Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетические механизмы клеточных реакций перисинусоидального фиброза при неалкогольной жировой болезни печени

На правах рукописи

ОДИНЦОВА АЛЬФИЯ ХАРИСОВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ПЕРИСИНУСОИДАЛЬНОГО ФИБРОЗА ПРИ НЕАЛКОГОЛЫГОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

14.00.16. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань - 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и Республиканской клинической больнице МЗ РТ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Киясов Андрей Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, доцент

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет, г. Москва

Защита состоится « » 2005 г.

На заседании диссертационного совета Д 208.034.01

при Казанском государственном медицинском университете по адресу:

420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного медицинского университета.

Бойчук Сергей Васильевич, доктор медицинских наук, профессор Сайфутдинов Рафик Галимзянович

Автореферат разослан «

» 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Киясов А.П.

TvJJy

ВВЕДЕНИЕ

J

Актуальность. Неалкогольная жировая болезнь печени в настоящее время рассматривается как клинико-гистологическая группа заболеваний. Она включает широкий спектр поражений печени от неосложненного стеатоза до стеато-гепатита, стеатонекроза, выраженного фиброза и цирроза. До недавнего времени накопление жира в гепатоцитах в форме больших капель триглицеридов (стеатоз) рассматривалось как доброкачественное заболевание с хорошим прогнозом, не вызывающее нарушение функции печени. Считалось, что стеатоз, в частности связанный с ожирением и сахарным диабетом, не прогрессирует в тяжелые формы заболевания печени при отсутствии приема алкоголя. Лишь при алкогольном стеатогепатите и хроническом гепатите С стеатоз рассматривался в связи с воспалением и фиброзом печени. У 31% - 72% больных вирусным гепатитом С развивается стеатоз (Scheuer P.J. et al. 1992, Lefkowitch J.H. 1993). Патофизиологические механизмы его развития до сих пор являются предметом научных дискуссий. Предполагают, что избыток массы тела может быть причиной развития стеатоза у инфицированных вирусом гепатита С пациентов (Hourigan L.F. et al. 1999, Czaja AJ. et al. 1998). В то же время, остается неясным, является ли накопление жира в печени ответственным за последующее воспаление или же воспаление, вызванное какой-либо причиной, приводит к дисфункции гепатоцитов с развитием стеатоза.

В последние десятилетия в работах различных авторов, (Catlin R. 1963, McGil D.B. et al. 1972, Angulo P. et al. 2002, Clouston A.D. et al. 2004), было показано, что у лиц не употребляющих алкоголь в токсических дозах и не зараженных вирусом гепатита С, отложение триглицеридов в печени может сопровождаться воспалительной реакцией, приводящей к развитию фиброза и цирроза. Многочисленные последующие исследования позволили выделить отдельную нозологическую форму гепатита, которую назвали неалкогольным стеатогепатитом (Ludwig J. et al. 1980).

Основными факторами риска заболевания являются избыточный вес, сахарный диабет и гиперлипидемия (Caldwell S.H. et al. 1999, James O.F.W. 1998). Некоторые авторы рассматривают неалкогольный стеатогепатит как часть метаболического синдрома, характеризующегося ожирением, гиперинсулинеми-ей, периферической инсулиновой резистентностью, диабетом, гипертриглице-

ридемией и гипертензией (Marchesini G. et al. 2003). Несмотря на огромный интерес и многочисленные научные публикации, до сих пор неизвестно, существует ли связь между развитием стеатогепатита и другими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, которые также укладываются в понятие метаболического синдрома, в частности желчнокаменной болезнью. Непонятно, почему в одних случаях при избыточном весе больных развивается только стеатоз (накопление жира без воспаления), а в других стеа-тогепатит (стеатоз с воспалительной реакцией не в портальных трактах, а в паренхиме печени). Взаимоотношения между стеатозом, стеатогепатитом и фиб-рогенезом, а также патогенетические механизмы стеатоза, сопровождающегося воспалительной реакцией требуют дальнейшего уточнения (Day С.Р. et al. 1998).

Неалкогольный стеатогепатит существенно отличается от других заболеваний печени последовательностью развития фиброза. Практически при всех гепатитах (в том числе алкогольном и вирусном гепатите С, когда наблюдается стеатоз) отложение соединительной ткани начинается в портальных трактах, вокруг них или в области центральных вен. При неалкогольном стеатогепатите начальным этапом фиброзирования является перисинусоидальный фиброз, то есть отложение соединительной ткани в просвете синусоидов печени.

Синусоиды печени являются уникальными по своему строению и функции кровеносными сосудами. Уникальность эта определяется тем, что эндотелий синусоидов не имеет базальной мембраны, обязательно присутствующей во всех других капиллярах, и не экспрессирует на своей поверхности маркер эндотелия - молекулу CD34. Между эндотелиальной выстилкой и гепатоцитами имеется щель - пространство Диссе. Эндотелиальные клетки синусоидов имеют кластеры фенестр, которые регулируют поступление в пространство Диссе, а, следовательно, к гепатоцитам, хиломикронов (Wisse Е. et al. 1985). В составе последних транспортируются по крови триглицериды, холестерин, эфиры холестерина, апопротеины и эфиры ретинола (Blomhoff R. et al. 1991). Хроническое воздействие алкоголя приводит к стойкому уменьшению диаметра фенестр (Wisse Е. et al. 1992) и рассматривается как один из механизмов развития стеатоза гепатоцитов. Однако задействованы ли эндотелиальные клетки в патогенезе неалкогольного стеатогепатита до сих пор неизвестно. Неизвестно, почему избыток триглицеридов легко проникает через фенестрированный эндотелий и не является ли первоначальное повреждение эндотелия пусковым ме-

2

ханизмом для накопления жире в I епатоцитах и развития перисинусоидального фиброза. Непонятно. почему но ранних этапах эгого заболевания развивается перисинусоидальный фиброз, то есть формируется подобие базальной мембраны. Какие клетки участвуют в синтезе компонентов соединительной ткани? Принадлежит ли и здесь доминирующая роль транедифференцированным в миофибробласты перисинусоидальным звездчатым клеткам, которые являются основным источником коллагена при фиброзе печени, на фоне алкогольных и вирусных гепатитов? Все выше перечисленное позволило нам сформулировать цель и задачи исследования.

Цель работы - изучить патогенетические механизмы клеточных реакций синусоидальных клеток печени в развитии неалкогольного стеатогепатита.

Задачи исследования:

1 Оценить частоту неалкогольной жировой печени у лиц с избыточной массой тела, избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью и у больных хроническим гепатитом С.

2. Изучить последовательность трансдифференцировки перисинусоидаль-ных звездчатых клеток в миофибробласты и роль последних в развитии перисинусоидального фиброза при различной степени активности неалкогольного стеатогепатита.

3. Изучить реакцию эндотелия и изменение фенотипа при различных степенях активности и стадиях неалкогольного стеатогепатита.

4. Провести сравнительный анализ гистологичесокой степени активности неалкогольного стеатогепатита с изменениями функциональных проб печени во всех трех группах больных.

Научная новизна. Проведена оценка клеточных реакций, участвующих в развитии фиброза при неалкогольном стеатогепатите. Установлено, что перисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности и на всех стадиях неалкогольного стеатогепатита, сопровождается транедифференци-ровкой перисинусоидальных звездчатых клеток. Впервые показано, что экспрессия С034 в эндотелии синусоидов коррелирует с активностью неалкогольного стеатогепатита.

Впервые получены данные о частоте неалкогольного стеатогепатита у больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью. Выявлена высокая частота заболевания в этой группе больных.

Практическая значимость работы. Высокая частота неалкогольного стеатогепатита в группе больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью позволяет сделать вывод, что ожирение в сочетании с желчнокаменной болезнью является фактором риска стеатогепатита. Эти больные нуждаются в диспансерном наблюдении с исследованием функциональных проб печени и проведением профилактических мероприятий для предупреждения развития цирроза печени.

В нашем исследовании интраоперационная биопсия печени не вызывала осложнений и не влияла на течение раннего послеоперационного периода, что позволяет рекомендовать выполнение биопсии печени при проведении лапароскопической холецистэктомии в этой группе больных, для ранней диагностики неалкогольного стеатогепатита, а следовательно, эффективной профилактики цирроза печени.

В группе больных с избыточной массой тела и клиническими признаками гепатита также была выявлена высокая частота НАСГ, подтвержденная биопсией печени. Это означает, что даже при отказе больных от биопсии печени, при наличии клинических признаков заболевания (увеличение печени, УЗИ признаки стеатоза, повышение уровня сывороточных трансаминаз), этих больных надо вести как больных с НАСГ, проводя все необходимые профилактические мероприятия и лечение гепатотропными препаратами с обязательным диспансерным наблюдением.

