальна.

Цель исследования: исследовать влияние острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых лиц и у больных алкогольной зависимостью без выраженной сопутствующей патологии органов и систем до назначения медикаментозного лечения.

Задачи исследования:

1. Исследовать in vitro в культуре клеток крови влияние различных доз этанола на пролиферативную активность лимфоцитов, цитолитическую активность NK-клеток, кислородзависимую активность фагоцитов и экспрессию на клеточных мембранах CD25-, CD38-, HLA-DR-молекул и молекул HLAI класса.

2. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя.

3. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом I стадии до назначения медикаментозного лечения.

4. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии до назначения медикаментозного лечения.

5. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии.

Научная новизна

Впервые на модели острой алкогольной интоксикации in vitro при исследовании влияния разных доз этанола, вносимого в культуры клеток крови, установлено его угнетающее влияние на CD4+ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8+ Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих Т-клеток, индуцированную митогенным лектином Con А, и экспрессию на них активационных молекул - CD25, HLA-DR и CD38. Кроме того, этанол обладает способностью усиления экспрессии молекул HLA I класса на клетках иммунной системы в крови.

Впервые установлено, что этанол, вносимый in vitro в культуры клеток крови здоровых лиц (модель острой алкогольной интоксикации) в дозах, вызывающих сильное и слабое опьянение, приводит к нарушениям клеточного иммунитета.

Впервые с помощью широкого спектра иммунологических методов при исследовании репрезентативной выборки образцов периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной

зависимостью, без выраженной соматической и системной патологии, проведено комплексное исследование основных параметров иммунного статуса, спустя 1719 час после последнего употребления ими алкоголя. Получены принципиально новые данные о механизмах влияния острой алкогольной интоксикации на иммунную систему, что согласуется с результатами исследования прямого влияния этанола на клетки крови in vitro. Показана доминирующая роль CD8+-лимфоцитов в иммунном ответе при алкогольной интоксикации, указывающая на их возможную роль в развитии воспалительных процессов на уровне тканей и органов у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Впервые обнаружены сходные нарушения иммунитета после острой алкогольной интоксикации у лиц без синдрома зависимости от алкоголя и у больных алкогольной зависимостью.

Впервые показано, что острая алкогольная интоксикация приводит к нарушению пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов и NK-клеток (натуральных клеток киллеров) и нарушению популяционного, субпопуляционного и активационного состава клеток крови как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (в количестве 0,2 л и более), так и у больных с алкогольной зависимостью.

Впервые выявлено, что острая алкогольная интоксикация приводит к повышению кислородзависимой активности фагоцитов и снижению их поглотительной способности как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые обнаружено, что после острой алкогольной интоксикации, спустя 17-19 час после последнего употребления алкоголя, в периферической крови повышается содержание иммуноглобулинов классов А и Е и снижается содержание иммуноглобулинов классов М и G, а также нарушается гемолитическая активность комплемента, изменяется содержание CI, СЗ и С4 компонентов системы комплемента, а также повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов как у здоровых лиц после употребления крепкого алкоголя (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые установлено, что острая алкогольная интоксикация ведёт к изменению типа иммунного ответа, о чём свидетельствуют сдвиги в содержании цитокинов - IL-4, IL-2 и IFN-y - в образцах периферической крови здоровых лиц, так и у больных с алкогольной зависимостью.

Практическая значимость исследования

Впервые получены принципиально новые данные о негативном влиянии острой алкогольной интоксикации как у лиц без синдрома зависимости от алкоголя, так и у больных алкоголизмом, на клеточные и гуморальные составляющие иммунной системы, приводящем к транзиторному иммунодефициту, активации цитолитических и аутоагрессивных реакций. Как следствие этих процессов возможно развитие системной и органной патологии, в частности, ослабление резистентности организма в борьбе с различными инфекциями и патологические изменения в органах и тканях, что было продемонстрировано ранее в имеющейся литературе.

Получены принципиально новые данные при исследовании показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом в фазе продолжительной ремиссии (3-5 лет), указывающие на то, что именно алкогольная интоксикация является патогенным фактором для иммунной системы. Впервые показано также, что при прекращении употребления алкоголя больными алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии восстанавливаются все изученные параметры иммунной системы и исчезает иммунодефицит, что свидетельствует о временном, транзиторном, характере иммунодефицитного состояния у больных с алкогольной зависимостью.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу лечения иммуномодулирующих препаратов при условии продолжающегося употребления алкоголя.

Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия острой алкогольной интоксикации следует учитывать при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови в научно-практических и лечебно-профилактических учреждениях, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке, во-первых, ошибочного диагноза воспалительного процесса, и, во-вторых, ошибочного диагноза иммунодефицитного состояния.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Этанол in vitro в культурах клеток крови человека (модель острой алкогольной интоксикации) в диапазоне доз 6х10"5-6х10"' мг/мл не влияет на спонтанную пролиферацию лимфоцитов, однако статистически значимо усиливает последующую индукцию делений Т-лимфоцитов митогенным лектином Con А (С08+-лимфоциты); приводит к значимому повышению экспрессии активационных молекул CD25, CD38, HLA-DR на С08+-лимфоцитах и молекул HLA I класса на клетках крови, а также приводит к статистически значимому снижению кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, индуцированной зимозаном и форбол-меристат-ацетатом (ФМА).

2. Острая алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям клеточного иммунитета у обследованных лиц, а именно:

- изменениям гемограммы; пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов; цитолитической активности NK-клеток (натуральные киллеры); фагоцитарного звена иммунной системы;

- изменению популяционного состава клеток крови, которое выражается снижением в периферической крови процента CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов), отношения CD4 /CD8 Т-лимфоцитов и увеличением процента CD19+ В-лимфоцитов.

- увеличению в периферической крови процента активированных CD8+DR+ Т-лимфоцитов, изменению процента активированных CD4+ Т-лимфоцитов и NK-клеток, экспрессирующих DR-молекулы.

3. Острая алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям гуморального иммунитета, а именно:

- изменению иммуноглобулинового профиля;

- изменению содержания комплемента и его компонентов;

- изменению содержания циркулирующих иммунных комплексов;

- изменению содержания цитокинов - IL-4, IL-2 и IFN-y - в периферической крови.

4. Статистически значимое повышение кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, увеличение цитолитической активности NK-клеток, повышение экспрессии молекул HLA I класса и экспрессии активационных молекул на С08+-лимфоцитах, а также увеличение в периферической крови процента активированных С08+-лимфоцитов могут явиться предпосылкой для развития соматической патологии вследствие цитолиза клеток у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

5. Тяжесть нарушений клеточного и гуморального иммунитета возрастает по мере увеличения количества потребляемого алкоголя и длительности его потребления.

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 40 публикациях, в том числе 23 публикациях в рецензируемых центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 3 публикациях в периодической научной печати, главе в монографии, 13 публикациях в материалах научных конгрессов и конференций.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследования доложены на 2-ом Национальном конгрессе РААКИ (Москва, 1998 г.); на XIV съезде психиатров России (Москва, 15-18 ноября 2005 г.); конференции - Современные достижения наркологии, посвященной 20-летию Национального научного центра наркологии (Москва, 21 -22 ноября 2005 г.); на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 3-7 октября 2005 г.); на XI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе (Санкт-Петербург, 28-31 мая 2007 г.); на VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 27 - 29 июня 2007 г.); на I Российском национальном конгрессе по наркологии с международным участием (Москва, 24 - 27 ноября 2009 г.); на XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011» (Санкт-Петербург, 23 - 26 мая 2011 г.); на VII Российской конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН Г.Н. Крыжановского «Нейроиммунопатология» (Москва, 13-14 ноября 2012 г.); на Третьей Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 5-6 марта 2013 г.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Цели и задачи исследования», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований и обсуждение», изложенные в 5 главах; «Заключение», «Выводы» и «Библиографический указатель» - представлен 220 библиографическими источниками, в том числе 88 отечественных и 132 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 59 таблицами и 38 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro.

Биологическим материалом для проведения исследований служила венозная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в стерильные пробирки "Vacutainer" с антикоагулянтом. В работе использовали цельную кровь и мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови, в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин "Gibco" d=l,077 г/см3 по общепринятой методике [Воут А., 1968]. Клетки культивировали при 37° С в атмосфере с 5% С02 в полной питательной среде (ППС), в состав которой входила среда RPMI ("Sigma Chemical Со", USA), дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой ("Sigma Chemical Со", USA), 2 mM L-глутамина ("Gibco", USA), 20 mM HEPES-буфера ("Gibco", USA) pH 7,4 и 10 мкг/мл гентамицина ("Gibco", USA).

Изучалось влияние этанола in vitro на способность Т-лимфоцитов усиливать синтез ДНК, цитолитический эффект NK-клеток, экспрессию на лимфоцитах активационных молекул - CD25, CD38, HLA-DR и экспрессию молекулы HLA I класса на клетках крови; функциональную активность фагоцитирующих клеток. Для выполнения этих задач был выбран широкий диапазон доз этанола, включающий: критические дозы (б мг/мл крови); дозы, вызывающие сильное (0,6x10"' мг/мл) или слабое (6x10'2 мг/мл) опьянение, и дозы, практически не влияющие на организм человека (6x10"3 мг/мл и ниже). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, употребивших алкоголь в различных количествах [Прозоровский В.И. и др., 1967].

Методы изучения влияния этанола на пролиферативную активность Т-лимфоцитов на модели реакции властной трансформации in vitro. Биологическим материалом для исследований служила цельная периферическая кровь здоровых лиц, взятая в пробирки с гепарином. Влияние этанола на пролиферативную активность Т-лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) без или с применением митогенных лектинов РНА ("Sigma", USA) в концентрации 5 мкг/мл и Con A ("Sigma", USA) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили клетки из той же цельной крови без

внесения этанола и культуры клеток без этанола, но с добавлением митогенных лектинов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на ß-счётчике ("Wallac 1409 DSA", Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (СРМ) и рассчитывали для каждой культуры. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур клеток. Результаты исследований выражали средними арифметическими значениями имп/мин (СРМ).

Метод изучения влияния этанола на цитолитическую активность NK-клеток на модели естественной цитолитической активности in vitro.

Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной периферической крови, как указано выше. Влияние этанола на цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro. Метод основан на способности NK-клеток in vitro лизировать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562, меченные 3Нгуридином. В культуры вносили этанол в концентрациях (6*10"5 -6x10"' мг/мл), контролем служила смесь мононуклеаров и культур К-562, меченных 3Н1-уридином, без этанола. Радиоактивность образцов измеряли на ß-счётчике "Wallac 1409 DSA" (Finland). Результаты измерения выражались в имп/мин (СРМ) в расчете на каждую культуру. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(7 - средние значения СРМ в опытных культурах: средние значения СРМ в контрольных культурах) х 100%.

Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул активации — CD25, CD38, HLA-DR - на лимфоцитах человека in vitro. Биологическим материалом для исследования служила цельная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки "Vacutainer" с гепарином. Экспрессию молекул активации - CD25, CD38 и HLA-DR - определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD19+ B-лимфоцитов и CD3"56+ NK-клеток, которую выражали в условных единицах, у.е. - MFI (mean fluorescence unit). Постановку реакции проводили в стерильных 24-луночных планшетах ("Nunc", Denmark). В лунки вносили 500 мкл ППС и 500 мкл цельной крови, после чего вносили этанол в конечных концентрациях 6x10"5 - 6 мг/мл. Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 час при 37° С в атмосфере влажности с 5% СС>2. Обработку биологического материала проводили согласно протоколу фирмы "Becton Dickinson" (USA). Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы "Becton Dickinson" (USA) с использованием двухцветных моноклональных антител фирмы "Becton Dickinson" (USA) [Loken M.R., 1990].

Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул HLA I класса на клетках крови in vitro. Биологическим материалом для исследования служили

мононуклеары, выделенные из крови здоровых лиц (как указано выше) без синдрома зависимости от алкоголя, взятой в пробирки "Vacutainer" с гепарином. Постановку реакции проводили в стерильных 96-луночных круглодонных планшетах ("Nunc"), в которые вносили 100 мкл ППС с конечными концентрациями этанола 6x10"5 - 6x10"' мг/мл и 100 мкл выделенных мононуклеаров (2x10б в 1 мл ППС), контролем служила клеточная суспензия в ППС без этанола. Культуры инкубировали 18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% СС>2, после чего планшеты центрифугировали 5 мин при 300g, надосадок убирали стряхиванием планшета, добавляли 240 мкл раствора Хенкса. В пластиковые пробирки для проточной цитофлуориметрии ("Falcon") вносили по 10 мкл суспензии клеток, добавляли по 50 мкл немеченого антитела к антигену HLAI класса («Сорбент», Филатов A.B.), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Отмывали центрифугированием 5 мин при 300g, надосадок удаляли и добавляли 150 мкл раствора Хенкса, еще раз отмывали 5 мин при 300g, надосадок убирали. Добавляли 50 мкл вторичных антител (меченных ФИТЦ), инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Центрифугировали 5 мин при 300g, осадок фиксировали раствором Cell Fix. Клетки анализировали не позднее 24 час после фиксации. Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы "Becton Dickinson" (USA). Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных клеток крови (моноцитов, Т- и B-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).

