Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Патогенетические и клинические аспекты нарушений регуляции сигнализации транскрипционного фактора STAT 6 при бронхиальной астме

На правах рукописи

СОРОКИНА Лада Николаевна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАРУШЕНИЙ РЕГУЛЯЦИИ

СИГНАЛИЗАЦИИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА 8ТАТ6 ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.01.2S - Пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских иаук

2 О Ш 2311

Санкт-Петербург 2010

4842706

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Валерий Николаевич Минеев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Евгеньевна Гембицкая

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Вадим Иванович Мазуров

доктор медицинских наук, профессор Валентина Ивановна Серебрякова

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита диссертации состоится « ¿рсврослл 2011 г. в <5,/¿Г часов на заседании диссертационного Совета Д.208.090.02 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова в Научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, Санкт-Петербург, ул. Рентгена 12, зал заседаний Ученого Совета).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова по адресу: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого 6-8.

Автореферат разослан умса&ра, 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор А.Д Александров

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем в современной пульмонологии и приобретает все большую социальную значимость (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006). При этом, несмотря на появление новых инновационных стратегий в диагностике и лечении этого хронического заболевания, возрастание арсенала медикаментозных средств, в последние годы, как свидетельствуют различные источники (Илькович М.М. и др., 2007; Чучалин А.Г., Илькович М.М.,

2009), отмечается неуклонный рост заболеваемости, увеличивается распространенность этой патологии во многих странах мира, составляя в настоящее время более 10% среди детей и 4-10% - среди взрослых.

Сохраняются высокими показатели смертности и инвалидизации (Кокосов А.Н., 2005; GINA, 2009). Растет число больных с тяжелым течением, среди которых велик процент лиц молодого возраста и детей, увеличивается количество пациентов, имеющих резистентность к проводимой терапии.

Сложившаяся ситуация требует поиска новых путей решения проблемы диагностики и лечения БА (Oh С.К., Geba G.P., Molfino N.,

2010) с обязательным обращением к вопросу о патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии, генетических аспектах формирования аллергических заболеваний (Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и др., 2008), центральным дефектом которых является изменение и нарушение функционирования клеточного мем-бранно-рецепторного аппарата (Минеев В.Н., 2005) и сигнальных систем (Barnes J.P., 2008).

Одной из новых сигнальных систем, играющих решающую роль в патогенезе БА, является JAK-STAT (Janus Kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription), которая вовлекается в патогенез при различных патологических процессах. К настоящему времени эта система относительно хорошо изучена в эксперименте. У животных и человека она трансдуцирует множество цитокиновых сигналов и ростовых факторов, которые обеспечивают клеточную пролиферацию, дифференциацию, миграцию и апоптоз. Достаточно подробно структурно-функциональная организация этой системы, а также особенно-

сти изменений этой системы при некоторых видах патологии изложены в целом ряде обзоров (Murray P.J., 2007; Barnes J.P., 2008).

Что касается бронхиальной астмы, то данные литературы о функционировании этой системы в клетках-мишенях при указанном виде патологии единичны и противоречивы (Schindler C.W., 2002; Pernis A.B., Rothman P.B., 2002; Rawlings J.S. et al., 2004), а в отечественной литературе - вообще отсутствуют.

Цель исследования

Определить патогенетическое и клиническое значение нарушений регуляции сигнализации транскрипционного фактора STAT6 при различных вариантах бронхиальной астмы.

Задачи исследования:

1. Изучить экспрессию и активацию транскрипционного фактора STAT6 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

2. Оценить изменение уровня транскрипционного фактора GATA-3 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в различные фазы заболевания.

3. Изучить экспрессию транскрипционного фактора STAT4 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

4. Исследовать экспрессию транскрипционного фактора T-bet при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

5. Изучить мРНК IL-4Ra при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

6. Выявить нарушения регуляции транскрипционного фактора STAT6 на основе анализа экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS3 и SOCS1 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

Научная новизна исследования:

-Впервые установлены особенности сигнализации транскрипционного фактора STAT6 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы исходно и в условиях активации ее

IL-4. При этом сопоставление компонентов STAT-сигнализации (STAT4 и STAT6) в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы дало возможность разработки методов дифференциальной диагностики вариантов заболевания.