Иммуногистохимический анализ особенностей клеточных реакций, участвующих в развитии фиброза печени при неалкогольном стеатогепатите, позволил уточнить патогенетические механизмы и последовательность трансдиффе-ренцировки перисинусоидальных звездчатых клеток и изменения фенотипа эндотелия в развитии перисинусоидального фиброза. Выявленная последовательность активации ПЗК и эндотелия позволяет рекомендовать использование иммуногистохимического выявления этих клеток при биопсии как дополнительный метод исследования для уточнения степени активности и прогноза течения НАСГ,

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трансдифферепцировка перисинусоидальных звездчатых клеток и пери-синусоидальный фиброз с начальных этапов развития неалкогольного стеато-

гепатита являются взаимосвязанными процессами, которые приводят к изменению фенотипа эндотелия и «капилляризации» синусоидов.

2. Сочетание избыточной массы тела с желчнокаменной болезнью является благоприятным фоном для развития неалкогольной жировой болезни печени.

Внедрение результатов исследования. Основные результаты исследований внедрены в практическую деятельность гастроэнтерологического, эндохи-рургического и патологоанатомического отделений РКБ МЗ РТ и используются в учебном процессе при проведении конференций по гастроэнтерологии в районах РТ, городской клинической больнице №1, кафедре терапии КГМА.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях и симпозиумах: VII Всероссийском съезде по эндоскопической хирургии (Москва, 16-19 февраля 2004 года), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов ( Казань, 17-18 сентября 2004 года), Республиканской научно-практической конференции «Научные методы диагностики и лечения» (Казань, 1996), II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, Д и G -проблемы диагностики, лечения и профилактики» ( Москва, 1997), Республиканской конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Казань, 2005), X Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2005).

Публикации по теме диссертации: Основной материал диссертационной работы опубликован в 8 научных трудах, в том числе в центральной печати - 6.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов, заключения, практических рекомендаций и указателя литературы, который состоит из 15 отечественных и 191 иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками, 16 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В соответствии с целью и задачами данной работы были изучены результаты 20 аутопсий лиц с ожирением, 40 пункционных биопсий печени больных с избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ, восьми пункционных биопсий у больных с клиническими признаками НАСГ и 40 биопсий больных хроническим гепатитом С. В этих группах больных оценивались показатели функциональных проб печени, включая билирубин, AJIT, ACT и щелочную фосфатазу.

Аутопсии были отобраны по историям болезней умерших больных из терапевтических отделений РКБ за период с 1996 по 2003 годы. Критериями отбора были: а) наличие избыточной массы тела; б) отсутствие в анамнезе приема алкоголя, вирусных гепатитов, хронических заболеваний печени и приема ге-патотоксических препаратов.

Клиническими показаниями для проведения пункционной биопсии печени были гепатомегалия, стойкое изменение функциональных проб печени, избыточная масса тела, исключение вирусных гепатитов, болезней накопления печени и аутоиммунного заболевания. При оценке функциональных проб печени оценивались билирубин, AJIT, ACT, протромбин.

Пункционная биопсия печени проводилась в гастроэнтерологическом отделении иглой Менгини диаметром 1,4 или 1,6 мм. В 8-м или 9-м межреберье по средней подмышечной линии в положении больного лежа на спине под местной анестезией 0,25% раствором новокаина аспирационным методом получали материал, который затем помещали в 10% забуференный раствор формалина. Осложнений не было. В этой группе также оценивалась частота НАСГ, степень активности и стадия болезни по методу, предложенному Brunt et al. и корреляция с изменениями трансаминаз.

У больных с избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ пункционная биопсия печени проводилась при лапароскопической холецистэктомии. Из обследования исключались больные со злоупотреблением этанола в анамнезе, а также лица, принимающие гепатотоксические препараты. Острый холецистит и осложненная желчнокаменная болезнь являлись противопоказанием для проведения пункции печени.

Интраоперационная биопсия печени не вызывает осложнений и не оказывает влияния на течение раннего послеоперационного периода. Этот фрагмент

работы выполнен совместно с эндохирургами РКБ МЗ РТ и заместителем главного врача РКБ по хирургии Фарраховым А.З.

Биопсия у больных хроническим гепатитом С проводилась перед назначением специфической интерферонотерапии, что определило особенности этой группы больных: молодой возраст и непродолжительное течение болезни.

Биоптаты фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону В группе больных хроническим гепатитом С оценивались индекс гистологической активности (степень), частота и характер фиброза (стадия болезни), а также наличие стеаюза.

Иммуногистохимически стрептавидин-биотиновым методом (LSAB-kit Dako, Denmark) с аминоэтилкарбазолом в качестве хромогена были изучены два типа синусоидных клеток печени: миофибробласты и эндотелий. Миофиб-робласты (трансдифференцированные ПЗК) выявляли окрашиванием антителами против альфа-гладкомышечного актина (Dako). Эндотелий выявляли антителами против CD34 (Novocastra, laboratories Ltd).

Результаты морфологического и иммуногистохимического исследования оценивались двумя независимыми морфологами. Экспрессию CD34 и выраженность активации миофибробластов оценивали в баллах (Табл.1 и 2).

Таблица 1

Полуколичественные критерии оценки экспрессии CD34 в эндотелии синусоидов

Баллы Характер экспрессии С034

0 Нет С034(+) клеток в синусоидах

1 Единичные С034(+)клетки в 1-й зоне ацинуса

2 Многочисленные С034(+) клетки в 1-й зоне и единичные во 2-й

3 Многочисленные С034(+) клетки в 1 -й и 2-й зонах, единичные в 3-й

4 Во всех зонах ацинуса многочисленные С034(+) клетки

Таблица 2

Полуколичественные критерии оценки выраженности миофибробластной трансдифференцировки клеток Ито

Баллы Характер экспрессии альфа-гладкомышечного актина

0 Нет миофибробластов, окрашиваются только сосуды портальных трактов

1 Только в перипортальных клетках

2 В синусоидах 1-й зоны ацинуса

3 В синусоидах 1-й и 2-й зоны ацинуса

4 Во всех зонах ацинуса

Морфологический фрагмент работы был выполнен на базе патологоана-томического отделения РКБ МЗ РТ (зав. отд. профессор С.Б. Петров).

Результаты исследования

Частота неалкогольной жировой болезни печени

у больных с избыточной массой тела

Из двадцати аутопсий лиц с избыточной массой тела, умерших в РКБ МЗ РТ от различной патологии в период с 1996 по 2003 годы, стеатоз диагностирован у 14 (70%), морфологические признаки неалкогольного стеатогепатита обнаружены в 5 случаях (25%).

Из 20 больных мужчин было 12, женщин 8, средний возраст составил 62 года (от 44 до 87 лет).

Причинами смерти в 6 случаях была ИБС, в 1-м дилятационная кардио-миопатия, в 5-и сахарный диабет, в 7-и острое нарушение мозгового кровообращения, в 1-м энцефалит. Смерть больных наступила быстро и сроки лечения в реанимационном отделении не превышали трех дней.

Поскольку НАСГ наиболее часто сочетается с ожирением, то многие исследования посвящены изучению частоты заболевания у больных с избыточной массой тела (ЫеизсЬ\уапс1ег-Те1п В.А.,2003). Индекс массы тела является единственным фактором, прямо связанным с тяжестью фиброза при стеатоге-патите (Равэю Е. е1 а1., 2004). Показано, что стеатоз встречается у 10-15% лиц с нормальным весом и у 70-80%) лиц с ожирением, частота неалкогольного стеатогепатита составляет 3% и 15-20%) соответственно (Угщуе Ра1ск-УНег е1 а1., 2001). Полученные нами показатели частоты НАСГ при ожирении не-

сколько выше данных тлтррг vpi,, что чол; быть связано с тем, что больные скрывают от врача им*Ьор\.ацию о приеме алкоголя, гистологически отличить НАСГ от алкогольного гепатита не представляется возможным.

Среди двадцати исследованных 12 были мужчинами, а вероятность злоупотребления алкоголем выше у мужчин, чем у женщин. Сравнить частоту стеатоза и стеатогепатита в зависимости от ИМТ не представилось возможным, так как во многих историях болезни вместо ИМТ указывалось питание больных (избыточное). Частота повышения трансаминаз была выше в группе больных стеатогепатитом и составила 80% (4 случая из 5). При стеатозе тран-саминазы были повышены в 50% случаев (7 из 14). Причиной смерти у больных с НАСГ в 3-х случаях было острое нарушение мозгового кровообращения, в 2-х острый инфаркт миокарда. В группе больных со стеатозом кроме ишемической болезни сердца и острого нарушения мозгового кровообращения причиной смерти стали сахарный диабет, гипертоническая болезнь. Эти заболевания относятся к факторам риска НАСГ, а сам стеатогепатит рассматривается в рамках метаболического синдрома, включающего ожирение, талер липидемию, сахарный диабет и артериальную гипертензию (Marchesini G. et al., 2003).