Метод изучения влияния этанола на функциональную активность фагоцитирующих клеток in vitro. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки "Vacutainer" с ЭДТА. Постановку проводили в стерильных пробирках ("Nunc") объемом 15 мл, в которые вносили по 500 мкл цельной крови. Затем вносили этанол в конечных концентрациях 6хЮ"5 - 6 мг/мл. Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% С02. Интенсивность реакции оценивалась количественно по числу импульсов за 1 минуту (имп/мин) в расчете на каждую исследуемую пробу. Для активации хемилюминесцентной реакции фагоцитирующих клеток использовали зимозан ("Sigma Chemical Со", USA), опсонизированный по Зыкину В.Ю. и Годкову М.А. (2004), или раствор форбол-меристат-ацетата (ФМА). В пробирки (по 3 на пробу) добавляли по 15 мкл зимозана (10 мг/мл) или ФМА (0,2 мг/мл) и регистрировали уровень хемилюминесценции в течение 30 мин. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивали по максимальному значению на кинетической кривой хемилюминометра Люцифер Б («Диалог», Москва). Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяли по данным трех идентичных измерений. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови): средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови).

Методы иммунологического обследования

Материалы для исследования. В качестве биологического материала для иммунологических исследований использовали репрезентативную выборку образцов периферической крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью спустя 17-19 час после употребления последней дозы крепкого алкоголя.

Характеристика обследованных групп

Часть работы выполнена на базе ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. В работе представлены результаты иммунологического обследования 220 больных алкогольной зависимостью, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в наркологических клиниках и диспансерах города Москвы в период с 1994 по 2009 годы, а также 180 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.

Распределение обследованных лиц по полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1.

Распределение обследованных лиц по полу и возрасту, п=400 (М±а)

Тендерный состав Средний возраст пациентов, лет Количество обследованных, %

Мужчины, п=321 24-60 (45,5±8,8) 81

Женщины, п=79 25-60 (40,9±9,8) 19

В табл. 2 представлена возрастная и тендерная характеристика обследованных групп больных алкоголизмом и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.

Таблица 2.

Характеристика групп обследованных больных с алкогольной зависимостью и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (М±с)

Группы обследованных Мужчины Женщины Средний возраст (лет) Рост (см) Вес (кг)

1. Больные алкоголизмом I стадии, п=79 58 (73%) 21 (27%) 43±10 165-190 64-110

2. Больные алкоголизмом П стадии п=72 60 (83%) 12 (17%) 43,3±9,6 167-189 63-105

3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, п=69 60 (87%) 9(13%) 44,9±9,6 165-192 63-105

4. Здоровые лица (контроль), п=90 73 (81%) 17(19%) 44±10 163-195 60-128

5. Здоровые добровольцы после употребления крепкого алкоголя, п=90 70 (78%) 20 (22%) 44,2±9,2 164-198 60-135

У больных алкоголизмом I стадии, вошедших в группу 1, длительность злоупотребления алкоголем варьировала от 1 года до 3,5 лет, средняя длительность хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) составляла 2,3±0,8 лет. Значимых различий длительности ХАИ у мужчин и женщин выявлено не

было. Состояние алкогольного абстинентного синдрома ни у одного из больных группы 1 не отмечено. Толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,4 л до 0,8 л (в среднем 0,6±0,2 л) и у женщин от 0,3 л до 0,6 л (в среднем 0,45±0,1 л) крепких алкогольных напитков в сутки (табл.3). Больные употребляли крепкий алкоголь в течение 1-2 дней до исследования в количестве 0,3-0,45 л, забор крови проводили спустя 17-19 час после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения им медикаментозного лечения.

Таблица 3.

Характеристика обследованных пациентов по длительности злоупотребления алкоголем, толерантности к алкоголю и частоте запоев (М±а)

Группы пациентов Длительность хронической интоксикаци и алкоголем Толерантность к крепкому алкоголю (в литрах) Продолжительность запоев (дни) Частота запоев в год

мужчины женщины

1. Больные алкоголизмом I стадии, п=79 2,3±0,8 0,б±0,2 0,43±0,1 0 0

2. Больные алкоголизмом II стадии, п=72 7,5±2,б 0,9±0,2 0,б8±0,22 10-20 4-7

3. Больные алкоголизмом П стадии, фаза ремиссии, п=69 В анамнезе 0 0

8,1±2,0 0,5 -1,2 0,4-1,1

У больных алкоголизмом группы 2 длительность ХАИ варьировала от б до 10 лет (в среднем 7,5±2,6 лет). Алкогольный абстинентный синдром появился 4-6 лет назад. Частота появления ААС варьировала от 4 до 7 раз в год (табл. 3). Продолжительность запоев составляла 10-20 дней, толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,6 до 1,2 л (в среднем 0,9±0,2 л) и у женщин от 0,4 до 1 л (в среднем 0,68±0,22 л) крепких алкогольных напитков в сутки. Больные употребляли алкоголь в течение 1-2 дней до исследования в количестве 0,3-0,6 л крепкого алкоголя, забор крови проводили спустя 17-19 час после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения им медикаментозного лечения.

В группу 3 вошли больные алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии длительностью от 3 до 5 лет, в среднем 4,1±1,1 лет (табл. 2,3).

В группу 4 - контрольную (группа сравнения, норма) вошли здоровые лица без синдрома зависимости от алкоголя. В группу 5 вошли здоровые добровольцы также без синдрома зависимости от алкоголя. В зависимости от дозы употребленного до исследования алкоголя группа 5 была разбита на 3 подгруппы (табл. 4). В подгруппу 1 вошли 27 практически не пьющих лиц, которые употребили 50 мл водки или 150 мл красного вина за 17-19 час до забора крови. В подгруппу 2 вошли 35 человек, употребивших 0,2—0,3 л крепкого алкоголя в течение дня до исследования, последний прием алкоголя был за 17-19 час до забора крови. В подгруппу 3 вошли 28 человек, употребивших 0,6-1 л крепкого алкоголя в течение 2-3 дней до исследования, последний приём был за 17-19 час

до забора крови. Перед данньм исследованием лица в подгруппе 3 не употребляли никакого алкоголя в течение 1,5-2 месяцев.

Таблица 4.

Характеристика подгрупп обследованных здоровых добровольцев из группы 5, без синдрома зависимости от алкоголя, употребивших алкоголь накануне исследования

Количество употреблённого алкоголя добровольцами из группы 5 Мужчины Женщины Возраст (лет) Рост (см) Вес (кг)

1 подгруппа: 50 мл водки или 150 мл вина, п=27 20 (74%) 7 (26%) 24-60 164-188 60-105

2 подгруппа: 0,2-0,3 л водки, п=35 30 (86%) 5 (14%) 25-60 170-190 68-105

3 подгруппа: 0,6—1 л крепкого алкоголя в течение 2-3 дней, п=28 24 (86%) 4 (14%) 28-60 170-190 70-135

Все обследованные (100%) - лица трудоспособного возраста с одинаковым социальным статусом (высшее образование, хорошая среда обитания и материальный достаток, проживание в полноценных семьях), жители города Москвы и ближнего Подмосковья. Из числа обследованных были исключены лица с отягощённой наследственностью по соматическим, аллергическим, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям, а также страдающие туберкулезом, рецидивирующими герпетическими, цитомегаловирусными, хламидийными инфекциями, гепатитами В и С и ВИЧ-инфекцией.

Исследование проводилось в соответствии с требованиями Основ законодательства «Об охране здоровья граждан», у больных и здоровых лиц было получено информированное согласие на проведение обследования.

Всем здоровым лицам и больным алкоголизмом после употребления алкоголя проводили определение показателей иммунного статуса: клеточного и гуморального иммунитета.

Забор крови у здоровых проводили рано утром, а у больных - в момент поступления в наркологические клиники или диспансеры в пробирки с антикоагулянтом (гепарином или ЭДТА), а также сухие без антикоагулянта с помощью системы "Vacutainer" ("Becton Dickinson", USA). Для оценки иммунного статуса кровь использовали не позднее 6 час после забора.

Методы определения клеточного иммунитета

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки "Vacutainer" с гепарином. В работе использовали мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови, как указано выше [Воуш А., 1968]. Клетки культивировали в полной питательной среде

(ППС), как указано выше (раздел «Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro»).

Всем обследованным проводили клинический анализ крови с обязательным определением лейкоцитарной формулы.

Метод определения пролиферативной активности Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Пролиферативную активность Т- и В- лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) с применением митогенных лектинов РНА ("Sigma", USA), Con A ("Sigma", USA), PWM ("Sigma", USA) и LPS ("Sigma", USA), которая рассматривается как экспериментальная модель пролиферативной экспансии клеток, происходящей под влиянием антигенов in vivo. Контролем служили культуры без добавления митогенных стимуляторов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-3Нг тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на ß-счётчике "Wallac 1409 DSA" (Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (СРМ) в расчете на каждую культуру клеток, каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали в виде средних арифметических значений и индекса стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения СРМ опытных культур: средние значения СРМ контрольных культур [Петров Р.В. и др., 1984].

Метод определения цитолитической активности NK-клеток. Цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro, как описано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro). Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(7 -средние значения СРМ в опытных культурах: средние значения СРМ в контрольных культурах) * 100% [Алексеев Л.П. и др., 1985].

Метод определения популяционного состава лимфоцитов. Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки "Vacutainer" с ЭДТА. Обработку крови проводили согласно протоколу фирмы "Becton Dickinson" (USA). Популяционный и субпопуляционный состав клеток периферической крови изучали методом проточной лазерной цитофлуориметрии на приборе FACS Calibur фирмы "Becton Dickinson" (USA) с использованием двух- и трёхцветных моноклональных антител фирмы "Becton Dickinson" (USA) [Loken M.R., 1990].

Методы определения функциональной активности фагоцитов. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки "Vacutainer" с ЭДТА. Кислородзависимую активность фагоцитирующих клеток оценивали методом хемилюминесценции, как описано выше. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови): средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на

100 мкл крови). Поглотительную активность фагоцитов оценивали на модели дрожжевых грибов, меченных ФИТЦ. Метод основан на способности фагоцитирующих клеток in vitro поглощать Candida albicans, меченные ФИТЦ. Интенсивность фагоцитоза оценивали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur фирмы "Becton Dickinson" (USA). Фагоцитарный индекс вычисляли как число грибов Candida albicans, поглощённых одной фагоцитирующей клеткой [Пинегин Б.В. и др., 2001; Saresella М., Spesiale D. et al., 1999].

Методы определения гуморального иммунитета

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в сухие пробирки "Vacutainer" без антикоагулянта. Кровь оставляли для свёртывания на 1 час при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 400g (+4° С). Сыворотку аликвотировали в пробирки "Eppendorf" и хранили до анализа при -20° С не более месяца.

Метод определения содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, G и Е. Количественное определение содержания IgA, IgM, IgG и общего IgE в сыворотке крови человека проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем фирмы "Sigma" (USA). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера "Titertek Multiskan МСС/340" ("Labsystems", Finland) при длине волны 492 nm [Фримель Г., 1987].

Методы определения в сыворотке крови гемолитической активности комплемента СН50, содержания компонентов комплемента CI, СЗ и С4. Гемолитическую активность комплемента (СН50) в сыворотке крови определяли методом 50% гемолиза эритроцитов барана (ЭБ). Постановку реакции осуществляли в триплетах. Контролем служила стандартная пулированная (более 30 образцов) сыворотка здоровых доноров. Качество гемолитической системы контролировали по установленному стандартному значению оптической плотности суспензии сенсибилизированных эритроцитов, инкубированных в лунках планшета без добавления сыворотки. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера "Titertek Multiskan МСС/340" ("Labsystems", Finland) при длине волны 690 nm. Активность комплемента выражали в условных единицах — СН50, рассчитанных с помощью специальной программы. За единицу активности принимали количество комплемента, выраженное в мл, вызывающее 50% гемолиз сенсибилизированных ЭБ [Кондратьева И.А. и др., 2001]. Количественное определение содержания в сыворотке крови С1, СЗ и С4 компонентов комплемента проводили методом твердофазного ИФА с применением тест-систем ("Beckman Culture", USA). Для определения были использованы наборы «IFA-Cl», «IFA-C3» и «IFA-C4», основанные на «сэндвич» - варианте твердофазного ИФА. Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера "Titertek Multiskan МСС/340" ("Labsystems", Finland) при длине волны 630 nm [Walport M.J., 2001].