- Впервые проведено исследование экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой в сравнении с группой практически здоровых лиц в зависимости от клинико-патогенетических особенностей заболевания, и показана роль этого транскрипционного фактора в механизмах утяжеления аллергической бронхиальной астмы.

- Впервые сопоставлены особенности экспрессии транскрипционного фактора STAT4 и мРНК IFN-y в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

-Впервые показаны особенности экспрессии транскрипционного фактора T-bet у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой, а также, выделен и охарактеризован «синдром повышения T-bet», свидетельствующий о тяжелом течении заболевания.

- Впервые показано нарушение баланса уровней экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS 1 и SOCS3 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы и проводимой терапии.

-Впервые разработано и проведено комплексное исследование особенностей экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в STAT-сигнализации, в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

Практическая ценность работы:

- Разработан метод дифференциальной диагностики бронхиальной астмы, основанный на сопоставлении уровней активной формы транскрипционного фактора STAT6 у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

- Нами охарактеризован новый симптоматокомплекс («синдром повышения T-bet»), включающий наличие парадоксальной экспрессии T-bet в сочетании с тяжелым течением заболевания, необходимостью применения применения системных глюкокортикостероидов и (32-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием соче-танной сопутствующей патологии.

- Выявленные разноуровневые нарушения в системе ЭТАТ-сигнализации можно рассматривать как мишени для разработки новых лечебных «стратегий будущего».

Положения, выносимые на защиту:

1. Для бронхиальной астмы характерны множественные изменения экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в 8ТАТ-сигнализации, и регуляторные нарушения на различных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, на уровне транскрипционных факторов, негативных регуляторов транскрипции генов), в основе которых лежат дефекты негативного контроля.

2. Аллергическая БА характеризуется разнонаправленными изменениями уровней экспрессии транскрипционных факторов 8ТАТ6 и БТАТ4 в мононуклеарах периферической крови, с активацией 1Ь-4 и одновременно угнетением альтернативного 1Ь-12 сигнального пути, что может указывать на повышенную ТЬ2-активность при данном варианте заболевания.

3. Для аллергической бронхиальной астмы характерно разнонаправленное изменение экспрессии транскрипционных факторов йАТА-З и Т-Ьй с выраженным увеличением интегрального коэффициента САТА-З/Т-Ьй, что может свидетельствовать о сдвиге регуля-торного ТЫ/ТЬ2 баланса в сторону ТЬ2-отвста.

4. Наличие парадоксальной экспрессии Т-Ье1 (повышение экспрессии) у больных бронхиальной астмой определяет симптоматоком-плекс («синдром повышения Т-ЬеЬ), проявляющийся преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикостероидов и |32-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии, среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта.

5. При БА глюкокортикостероиды проявляют свое модулирующее влияние в отношении 5ТАТ-сигнализации в мононуклеарах периферической крови на разных уровнях клеточной сигнализации, особенно выраженное в группе больных с пероральной глюкокортикостероид-ной терапией.

6. Дефектность негативного регуляторного контроля в системе 8ТАТ-сигнализации проявляется на уровне супрессоров цитокиновой сигнализации 80С81 и БОСЭЗ в мононуклеарах периферической крови, что связано с нарушением их баланса.

Апробация работы

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа. Из них 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 12 работ в зарубежной литературе, 1 изобретение «Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы»; авторы: Минеев В.Н., Сорокина JI.H., Трофимов В.И. (патент на изобретение № 2391663), 1 глава в монографии «Саногенез» и монография «Фундаментальные и клинические аспекты JAK-STAT сигнализации».

Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Бронхиальная астма - вчера, сегодня, завтра» (Санкт-Петербург, 2007); на «Булатовских чтениях» (Санкт-Петербург, 2007, 2008); на 16-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006); на 18-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2008); на 19-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009); на пульмонологической секции Санкт-Петербургского научно-практического общества терапевтов имени С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2008); на 17 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Stockholm, Sweden, 2007); на 18 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Berlin, Germany, 2008), на 19 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2009).