Стеатоз гепатоцитов у больных хроническим гепатитом С

В гастроэнтерологическом отделении РКБ МЗ РТ перед назначением этиотропного лечения больным хроническим гепатитом С обязательно проводится диагностическая пункционная биопсия печени. За период с 2002 по 2004 годы проведено более 150 биопсий больным хроническим вирусным гепатитом. Среди всех вирусных гепатитов именно для гепатита С патогномо-ничным является наличие микро и макровезикулярного стеатоза. Стеатоз гепатоцитов наблюдается у большого числа больных хроническим гепатитом С, особенно при 3-м генотипе вируса. Предполагают, что вирус С вызывает такие же изменения метаболизма свободных жирных кислот, какие наблюдаются при алкогольном гепатите и НАСГ (Moriya К. et al., 1997). Неалкогольный стеатогепатит может сочетаться с гепатитом С и способствовать прогресси-рованию заболевания. Выборочно было отобрано 40 случаев хронического гепатита С и проанализирована частота стеатоза, а также связь с избыточной массой тела. Из 40 больных только у девяти (22,2%) при морфологическом исследовании был выявлен стеатоз. При этом только у двоих имелся небольшой избыток массы тела (ИМТ 27). Для установления взаимосвязи между

степенью активности и стадией болезни со стеатозом был проведен сравнительный анализ индекса гистологической активности и стадии гепатита у больных со стеатозом и без него. Не выявлено связи стеатоза с активностью гепатита и выраженностью фиброза.

В литературе есть данные о том, что ожирение может играть определенную роль в развитии стеатоза и ацинарного фиброза у больных хроническим гепатитом С (Clouston A.D. et al., 2001), однако результаты нашего исследования не подтвердили эти данные. Возможно, что полученные нами данные отражают то, что для лечения отбирались молодые пациенты (34 в возрасте до 40 лет, средний возраст 36 лет) с непродолжительной длительностью хронического гепатита С, что является предиктором хорошего ответа на лечение интерфероном. Может быть, именно поэтому нами не было выявлено связи стеатоза с более высокой активностью процесса и стадией гепатита, а также с избытком массы тела.

Неалкогольный стеатогепатит у больных с клиническими признаками болезни

В гастроэнтерологическом отделении РКБ МЗ РТ за период с 2003 по 2004 годы проведено 8 пункционных биопсий печени у больных с клиническими признаками НАСГ. При поступлении в отделение все пациенты жаловались на слабость и неприятные ощущения в правом подреберье. При объективном осмотре определялась слегка увеличенная печень, на УЗИ имелись признаки стеатоза. При обследовании в поликлинике были исключены вирусные гепатиты, аутоиммунные гепатиты, болезни накопления, прием гепато-токсических препаратов, в беседах с больным и родственниками исключено злоупотребление этанолом.

Из восьми больных, находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении РКБ в период с 2002 по 2004 годы, которым диагностическая биопсия печени была проведена по клиническим показаниям, во всех случаях диагностирован НАСГ со степенью активности от 1 до 3 на стадии от 1до 4. Не выявлено связи ИГА и стадии болезни с имеющимся стеатозом. Также не было обнаружено связи между уровнем повышения АЛТ и ACT и морфологической активностью гепатита. Это означает, что в случаях стойкого повышения трансаминаз у больных с избыточной массой тела очень высока вероятность НАСГ, однако степень повышения ферментов не отражает активности процесса. По литературным данным у 10% больных с длитель-

10

ным повышением j розня AJIT не обнаруживаюг причин этих изменений (Mofrad P. el al, 2003). Около 50% этих случаев вызвано НАСГ. Проведенное ретроспективное сравнение гистологических изменений при НАСГ с повышением АЛТ и при нормальном уровне аминотрансфераз, показало, что спектр гистологических изменений в этих группах больных сходный, а нормальные уровни АЛТ не гарантируют отсутствие гепатита с выраженным фиброзом. Таким образом, наше исследование еще раз подтвердило, что повышение АЛТ не может быть использовано как маркер диагностики степени и стадии стеатогепатита. Тем не менее, повышение АЛТ часто встречается у больных НАСГ, а повышение ACT может коррелировать с гистологическим прогрессированием фиброза (Harrison S.A., 2003). Поскольку отсутствует прямая корреляция между тяжестью НАСГ и повышением трансаминаз, лицам старше 40 лет при стойком повышении АЛТ и ACT и наличии факторов риска, таких как ожирение, сахарный диабет рекомендуется проведение диагностической пункции печени. Надо отметить, что и больные и врачи с осторожностью относятся к этой инвазивной процедуре из-за возможных осложнений, таких как кровотечение, пункция полых органов.

Цена и риск биопсии могут перевешивать ценность информации, получаемой при биопсии, в оценке прогноза и выбора тактики лечения. Если принимается решение об отказе от биопсии, то необходимо обсудить возможные последствия с больным.

В то же время, как показало наше исследование, морфологическое подтверждение диагноза позволяет не только определить тактику лечения, но и прогнозировать исход, а главное сроки развития и тяжесть фибротических изменений.

При клиническом осмотре наиболее частым признаком болезни является гепатомегалия. В нашем исследовании все больные имели избыточную массу тела, увеличенную печень и повышение уровня как АЛТ, так и ACT, что объясняет частоту выявления НАСГ.

Частота неалкогольной жировой болезни печени у больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью С целью раннего выявления НАСГ и изучения частоты НАСГ у больных с избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ в эндохирургическом отделении РКБ совместно с гастроэнтерологом с 2001 года проводится пункционная биопсия печени при проведении плановой лапароскопической холецистэкто-

11

мии. Показаниями для проведения интраоперационной диагностической пункционной биопсии печени были:

а) избыточная масса тела;

б) неосложненная ЖКБ;

в) отсутствие приема этанола в анамнезе;

г) отсутствие приема гепатотоксических препаратов и хронических гепатитов в анамнезе.

Интраоперационная биопсия печени не вызывала осложнений и не оказывала влияния на течение раннего послеоперационного периода. Из 40 биопсий у больных с избыточной массой тела и ЖКБ в 70% (28 биопсии) морфологически был выявлен стеатогепатит.

Из 28 больных НАСГ 25 были женщинами, трое мужчинами, средний возраст составил 54,8 (от 39 до 76 лет), ИМТ от 26 до 41. Анализ наличия сопутствующих заболеваний выявил, что в 3-х случаях имелась гиперлипиде-мия, в 4-х сахарный диабет, в 2-х сниженная толерантность к глюкозе. Это еще раз подтверждает, что факторами риска НАСГ являются сахарный диабет, сниженная толерантность к глюкозе и гиперлипидемия.

Таким образом, ЖКБ может быть предиктором НАСГ у больных с ожирением. Возможно, это связано с тем, что в патогенезе НАСГ играет роль эн-дотоксемия, которая рассматривается как «толчок» к развитию воспаления при стеатозе (\Vigg АЛ. ег а1., 2001). В литературе есть данные о том, что эн-дотоксемия наблюдается у больных с нарушением желчеотделения, что связывают либо с недостаточным поступлением в кишечник желчных кислот, нейтрализующих эндотоксины, либо с нарушением секреции содержащегося в желчи секреторного А (Петухов В.А. е1 а1., 2001). Возникновение воспалительных реакций связано в первую очередь с тем, что липополисахариды кишечной флоры являются мощным индуктором провоспалительных цито-кинов. Под воздействием ЭТ в печени развиваются различной выраженности дистрофические процессы, ультраструктурные нарушения вплоть до некроза гепатоцитов и слущивания эндотелиоцитов в просвет синусоидов, появления воспалительных клеточных инфильтратов как по ходу синусоидов, так и в паренхиме, состоящих из полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоидных клеток.

Подобное нашему исследованию, морфологическое исследование печени проводилось во время операции наложения обходного желудочного анасто-

моза по поводу ожирения. У 48 больных ожирением интраоперационно была проведена биопсия печени, В 65% случаев морфологически был обнаружен стеатоз, в 12% выраженный фиброз и в 33% НАСГ (С. Beymer et al. 2003). В другой аналогичной работе эти цифры составили 90% и 42-47% соответственно (S. Shalhub et al. 2004). Одновременно было показано, что ни ИМТ, ни изменение трансаминаз не могут быть предиктором наличия и тяжести стеа-тогепатита. Следовательно, биопсия печени остается «золотым» стандартом диагностики НАСГ, и проведение биопсии печени при проведении операции по поводу ожирения является желательной для определения прогноза заболевания.