Методы определения содержания в сыворотке крови С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Количественное определение содержания в сыворотке крови CRP, ASO и RF. Тест основан на взаимодействии исследуемых сывороток или контрольной сыворотки со специфическими моноклональными антителами к CRP, или ASO, или RF, иммобилизованными на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX CRP, ASO и RF ("HUMAN", Deutschland). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Количественное определение содержания в сыворотке крови ЦИК. Определение основано на снижении растворимости иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Увеличение мутности раствора при осаждении циркулирующих иммунных комплексов ПЭГ-ом определяли турбодиметрически, оценивая скорость нарастания оптической плотности. При 3% концентрации ПЭГ происходит осаждение крупных иммунных комплексов, при 4% концентрации ПЭГ - средних и мелких. Измерение проводили с помощью спектрофотометра - ридера "MRX Microplate Reader" ("Dinex Technology Ins.", USA) при длине волны 340 nm. Конечный результат выражали как среднее арифметическое трех значений оптической плотности (OD) [Digeon M. etal., 1977].

Метод определения содержания цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-а и IFN-y. Количественное определение содержания в сыворотке крови цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y проводили методом твердофазного ИФА с применением тест-систем "Cytimmune" (USA). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера "MRX Microplate Reader" ("Dinex Technology Ins.", USA) при длине волны 490 nm. Метод определения продукции лейкоцитами IFN-y при индукции клеток крови митогеном РИА in vitro. Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, выделенные из гепаринизированной крови, как указано выше [Воут А., 1968]. Для. индукции IFN-y использовали фитогемагглютинин (РНА) "Sigma" (USA) в концентрации 5 мкг/мл ППС (мононуклеары культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной питательной среде при 37° С в атмосфере с 5% С02, время культивирования 48 час). По завершении инкубации планшеты центрифугировали, затем собирали супернатанты в стерильные пробирки "Eppendorf, которые хранили до анализа при -20° С. Содержание IFN-y в культуральной среде определяли с помощью твердофазного ИФА с применением тест-систем "Cytimmune" (USA), постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра - ридера "MRX Microplate Reader" ("Dinex Technology Ins.", USA) при длине волны 490 nm.

Методы статистической обработки результатов исследований

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики на персональном IBM-совместимом компьютере с применением пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 2007» и "Biostatistics".

Результаты представлены в виде средней (М) ± стандартное отклонение (а). Сравнение показателей групп здоровых лиц и больных алкоголизмом после употребления ими алкоголя с группой здоровых (норма) проведено с использованием t-критерия Стьюдента при условии нормального распределения признаков. Различия считались достоверными при р<0,05 [Реброва, О.Ю., 2003; Стентон Гланц, 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние этанола на иммунокомиетентные клетки крови здоровых лиц в культурах in vitro

Для выяснения механизмов влияния этанола на клетки крови нами было проведено исследование действия различных концентраций этанола in vitro (модель острой алкогольной интоксикации) на иммунокомпетентные клетки периферической крови здоровых лиц. Биологическим материалом для исследования служили образцы периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. Нами был выбран широкий диапазон концентраций этанола - от критических (6 мг/мл крови) до нейтральных (6x10"5 мг/мл). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, и употребивших различные количества алкоголя [Прозоровский В.И. и др., 1967]. В соответствии с этим исследованы in vitro дозы этанола, не влияющие на человека (6хЮ"5 - 6хЮ"3 мг/мл); дозы, вызывающие слабое (6x10"2 мг/мл) и сильное(6хЮ"' мг/мл) опьянение, и критические дозы, приводящие к смертельному исходу (6 мг/мл).

Влияние этанола на пролиферацию лимфоцитов крови

Исследовали влияние различных концентраций этанола на способность лимфоцитов цельной крови спонтанно инициировать клеточное деление in vitro. В одном варианте экспериментов на весь период культивирования лимфоцитов цельной крови от 10 здоровых лиц (72 часа при 37°С в атмосфере влажности с 5% С02) этанол вносили в отсутствии митогенных лектинов РИА и Con А. Во втором варианте этанол вносили вместе с митогенными лектинами (кровь от тех же 10 здоровых лиц), а в третьем варианте лимфоциты цельной крови (от 10 здоровых лиц) инкубировали 3 часа в тех же условиях в присутствии митогенных лектинов, после чего вносили этанол (оценка влияния этанола на индуцибельную фазу иммунного ответа).

Результаты исследования влияния in vitro широкого диапазона концентраций этанола на лимфоциты цельной крови представлены на рис. I. Из рисунка видно, что этанол 8 концентрации 6 мг/мл полностью подавляет спонтанный пролмфервтмвный ответ лимфоцитов (их способность к делению). Концентрация этанола 6x10 1 мг/мл статистически значимо подавляет спонтанный пролиферативный ответ лимфоцитов, дозы этанола от 6* 10 ' мг/мл и ниже не влияют на спонтанную пролиферацию лимфоцитов in vitro, в сравнении с клеточными культурами без внесения этанола. Полученные результаты свидетельствуют о том. что этанол при внесении его в культуры клеток крови in vitro не индуцирует пролиферацию лимфоцитов, а в высокой концентрации (6*10"' мг/мл). напротив, подавляет её. Причем, этанол в концентрации 6 мг/мл вызывает гибель клеток крови, что было подтверждено подсчетом клеток в камере Горяева. т.е. обладает выраженным цитостатическим эффектом.

ычгалправин ггммда мг и*

Р»с, I. Уровень спонтанной пролиферации (СП) лимфоцитов (имп/мии) периферической крови цоровых лиц веч емклрома паисимостн от алкоголе в присутствии этанола ш \ntro в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; ••• - р<0.0001 статистически тачимос отличие от контроля; 1-крн1ернй Стьюденп

Таким образом, можно сделать заключение, что этанол не влияет на пролиферацию (деление) лимфоцитов крови человека в диапазоне доз. не подавляющих их жизнеспособность, и не способен инициировать иммунный ответ.

Далее мы устано»или. что этанол в конечных концентрациях 6*10' -6 мг/мл. вносимый в культу ры лимфоцитов крови человека вместе с митогенными лектинами РНЛ или Соп А. подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на эти митогенные стимуляторы по абсолютным значениям СРМ (имп/мин) в сравнении с контрольными культурами без этанола (рис.2).

Рис. 2. Уровень пролифсрлмвиоА активности лимфоцитов, индуцированной миниеннымн лектинами РИА и Con А. в присутствии панаш in vitro в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; " р<0,001; - р<0,0001 - статистически значимые отличия от контроля; t тенденция к увеличению показателя, i-критерий Стъюдента

Дозы этанола 6*105 - 6х10'г мг/мл не влияют на пролиферацию Т-лимфоцитов, индуцированную мнтогенным лектнном РИА, в то же время усиливают пролиферацию Т-лнмфоцитов. ннлуцнрованную Con А (рис. 2). Результаты, полученные в этом варианте исследований, свидетельствуют о том, что панол обладает способностью усиливать пролиферацию CD8' Т-лимфоцитов, поскольку известно, что Т-клеточный митогеи Con А в культурах лимфоцитов in vitro стимулирует к пролиферации в основном популяцию CD8'-лимфоцитов [Дейл М.М., Формен Д.К.. 1998].

Таким образом, установлено, что этанол обладает способностью усиливать in vitro индуцированную мнтогенным лектнном Con А пролиферацию CD8* Т-лимфоцитов. что говорит о тропности этанола к этим клеткам.

В экспериментах с предварительным культивированием лимфоцитов цельной крови здоровых лиц (в течение 3 часов при 37°С в атмосфере влажности С 5% СОг) в присутствии митогенов РНА или Con А и без них с последующим внесением этанола в конечных концентрациях 6* 10"' - 6x|0'J мг/мл (время культивирования 72 часа при тех же условиях) обнаружено, что этанол не оказывал влияния на фазу индуцибельного периода иммунного ответа и не усиливал последующую индукцию митогенными лектинами РНА или Con А деления Т-лимфоцитов (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние этанола in vitro на фазу индуцибельного периода иммунного ответа лимфоцитов крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (М±с)__

Концентрация этанола, т/мл Про.зиферашвныП ответ лимфоцитов, (ими. мин), п 10

СП РНА (5мг/мл) Con А (5мг/мл)

контроль (без этанола) 544±77 24593*4380 18483±4503

6*10' 544±76,9 2450814351 18457*4398

6* КГ1 539*80,0 24393±4303 18450*4474

6*105 538*75,6 24829*4488 18275*4658

6*102 529*70.1 2372614333 18647*4352

Таким образом, установлено, что этанол в дозах, вызывающих как сильное, так и слабое опьянение, не влияет на пролифсративные процессы Т-лимфоцитов на начальной фазе иммунного ответа.

На основании полученных результатов исследования можно сделать заключение, что критические концентрации этанола, приводящие к гибели лиц. злоупотребляющих алкоголем, обладают способностью практически полностью подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов крови человека (как CD8', так и CD4'), Тогда как дозы, вызывающие сильное опьянение, пролиферацию этих клеток статистически значимо снижают. Напротив, дозы этанола, вызывающие слабое опьянение, статистически значимо усиливают пролиферацию CD8* Т-лимфоцитов, индуцированную митогснным лектином Con А. и не влияют на пролиферацию CD4' Т-лимфоцитов, индуцированную митогснным лектином РНА. Обнаруженные в этом разделе работы факты свидетельствуют о тропностн этанола к CD8* Т-лимфоцитам.

Влияние этанола на активность NK-клеток

Исследовали in vitro влияние этанола на цитолитическую активность NK-клеток крови человека. Биологическим материалом для исследования служили лимфоциты, выделенные из венозной крови от 10 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. На весь период культивирования (18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% СОг) клеток-мишеней (клеточная линия К-562, меченная Н1-уридином) и выделенных лимфоцитов в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях от 6* 10* -6 мг/мл Контролем служили соответствующие культу ры клеток без этанола (рис. 3).

Рис. 3. Индексы цитолигичсской активности NK-клето* крови in vitro; • - pO.OS; " р<0.001; '" pKO.OOOl - статистически значимые отличия показателя « присутствии этанола от показатели контрольных культур в отсутствии этанола. J - тенденция к снижению показателя; Меритерий Стыолента

Установлено, что этанол в концентрациях от 6*10 " до 6 мг/мл снижает цитолитическую активность NK-клеток. Наиболее выраженный эффект снижения наблюдается при дозах. вызывающих слабое (6* 10) и сильное (6*10'1 мг/мл) опьянение. Как видно из рисунка 3, при этих концентрациях отмечается высоко значимое снижение цитолитичсской активности NK-клеток по сравнению с контролем. Эффект полного подавления цитологической активности NK-клеток этанолом наблюдается при концентрации 6 мг/мл, которая приводит к гибели человека.

Приведенные выше данные позволяют сделать заключение, что этанол in vitro обладает способностью подавлять цитолитическую активность NK-клеток в широком диапазоне концентраций.

Влияние этанола на экспрессию активационных CD-молекул

Исследовали влияние этанола in vitro на экспрессию активационных CD-молекул (CD25, HLA-DR и CD38) на Т-лимфоцитах и В-лимфоцитах и NK-клетках, которую определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов и CD3"56+ NK-клеток. На весь период культивирования лимфоцитов цельной крови здоровых лиц (18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% СОг) в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях 6х10"5; бхЮ"4; 6х10"3; 6х10"2 и 6x10"' мг/мл. Контролем служили соответствующие культуры клеток без внесения этанола.

Результаты исследования представлены в табл. 6. Как видно из таблицы, концентрации этанола, которые обладают наиболее выраженным эффектом усиления индуцированной Con А пролиферации Т-лимфоцитов in vitro, приводят к статистически значимому снижению экспрессии HLA-DR молекул на CD4+ Т-лимфоцитах. Наиболее выраженный эффект снижения экспрессии HLA-DR молекул на CD4+ Т-лимфоцитах наблюдается при дозах этанола, вызывающих слабое (6х1(Г2 мг/мл) и сильное (6x10"' мг/мл) опьянение. В то же время, как видно из табл. 6, этанол во всех исследованных концентрациях (6xl0"5-6xl0_1 мг/мл) статистически значимо повышает экспрессию этих молекул на CD8+ Т-клетках и в концентрациях 6x10"3 и выше - на CD19+ В-лимфоцитах в сравнении с показателями культур без внесения этанола. Этанол в концентрациях 6x10"3 и выше также значимо усиливает экспрессию молекулы адгезии CD38 как на CD8+ Т-клетках, так и на CD19+ В-лимфоцитах (табл. 6).