По результатам конкурса докладов молодых ученых в рамках 16 Национального Конгресса по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006) доклад «Особенности JAK-STAT сигнализации при бронхиальной астме» занял первое место и был награжден стипендией Главного терапевта России.

По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект «JAK-STAT сигнализация как базис формирования аллергических заболеваний: фундаментальные и прикладные аспекты» стал победителем конкурса 2007 года. Шифр гранта: РД 074.0-86.

По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект «Новая сигнальная система JAK-STAT: разработка инновационного подхода к комплексному исследованию патогене-

тических и клинических основ» стал победителем конкурса 2008 года. Шифр гранта: 28-04/17.

По результатам конкурса грантов НИР в 2008 году СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова на лучшую научную работу, конкурсный проект: «Патогенетические и клинические аспекты нарушений регуляции 8ТАТ6-сигнализации при бронхиальной астме», стал победителем конкурса 2008 года.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в лечебную практику пульмонологического отделения клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав с результатами собственных наблюдений, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 292 работы (24 отечественных и 268 иностранных авторов).

Работа изложена на 269 страницах машинописного текста, иллюстрирована 85 таблицами и 31 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами было обследовано 218 больных БА, находившихся на лечении в клинике госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова за период с 2006 по 2010 годы. В качестве контрольной группы донорами периферической крови явились 27 практически здоровых человека: 16 женщин и 11 мужчин. Среди больных БА было 70 мужчин (36,6%) и 121 женщина (63,4%).

Сравнительная характеристика больных АБА и НАБА представлена в таблицах 1, 2.

Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (США, 2009). Обследование проводили в фазе обострения и в фазе ремиссии заболевания.

Распределение больных БА по группам было следующим: группу больных аллергической БА (АБА) составили 101 человек, неаллергической БА (с инфекционно-зависимым или преимущественно инфек-ционно-зависимым вариантом заболевания) (НАБА) - 90 человек.

Всем больным проводилось комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее общеклинические методы, цитологический и бактериологический анализ мокроты или промывных вод бронхов, исследование иммунологического статуса, исследование функции внешнего дыхания, а также, по показаниям, бронхоскопическое, аллергологическое, гормональное исследования.

Таблица 1

Сравнительная характеристика клнннко-лабораторных признаков у больных обследованных групп

Признак ЛБА* НАБА* Достоверность различии **

Средний возраст, лет 39.3+14,81 53,9±14,2 р=0,0001

Длительность заболевания, лет 14.01 + 11,9 13,1+12,5 р>0,05

Возраст начала заболевания, лет 24.7+15,7' 41.01+15.8 р=0,0001

Исследование крови:

количество лейкоцитов, 109/л 8.0 ± 3,2 8,5 ± 2,5 р>0,05

СОЭ, мм/час 8,03 ± 8,0 11,4 ± 9,0 р=0,03

Уровень эозинофилов в периферической крови (%) 7,04 + 0,6 3,82±0,31 р=0,03

Концентрация кортизола в плазме крови (нмоль/л) 318,6±210,8 223,3±158,99 р=0,09

Концентрация иммуноглобулина Е общего (Ш/ш1) 268,1±210,94 108,92+134,8 р=0,001

Исследование мокроты:

Уровень эозинофилов (%) 20.82±12,07 17,08+8,46 р>0,05

Уровень нейтрофилов (%) 41,25±15,76 46,76+14,83 р>0,05

Уровень лимфоцитов (%) 11,36±3,87 8,6+2,95 р=0,001

Уровень моноцитов (%) 3,91±3,17 2,72+3,15 р>0,05

Уровень макрофагов (%) 22,67+13,97 24,83+13,14 р>0,05

Исследование ФВД:

ОФВ| % должного 82,42+25,47 68,95+22,47 р=0,001

ОФВ, % должного после бронхолитика 94.39+23,5 82.16+20,97 р=0,001

Индекс Тиффно после бронхолитика (ОФВ|/ФЖЕЛ) 73,62+26,6 63,84+12,74 р=0,008

МОС50 % должного 49,23+28,6 34,91+23,47 р=0,001

МОС50 % должного после бронхолитика 66,53+38,16 47,53+27,65 р=0,001

МОС75 % должного 40,01+30,17 23,17+17,2 р=0,0001

ЖЕЛ % должного 104,26+18,36 95,76+21,17 р=0,014

Примечание:

* - для выборок, подчиняющихся нормальному распределению, указаны среднее и стандартное отклонение (М±а) (параметрическая статистика);

** - уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения двух несвязанных выборок использован параметрический t-критерий Стьюдента для независимых выборок).

Таблица 2

Сравнительная характеристика анамнестических данных у больных обследованных групп

Признак АБА* НАБА* Достоверность различий **

Наличие отягощенного аллергологического анамнеза 0.98 0,89 р=0,026

Наличие бытовой сенсибилизации 0,93 0.73 р=0,002

Наличие пыльцевой сенсибилизации 0,53 0.42 р>0.05

Наличие эпидермальной сенсибилизации 0.61 0,34 р=0,005

Наличие пищевой сенсибилизации 0.38 0.32 р>0,05

Наличие лекарственной непереносимости 0.25 0,44 р=0,049

Наличие наследственной предрасположенности по аллергическим заболеваниям 0,41 0,18 р=0,021

Наличие наследственной предрасположенности по БА 0,47 0,27 р=0,06

Курение 0,35 0,72 р>0,05

Курение, длительность 14,2±11,0 19,2+12.0 р>0,05

Профессиональные вредности, частота 0,3 0,44 р>0,05

Сопутствующий аллергический ринит 0,76 0,42 р=0,0001

Сопутствующий атопический дерматит 0,06 0,03 р>0,05

Сопутствующая крапивница 0,02 0,04 р>0,05

Сопутствующий вазомоторный ринит 0,06 0,11 р>0,05

Наличие другой сопутствующей патологии: 0,69 0,91 р=0,002

Хронический бронхит 0,33 0,42 р>0,05

Кардиологическая патология 0,34 0,74 р=0,0001

Гастроэнтерологическая патология . 0,32 0,65 р=0,0001

Нефрологическая патология . 0,14 0,26 р=0,087

Сахарный диабет 0,046 0,10 р>0,05

Патология щитовидной железы 0,09 0,23 р=0,035

Примечание:

* - для выборок, подчиняющихся нормальному распределению, указаны среднее и стандартное отклонение (М±о) (параметрическая статистика); для качественных признаков указаны число и доля больных в группе;

** - при проведении статистического анализа использован критерий для качественных признаков;

*** - уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения двух несвязанных выборок использован параметрический t-критерий Стьюдента для независимых выборок).

Анализ исследования функции внешнего дыхания (табл. 1) выявил достоверно более низкие показатели ОФВь МОС50, МОС75, Индекс Тиффно после бронхолитика и ЖЕЛ у больных НАБА, с увеличением удельного веса значительных и резких обструктивных изменений по

сравнению с больными АБА. Изменения ОФВ| и МОС50 после ингаляции беротека были менее выражены у больных НАБА.

Основные показатели крови больных БА представлены в таблице 1. Для больных АБА были характерны достоверно более высокие средние значения уровня эозинофилов крови. При анализе СОЭ выявлено, что данный показатель значимо выше у больных НАБА.

Сравнительная характеристика анамнестических данных представлена в таблице 2. Отягощенная наследственность и отягощенный аллергологический анамнез по БА и другим аллергическим заболеваниям более часто встречались у больных АБА по сравнению НАБА.

Кардиологическая патология (ИБС, гипертоническая болезнь, недостаточность кровообращения) существенно чаще встречалась у больных НАБА.

Сопутствующая патология желудочно-кишечного тракта, хроническая нефрологическая патология и эндокринная патология были также более характерны для больных НАБА.

Комплекс лечебных мероприятий у больных БА полностью соответствовал варианту заболевания. Больные получали медикаментозную терапию в соответствии со стандартами лечения (GINA, 2009).