Сравнительный анализ морфологической активности неалкогольного стеатогепатита и изменений функциональных проб печени

В группе больных НАСГ, диагностированном при интраоперационной биопсии печени, был проведен сравнительный анализ морфологической активности гепатита и степени повышения цитолиза. Оказалось, что лишь у одного больного в функциональных пробах печени, которые исследовались до операции, было повышение трансаминаз (4%). Таким образом, у 96% больных избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ НАСГ протекает без повышения AJIT и ACT.

Это еще раз подтверждает необходимость проведения пункционной биопсии печени у больных с факторами риска НАСГ для раннего выявления заболевания и определения прогноза даже при неизмененных трансаминазах. Больных с сочетанием избыточной массы тела с ЖКБ можно рассматривать как группу риска по НАСГ. Пункционная биопсия печени, проводимая во время лапароскопической холецистэктомии является безопасной, не вызывает осложнений и позволяет диагностировать НАСГ даже при неизмененных трансаминазах. Наши данные совпадают с результатами исследования больных, подвергшихся операции обходного желудочного анастомоза по поводу ожирения, где было показано, что изменение трансаминаз не может быть предиктором наличия и тяжести неалкогольного стеатогепатита (Frantzides С.Т. et al., 2004).

Перисинусоидальный фиброз и трансдифференцировка перисинусоидальныз звездчатых клеток

23 случая больных НАСГ, выявленных при интраоперационной биопсии печени, были исследованы для изучения клеточных типов, участвующих в развитии перисинусоидального фиброза. С этой целью была определена степень активности и стадия болезни по методу предложенному Brunt et al. Фиброз печени - частое последствие различных повреждений печени. Он характеризуется накоплением интерстициального коллагена и других компонентов матрикса. Прогрессирующий фиброз печени является основной причиной органной недостаточности при хронических заболеваниях печени различной * этиологии. Фиброз развивается в форме разных пространственных моделей в зависимости от превалирующих патогенетических механизмов при повреж- « дениях печени различной этиологии. Фиброз, наблюдаемый при хронических вирусных инфекциях, первоначально концентрируется в пределах портальных трактов, тогда как фиброз вследствие метаболических нарушений локализуется в основном в центролобулярных зонах. В последние годы многими работами доказано, что различные клеточные типы вовлечены в отложение фибриллярного межклеточного матрикса в процессе активного печеночного фиброгенеза. ПЗК являются основным источником коллагена, когда повреждение ограничивается или концентрируется в пределах печеночной дольки. Портальные миофибробласты и фибробласты вносят основной вклад в фиб-рогенез, когда повреждение локализуется вблизи портальных трактов. На поздних стадиях (септальный фиброз) все клетки, продуцирующие экстацел-люлярный матрикс, участвуют в фиброгенезе.

В нашей работе анализ взаимосвязи степени активности и стадии болезни „

показал, что уже при первой степени активности НАСГ часто выявляется 1 -я, а иногда и 2-я стадии болезни (Табл. 3).

Таблица 3

Взаимосвязь между степенью активности и стадией НАСГ

Активность 1 НАСГ легкая 1 2 средне 1яжелая 3 тяжелая

Стадия НАСГ 1 1,4±0,23 (M±m) j 2,16±0,33 2,0+0,0

Для 1-й стадии НАСГ характерен перивен>лярный фиброз в 3-й зоне аци-нуса и перисинусоидальный фиброз. Таким образом, в отличие от вирусных хронических гепатитов, при НАСГ на начальном этапе заболевания, который характеризуется легкой степенью активности, развивается перисинусодаль-ный фиброз. Среднетяжелая степень активности сопровождается 2-й стадией заболевания, когда фиброз развивается и в перипортальных зонах.

Для выяснения роли отдельных клеточных типов в развитии перисину-соидального фиброза в первую очередь была проанализирована связь между степенью активности и выраженностью активации миофибробластов. Оказалось, что активация миофибробластов и распределение их в пределах сину-соидов различных зон ацинуса высокая при любой степени активности НАСГ, то есть с начальных этапов заболевания (Табл. 4).

Таблица 4

Активация миофибробластов при различной активности НАСГ

Активность НАСГ 1 легкая 2 среднетяжелая 3 тяжелая

Миофибробласты (М±т) 2,88±0,37 2,6±0,57 2,43±0,46

Было показано, что выраженность активации миофибробластов не зависит от степени активности, так как различия между группами недостоверны. Та же самая связь прослеживается и со стадией болезни, активация миофибробластов наблюдается уже на первой стадии фиброза и остается высокой на 2-й и 3-й стадиях. Таким образом, выраженность активации миофибробластов или трансдифферекцировки ПЗК не зависит от степени активности и стадии болезни. Уже при легкой активности НАСГ в синусоидах появляется достаточно много миофибробластов, что означает, что перисинусоидальный фиброз может быть следствием миофибробластической трансдифференцировки ПЗК. Таким образом, перисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности и на всех стадиях НАСГ, сопровождается трансдиффе-ренцировкой перисинусоидальных звездчатых клеток. Учитывая, что функцией миофибробластов является синтез макромолекул межклеточного мат-рикса, можно предположить, чго первично происходит трансдифференциров-

ка ПЗК, а вследствие этого развивается пернсинусоидальный и другие формы фиброза.

Пернсинусоидальный фиброз и экспрессия CD34

в синусоидах печени

Для изучения связи трансдифференцировки ПЗК в миофибробласты с ка-пилляризацией, то есть с приобретением эндотелием сосудистого фенотипа, была исследована экспрессия CD34. Выявление CD-34 в паренхиме свидетельствует о появлении капилляров внутри печеночных долек. В норме в эндотелии синусоидов печени CD34 не экспрессируется. Печеночные синусоидальные эндотелиальные клетки образуют стенку синусоида печени. Они осуществляют важную фильтрационную функцию, благодаря наличию мелких фенестр. Через эти фенестры происходит свободная фильтрация многих * веществ кроме частиц размеров хиломикронов, между кровью и поверхностью гепатоцита. По мере развития фиброза печени увеличивается содержание коллагени 4-го типа, энтактина и ламинина (компонентов базальной мембраны сосудов) и образуется структура, подобная базальной мембране капилляров, в пределах пространства Диссе. Количество эндотелиальных фенестр синусоидов уменьшается. Эти изменения синусоидов и называют «капилля-ризацией», так как нарушенное строение синусоидов напоминает капилляры. При этом синусоидные эндотелиальные клетки теряют фенотипические признаки, характеризующиеся открытыми фенестрами и отсутствием базальной мембраны (Neubauer К. С et а!., 2001). Было показано, что измененный эндотелий экспрессирует маркеры, связанные с эндотелием сосудов - CD31.

Нами был проведен анализ соотношения плотности CD34(+) клеток и ПЗК В результате проведенного анализа мы не обнаружили зависимости ме- «

жду выраженностью экспрессии CD34 и миофибробластической трансдиффе-ренцировкой ПЗК (Табл.5). ,

Таблица 5

Экспрессия CD34 в зависимости от миофибробластической трансдиффе-

ренцировки печеночных звездчатых клеток

Трансдифференцировки ПЗК (баллы) г i 2 3 4

CD34 (М±ш) 2,5±0,71 2,88±0,44 2,17±0,38 2,66±1,08

Возможно, это связано с тем, что миофибробластическая трансдифференци-ровка ПЗК наблюдается в самом начале болезни. Уже при первой степени активности происходит активация ПЗК, а капилляризация синусоидов происходит позже. Таким образом, экспрессия СБ34 в эндотелии синусоидов печени не зависит от выраженности миофибробластической трансдифференцировки пе-рисинусоидальных звездчатых клеток и экспрессии в них альфа-гладко-мышечного актина.

Активность НАСГ и выраженность "капилляризации" синусоидов

Сравнение активности НАСГ с экспрессией СВ34 показало, что чем выше активность, тем больше экспрессия С034 (Табл.6).

Таблица 6

Экспрессия СБ-34 при различной степени активности НАСГ

Активность НАСГ 1 легкая 2 среднетяжелая 3 тяжелая

СЭ34 (М±ш) 1,88±0,21 2,6±0,44 3,2±0,19*

* - р < 0,001 от 1-й ст. активности

По-видимому, миофибробласты запускают перисинусоидальный фиброз, что приводит к появлению соединительно-тканного каркаса по типу базаль-ной мембраны эндотелия, и эндотелий синусоидов приобретает фенотип, свойственный эндотелию сосудов, то есть происходит «капилляризация». Экспрессия С034 в эндотелии синусоидов печени коррелирует с активностью НАСГ, чем выше активность, тем больше эндотелиальных клеток экспресси-руют СЭ34. Безусловно, «капилляризация» синусоидов может рассматриваться как предиктор развития мостовидного и септального фиброза, которые могут привести к циррозу. По-видимому, клеточные реакции при перисину-соидальном фиброзе развиваются в следующей последовательности (Рис.1).