Таблица 6.

Экспрессия активационных молекул CD25, HLA-DR и CD38 на клетках периферической крови здоровых лиц после воздействия различных доз этанола in vitro (M±g)_

Показатель Интенсивность флуоресценции (y.e.)

Контроль (n=10) 6*10'5 мг/мл (n=10) 6x10" мг/мл (n=10) 6x10 3 мг/мл (n=10) 6xl0'2 мг/мл (n=10) 6x10"' мг/мл (n=10)

CD4+25+ 18±2,77 17,99±2,8 18,4±2,8 18,3±2,7 18,3±2,77 19,3±2,93

CD4+DR+ 231,6±8,4 229,5±8,5 214,8±7,2Ц 125,2±6,67* 89,6±4,06** 98,6±4,54**

CD4*38" 91±5,6 91,3±5,0 90,95±5,68 91,0±5,5 105,3±3,42 103,4±3,1

CD8+25+ 1,5±0,16 7,8±2,0*** 14,0±2,1*** 25,5±2,5 *** 23,5±1,8*** 20±1,1***

CD8+DR+ 196±19,2 399,2±20,7* 516±35,85** 1799±122,2*** 1111±100,4*** 790±45,9 ***

CD8*38+ 138,7±7,94 140,6±9,0 158,28±8,0T 174,4±5,78* 216,3±9,2** 203,33±8,46*

CD 19+DR+ 224,3±9,96 238,2±9,3 269,4±10,15t 300,7±8,4* 359,4±7,46* 295,66±8,97*

CD19+38+ 22,6±1,4 23,0±2,0 24,1±1,9 28,15±2,4t 39,5±3,5* 38,2±3,24*

CD3"56+DR+ 160,7±20,6 161,1 ±21,0 165,3±20,8 166,4±24,6 164,25±25,1 163,66±23,1

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,001; *** - р<0,001 - статистически значимые отличия показателей экспрессии молекул СЭ25, НЬА-ОЯ, С1)38 на Т- и В-лимфоцитах и ЫК-клетках в присутствии этанола в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; Т - тенденция к увеличению и | -тенденция к снижению показателя; ^критерий Стьюдента

Под влиянием этанола на С08+-лимфоцитах статистически значимо повышается экспрессия СЭ25-молекул, причём это повышение отмечается при всех исследованных концентрациях этанола (6х10"5-6х10"' мг/мл) в сравнении с контрольными культурами без внесения этанола. Изменений в экспрессии CD25 молекул на CD4+ Т-лимфоцитах не наблюдается (табл. 6).

Таким образом, этанол обладает тропностью к CD8+ Т-лимфоцитам, что проявляется усилением экспрессии активационных молекул на этих клетках и снижением их экспрессии на CD4+ Т-лимфоцитах. Усиление экспрессии активационных молекул на CD8+ Т-лимфоцитах приводит к активации эффекторного (киллерного) механизма иммунной системы, что является в, свою очередь, определяющим моментом в развитии патологии органов и систем.

Влияние этанола на экспрессию молекул HLA I класса

Исследовано влияние этанола на экспрессию молекул HLA I класса на клетках крови in vitro, которую определяли по суммарной интенсивности флуоресценции всех антиген-позитивных клеток периферической крови (Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов и нейтрофилов). На весь период культивирования (18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% ССЬ) лимфоцитов цельной крови (от 10 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя) в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях 6х10"5; 6x10"4; 6х10"3; 6хЮ"2и 6* 10"' мг/мл. Контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола. Обработку крови после 18-часовой инкубации с этанолом и без него проводили согласно протоколу фирмы "Becton Dickinson" (USA) с помощью моноклональных антител к молекулам HLA I класса.

Результаты исследования представлены в табл. 7. Как видно из таблицы, этанол в концентрациях 6* 10"5-6х 10"'мг/мл, вносимый в культуры клеток крови in vitro, усиливает экспрессию молекул HLA I класса на всех клетках крови. Обнаружено, что наибольшим, статистически значимым, эффектом усиления экспрессии этих молекул, обладают дозы этанола, вызывающие слабое (6*10"2 мг/мл) и сильное (6x10"') опьянение.

Таблица 7.

Экспрессия молекул HLA I класса на клетках периферической крови здоровых

Концентрации этанола, мг/мл Интенсивность флуоресценции, у.е. п=10

контроль (в отсутствии этанола) 438,±14,92

6x10° 600±21,4*

6ХІ04 648,5±22,6 *

6*10J 690,4±23,0 *

6*1 о-2 818,1±23,5 **

6x10"' 829,5±24,7 **

Примечание: * — р<0,05; ** — р<0,001 — статистически значимые отличия показателя суммарной экспрессии молекул НЬА I класса в присутствии этанола от показателя контрольных культур в отсутствии этанола; ^критерий Стьюдента

Таким образом, установлено, что этанол обладает способностью усиливать экспрессию молекул НЬА I класса на клетках крови и, по-видимому, на многих

других клетках организма, в широком диапазоне доз. Известно, что молекулы HLA I класса осуществляют контактные взаимодействия различных клеток организма человека с С08"-лимфоцитами, что свидетельствует о влиянии этанола на процессы кооперации между этими иммунокомпетентными клетками и другими клетками организма.

Влияние этанола на функциональную активность фагоцитов

Исследовали влияние этанола на способность фагоцитирующих клеток крови человека активироваться при воздействии на них зимозаном и ФМА in vitro. На весь период культивирования клеток цельной крови от 10 здоровых лиц (18 час при 37°С в атмосфере влажности с 5% С02) в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях бхЮ^-бхЮ"1 мг/мл, контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола.

Результаты исследования влияния этанола на кислородзависимую активность фагоцитирующих клеток in vitro представлены в табл. 8. Как видно из таблицы, этанол в концентрациях, вызывающих слабое (6x10"2 мг/мл) и сильное (бхЮ"1 мг/мл) опьянение, подавляет хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток, как спонтанную кислородзависимую, так и индуцированную зимозаном и ФМА. Причем, это подавление было статистически значимым по сравнению с показателями культур без этанола. Выявленные факты являются, по-видимому, следствием токсического эффекта высоких концентраций этанола. В то же время, этанол в концентрациях 6х10"5-6хЮ"3мг/мл не изменяет спонтанную и зимозан-индуцированную хемилюминесценцию. Обнаружено также, что этанол при внесении его в культуры фагоцитирующих клеток in vitro во всех исследованных концентрациях подавляет ФМА-индуцированную хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток.

Таблица 8.

Влияние этанола на хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток после 18-часовой инкубации цельной крови здоровых лиц in vitro (М±о)_

Концентрация этанола, мг/мл Хемилюминесценция фагоцитирующих клеток, п=10

Спонтанная (имп/мин) Индуцированная зимозаном Индуцированная ФМА

имп/мин ИС имп/мин ИС

контроль (без этанола) 1642,3±492.3 13292±1118 8,48±2,3 8892±748 5,4±1,49

бхЮ-5 1643±486 12396±1052 7,5±1,8 6036±332* 4,95±1,23

6x10" 1654±500 11228±945 6,8±1,59 5326±327* 3,67±1,22*

6х10'3 1645,6±500,0 10878±875,4 6,6±1,54 5081,3±305* 3,2±0,98+

6Х10"2 673±50,9** 2288±405*** 3,5±0,71" 1952,6±398" 3,08±0,97*

6x10"' 337±23,8"» 308±7,2"* 0,9±0,2"* 360,3±21,4*»» 1,06±0,45***

Примечание: * — р<0,05; ** — р<0,001; *** - р<0,0001 — статистически значимые отличия показателей хемилюминесценции фагоцитов в присутствии этанола от показателей контрольных культур в отсутствии этанола; 1-критерий Стьюдента

Следовательно, проведенные исследования с использованием этанола в широком диапазоне концентраций выявили его прямое влияние на фагоцитирующие клетки крови человека. Установлено, что этанол при 18-часовой инкубации с клетками крови человека подавляет хемилюминесценцию, индуцированную зимозаном и ФМА, причем, в случае с ФМА этот эффект был более выражен и прослеживался при всех исследованных концентрациях этанола (6х10"5-6х10"' мг/мл). Обнаруженные факты снижения кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток под влиянием этанола говорят о нарушении функционального потенциала этих клеток, а именно - поглотительной и переваривающей способности.

Таким образом, в модели острой алкогольной интоксикации in vitro этанол в широком диапазоне доз оказывает деструктивное влияние на клетки иммунной системы, которое проявляется в нарушениях функциональной активности Т-хелперов, NK-клеток, их активационного состава, функциональной активности фагоцитирующих клеток и сопровождается усилением экспрессии молекул HLA I класса на поверхностной мембране клеток крови: Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов и нейтрофилов.

Особенности показателей иммунного статуса после острой алкогольной интоксикации у здоровых добровольцев и больных алкоголизмом

В этом разделе работы представлены результаты исследований иммунного статуса (показателей клеточного и гуморального иммунитета) здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и лиц, страдающих алкогольной зависимостью, после употребления ими крепкого алкоголя.

Особенности клеточного иммунитета

Особенности гемограммы

Анализ и сравнение параметров гемограммы показали, что как у здоровых добровольцев, употребивших 0,2 л и более крепкого алкоголя, так и у больных алкогольной зависимостью групп 1 и 2 (употребили 0,3-0,6 л крепких алкогольных напитков) наблюдаются изменения этих параметров в сравнении с параметрами нормы (табл. 9). Напротив, у здоровых добровольцев подгруппы 1, однократно употребивших 50 мл водки или 150 мл вина, и у больных в ремиссии (группа 3) показатели гемограммы соответствуют показателям нормы. Изменения параметров гемограммы после острой алкогольной интоксикации у здоровых добровольцев подгрупп 2 и 3, а также у больных алкоголизмом группы 1 выражаются увеличением количества эритроцитов, их объёма, гематокрита, повышением СОЭ и снижением количества лимфоцитов и тромбоцитов. Из табл. 9 также видно, что у больных алкогольной зависимостью в группе 2 после алкогольной интоксикации в крови проявляются более выраженные изменения показателей гемограммы и наблюдается статистически значимое снижение количества эритроцитов в периферической крови и повышение количества сегментоядерных лейкоцитов и СОЭ в сравнении с нормой.

Таблица 9.

Гематологические показатели у больных алкогольной зависимостью и здоровых добровольцев после острой алкогольной интоксикации в сравнении со здоровыми лицами без синдрома зависимости от алкоголя (М±о)

Показатели Ед. измерения Норма группа 4 (п=90) Здоровые добровольцы после употребления алкоголя, группа 5 (п-90) Больные алкогольной зависимостью (п=220)

подгруппа 1 (50 мл водки или 150 мл вина) п=27 подгруппа 2 (0,2-0,3 л водки) п=35 подгруппа 3 (0,6-1 л крепкого алкоголя) п=28 группа 1 I стадия п=79 группа 2 II стадия п=72 группа 3 ремиссия п-69

Эритроциты млн/мл 4,0±0,2 4,0 7±0,16 4,99±0,48 Г 5,38±0,22» 5,2±0,2* 2,8±0,4* 4,01±0,16

Гемоглобин г/% 13,6±0,5 13,36±0,63 14,03 ±0,53 14,0±0,46 13,1 ±0,6 10,6±1,04| 13,60±0,46

Гематокрит % 35,9±1,87 35,48±1,81 43,06 ±2,07| 43,64±1,95| 44,7±2,2* 21,9±1,4* 35,71±2,08

Ср. объем эритроцитов мкм 80,3±2,86 79,89±3,03 85,06±4,09| 89,21± 1,84| 89,4±1,6| 115,7±7,1Т 80,76±3,17

Тромбоциты кл/мкл 238,1±36,8 236,89±35,88 209,29±12,191 П7,1±5,27* 187,9±12,5І 132,7±10,0» 238,80±39,02

Лейкоциты кл/мкл 5600±254 5592,1±249,36 6325,8±338,5І 7700.ЙШ0* 7516,7±276,6* 10020,3±990,9* 5598,1±259,9

Нсйтр. мислоциты % 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0

метамиелоцигы % 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0

палочко ядерные % 1,0±0,4 l,037ifl,44 1,2±0,47 1,36±0,49 1,7±0,7 2,2±0,77 1,06±0,38

сегментшдсрные % 57,0±3,2 56,89±2,83 57,4±1,34 57,86±1,88 57,2±3,0 76,8±3,5* 57,3±2,9

Эозинофилы % 1,3±0,6 1,19±0,55 1,14±0,42 1,21±0,41 1,5±0,6 1,5±0,6 1,16±0,47

Базофилы % 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0 0,0±0

Лимфоциты % кл/мкл 34,3±1,76 33,93±2,02 28,31±2,78| 21,96±2,58* 21,5±3,4* 17,2±2,44 ** 34,52±1,72

Моноциты % 5,5±1,0 5,74±0,84 6,74±0,95| 7,11±0,77| 6,3±1,0 4,1 ±0,95 і 5,6±0,8

соэ мм/час 4,8±1,2 4,56±1,13 7,94±1,59Г 11,0±0,8* 11,6±1,8** 16,0±1,6" 4,93±1,1

Примечание к табл. 9: здесь и далее представлены статистически значимые отличия (* -р<0,05; ** -р<0,001; ***-р<0,0001) показателей здоровых добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации от показателей нормы; | - тенденция к увеличению и | - тенденция к снижению показателя; 1-критерий Стьюдента

to

Таким образом, употребление крепкого алкоголя как здоровыми добровольцами (0,2 л и более в 'течение 1-3 дней), так и больными на начальной стадии алкогольной зависимости (0,3-0,45 л в течение 2-3 дней), приводит к нарушениям гемограммы. Эти изменения напоминают картину, характерную для развивающегося воспаления. Увеличение количества эритроцитов, их объема, показателей гематокрита, лейкоцитоз, повышение СОЭ и снижение количества лимфоцитов и тромбоцитов являются важным критерием оценки развития воспаления. У больных же алкоголизмом при более тяжёлой стадии зависимости (II стадия) изменения в показателях гемограммы соответствуют картине острого воспаления [Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2002]. В то же время, у добровольцев после однократного употребления 50 мл водки или 150 мл вина (за 17-19 час до забора крови) и у больных в ремиссии все показатели гемограммы соответствуют норме.