У всех больных и практически здоровых лиц получали информированное согласие на проведение обследования.

Нами был разработан методологический подход к исследованию механизмов патогенеза БА, включающий в себя различные уровни клеточной сигнализации (рис. 1).

В качестве адекватной и патогенетически обоснованной модели (Клаус Дж., 1990) для исследования нами были использованы моно-нуклеары периферической крови. Не позднее чем через 40 мин после получения венозной крови проводили выделение клеток методом центрифугирования в градиенте плотности «Lymphoseparation Medium» (производство «MP Biomedicals», США), плотность 1,077 г/см3 (Boyum А., 1968). Гепаринизированную кровь разводили в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, рН=7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали 30 минут при 400 g. Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л, рН=7,2) и доводили концентрацию до 2х10б клеток/мл. Жизнеспособность клеток, которую определяли по связыванию три-панового синего, составляла 95-100%.

Внеклеточный

Рецелторный

Транскрипцион. факторов

(STA.T6 KySTAT«! ( STAT4 } (вАТАз) «-——» (jr-betJ)

yi*) (-)%

SO( S3 (soesi) Регуляторный |

Цитоплазма

Рис. 1. Методологическая схема исследования по уровням.

Активация ЛЛК-8ТАТ сигнального пути после стимуляции интерлейкином приводит к фосфорилированию вТАТ-белка, с образованием вТАТ-димеров и транслокацией их в ядро для регуляции транскрипции.

Активацию мононуклеаров проводили добавлением 10 ng/ml 1L-4 (Sigma Aldrich, США) в ССЬ-инкубаторе в течение 60 мин. После окончания инкубации мононуклеары помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4°С. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS).

Исследование экспрессии мРНК методом RT-PCR: IL-4Ra, транскрипционных факторов STAT6, STAT4, GATA-3, негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3, IFN-y в мононуклеарах периферической крови больных БА выполнено на базе лаборатории Научно-Методического Центра по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И.П. Павлова, при непосредственном методическом содействии заместителя директора по научной работе НИИ микробиологии им. J1. Пастера, профессора, доктора медицинских наук Тотоляна Арега Артемовича и старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук Сысоева Кирилла Александровича.

Исследование экспрессии белков методом иммуноблоттинга: транскрипционных факторов STAT6, STAT4, GATA-3, T-bet, негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3 в мононуклеарах периферической крови больных бронхиальной астмой проводилось на базе отдела «Внутриклеточной сигнализации и транспорта» Научно-исследовательского института Цитологии РАН, при непосред-

ственном методическом содействии руководителя отдела, академика РАН, профессора, доктора биологических наук Никольского Николая Николаевича и старшего научного сотрудника, кандидата химических наук Буровой Елены Борисовны.

Тотальный лизат получали добавлением в пробирки 0,1 мл лизи-рующего буфера (Lysis-buffer), содержащего коктейль из ингибиторов протеаз. Клетки инкубировали в течение 10 мин при +4 С. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при 10000g. К супернатанту добавляли 1/4 часть буфера для электрофоретических проб и инкубировали в течение 5 мин при +100 С. Концентрацию белка определяли по методу Bradford М.М. (Bradford М.М., 1976), используя овальбумин для построения калибровочной кривой. Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле в присутствии SDS в модификации Laemmli U.K. (Laemmli U.K., 1970). Концентрирующий гель содержал 4% полиак-риламида, разделяющий - 8% и 10% (10% - для определения SOCS-белков). Разделение белков проводили в блоках геля 90x60x1 мм при силе тока 30 мА на пластину в течение 2 ч. Разделённые в полиакри-ламидном геле белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция).

Электроперенос проводили при силе тока 0,8 мА на 1 см2 геля в течение 1 ч в буфере для полусухого переноса. Для визуализации белковых полос использовали Ponceau S.