Рис.1

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ ПЕРИ-СИНУСОИДАЛЬНОМ ФИБРОЗЕ

СР-34() ГМА(-)

Избыточное поступление жиров

ЭК<=

А

Приток свободных жирных кислот Окислительный стресс Ишемия

I

18

Привлечение

воспалительных

клеток

(еР) Медиаторы воспаления

I

СО-34(-) а-ГМА(+) Синтез коллагена

Перисинусоидальный фиброз

А

эк<

СР-34(+) а-ГМА(+)

"Капилляризаиия"

Условные обозначения:

Л - лейкоциты

С - синусоид

ПК - печеночные клетки

ЭК - эндотелиальные клетки ПЗК - печеночные звездчатые клетки КК - клетки Купфера

выводы

Перисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности и на всех стадиях неалкогольного стеатогепатита, наблюдается одновременно с трансдифференцировкой перисинусоидальных звездчатых клеток в миофибробласты, которые синтезируют макромолекулы межклеточного матрикса и обладают сократительной способностью, экс-прессируя альфа-гладкомышечный актин.

Экспрессия CD34 в эндотелии синусоидов печени начинается после развития перисинусоидального фиброза и миофибробластической транс-дифференцировки перисинусоидальных звездчатых клеток, и зависит от активности неалкогольного стеатогепатита. Чем выше активность гепатита (стеатоз, некрозы и воспаление), тем больше эндотелиальных клеток экспрессируют CD34. Последнее, является отражением начала ка-пилляризации синусоидов с нарушением обменных процессов между кровью и гепатоцитами и выражается в прогрессировании фиброза. В группе больных с сочетанным метаболическим синдромом (ожирение в сочетании с желчнокаменной болезнью) неалкогольный стеатогепатит встречается в три раза чаше (70%), чем в группе больных только с ожирением (22%), а у больных хроническим гепатитом С стеатоз гепатоци-тов не является проявлением метаболического синдрома и не связан с избытком массы тела и гиперлипидемией.

Биохимические показатели цитолиза (повышение АЛТ и ACT) не являются четким критерием выраженности дистрофии, некроза и воспаления в паренхиме печени у больных с неалкогольным стеатогепатитом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведение пункции печени при лапароскопической холецистэктомии по поводу желчнокаменной болезни у больных с ожирением способствует уточнению диагноза неалкогольного стеатогепатита и определению прогноза заболевания.

2. Биопсия печени у лиц со стойким повышением трансаминаз и факторами риска неалкогольного стеатогепатита целесообразна, так как позволяет определить не только тактику лечения, но и прогнозировать исход, а главное сроки развития и тяжесть фибротических изменений.

3. Окрашивание биоптатов печени на CD34 дает возможность точнее прогнозировать дальнейшее развитие заболевания, так как капилляризация синусоидов может рассматриваться как предиктор развития мостовид-ного и септального фиброза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Значение морфологического исследования в диагностике заболеваний печени / С.Б. Петров, JI.C. Фатхеева, А.Х. Одинцова и др. // Тезисы докладов научно-практической конференции. « Новые методы диагностики и лечения» Часть 1.- Казань,- 1996.- С. 94-96.

2. Использование иммуногистохимических методов для прогнозирования исходов хронического гепатита / В.А. Анохин, A.C. Созинов, А.Х. Одинцова и др. // II Российская научно-практическая конференция с международным участием « Гепатиты В,С,Д и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики» Москва, 1997. - С. 82-83.

3. Одинцова А.Х. Лапароскопические операции в сочетании с пункцион-ной биопсией печени в диагносшке неалюлольного стеатоrenalша / А.Х. Одинцова, А.П.Киясов, А.З.Фаррахов // VII Всероссийский съезд по эндоскопической хирургии Москва, 16-19 февраля 2004 года, Эндоскопическая хирургия. - 2004,- №1.- С. 87.

Одинцова А.Х. Неалксн ольная жировая болезнь печени / А.Х. Одинцова // Практическая медицина. - 2003.- №4.- С. 28-31.

5. ОдинЦова А.Х. Неалкогольный стеатогепатит: связь с ожирением и желчнокаменной болезнью, корреляция степени морфологической активности и изменений функциональных проб печени / А.Х. Одинцова, А.П. Киясов // Казанский медицинский журнал.- 2004.- том LXXXV, №2.- С. 142.

6. Киясов А.П. Фенотип эндотелия синусоидов печени при неалкогольном стеатогепатите / А.П. Киясов, А.Х. Одинцова // Тезисы V Общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов, 17-18 сентября 2004 года, Казань, Морфологические ведомости (приложение).- 2004,- №12,- С. 75.

7. Одинцова А.Х. Неалкогольный стеатогепатит: особенности развития фиброза / А.Х. Одинцова, А.П. Киясов, С.Б. Петров // Материалы десятой Российской конференции «Гепатология сегодня», 28-30 марта 2005 года, Москва, Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии приложение №24.- 2005.- №1.- С. 52.

8. Одинцова А.Х. Частота неалкогольного стеатогепатита у больных ожирением в сочетании с желчнокаменной болезнью / А.Х. Одинцова, А.П. Киясов, А.З. Фаррахов // Материалы десятой Российской конференции «Гепатология сегодня», 28-30 марта 2005 года, Москва, Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии приложение №24,- 2005,-№1,- С. 53.

9. Одинцова А.Х. Неалкогольный стеатогепатит / А.Х. Одинцова, А.П. Киясов // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2005,-№1,- С. 20-25.

Подписано к печати 20.082005 г. Бумага офсетная. Гарншура Тайме. Формат 80x108 )П6. Уел печл. 1,5. Уч.-изд. л.1,75. Печаль ризографическая. Тираж ЮОэю.Заказ 022.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ООО «Олитех» 420015, г.Казань. ул.Толсгого, 15(3-е здание КАИ) тел36-11-71 Лицеюия№0139 от 15.10.98г. выданная министерством информации и печати Республики Татарстан

» 164 09

РНБ Русский фонд

2006-4 14394

Актуальность. Неалкогольная жировая болезнь печени в настоящее время рассматривается как клинико-гистологическая группа заболеваний. Она включает широкий спектр поражений печени от неосложненного стеатоза до стеатогепатита, стеатонекроза, выраженного фиброза и цирроза. До недавнего времени накопление жира в гепатоцитах (стеатоз) рассматривалось как доброкачественное изменение фенотипа гепатоцитов, которое не вызывает выраженных нарушений функции печени. Считалось, что стеатоз, в частности, связанный с ожирением и сахарным диабетом, не прогрессирует в тяжелые формы заболевания печени при отсутствии приема алкоголя. Лишь при алкогольном стеатогепатите и хроническом гепатите С стеатоз рассматривался как одна из причин воспаления и фиброза печени. У 31% - 72% больных вирусным гепатитом С развивается стеатоз [194,148,27]. Патофизиологические механизмы его развития до сих пор являются предметом научных дискуссий. Предполагают, что избыток массы тела может быть причиной развития стеатоза у инфицированных вирусом гепатита С пациентов [69,87,112]. В то же время, остается неясным, является ли накопление жира в печени ответственным за последующее воспаление или же воспаление, вызванное какой-либо причиной, приводит к дисфункции гепатоцитов с развитием стеатоза.

В последние десятилетия в работах различных авторов, в частности Са^ Нп Я., МсвП О.В.(1972), было показано, что у лиц не употребляющих алкоголь в токсических дозах и не зараженных вирусом гепатита С, отложение триглицеридов в печени может сопровождаться воспалительной реакцией, приводящей к развитию фиброза и цирроза. Многочисленные последующие клинические наблюдения [18,22,124,189] позволили выделить отдельную нозологическую форму гепатита, которую назвали неалкогольным стеатогепа-титом. Гистологическими критериями диагноза неалкогольного стеатогепатита являются стеатоз в сочетании с различной степенью выраженности воспаления и фиброза [35]. Фактически, заболевание может быть частым предшественником криптогенного цирроза печени.

Неалкогольный стеатогепатит рассматривается как часть метаболического синдрома, характеризующегося ожирением, гиперинсулинемией, периферической инсулиновой резистентностью, диабетом, гипертриглицеридемией и гипертензией [137]. Несмотря на огромный интерес и многочисленные научные публикации, до сих пор неизвестно, существует ли связь между развитием стеатогепатита и другими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, которые также укладываются в понятие метаболического синдрома, в частности желчнокаменной болезнью. Непонятно, почему в одних случаях при избыточном весе больных развивается только стеатоз (накопление жира без воспаления), а в других стеатогепатит (стеатоз с воспалительной реакцией не в портальных трактах, а в паренхиме печени);

Неалкогольный стеатогепатит существенно отличается от других заболеваний печени последовательностью развития фиброза. Практически при всех гепатитах (в том числе алкогольном и вирусном гепатите С, когда наблюдается стеатоз) отложение соединительной ткани начинается в портальных трактах, вокруг них или в области центральных вен. При неалкогольном стеатоге-патите начальным этапом фиброзирования является перисинусоидальный фиброз, то есть отложение соединительной ткани в просвете синусоидов печени.