Особенности пролиферативной активности Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток

Алкогольная интоксикация как у здоровых добровольцев подгрупп 2 и 3 (употребили 0,2 и более крепкого алкоголя за 17-19 час до забора крови), так и у больных алкогольной зависимостью групп 1 и 2 приводит к нарушениям пролиферативной активности Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и активности NK-клеток в сравнении с нормой (табл. 10). Как у тех, так и у других в образцах периферической крови отмечается статистически значимое увеличение спонтанного пролиферативного ответа лимфоцитов (не индуцированного митогенными лектинами). В то же время, у добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом группы 1 наблюдается статистически значимое снижение индекса стимуляции (ИС) Т-лимфоцитов при активации митогенным лектином РИА и В-клеток - при активации LPS. Снижается цитолитическая активность NK-клеток (индекс цитотоксичности - ИЦ) и наблюдается увеличение ИС пролиферативного ответа при активации Con А (табл. 10). Последнее, подтверждает результаты исследований, полученных в экспериментах на культурах лимфоцитов здоровых лиц in vitro, и говорит о тропности этанола к СВ8+-лимфоцитам, так как митогенный лектин Con А инициирует пролиферацию in vitro 75% этих клеток [Дейл М.М., Формен Д.К., 1998; Stobo J.D., 1972].

В образцах периферической крови больных алкогольной зависимостью группы 2 отмечается статистически значимое снижение ИС Т- и В-лимфоцитов в ответ на активацию всеми митогенными лектинами и значимо увеличивается цитолитическая активность NK-клеток в сравнении с показателями нормы. Напротив, у больных в ремиссии (группа 3) и здоровых добровольцев подгруппы 1 показатели пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток соответствуют показателям нормы (табл. 10).

Таблица 10.

Индексы стимуляции пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов и цитолитической активности ЫК-клеток у здоровых добровольцев и больных алкогольной зависимостью после острой алкогольной интоксикации в сравнении

Показатели группа 4 норма 11=90 Здоровые добровольцы после употребления алкоголя, группа 5 (п=90) Больные с алкогольной зависимостью (п=220)

подгруппа 1 (50 мл водки или 150 мл вина) п=27 подгруппа 2 (0,2-0,3 л ВОДКИ) п=35 подгруппа 3 (0,6-1 л крепкого алкоголя) п=28 группа 1 I стадия п=79 группа 2 II стадия п-72 группа 3 Ремиссия п=69

СП - спонтанная пролиферация Ти В-лимфоцитов 479,3±66 476,9±68,0 817,8±59,76' 958,6±118,7* 908,4±Ю8,0* 1475,8±550,9" 477,8±58,5

ИС - индекс стимуляции РНА (10 мкг/мл) 150,6±20 151,37±9,9 69,7±7,33* 51,96±5,35 *• 53,ШЗ" 12,7±4,0»" 149,4±16,7

ИС - индекс стимуляции Con А (10 мкг/мл) 69,7±10 70,01±8,83 91,11±6,81Т 91,36±9,35Т 88,0±8,2Т n^.s»»» 68,9±10,4

ИС - индекс стимуляции PWM (10 мкг/мл) 51,4±7,5 92,85±8,67t 70,1±5,62Т 71,05±6,75Т 65,4±4,9Т 23,9±5,6*» 50,6±7,0

ИС - индекс стимуляции LPS (1 мкг/мл) 7,7±1,2 7,Ó5±0,91 3,91±0,8* 2,93±0,47" 3,6±0,5• 3,2±0,4«» 7,67±1,0

ИЦ(%) NK-клеток 53,5±3,б 53,1±ЗД5 40,14±2,46* 37,82±2,42* 38,5±2Д» 70,1±5,5* 50,0±5,9

*-р<0,05; **-р<0,001; ***-р<0,0001 - статистически значимые отличия показателей добровольцев и больных алкоголизмом от нормы; { - тенденция к увеличению показателя; ^критерий Стьюдента

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях иммунореактивности организма после острой алкогольной интоксикации, как у здоровых добровольцев, так и у больных алкоголизмом, что выражается в снижении пролиферативной активности Т-хелперов, В-лимфоцитов и NK-клеток. Отмеченные нами изменения функциональной активности этих иммунокомпетентных клеток in vitro коррелируют с нарушением их функций in vivo, что является предпосылкой снижения устойчивости организма к инфекциям и повышения риска развития онкологических заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Особенности фенотипа клеток крови

Острая алкогольная интоксикация как у здоровых добровольцев (после употребления крепкого алкоголя в количестве 0,2 л и более), так и у больных алкогольной зависимостью групп 1 и 2 приводит к изменению популяционного и субпопуляционного состава периферической крови. Как у тех, так и у других в

образцах периферической крови снижается процент СИЗ "4 Т-хе/перов относительно нормы (рис. 4а).

После острой алкогольной интоксикации на фоне снижения содержания Т-хелперов в образцах периферической крови, как у здоровых добровольцев, так и у больных алкоголизмом не было выявлено значимых изменений в содержании Т-клеток с фенотипом СЭЗТ (рис. 4а.). В то же время, у них наблюдалось значимое снижение отношения С04'/С08'-клеток (рис.4б.), главным образом, за счет снижения количества клеток с фенотипом С1>4'. У добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных групп I и 2 после алкогольной интоксикации обнаружено дополнительно статистически значимое увеличение в образцах периферической крови процента СО 19*- В-лимфоцитов (рис. 4а.). Для сравнения следует отмстить, что у здоровых добровольцев подгруппы I и у больных алкоголизмом в ремиссии все показатели соответствуют показателям нормы (рис. 4а. б).

•(ТІ»-»-• (t>l*>

< «М- IV- I ЛИМФОЦИТОВ

4а

4«

Рис 4 «V Процент СКЧ\ СОЗ'в' Тлимфоцитов н СР19' В-»елеток, 6) отношение С04'С»8' у ложных добровольцев и больны« ал КО! ольхой зависимостью после острой алкогольной интоксикации. • - 1*0,05. "* - р<0,001 - статистически значимые отличи« от нормы. I - тенлемикя к снижению посазателя. 1*крмтсрий Стъюлапа Примечание 1ЛСС1 и на рис 5-10 обомачення по оси абсцисс Н - норма. 1п - подгруппа I добровольцев (однократно употребили $0 мл водки или 150 мл вин»), 2 п пмруппа 2 добровольцев (в течение дня употребили 0,2-0.3 я крепкого алкоголя). 3 п. подгруппа 3 добровольцев (в течение 2-3 дней употребили 0.6-1 я крепкого алкоголя). I с - больные алкогольной зависимостью I стадии II с больные алкогольной зависимостью II стадии. Р - больные алкоголизмом в ремиссии

Таким образом, у здоровых добровольцев и у больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации выявлен существенный дисбаланс иммунорегуляторных клеток с преобладанием CD8' Т-клеток. что свидетельствует об избирательном действии алкогольной интоксикации на эту субпопуляиию Т-лимфошпов. Снижение же содержания CD4'-T-xe.inepoB в периферической крови, безусловно, является причиной возникновения траизиторного нммунодефицитного состояния у лий, злоупотребліюіиих алкоголем.

У здоровых добровольцев после употребления крепкого алкоголя в количестве 0,2 л и более (подгруппы 2 и 3) и у больных на начальной (I) стадии алкогольной зависимости (группа 1) в крови снижается процент NK-клеток с

фенотипом CD3'16*56" (натуральные киллеры) и процент NKT-клсток киллеров с фенотипом CD3*16*/56* (рис. 5). У больных алкоголизмом группы 2 также статистически значимо снижается процент NKT-клеток киллеров и значимо увеличивается процент NK-клеток в периферической крови (рис. 5). У больных же в ремиссии и у добровольцев подгруппы 1 (однократное употребление алкоголя в количестве 50 мл водки или 150 мл вина) процент NK-клеток и NKT-клеток в крови соответствует показателям нормы (рис. 5).

H I • 2 а. Н If. Ilr. р

Рис. 5. Процент CD3 1656' NK- и CD3' I6V56' NKT-клсток киллеров в периферической крови иоровых лоброволыкв и больных алкогольной зависимостью после острой алкогольной мнюксикацни. * -р<0,05; •• - р<0.001; - р<0,0001 - статистически значимые отличии от нормы, t тенлеиии» к увеличению показателя; i-крнтернй Стьюлскта. Обозначения см. рж 4

Таким образом, после острой алкогольной интоксикации у здоровых лиц и у больных на начальной стадии алкогольной зависимости обнаружено снижение в периферической крови содержания CD3T6*56' NK-клеток и CD3"16'/56* NKT-клеток киллеров. Это обуславливает снижение противоопухолевого иммунитета, а также может явиться одной из причин снижения резистентности к инфекциям.

Острая алкогольная интоксикация влияет на активационный состав Т-лимфоинтов периферической крови, который напрямую связан с появлением на клетках HLA-DR молекул и рецептора к IL 2 (антигенный маркер CD25), а также других молекул активации [Алексеев Л.П.. Хаитов P.M.. 2001]. Установлено, что в периферической крови здоровых добровольцев после употребления крепкого алкоголя в количестве 0.2 л и более и больных алкоголизмом, после употребления ими крепкого алкоголя в количестве 0,3-0.6 л, статистически значимо увеличивается процент Т-клсток с фенотипом CD8*DR\ несущих на своей поверхности HLA-DR молекулы (рис. 6). Однако у добровольцев подгруппы I и у больных в ремиссии содержание Т-клеток с фенотипом CDS'DR" соответствует показателям нормы.

Н II la. It It Ос f

Рис 6. Процент CDfl'DR', CD4 DR' T-лимфоцитов и CD3CD56DR" NK-клеток в периферической кропи иороаых добровольце» и больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации: * -р<0,05; •• - р<0.001; - рО.ОООІ - статистически значимые отличи* от нормы; | тенденция к увеличению и J - тенденция к снижению показателя; (-критерий Стьюдента Обозначения см. рис. 4

В периферической крови здоровых добровольцев подгрупп 2 и 3 и больных алкогольной зависимостью группы і после острой алкогольной интоксикации наблюдается снижение процента активированных Т-хелперов с фенотипом CD4DR' и активированных NK-клеток с фенотипом CD3'CD56*DR' (рис. 6). В крови больных алкоголизмом группы 2, напротив, увеличивается процент не только CD8*DR*-, но и CD4DR*- и CD3"CD56*DR'-miCTOK. В то же время, как у добровольцев подгруппы 1, так и у больных в ремиссии процент CD8~DR*-, CD4 DR - и CD3'CD56'DR'-mieTOK в периферической крови соответствует норме (рис. 6).

Следовательно, нами установлено, что острая алкогольная интоксикация влечСт за собой активацию CD8" Т-лимфоцитов, что может привести к активации эффекгорного (киллерного) механизма иммунной системы. Последнее является, в свою очередь, определяющим моментом в развитии патологии органов и систем. Эти данные подтверждают результаты исследований, полученные в экспериментах на модели острой алкогольной интоксикации, воспроизведенной на культурах лимфоцитов крови здоровых лиц in vitro. Изменения же в активациониом составе С04-хслперов и NK-клеток отражают стадию алкогольной зависимости или. что более точно, длительность хронической алкогольной интоксикации.