Антитела. Окрашивание антителами проводили в соответствии со стандартными протоколами Bio-Rad Laboratories с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена вторичных антител и реакции усиленной хемилюминесценции. Для специфического выявления белков использовали поликлональные анти-БТАТб антитела в разведении 1:1000 (Cell Signaling Technology, США), поликлональные анти-STAT4 антитела в разведении 1:1000 (Abeam, Великобритания), поликлональные анти-T-bet антитела в разведении 1:500 (Santa Cruz Biotechnology, UK), поликлональные кроличьи антитела против GATA-3 в разведении 1:500 (Abeam, Великобритания), поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированного по тирозину STAT6 в разведении 1:1000 (Tyr641) (Cell Signaling Technology, США). Для специфического выявления негативных регуляторов транскрипции генов использовали моноклональные aHTH-SOCS3 антитела (Santa Cruz Biotechnology, UK) и поликлональные анти-SOCSl антитела (Santa Cruz Biotechnology, UK).

В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пе-роксидазой хрена в разведении 1:10000 (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США); козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1-.10000 (GAM-HRP, Sigma Aldrich, США). Уровень белка определяли по уровню ß-актина с использованием соответствующих монокло-нальных антител в разведении 1:20000 (Sigma Aldrich, США).

Определение уровня концентрации pSTAT6 (в лизатах мононук-леаров) цитокинов (в плазме крови) проводилось по стандартному протоколу Bio-Plex на иммуноанализаторе (проточном флюориметре) Bio-Rad-Plex (Bio-Rad, США) с применением технологии хМАР (селективное связывание определяемых цитокинов и сорбированных на поверхности микрочастиц антител) с использованием следующих наборов: набор для определения белка phosphoSTATó (Туг641) (тип Bio-Plex Phosphoprotein Assays), 96 well; Bio-Plex Phospho Reagent Kit, 96 well; Bio-Plex Cell Lysis Kit, 96 well; Bio-Plex Human Serum Diluent Kit, 96 well; Bio-Plex Cytokine Reagent Kit, 96 well; Bio-Plex Human Cytokine Thl/Th2 Panel Kit, 96 well.

Определение полиморфизма rs324011 гена белка STAT6 выполнено на базе отдела молекулярно-генетических технологий НИЦ Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени акад. И.П.Павлова (зав. отделом, д.м.н., член-корреспондент РАН М.В.Дубина) при непосредственном методическом содействии младшего научного сотрудника отдела, кандидата медицинских наук Ян-чиной Елены Дмитриевны.

Для идентификации полиморфного варианта rs324011 гена была использована методика полимеразной цепной реакции с ДНК, выделенной из клеток периферической крови, последующей рестрикцией, и анализом количества и длины получившихся отрезков ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Праймеры для фрагмента 2 интрона гена STAT6 были разработаны на основе известной последовательности 12 хромосомы АС018673 (GenBank). Продукт амплификации размером 216 нуклеотидов обрабатывался эндонуклеазой Ava II (Eco47I, Fermentas).

Для анализа результатов исследований была разработана специальная база данных на основе программы SPSS для Windows (Statistical Package for the Social Science for Windows) (русифицированная версия 13.0).

Статистическую обработку результатов исследований (определение числовых характеристик выборок, оценку значимости различия оцениваемых параметров методами параметрической и непараметрической статистики, корреляционный анализ) проводили в соответствии с рекомендациями по обработке результатов медико-биологических исследований (Гланц М., Стентон А., 1992). Заключение о статистической значимости давалось при уровне вероятности ошибочного заключения не менее 0,05. Вся математическая обработка проводилась на ПЭВМ - Pentium.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По современным представлениям о патогенезе БА, ведущая роль отводится изменению функций мембранно-рецепторного аппарата клетки и сигнальных систем, которые рассматриваются как центральный дефект не только иммунного, но и эффекторного звеньев аллергических реакций (Минеев В.Н., 2005; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006).

Предполагается, что при БА наблюдается сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа, с активацией IL-4 пути сигнализации. Взаимодействие IL-4 и/или IL-13 с рецептором приводит к активации соответствующих Янус-киназ JAK1 и JAK3, которые фосфорилируют STAT6-мономер (неактивный белок), превращая его в pSTATö-димер (активный белок), с последующей транслокацией его в ядро, для участия в транскрипции. В контексте вышеизложенного, наиболее важным нам представлялось изучение особенностей экспрессии одного из ключевых в патогенезе БА компонентов JAK-STAT-сигнализации - транскрипционного фактора STAT6 и нарушения основных механизмов его регуляции при этом заболевании.