Синусоиды печени являются уникальными по своему строению и функции кровеносными сосудами. Уникальность эта определяется тем, что эндотелий синусоидов не имеет базальной мембраны, обязательно присутствующей во всех других капиллярах, и не экспрессируют на своей поверхности маркер эндотелия - молекулу С034. Между эндотелиальной выстилкой-и ге-патоцитами имеется щель - пространство Диссе. Эндотелиальные клетки синусоидов имеют кластеры фенестр, которые регулируют поступление в пространство Диссе, а, следовательно, к гепатоцитам, хиломикронов [191]. В составе последних транспортируются по крови триглицериды, холестерин, эфиры холестерина, апопротеины и эфиры ретинола [30]. Хроническое воздействие алкоголя приводит к стойкому уменьшению диаметра фенестр [39] и рассматривается как один из механизмов развития стеатоза гепатоцитов. Однако задействованы ли эндотелиальные клетки в патогенезе неалкогольного стеа-тогепатита до сих пор неизвестно. Неизвестно, почему избыток триглицери-дов легко проникает через фенестрированный эндотелий и не является ли первоначальное повреждение эндотелия пусковым механизмом для накопления жира в гепатоцитах и развития перисинусоидального фиброза. Непонятно почему на ранних этапах этого заболевания развивается перисинусоидаль-ный фиброз, то есть формируется подобие базальной мембраны. Какие клетки участвуют в синтезе компонентов соединительной ткани? Принадлежит ли и в этом случае доминирующая роль, трансдифференцированным в миофиб-робласты печеночным звездчатым клеткам, которые являются основным источником коллагена при фиброзе печени на фоне алкогольных и вирусных гепатитов?

Все выше перечисленное позволило нам сформулировать цель и задачи исследования.

Цель работы - изучить патогенетические механизмы клеточных реакций синусоидных клеток печени в развитии неалкогольного стеатогепатита.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту неалкогольной жировой болезни печени у лиц с избыточной массой тела, избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью и у больных хроническим гепатитом С.

2. Изучить последовательность трансдифференцировки печеночных звездчатых клеток в миофибробласты и роль последних в развитии перисинусоидального фиброза при различной степени активности гепатита.

3. Изучить реакцию эндотелия и изменение фенотипа при различных степенях активности и стадиях неалкогольного стеатогепатита.

4. Провести сравнительный анализ гистологической степени активности неалкогольного стеатогепатита с изменениями функциональных проб печени во всех трех группах больных.

Научная новизна. Проведена оценка клеточных реакций, участвующих в развитии фиброза при неалкогольном стеатогепатите. Установлено, что пе-рисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности и на всех стадиях неалкогольного стеатогепатита, сопровождается трансдиффе-ренцировкой печеночных звездчатых клеток. Впервые показано, что экспрессия СЭ34 в эндотелии синусоидов, то есть изменение фенотипа эндотелия, коррелирует с активностью неалкогольного стеатогепатита.

Впервые получены данные о частоте неалкогольного стеатогепатита у больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью. Выявлена высокая частота заболевания в этой группе больных.

Практическая значимость работы.

Высокая частота неалкогольного стеатогепатита в группе больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью позволяет сделать вывод, что ожирение в сочетании с желчнокаменной болезнью является фактором риска стеатогепатита. Эти больные нуждаются в диспансерном наблюдении с исследованием функциональных проб печени и проведением профилактических мероприятий для предупреждения развития цирроза печени.

В нашем исследовании интраоперационная биопсия печени не вызывала осложнений и не влияла на течение раннего послеоперационного периода, что позволяет рекомендовать выполнение биопсии печени при проведении лапароскопической холецистэктомии в этой группе больных, что будет способствовать ранней диагностике неалкогольного стеатогепатита, а следовательно, эффективной профилактике цирроза печени.

В группе больных с избыточной массой тела и клиническими признаками гепатита также была выявлена высокая частота НАСГ, подтвержденная биопсией печени. Это означает, что даже при отказе больных от биопсии печени, при наличии клинических признаков заболевания (увеличение печени, УЗИ признаки стеатоза, повышение уровня сывороточных трансаминаз), этих больных надо вести как больных с НАСГ, проводя все необходимые профилактические мероприятия и лечение гепатотропными препаратами с обязательным диспансерным наблюдением.

Иммуногистохимический анализ особенностей клеточных реакций, участвующих в развитии фиброза печени при неалкогольном стеатогепатите, позволил уточнить патогенетические механизмы и последовательность транс-дифференцировки печеночных звездчатых клеток и изменения фенотипа эндотелия в развитии перисинусоидального фиброза. Выявленная последовательность активации ПЗК и эндотелия позволяет рекомендовать изучение этих клеток при биопсии как дополнительный метод исследования для уточнения степени активности и прогноза течения НАСГ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Трансдифференцировка печеночных звездчатых клеток и перисинусои-дальный фиброз с начальных этапов развития неалкогольного стеатогепа-тита являются взаимосвязанными процессами, которые приводят к изменению фенотипа эндотелия и «капилляризации» синусоидов.

2. Сочетание избыточной массы тела с желчнокаменной болезнью является благоприятным фоном для развития неалкогольной жировой болезни печени.

Внедрение результатов исследования

Основные результаты исследований внедрены в практическую деятельность гастроэнтерологического, эндохирургического и патологоанатомиче-ского отделений РКБ МЗ РТ и используются в учебном процессе при проведении конференций по гастроэнтерологии в районах РТ, городской клинической больницы №1, кафедры терапии КГМА.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях и симпозиумах: VII Всероссийском съезде по эндоскопической хирургии (Москва, 16-19 февраля 2004года), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов ( Казань, 17-18 сентября 2004 года), Республиканской научно-практической конференции «Научные методы диагностики и лечения» (Казань, 1996), II Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатиты В, С, Д и в - проблемы диагностики, лечения и профилактики» ( Москва, 1997), Республиканской конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Казань, 2005), X Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва 2005).

Публикации по теме диссертации: Основной материал диссертационной работы опубликован в 9 научных трудах, в том числе в центральной печати — 6.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов, заключения, практических рекомендаций и указателя литературы, который состоит из 206 отечественных и иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками, 16 таблицами.

5. ВЫВОДЫ

1. Перисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности и на всех стадиях неалкогольного стеатогепатита, наблюдается одновременно с трансдифференцировкой печеночных звездчатых клеток в миофибробласты, которые синтезируют макромолекулы межклеточного матрикса и обладают сократительной способностью, экспрес-сируя альфа-гладкомышечный актин.

2. Экспрессия CD34 в эндотелии синусоидов печени начинается после развития перисинусоидального фиброза и миофибробластической трансдифференцировки печеночных звездчатых клеток, и зависит от активности неалкогольного стеатогепатита. Чем выше активность гепатита (стеатоз, некрозы и воспаление), тем больше эндотелиальных клеток экспрессируют CD34. Последнее является отражением начала ка-пилляризации синусоидов с нарушением обменных процессов между кровью и гепатоцитами и выражается в прогрессировании фиброза.

3. В группе больных с избыточной массой тела в сочетании с желчнокаменной болезнью неалкогольный стеатогепатит встречается в три-раза чаще (70%), чем в группе больных только с ожирением (22%), а у больных хроническим гепатитом С стеатоз гепатоцитов не связан с избытком массы тела и гиперлипидемией.

4. Биохимические показатели цитолиза (повышение АЛТ< и ACT) не являются четким критерием выраженности дистрофии, некроза и воспаления в паренхиме печени у больных неалкогольным стеатогепатитом.

4.3АКЛЮЧЕНИЕ

Неалкогольный стеатогепатит - заболевание, являющееся одной из клинических форм жирового перерождения печени, морфологически характеризующееся стеатозом и воспалением, отличающееся неопределенностью прогноза и возможным развитием фиброза и цирроза печени у лиц, не употребляющих алкоголь в гепатотоксических дозах [6,99,123]. Несмотря на то, что этот термин был предложен Ludwig et al. не более трех десятилетий назад [143], связь стеатоза печени с воспалительными изменениями и фиброзом была известна намного раньше [206].