Обнаружено также, что в периферической крови добровольцев подгруппы 3 и больных алкогольной зависимостью групп I и 2 после употребления крепкого алкоголя наблюдается нарастание процента Т-лнмфоцитов с фенотипом CD8'28\ экспрессируюших ко-стимуляционную молекулу CD28, которая также является молекулой активации (рис. 7). В то же время, у этих больных снижается процент клеток CD8*28\ не экспрессируюших эту молекулу, по сравнению с нормой (рис. 7). У добровольцев подфуппы 1 и больных в ремиссии содержание в крови CD8 28'-и CD8'28 -клеток соответствует норме (рис. 7).

Г •

!

Рис. 7. Процент CD8'28'. СГО'28' Т-лимфоцитов в периферической крови норовы* добровольцев и больных алкогольной иаисимостъю после острой алкогольной интоксикации: * - р<0.05 статистически значимые отличив or нормы: J тенденция к увеличению и | - тенденция к снижению показателя: t-критсрий Стыолпла. Обозначения см. рис. 4

Таким образом, можно заключить, что острая алкогольная интоксикация приводит к серьезным изменениям популяционного и субпопуляционного состава клеток периферической крови: как у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя (употребивших 0,2 л и более крепкого алкоголя в течение 1-3 дней), так и у больных на начальной стадии алкогольной зависимости наблюдается активация CD8* - Т-лимфоиитов. Об этом свидетельствует увеличение в крови процента активированных Т-лимфоцитов с фенотипами CD8*25\ CD8DR" и CD828". Из активированных С D8'-лимфоцитов впоследствии образуются эффекторные цитолитическис Т-клетки киллеры (CD8*57* - ЦТЛ). Поскольку острая алкогольная интоксикация приводит к активации CD8' Т-клеток. то в условиях повторяющейся алкогольной интоксикации из этих лимфоцитов могуг образоваться цитолитические Т-лимфоциты (ЦТЛ). Известно, что эти клетки распознают видоизмененные клетки организма человека, несущие молекулы HLA I класса [Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 2001]. В нашем случае клетки организма могут быть изменены под влиянием ацетальдегида или иммунных комплексов. В результате такого распознавания может произойти цитолиз гепатоцитов печени или любых других видоизмененных клеток организма.

В то же время, продолжительная ремиссия у больных алкоголизмом способствует полному восстановлению популяционного и субпопуляционного состава клеток иммунной системы

Особенности функциональной активноеш фагоцитов

Сравнение показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток здоровых добровольцев и больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации с показателями контрольной группы здоровых лиц выявило значительные различия в функциональных возможностях этих клеток. У добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом групп I и 2 статистически значимо увеличивается спонтанная кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток в сравнении с нормой (рис. 8а). У больных же в фазе

ремиссии и у добровольцев полгруппы 1 (употребили однократно 50 мл водки или 150 мл вина за 17-19 час до забора крови) спонтанная кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток соответствует норме (рис. 8а). В то же время, при активации клеток крови зимозаном или ФМА индексы стимуляции (ИС) кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток значимо снижаются после употребления крепкого алкоголя как у здоровых добровольцев подгруппы 3. так и у больных алкоголизмом групп 1 и 2. Аналогичная картина наблюдается и у добровольцев подгруппы 2, однако снижение ИС кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток в этом случае не было статистически значимым (рис. 86). У больных же в ремиссии и у добровольцев подгруппы I индуцированная зимозаном или ФМА кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток соответствует показателям нормы (рис. 86).

■ ІІ || II

и и 1» »» и «< г

Ь

Рисунок 8. а) спонтанна« кислоролааиспмия \емилк>чниесценция; 6) индексы стимуляции кислоролтависимой хечилюминссиениин. индуцированной ЗИМ и ФМА. фагоцитов периферической крови норовых добровольцев и больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации; • - р<0.05; ** - р<0,001; ••• - р<0,0001 - статистически значимые отлична от нормы; | - тенденция к снижению показателя; 1-критернй Стыолента. Обозначения см. рис. 4

Несмотря на увеличение после употребления крепкого алкоголя общего количества лейкоцитов в периферической крови добровольцев подгруппы 3 (употребили в течение 2-3 дней 0,6-1 л крепкого алкоголя) и больных алкоголизмом на I и II стадиях (табл. 9), у них наблюдается статистически значимое снижение способности фагоцитирующих клеток поглощать Candida albicans в сравнении с нормой. У добровольцев подгруппы 2 также наблюдается снижение способности фагоцитирующих клеток поглощать Candida albicans, но оно не было значимым (рис. 9). У добровольцев же подгруппы 1 и у больных в ремиссии поглотительная активность фагоцитирующих клеток не изменяется, а соответствует показателям нормы (рис. 9).

I

I I

I

I

Рис 9. Поглотительная способность фагоцитов (ФИ - фаюцитарный индекс) у моровых добровольцев и у больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации; * - р<0.0$; ••• - р<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; 1 - тенденция к снижению показателя. 1-крнтерий Стъюдеита. Обозначения см. рис 4

Таким образом, исследование функциональной активности фагоцитов показало, что острая алкогольная интоксикация приводит к усилению спонтанной кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток. Это может привести, в свою очередь, к кислородному взрыву и явиться одной из причин поражения органов и тканей организма у лиц, злоупотребляющих алкоголем, в результате образования свободных радикалов. Обнаруженные нарушения функциональной активности фагоцитов могут явиться также одной из причин снижения резистентности организма к инфекциям и повышения риска развития болезней иммунных комплексов.

На основании представленных в этом разделе результатов исследования можно сделать заключение, что острая алкогольная интоксикация у здоровых лиц, а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, приводит к серьешым нарушениям функции клеточного звена иммунной системы. Они проявляются изменениями параметров гемограммы, снижением пролиферативной активности Т- и В-лнмфоцитов и цитолитической активности 1МК-клеток, нарушениями популяционного и субпопуляцнонного состава клеток крови, увеличением кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток и снижением их поглотительной способности. Обнаруженные нарушения клеточного звена иммунной системы у лиц, злоупотребляющих алкоголем, могут привести к возникновению транзиторного нммунодефицитного состояния, неблагоприятными последствиями которого являются снижение резистентности к инфекциям и риск развития онкологических заболеваний. Важно отметить, что воздержание от приема крепкого алкоголя приводит к восстановлению функциональных возможностей всех исследованных клеток иммунной системы.

»

1 м

Л I*

Особенности гуморальною иммунитета Особенности иммуноглобулинового профиля

После острой алкогольной интоксикации у здоровых добровольцев (употребили 0,2 л и более крепкого алкоголя), а также на фоне хронической интоксикации у больных с алкогольной зависимостью в периферической крови наблюдается статистически значимое увеличение содержания в сравнении с нормой (рис. 10).

1*00

Н 1а. 1« За. 1с. Пс. Р

Рис. 10. Содержание 1уМ. ||С и общего в сыворотке кров« иороаых лоброаольцеа и бальных алкоголизмом после острой алкогольной инпиесиющии; • - р<0.05; •• - р<0,001: ••• - р- 0.0001 статистически значимые отличи* от нормы: 1 тендеииш к снижению показател»; (-критерий Стыолежта Обозначения см. рис. 4

Обнаружено, что увеличение содержания в крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью 1цА сопровождается снижением ^М и ДО. Снижение содержания в крови и ДО является, вероятно, следствием острой интоксикации этанолом. При этом, этанол (аиетатьдегид) или его комплексы с белками крови, прежде всего с альбумином, могут быть нейтрализованы в результате связывания со специфическими иммуноглобулинами классов Миб [Гамалея Н.Б. и др., 1997).

Острая алкогольная интоксикация у добровольцев подгрупп 2 и 3, а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом в группах 1 и 2, приводит к увеличению в крови содержания общего ДО по сравнению с контролем (рис. 10). При этом, как показало клиническое обследование, в анамнезе больных и здоровых добровольцев отсутствовали симптомы аллергии н бронхиальной астмы. У добровольцев же подгруппы 1 и у больных алкоголизмом в фазе ремиссии содержание 1&А, ^М, ДО и общего соответствует норме.

Таким образом, острая алкогольная интоксикация у здоровых лиц. а также у больных алкоголизмом, приводит к нарушениям иммуноглобулинового профиля, что может явигься одной из причин повышения риска развития инфекционных и аллергических заболеваний у лиц. злоупотребляющих алкоголем.

Особенности показателей активности комплемента, компонентов комплемента, C RP, ASO, Rh и ЦИК

Определение гемолитической активности комш1емента после острой алкогольной интоксикации показало, что у всех добровольцев подгруппы 3 (в течение 2-3 дней употребили 0,6-1 л крепкого алкоголя) и у обследованных больных алкоголизмом группы 1 наблюдается статистически значимое увеличение гемолитической активности комплемента в сравнении с нормой. В подгруппе 2 добровольцев также отмечалось увеличение гемолитической активности комплемента, но оно не было значимым. Напротив, у больных алкоголизмом группы 2 наблюдается статистически значимое снижение этого показателя. У добровольцев же подгруппы I и у больных в ремиссии гемолитическая активность комплемента соответствует показателям нормы (рис. На).

Обнаружено, что у добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом групп I и 2 в сыворотке крови статистически значимо снижается содержание С4 компонента комплемента (рис. 116). Изменений в содержании CI и СЗ компонентов комплемента в сыворотке крови добровольцев подгрупп 2 и 3 и у пациентов группы I не было выявлено (рис. 116.). В то же время, у больных группы 2 в крови наблюдается тенденция к увеличению содержания С1 и к снижению СЗ компонентов комплемента (рис. 116). У добровольцев же подгруппы I (после однократного приема алкоголя в количестве 50 мл водки или 150 мл вина) и у больных в ремиссии содержание в крови С1, СЗ и С4 компонентов комплемента соответствовало показателям нормы.

на мб.

Рис II. а) гемолитическая активності, комплемента - СН50. б) содержание СІ, СЗ и С4 компонентов комплемента в сыворотке крови здоровых добровольцев н больных алкоголизмом после осірой алкогольной интоксикации, * - р<0.05; " - р<0.001; *•• - р<0.0001 статистически значимые отличия от нормы. | тенденция к увеличению и і тенденция к снижению показателя: меритерий Сгьюдеігтя. Обозначения см. рис 4

Таким образом, мы установили, что острая алкогольная интоксикация у здоровых, а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, приводит к изменению пути активации комплемента (с классического на альтернативный путь), о ч£м свидетельствует снижение в крови уровня С4

компонента комплемента, что может быть также одной из причин снижения резистентности к различным инфекциям лиц, злоупотребляющих алкоголем.

После употребления алкоголя в сыворотке крови здоровых добровольцев, а также больных на начальной стадии алкоголизма не было выявлено изменений в содержании CRP, ASO и RF (рис. 12а.). Эти показатели соответствовали нормальным значениям, тогда как в сыворотке крови больных на II стадии зависимости после острой алкогольной интоксикации наблюдается статистически значимое увеличение титров С-рсактивного белка, что свидетельствует о наличии воспалительного процесса в печени, так как именно макрофага печени являются основными продуцентами этого белка. Содержание ASO и RF в сыворотке крови больных группы 2 соответствуют показателям нормы (рис. 12а). У больных в фазе

ремиссии все показатели били * пределах нормы

Острая алкогольная интоксикация у здоровых добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом в группах 1 и 2 приводит к повышению уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сравнении с нормой (рис. 126.). В то же время, у добровольцев подгруппы I (употребили однократно 50 мл водки или 150 мл вина за 17-19 час до забора крови) и у больных алкоголизмом в ремиссии содержание ЦИК в сыворотке крови соответствует показателям нормы.

_ —

к

с

! • иг Км«

:_____ N la a» 1а 1«- L- 0« г

12а.

Рис. 12. а) содержание С-реаетивного белка (CRP). актистрсптолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF). б) содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови здоровых добровольцев и больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации: • - р<0.05; •• - р<0,001: ••• р<0.0001 - статистически значимые отличи» от нормы: Г - тенденция к увеличению показателе i-критернй Стьюдента. Обозначения см. рис.4.

Следовательно, острая алкогольная интоксикация у здоровых, а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом приводит к повышению в крови уровня циркулирующих иммунных комплексов. Это связано, прежде всего, с нарушением поглотительной способности фагоцитирующих клеток и может явиться одной из причин отложения иммунных комплексов в почках, печени и тканях организма человека с последующим нарушением их функции. В свою очередь, отложение иммунных комплексов способствует последующему цитолиз)' видоизменившихся клеток этих органов и тканей NK-клетками И цитологическими CD8' Т-лимфоцитами.