Истинная распространенность НАСГ неизвестна, так как для постановки этого диагноза необходимо исследование биопсии печени, которое проводится лишь по показаниям и в определенных группах больных. В тоже время следует отметить, что НАСГ обнаруживается, у 1,2-9% больных [179], которым проводят биопсию печени. Более того, согласно данным литературы около 20-30% взрослого населения США и стран Европы имеют чрезмерное накопление жира в печени, а 10% (2-3% взрослого населения) из них болеют НАСГ [130].

Несмотря на то, что стеатоз встречается у 10-15% лиц с нормальным весом и у 70-80% лиц с ожирением, частота стеатогепатита составляет соответственно 3 и 15-20% [23,203]. Таким образом, частота именно гепатита, а не просто стеатоза тем выше, чем больше масса тела, то есть НАСГ чаще всего сочетается с ожирением. В настоящее время НАСГ рассматривается, как часть метаболического синдрома, характеризующегося ожирением, гиперин-сулинемией, периферической инсулиновой резистентностью и гипертензией [142]. Одним из проявлений метаболического синдрома может быть ЖКБ. Более того, неоднократно отмечалось, что ожирение чаще встречается среди больных желчнокаменной болезнью, чем в общей популяции [13]. Однако в литературе нет данных о частоте НАСГ у больных с ожирением в сочетании с

ЖКБ. Существуют публикации о том, что диагностируемый на УЗИ стеатоз печени, связан с повышенной частотой ЖКБ [193]. Но что это — просто жировая дистрофия гепатоцитов (стеатоз) или стеатогепатит неизвестно.

До настоящего времени патогенез НАСГ остается неизвестным. Предполагают, что накопление жиров в печени может быть следствием избыточного поступления свободных жирных кислот в орган, усиления синтеза жирных кислот в печени, пониженного бета-окисления свободных жирных кислот, снижения синтеза или секреции холестерина липопротеидов очень низкой плотности [101]. Подтверждением этого является то, что в ткани печени у больных с ожирением отмечено повышенное содержание свободных жирных кислот [80]. Накопление свободных жирных кислот может быть причиной нарушения функции печени, поскольку жирные кислоты химически очень активны и могут повреждать биологические мембраны [17]. Еще одним практически неизученным феноменом является связь между стеатозом, стеатогепа-титом и развитием фиброза. Даже существующая в настоящее время теория двух толчков, которая рассматривает в качестве пусковых механизмов развития НАСГ усиление ПОЛ и эндотоксемию, не может объяснить причинно-следственных взаимоотношений между стеатозом и фиброзом [52].

Большинство больных НАСГ асимптомны. Заболевание выявляется случайно при проведении рутинных лабораторных тестов или при исследовании по поводу других болезней, таких как ожирение, диабет или гипертензия. Утомляемость, наверное, наиболее частый сообщаемый симптом, не коррелирует с тяжестью гистологического повреждения печени. Другой частый симптом - дискомфорт в правом подреберье [179]. При физикальном осмотре больных не обнаруживается патогномоничных признаков. Ожирение является наиболее частым нарушением и встречается у 30-100% больных [130,143,198]. Печеночные трансаминазы могут быть повышены в 2-4 раза, однако по некоторым данным уровень повышения трансаминаз не отражает тяжести заболевания [134,182]. В то же время НАСГ наиболее частая причина необъяснимого повышения АЛТ при исключении вирусных гепатитов и других хронических заболеваний печени. Недавно было показано, что у больных с ожирением и измененными функциональными пробами печени часто встречается фиброз в сочетании с воспалением [104]. Избыточная масса тела, повышение трансаминаз, возраст старше пятидесяти лет, повышение триглице-ридов могут быть показанием для проведения биопсии печени [104].

Диагноз НАСГ может быть установлен только при биопсии печени, так как лабораторные данные и данные УЗИ и КТ не могут помочь врачу в проведении дифференциального диагноза стеатоза и стеатогепатита [46]. Следует отметить, что до сих пор не существует общепринятой шкалы для определения активности и стадии стеатогепатита. Наиболее удобный и простой метод полуколичественной оценки степени активности и стадии НАСГ был предложен Brunt et al. [35]. Этот метод полуколичественной оценки степени активности и стадии патологического процесса является адаптированным аналогом методов морфологической диагностики хронических вирусных гепатитов и первичного билиарного цирроза. В то же время только НАСГ характеризуется выраженным перисинусоидальным фиброзом, который выделяется морфологами отдельно не только с начальных стадий фиброза, но и как обязательный компонент среднетяжелой и тяжелой степени активности воспаления НАСГ.

Многочисленные работы были посвящены изучению клеточных типов, участвующих в отложении соединительной ткани при фиброзе печени [7,14,21,37,72,127,201]. Как in vitro, так и in vivo было показано, что три клеточных типа в пределах печеночной дольки могут синтезировать макромолекулы соединительной ткани, а, следовательно, участвовать в развитии фиброза. Источником соединительной ткани может быть эндотелий, гепатоциты, но в большей степени печеночные звездчатые клетки, которые трансдифферен-цируются в миофибробласты [65,163]. Поскольку патогенез НАСГ до сих пор неизвестен и ясно лишь то, что стеатоз гепатоцитов развивается не без участия фенестрированного синусоидного эндотелия [10,97,191], который первым вступает в контакт с хиломикронами, важно понять, почему же именно при НАСГ развивается перисинусоидальный фиброз, и какие клеточные типы в этом участвуют. Синусоидные эндотелиальные клетки отличаются от типичного сосудистого эндотелия. СД 34, экспрессирующийся в эндотелии практически всех сосудов, отсутствует в эндотелии синусоидов. Однако для синусоидов печени характерна, так называемая "капилляризация", когда при перипортальном фиброзе в перипортальных зонах на месте синусоидов появляются мелкие сосуды, в эндотелии которых экспрессируется СЭ34 [55]. Не является ли "капилляризация" синусоидов, если она есть при НАСГ, пусковым механизмом стеатоза, ведущего к воспалению и фиброзу.

Исходя из вышеизложенного, нами были сформулированы задачи исследования. Эти задачи* включали в себя изучение частоты НЖБП в группе больных с избыточной массой тела, с избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ, с избыточной массой тела и стойким повышением трансаминаз, проведение сравнительного анализа морфологической активности НАСГ и повышения трансаминаз. Отдельной задачей было определение частоты стеатоза при хроническом гепатите С и его связи с избыточной массой тела. Но ключевой целью для себя мы поставили уточнение патогенетических звеньев НАСГ. Именно поэтому, была изучена причинно-следственная связь между развитием перисинусоидального фиброза, активацией миофибробластов и "капилляризацией" синусоидов при НАСГ.

С целью изучения частоты НЖБП у больных с избыточной массой тела были проанализированы истории болезней умерших в терапевтических отделениях РКБ МЗ РТ от различных причин в период с 1996 по 2003 годы. Были отобраны случаи, удовлетворяющие следующим критериям:

1 наличие избыточной массы тела;

2 отсутствие злоупотребления алкоголем;

3 отсутствие приема гепатотоксических препаратов, длительного голодания;

4 исключение хронических заболеваний печени.

Из 20 аутопсий лиц с избыточной массой тела, умерших в РКБ МЗ РТ от различной патологии, стеатоз диагностирован у 70%, но морфологические признаки НАСГ обнаружены-только в 25% случаев. В тоже время эти цифры несколько выше данных литературы, что может быть связано с тем, что больные скрывают от врача информацию о приеме алкоголя. Среди двадцати исследованных 12 были мужчинами, а вероятность злоупотребления' алкоголем выше у мужчин, чем у женщин.

С целью изучения частоты НЖБП у больных с избыточной массой тела в сочетании с ЖКБ в эндохирургическом отделении РКБ проводилась пункци-онная биопсия печени при проведении плановой лапароскопической холеци-стэктомии. Показаниями для проведения интраоперационной диагностической, пункционной биопсии печени являлись:

1 наличие избыточной массы тела;

2 неосложненная ЖКБ;

3' отсутствие злоупотребления алкоголем в анамнезе.

Было поведено 40 биопсий, НАСГ диагностирован в 70% случаев (28 больных). Биопсия печени у этих больных не вызывала осложнений и не влияла на течение раннего послеоперационного периода. Частота НАСГ составила 70%), что значительно выше, чем у лиц с ожирением без ЖКБ. Таким образом, ЖКБ может быть предиктором НАСГ у больных с ожирением. Возможно, это связано с тем, что в патогенезе НАСГ играет роль эндотоксемия, которая рассматривается как «толчок» к развитию воспаления при стеатозе [11,19,52,197]. Повышенное содержание эндотоксина в крови наблюдается у больных с нарушениями желчеотделения, что связывают либо с недостаточным поступлением в кишечник желчных кислот, нейтрализующих эндотоксины, либо с нарушением секреции содержащегося в 4 желчи секреторного А [11,19]. Возникновение воспалительных реакций связано в первую очередь* с тем, что липополисахариды кишечной флоры являются мощным индуктором провоспалительных цитокинов. Под воздействием ЭТ в печени развиваются различной выраженности дистрофические процессы, появляются воспалительные клеточные инфильтраты как по ходу синусоидов, так и в паренхиме.