Особенности uiitoktiiioboi о профиля

При развитии иммунного ответа разные клетки иммунной системы взаимодействуют друг с другом через мембранные молекулы или при помощи медиаторов - цитокинов (интерлейкннов, IL) и хемокннов (Кадагидзе З.Г..1996; Хаитов P.M. и др., 2010; Ярилин А.А., 2000]. В этой связи, как у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя, так и у больных алкогольной зависимостью мы сочли целесообразным исследовать в сыворотке крови содержание цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y. Выбор данного цнтокинового профиля был связан с тем, что. по результатам предварительного исследования как у добровольцев, так и у больных алкоголизмом после употребления крепкого алкоголя содержание IL-10 в периферической крови соответствовало показателям нормы.

Установлено, что острая алкогольная интоксикация у здоровых лиц. а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, приводит к нарушениям цнтокинового профиля. У добровольцев подгруппы 3 и у больных алкоголизмом группы 1 в крови статистически значимо снижается содержание IL-2 и IFN-y. в подгруппе 2 отмечается тенденция к снижению этих цитокинов. Во всех упомянутых группах значимо увеличивается содержание IL-4. который является ростовым фактором для В-лимфоцитов (рис. 13). В сыворотке крови больных алкоголизмом группы 2, напротив, статистически значимо увеличивается содержание IFN-y н IL-2. Содержание IL-4 ешй больше повышается. В то же время, у больных в ремиссии и у добровольцев подгруппы I уровень этих цитокинов соответствует норме.

»

I

3 и

•1ШШ

II |> 2 В- Зи 1«. Не Г

Рис.13. Содержание 11.-2, 11.-4, 1ГЫ-у и сыворотке крови здоровых добровольцев и больных алкоголизмом после острой алкогольной интоксикации; • - р<0.05; *•* - р<0,000| -статистически значимые отличия от нормы; I тенденция к снижению показателя; (•критерий Стьюдента Обозначения см. рнс.4

Следовательно, острая алкогольная интоксикация у здоровых лиц. а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом стадии I, приводит к снижению в сыворотке крови содержания 11,-2 н 1Р[М-у. Известно, что продуцентами этих цитокинов являются ТЫ-лимфоциты хелперы и КК-клетки. В

■ ILIqni • lUaiu «IKS/и 41

упомянутых группах обследованных лиц увеличивается содержание IL-4, который продуцируется ТЬ2-лимфоцитами хелперами. Это дает основание для заключения, что у здоровых добровольцев и у больных алкоголизмом на начальной стадии после острой алкогольной интоксикации иммунный ответ реализуется по 2 типу (гуморальному), для которого характерно увеличение продукции IL-4. В то же время, при II стадии зависимости в сыворотке крови значимо увеличивается содержание не только IL-4, но также IL-2 и IFN-y, что свидетельствует о подключении к гуморальному иммунному ответу по типу 2 также и клеточных, эффекторных, механизмов иммунного ответа типа 1. Иммунный ответ в этой группе больных реализуется по смешанному типу (2+1).

Таким образом, в данном разделе работы показано, что острая алкогольная интоксикация приводит к нарушениям и гуморального иммунитета, включая цитокиновый профиль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные in vitro исследования по влиянию этанола на клетки иммунной системы, а также исследования клеточного и гуморального иммунитета у здоровых добровольцев (употребляли различное количество крепкого алкоголя) и у больных алкоголизмом I и II стадии (до назначения медикаментозного лечения) после острой алкогольной интоксикации дают возможность объяснить неясные ранее механизмы возникновения иммунодефицитного состояния, системной и органной патологии и риска развития онкологических и инфекционных заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Полученные результаты Говорят о том, что алкоголь и его метаболиты выступают в роли важных патогенных факторов, влияющих на клеточные и гуморальные составляющие иммунной системы. Это позволяет нам сформулировать концепцию о деструктивной роли нарушений функции иммунной системы в патогенезе органной и системной патологии при алкогольной интоксикации.

Очевидно, что острая алкогольная интоксикация у здоровых лиц, а также на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом является причиной значимых нарушений функции клеточного звена иммунной системы: лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, а также причиной нарушений популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов. В результате острой алкогольной интоксикации в периферической крови значимо снижается содержание С04+-лимфоцитов-хелперов, отношение С04+/С08+-лимфоцитов при незначимом увеличении CD8+ Т-лимфоцитов, что приводит к разбалансировке иммунной системы и является одной из причин возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния у лиц, злоупотребляющих крепкими алкогольными напитками. Острая алкогольная интоксикация влияет на состав активированных Т-лимфоцитов, а именно: приводит к увеличению в периферической крови процента активированных CD8+ Т-лимфоцитов и к снижению процента активированных CD4+ Т-лимфоцитов. Результатом этого

являетсядисбаланс иммунорегуляторных клеток с превалированием СБ8+-клеток над С04+-клетками, что свидетельствует о тропности этанола к популяции CD8+ Т-лимфоцитов.

Обнаруженные факты усиления экспрессии молекул HLA I класса на клетках иммунной системы говорят о способности этанола влиять на контактные взаимодействия всех клеток организма человека с CD8+ иммунокомпетентными клетками. Следствием обнаруженного нами усиления экспрессии молекул активации (CD25, HLA-DR, CD38) на этих клетках может стать ускоренное образование из+ них эффекторных цитотоксических Т-клеток киллеров с фенотипом CD8 57+ (ЦТЛ), распознающих видоизмененные, в частности, под действием ацетальдегида или иммунных комплексов, клетки организма человека, несущие на своей поверхности молекулы HLA I класса. Этот процесс, в свою очередь, может явиться одной из причин цитолиза видоизмененных гепатоцитов и других клеток организма. Острая алкогольная интоксикация оказывает влияние на функциональную активность фагоцитарного звена иммунной системы, что выражается усилением кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток и снижением их способности к поглощению патогенных микроорганизмов. Усиление кислородзависимой активности фагоцитов может обусловить разрушительное действие генерируемых фагоцитами свободных радикалов на различные клетки и ткани, а снижение поглотительной способности этих клеток может привести к ослаблению иммунологической реактивности организма и явиться одной из причин частых инфекций и болезней иммунных комплексов.

Кроме того, острая алкогольная интоксикация приводит также и к существенным нарушениям гуморального иммунитета, состояние которого определяется активностью иммунокомпетентных клеток. После острой алкогольной интоксикации в периферической крови как здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкоголизмом до назначения медикаментозного лечения увеличивается содержание IgA и IgE и снижается уровень IgM и IgG. Снижение содержания IgM и IgG может явиться причиной возникновения различных инфекционных заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем, а увеличение содержания IgE повышает риск развития аллергических заболеваний и бронхиальной астмы. Острая алкогольная интоксикация приводит к увеличению гемолитической активности комплемента, что также может способствовать лизису клеток организма и возникновению органной патологии. Кроме того, выявлено, что алкогольная интоксикация влияет на цитокиновый профиль, что выражается изменениями содержания IL-2, IL-4 и IFN-y в периферической крови и ведёт к изменению типа иммунного ответа.

Подводя итоги полученных результатов иммунологического исследования, мы констатируем, что злоупотребление алкоголем может привести к дефициту составляющих врожденного иммунитета (системы комплемента, антител, фагоцитарного звена и NK-клеток), на взаимодействии которых основана защита от бактериальных инфекций. С другой стороны, Т-клеточная недостаточность, которая является составляющей адаптивного (приобретенного) иммунитета]

повышает чувствительность к заражению вирусами, грибами, паразитами и бактериями, обитающими внутриклеточно, поскольку защиту от этих возбудителей обеспечивает клеточный иммунитет.

На основании полученных нами данных и литературных сведений можно выделить общие закономерности в изменении иммунного статуса у лиц после острой алкогольной интоксикации:

1. Нарушения в гематологических показателях.

2. Нарушения пролиферативной активности Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, цитолитической активности NK-клеток и фагоцитарного звена иммунной системы.

3. Нарушения популяционного состава лимфоцитов.

4. Нарушения в составе активированных Т-лимфоцитов.

5. Нарушения в содержании иммуноглобулинов классов А, М, G и общего IgE в периферической крови.

6. Нарушения гемолитической активности комплемента и содержания в крови компонентов комплемента.

7. Нарушения в цитокиновом профиле.

Важно, однако, подчеркнуть, что прекращение употребления алкоголя больными алкоголизмом (фаза ремиссии) способствует полному восстановлению клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу иммуномодулирующих препаратов в случае продолжающегося употребления алкоголя.

Таким образом, в настоящей работе вскрыты патогенетические механизмы повреждающего действия острой алкогольной интоксикации на клеточные и гуморальные звенья иммунитета и обоснована деструктивная роль нарушенной иммунной системы в развитии органной и системной патологии.

Выводы

1. Острая алкогольная интоксикация в культурах клеток крови in vitro оказывает угнетающее влияние на CD4+ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8+ Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих клеток, индуцированную митогенным лектином Con А, и экспрессию на них активационных молекул - CD25, HLA-DR и CD38, что способствует их переходу в цитолитические Т-клетки киллеры.

2. Острая алкогольная интоксикация (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, характеризуется нарушениями гемограммы, пролиферативной активности CD4+- и С08+-лимфоцитов, В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток. Снижение содержания CD4+

Т-лимфоцитов и их пролиферативной активности является предпосылкой возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния.

3. Выявленные изменения активационного состава лимфоцитов при острой алкогольной интоксикации (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, а именно: повышение содержания CD8+DR+ и CD8+25+ Т-лимфоцитов в периферической крови, приводит к активации эффекторного звена иммунной системы (цитолитических Т-клеток киллеров), результатом действия которого может явиться возникновение алкогольного поражения органов и тканей организма. Обнаруженные изменения CD4 DR Т-лимфоцитов и NKDR+-iuieTOK отражают длительность хронической алкогольной интоксикации.

4. Острая алкогольная интоксикация (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, существенно усиливает кислородзависимую активность фагоцитов и снижает их способность к поглощению патогенных микроорганизмов. Усиление кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток может обусловить разрушительное действие фагоцитов на различные клетки и ткани, а снижение их поглотительной способности - привести к нарушению иммунологической реактивности организма и явиться одной из причин частых инфекций и болезней иммунных комплексов.

5. Острая алкогольная интоксикация приводит к увеличению содержания иммуноглобулинов классов А и Е и к снижению уровня иммуноглобулинов классов М и G в периферической крови как у здоровых добровольцев после употребления крепкого алкоголя в количестве 0,2 л и более, так и у больных алкоголизмом I и II стадии. Увеличение содержания IgE повышает риск развития аллергических заболеваний и бронхиальной астмы, а снижение уровней IgM и IgG может явиться причиной возникновения различных инфекций у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

6. Острая алкогольная интоксикация приводит к изменению гемолитической активности комплемента и содержания компонентов комплемента в периферической крови больных алкоголизмом и здоровых добровольцев, что говорит об изменении классического пути активации комплемента на альтернативный путь.

7. Острая алкогольная интоксикация ведёт к изменению типа иммунного ответа, о чем свидетельствует изменение уровня IL-4, а также IL-2 и IFN-y в периферической крови.

8. Усиление экспрессии молекул HLA I класса наряду с повышением экспрессии активационных молекул на С08+-лимфоцитах in vitro и in vivo после острой алкогольной интоксикации свидетельствуют об активации эффекторного (киллерного) механизма иммунитета, что

является предпосылкой для развития соматической патологии у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

9. Длительное воздержание от алкоголя (в течение 3-5 лет) больных алкоголизмом приводит к восстановлению основных параметров клеточного и гуморального иммунитета. В случае продолжающегося употребления алкоголя в терапевтическую программу необходимо включать иммуномодулирующие препараты.

10. Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия острой алкогольной интоксикации следует учитывать при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке ошибочных диагнозов воспалительного процесса и иммунодефицитного состояния.

Практические рекомендации

Результаты углубленного исследования параметров иммунного статуса здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя после острой алкогольной интоксикации имеют большое значение для практического здравоохранения. Показано, что частое употребление крепкого алкоголя в дозах от 0,2 л и выше приводит к нарушениям клеточного и гуморального звена иммунной системы, что может явиться причиной возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния.

Важными для практического здравоохранения являются результаты исследования иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью в фазе ремиссии, а именно: длительное воздержание от алкоголя приводит к восстановлению основных параметров клеточного и гуморального иммунитета.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу иммуномодулируклцих препаратов в случае продолжающегося употребления алкоголя.

Полученные результаты диктуют необходимость введения запрета на исследование иммунного статуса и проведение клинических анализов крови в научно-практических и лечебно-профилактических учреждениях у лиц, принимавших накануне крепкий алкоголь в дозах 0,2 л и более, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке ошибочного диагноза воспалительного процесса и иммунодефицитного состояния.

Благодарности

Автор считает своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность своим учителям и руководителям, давшим мне неоценимые знания и навыки работы в области иммунологии и привившим мне глубокий интерес к этой важнейшей и интереснейшей области медико-биологической науки: академику РАН, профессору Хаитову P.M.; члену-корреспонденту РАМН, профессору Алексееву Л.П.; профессору Атауллаханову Р.И.; профессору Манько В.М.; члену-корреспонденту РАЕН, профессору Ярилину A.A., а также выразить искреннюю признательность сотрудникам Института иммунологии - к.б.н. Мастернак Т.Б., к.б.н. Пичугину A.B., к.б.н. Стеценко О.Н., к.м.н. Малкиной Е.Ю., н.с. Шишковой H.H., ст. лаб. Ипатовой H.H. за консультативную помощь в освоении методик.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Климова С.Н., Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б. и др. Особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных опийной и эфедроновой наркоманией. //Вопросы наркологии. - 1994. - JV®2. -с.54-58.

2. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И., Климова С.Н. и др. Особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом в состоянии абстинентного синдрома и ремиссии. //Вопросы наркологии. -1994. - № 3. - с.45-48.

3. Gamaleya N.. Tronnikov S., Ulyanova L., Klimova S., Dmitrieva I. Antibodies to morphine as indicators of chronic morphine intoxication and impaired immune reactivity. //Addiction Biology. - 1996. - Vol. 1. - p 437445.

4. Атауллаханов Р.И., Ульянова Л.И., Мастернак Т.Б., Голощапова Е.Н. Изучение влияния иммуномодулятора Диуцифона на процессы активации Т-лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов человека в условиях культуры клеток in vitro. //Иммунология. - 1997 - JV»5. -с.41-44.

5. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И., Даренский И.Д. и др. Нарушения в системе клеточного иммунитета у больных алкоголизмом и перспективы их коррекции с помощью иммуномодулятора тактивина. //Вопросы наркологии. - 2000. - № 4. - с.54-60.

6. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И., Даренский И.Д., Хотовицкий А.В. Нарушения клеточного иммунитета у больных героиновой наркоманией и попытка их коррекции с помощью тактивина. //XIII съезд психиатров России. - Москва. - 2000. - с.235.

7. Krasotkina Y.V., Ovanesov M.V., Ataullakhanov F.I., Oulianova L.I. Evidence that the primary destination of the intrinsic coagulation pathway is

to provide the propagation of clotting. //Biomedical Soc. Transactions. -

2000. - У. 28.- №5. - A328.

8. Ризопулу А.П., Ульянова Л.И., Арипова Т.У. и др. Изменения цитотоксической активности натуральных киллеров под влиянием иммуномодулина в системе in vitro. //Журнал теоретической и клинической медицины. АНР Узбекистан. - 2001. - №3. - с. 15-19.

9. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И., Хотовицкий A.B. и др. Показатели клеточного иммунитета у больных героиновой наркоманией и их коррекция иммуномодулятором тактивином. //Вопросы наркологии. -

2001. - №4. - с.50-59.

10. Атауллаханов Р.И., Пичугин A.B., Мастернак Т.Б., Ульянова Л.И. и др. Лабораторные и клинические критерии недостаточности иммунитета. //Аллергология, астма и клиническая иммунология. -М.- 2001. - №1. - с.81-86.

11. Ovanesov M.V., Krasotkina Y.V., Oulianova L.I. et al. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dymanics of clot growth. //Biomedica et Biophysica. Acts. - 2002. - Vol.1572. - p.45-57.

12. Хаитов M.P., Тихонова O.B., Згода В.Г., Говорун В.Н., Ульянова Л.И. и др. Протеомный анализ иммунокомпетентных клеток человека //Иммунология. - 2003. - 24. - 5. - с.276-281.

13. Ovanesov M.V., Lopatina E.G, Saenko EX., Ananyeva N.M., Oulianova L.I. et al. Effect of factor - initiated spatial clot growth. //Thromb. Haemost. - 2003. - V.89. - pp.235-242.

14. Гамалея Н.Б., Шостак O.A., Макарова Н.Е., Ульянова Л.И. и др. Влияние пирогенала на иммунный статус и патологическое влечение к алкоголю у больных алкоголизмом. //Вопросы наркологии. - 2004. -№ 3. - с.47-56.

15. Гамалея Н.Б., Шостак O.A., Макарова Н.Е., Ульянова Л.И. и др.. Показатели иммунитета у больных алкоголизмом, осложненным и не осложненным вирусными гепатитами В и С, и влияние на них иммуномодулятора пирогенала. //Вопросы наркологии. - 2004. - № 4. - с.57-69.

16. Атауллаханов Р.И., Пичугин A.B., Шишкова H.H., Малкина Е.Ю., Мастернак Т.Б., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата иммуномакса. //Иммунология. - 2005. - 26. - №2. - с.111-120.

17. Бишева И.В., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на иммунный статус больных алкоголизмом. //Тезисы докладов Международного конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, 3-7 октября 2005 г., Тезисы, Журнал АДАИР. - 2005. - том. 6 (Приложение 1). - с.234-235.

18. Гамалея Н.Б., Бишева И.В., Дмитриева И.Г., Ульянова Л.И. и др. Иммунобиохимические и клинические показатели эффективности двух схем лечения больных алкоголизмом иммуномодулятором полиоксидонием. //Современные достижения наркологии. - Материалы конференции, посвященной 20-летию «Национального научного центра наркологии». - Москва, 21-22 ноября - 2005 г. - с.42-43.

19. Бишева И.В., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И. и др. Иммунный статус и оксидантно-антиоксидантный баланс у больных алкоголизмом при лечении иммуномодулятором полиоксидонием. //XIV съезд психиатров России. 15-18 ноября 2005. -Москва - Материалы съезда. -с.330-331.

20. Гамалея Н.Б., Бишева И.В., Дмитриева И.Г., Ульянова Л.И. и др. Динамика показателей иммунного статуса у больных алкоголизмом при . лечении иммуномодулятором полиоксидонием. //Вопросы наркологии. - 2006. - № 4. - с.19-29.

21. Черноусов А.Д., Петрова Т.В., Пичугина Л.В., Ильинская А.Н., Литвина М.Н., Апарин П.Г., Трубчанинова Л.П., Ульянова Л.И. Индукция клеточной латентности ВИЧ комбинацией высокоэффективной антиретровирусной терапии и интерферонов у пациента с исходной СЗ-стадией ВИЧ инфекции. //Иммунология. -2006. - 27. - 5. - с.266-269.

22. Гамалея Н.Б., Бишева И.В., Ульянова Л.И. Динамика иммунобиохимических показателей у больных алкоголизмом при лечении иммуномодулятором полиоксидонием в сопоставлении с психопатологическими проявлениями. //Труды VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - (Москва, 27-29 июня 2007) Российский аллергологический журнал. - 2007. - № 3. - приложение 1. -с.394.

23. Бишева И.В., Гамалея Н.Б., Дмитриева И.Г., Ульянова Л.И. и др. Динамика показателей оксидантного стресса, системы антиоксидантной защиты, эндогенной интоксикации и биохимических маркеров поражения печени у больных алкоголизмом при лечении иммуномодулятором полиоксидонием. //Наркология. - 2007. - № 7. -с.40-45.

24. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И. Влияние пирогенала на показатели клеточного иммунитета, а также связывания лигандов дофаминовых и опиоидных рецепторов с лимфоцитами периферической крови у больных героиновой наркоманией и алкоголизмом. //Материалы XI Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» 28-31 мая 2007, Санкт-Петербург. - Медицинская иммунология. - 2007. - том 9. - № 2-3. - с.297-298.

25. Гамалея Н.Б., Бишева И.В., Ульянова Л.И. и др. Сравнительная динамика изменения иммунологических, биохимических и клинических показателей при включении в схему лечения больных алкоголизмом иммуномодулятора полиоксидония. //Вопросы наркологии. - 2008. - № 1. - е.36-45.

26. Бишева И.В., Гамалея Н.Б., Дмитриева И.Г., Ульянова Л.И. и др. Динамика показателей иммунного статуса у больных алкоголизмом при лечении иммуномодулятором полиоксидонием. //Вопросы наркологии. - 2009. - № 4. - с.19-29.

27. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Особенности антителонезависимого иммунитета на начальной стадии алкогольной зависимости. //Вопросы наркологии. - 2009. - № 3. - с.91-102.

28. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б. Показатели клеточного иммунитета у больных с алкогольным абстинентным синдромом. //Материалы I Российского национального конгресса по наркологии с международным участием. - Москва. - 24-27 ноября 2009. — с.42-43.

29. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Особенности антителозависимого иммунитета на начальной стадии алкогольной зависимости. //Вопросы наркологии. - 2009. - № 4. - с.26-34.

30. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Функциональная характеристика клеток иммунной системы при алкогольном абстинентном синдроме средней степени тяжести в ранней постинтоксикационной фазе. //Вопросы наркологии. - 2010. - № 4. -с.44-55.

31. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Особенности гуморального иммунитета и цитокинового профиля на II стадии алкогольной зависимости в фазе постинтоксикации. //Вопросы наркологии. - 2010. - № 5. - с.25-33.

32. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Особенности клеточного иммунитета у здоровых добровольцев после нагрузки алкоголем (в фазе постинтоксикации). //Наркология. - 2011. — № 4. — с.54-63.

33. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б. Особенности показателей врожденного иммунитета у больных с алкогольной зависимостью. //Материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011», 23-26 мая 2011. - Медицинская иммунология . - т.13. - №4—5.-с.478.

34. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. и др. Показатели гуморального иммунитета и цитокинового профиля у больных на ранней стадии алкогольной зависимости в фазе постинтоксикации. //«Медицинская иммунология». - Материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием им. Академика В.И.

Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011», 23-26 мая 2011. - Медицинская иммунология. - т. 13. - №4-5. - с.479.

35. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Алексеев Л.П. Влияние этанола in vitro на функциональный потенциал клеток крови человека. //Наркология. -2011. - №8 (116). - с.57-65.

36. Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И. Нарушение функций иммунной системы при хронической алкогольной интоксикации. //Алкоголизм. Руководство для врачей. Под ред. H.H. Иванца, М.А. Винниковой, Москва. Изд-во МИА. - 2011. - с.167-184.

37. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А., Алексеев Л.П. Функциональная характеристика клеток иммунной системы у больных алкогольной зависимостью II стадии в фазе продолжительной ремиссии. //Вопросы наркологии. - 2012. - № 2. - с.56-66.

38. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Сравнительная оценка функциональной активности клеток иммунной системы у больных алкогольной зависимостью II стадии в фазе абстинентного синдрома и продолжительной ремиссии. //Материалы VII Российская конференция посвящается 90-летию со дня рождения академика РАМН Г.Н. Крыжановского «Нейроиммунопатология», 13-14 ноября 2012. -Патогенез. - т. 10. - №3. - с.бб.

39. Гамалея Н.Б., Ульянова М.А., Берзина А.Г., Ульянова Л.И. Нарушения показателей клеточного иммунитета у больных опиатной зависимостью в постинтоксикационной фазе. //Сборник тезисов. Третья Всероссийская конференция с международным участием. «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии», Томск, 5-6 марта 2013. - с.49-50.

40. Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Ульянова М.А. Сравнительная характеристика популяционного состава лимфоцитов периферической крови больных алкогольной зависимостью в состоянии алкогольного абстинентного синдрома и больных опийной наркоманией (фаза постинтоксикации). //Сборник тезисов. Третья Всероссийская конференция с международным участием. «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии», Томск, 5-6 марта 2013. -с. 170-172.

Список сокращений

ААС - алкогольный абстинентный синдром

ИС - индекс стимуляции

ИЦ - индекс цитотоксичности

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ФМА - форбол-меристат-ацетат

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ASO - антистрептолизин-0

СопА - митоген конканавалин А

СН50 - комплемент (гемолитическая активность)

С1 — компонент комплемента

СЗ - компонент комплемента

С4 - компонент комплемента

CD - кластер дифференцировки

CRP - С-реактивный белок

HLA - система лейкоцитарных антигенов человека

IFN - интерферон

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

LPS - митоген липополисахарид

NK - натуральные киллеры

NKT - Т-клетки киллеры

РИА - митоген фитогемагглютинин

PWM - митоген лаконоса

RF - ревматоидный фактор

Подписано в печать 15.10.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 671. Отпечатано на учаспсе множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24