Нами также была изучена частота НАСГ у больных с избыточной массой тела и со стойким повышением трансаминаз, при исключении вирусных гепатитов и других хронических заболеваний печени. Во всех случаях (п=8) гистологически обнаружен НАСГ различной степени активности и стадии. В этой группе больных и в 28 случаях НАСГ при ожирении в сочетании с ЖКБ был проведен сравнительный анализ повышения трансаминаз и степени активности гепатита. Оказалось, что нет связи активности НАСГ с изменением AJIT. Трансаминазы были повышены только в одном случае НАСГ при ЖКБ. Таким образом, при неизмененных трансаминазах нельзя клинически исключить НАСГ при наличии факторов риска заболевания, а степень повышения AJIT не отражает активности процесса. Это еще раз подтверждает необходимость проведения пункционной биопсии печени у больных с факторами риска НАСГ для раннего выявления заболевания и определения прогноза. Пунк-ционная биопсия печени, проводимая во время лапароскопической холеци-стэктомии также является безопасной процедурой, не вызывает осложнений и позволяет диагностировать НАСГ даже при неизмененных трансаминазах. В случаях стойкого повышения AJIT и ACT у больных с избыточной массой тела высока вероятность НАСГ, однако степень повышения ферментов не отражает активности процесса [134]. Поэтому в этой группе пациентов также целесообразно проводить пункцию печени для определения активности и стадии болезни, что позволит точнее определить не только диагноз НАСГ, но прогноз заболевания на будущее.

Стеатоз гепатоцитов наблюдается ^ большого числа больных хроническим гепатитом С, особенно при 3-м генотипе вируса. Предполагают, что вирус С вызывает такие же изменения метаболизма свободных жирных кислот, какие наблюдаются при НАСГ [184,185]. Неалкогольный стеатогепатит может сочетаться с гепатитом С и способствовать прогрессированию заболевания [183]. Существует предположение, что ожирение может играть определенную роль в развитии не только стеатоза но и ацинарного фиброза у больных хроническим гепатитом С [184]. В гастроэнтерологическом отделении РКБ проводится диагностическая пункционная биопсия печени у больных хроническим гепатитом С перед назначением этиологического лечения. Так за период с 2002 по 2004 годы проведено более 150 биопсий. Выборочно было отобрано 40 случаев и проанализирована частота стеатоза, а также связь с избыточной массой тела. Из 40 больных только у девяти при морфологическом исследовании выявлен стеатоз. При этом только у двоих из них имелся небольшой избыток массы тела (ИМТ 27). Таким образом в нашем исследовании стеатоз печени при хроническом гепатите С не был связан с избыточной массой тела. Возможно, на результаты нашего исследования повлияло то, что для лечения были отобраны молодые пациенты ( 34 в возрасте до 40 лет, средний возраст 24,9 лет) с непродолжительной длительностью хронического гепатита С, что является предиктором хорошего ответа на лечение интерфероном. В тоже время, можно предположить, что механизмы развития жировой дистрофии при НАСГ и гепатите С могут быть различными.

Диагноз НАСГ может быть выставлен только на основании анализа биопсии печени. Изучение особенностей фиброза при НАСГ с окрашиванием препаратов на СЭ34 и альфа-гладкомышечный актин у 23 больных с ожирением и ЖКБ позволило нам установить последовательность клеточных реакций, приводящих к развитию фиброза. Было обнаружено, что уже на первой стадии НАСГ развивается перивенулярный и перисинусоидальный фиброз в 3-й зоне ацинуса. Таким образом, в отличие от хронических вирусных гепатитов, при НАСГ на начальном этапе заболевания, который характеризуется умеренной степенью активности, развивается перисинусоидальный фиброз. Среднетяжелая степень активности, как правило, сопровождается второй стадией заболевания, когда фиброз развивается и в портальных зонах.

Для выяснения роли отдельных клеточных типов в развитии перисину-соидального фиброза в первую очередь нами была проанализирована связь между степенью активности гепатита и выраженностью активации миофибробластов. Оказалось, что активация миофибробластов и их распределение в пределах синусоидов различных зон ацинуса высокая при любой степени активности НАСГ. Та же самая связь была прослежена и при сравнении активации миофибробластов со стадией болезни (фиброз), активация миофибробластов наблюдалась уже на первой стадии фиброза и оставалась высокой на второй и третьей стадиях. Таким образом, мы установили, что выраженность активации миофибробластов или трансдифференцировки ПЗК не зависит от степени активности и стадии болезни. Уже при умеренной активности НАСГ, то есть в самом начале заболевания, в синусоидах появляется достаточно много миофибробластов, что означает, что перисинусоидальный фиброз может быть следствием миофибробластической трансдифференцировки ПЗК. Таким образом, перисинусоидальный фиброз, выявляемый при любой степени активности НАСГ, сопровождается трансдифференцировкой ПЗК.

Исследование экспрессии СОЭ4 позволило изучить связь трансдифференцировки миофибробластов с "капилляризацией", то есть с изменением,фенотипа эндотелиальных клеток. В норме в синусоидах СЭ34 не экспрессиру-ется, а его обнаружение свидетельствует о трансформации синусоидов печени в капилляры [105,127,169]. Проведя анализ, мы обнаружили, что нет зависимости между выраженностью экспрессии С034 в синусоидах и миофибробластической трансдифференцировкой ПЗК. Возможно, это связано .с тем, что активация ПЗК возникает в самом начале болезни, уже при первой степени активности, а "капилляризация" синусоидов появляется позже, когда вместо прерывистой базальной мембраны в просвете синусоидов откладывается коллаген, формирующий подобие непрерывной базальной. мембраны сосудов.

Сравнение активности НАСГ с экспрессией С034, отражающей процесс капилляризации, показало, что чем выше активность, тем больше в синусоидах экспрессия С034. По-видимому, миофибробласты запускают перисинусоидальный фиброз, что приводит к появлению соединительно-тканного каркаса по типу базальной мембраны, и эндотелий синусоидов на этом фоне приобретает фенотип, свойственный эндотелию сосудов, то есть происходит капилляризация". Именно это предположение может объяснить то что, экспрессия СЭ34 в эндотелии синусоидов печени коррелирует с активностью НАСГ, чем выше активность, тем больше эндотелиальных клеток экспресси-руют СЭ34. Другими словами, метаболические нарушения на уровне гепато-цитов вызывают трансдифференцировку ПЗК, которые в свою очередь, синтезируя коллаген и откладывая его в просвет синусоидов, изменяют микроокружение эндотелия. Последний теряет присущий ему фенотип и становится подобен эндотелию капилляров. "Капилляризация" же синусоидов является отражением финальной перестройки синусоидов, в частности, и межклеточных взаимоотношений, в общем, что усугубляет нарушения функции органа. По-видимому, схему патогенеза развития НАСГ и последовательность клеточных реакций при перисинусоидальном фиброзе можно представить следующим образом (Рис. 19, 20).

Рис. 19

СХЕМА ПАТОГЕНЕЗА НЕ АЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА

Первый "толчок" ожнгчснш

CHATOS ПЕЧЕНИ

Увеличение содержания жира

Второй "толчок"

Притон ' вббоцнь» t.nfii-ь > ti!<j¡' Окислительные слреге: ¡.i-'.uv

Снижение функции макрофагов

Ахтиi3Uttft перекиси-г о окиплвния пигнядов | Снижение АТФ а ткам' печени ПаВышонпс MVEC'Hil Т'-ЛЬНОС 1 и , * ачдоюиоину ч В результате активации ПЗК i

Пврисинусоидальный фиброз i

Капилляризация эндотелия

Рис. 20

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ ПЕРИ-СИНУСОИДАЛЬНОМ ФИБРОЗЕ

Нгёьпочио« нм-тлилш« жкрм

ЭК кк сгкмн

-ГМЛ(-) С

Mrnaiopu в<ц-п j.fffiHH

ППМЛЩСЛЬЫЫ! кк

CD-Ж-) в-ГМА(->

КК

С&-М1-) гм.лш

Трянсднфференцуровка IHK

КК

СО-34<-) в-ГМЛ<+)

Синтез кшма) ска I

Перисннусондальный фиброз

Капилляризация" У

С&-34Н а-ГМА(+)

Условные обозначения:

Л - лейкоциты

С - синусоид

ПК - печеночные клетки

ЭК - эндотелиальные клетки ПЗК - печеночные звездчатые клетки КК - клетки Купфера