Обсуждая роль STAT6 в патогенезе БА, следует отметить, что активация этого транскрипционного фактора оказывается, по нашему мнению (Минеев В.Н., Сорокина J1.H., 2007) и мнению ряда авторов (Kaplan М.Н., Schindler U., Smiley S.T. et al„ 1996; Rawlings J.S., Rosier K.M., Harrison D.A., 2004; Caramori G., Lim S., Ito K.et al., 2001; O'Shea J. J., Park H., Pesu M. et al., 2005; Kharmate G., Liu Z., Patterson E. et al., 2007; Murray P.J., 2007; Barnes P.J., 2008), ключевым звеном в IL-4 сигнальном каскаде.

Так, ранее (Минеев В.Н., Сорокина J1.H., 2007) было обнаружено повышение экспрессии STAT6, а также повышенный уровень актив-

ной (фосфорилированной) формы его (pSTAT6) в мононуклеарах периферической крови больных АБА (изобретение «Способ дифференциальной диагностики БА»; авторы: Минеев В.Н., Сорокина J1.H., Трофимов В.И.; решение о выдаче патента на изобретение от 12.02.2010 по заявке № 2008151226/15).

Нами выявлено повышение уровня экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови (при АБА 0,83±0,66; п=52; при НАБА 0,72±0,4; п=44 и в группе практически здоровых лиц 0,17±0,16; п=20; р=0,0001; критерий Геймса-Хоуэлла), а также значительное увеличение разработанного нами интегрального коэффициента STAT6/STAT4 у больных БА по сравнению с группой практически здоровых лиц (при АБА 1,7 (1,17; 8,2); при НАБА 1,01 (0,75; 1,8) и в группе практически здоровых лиц 0,11 (0,08; 0,33); р=0,0001; U-критерий Манна-Уитни).

Выявленный факт не удивителен, поскольку STAT6 является одним из основных компонентов в ТЬ2-дифференцировке Т-лимфоцитов, создавая, тем самым, предпосылки для развития Th2-сдвига при БА (Elias J.A., Chun Geun Lee, Tao Zheng et al., 2003; Barnes J.P., 2008). При этом в фазе ремиссии заболевания отмечается снижение уровня экспрессии STAT6 как у больных АБА (в фазе обострения 0,79±0,38; в фазе ремиссии 0,55±0,17; р=0,015; t-критерий парных выборок Стьюдента), так и у больных НАБА (в фазе обострения 0,67±0,4; в фазе ремиссии 0,38±0,22; р=0,044; t-критерий парных выборок Стьюдента).

Исходя из выше изложенного, можно заключить, что АБА отличается наиболее высокими уровнями экспрессии STAT6 и интегрального коэффициента STAT6/STAT4. В этой связи интересны данные литературы, констатирующие наибольшую активность IL-4-сигнализации в бронхах именно при данном варианте заболевания (Christodoulopoulos P., Cameron L., Nakamura Y. et al., 2001).

В частности, при иммуногистохимическом исследовании ткани бронхов больных БА (Christodoulopoulos P., Cameron L., Nakamura Y. et al., 2001) определялось более высокое содержание клеток, экспрес-сирующих STAT6, у больных АБА в сравнении с НАБА. В этой связи представляется интересным наличие и направленность выявленных нами корреляционных связей между уровнями экспрессии транскрипционного фактора STAT6 и процентным содержанием эозинофилов в мокроте: у больных АБА указанная корреляционная связь является положительной (г (Спирмен) = 0,4; р=0,03; п=29), в то время как у

больных НАБА она становится отрицательной (г (Спирмен) = 0,41; р=0,029; п=29).

В условиях активации мононуклеаров периферической крови IL-4 существенное снижение уровня экспрессии STAT6 отмечается только у больных АБА (0,66±0,58; р=0,002; t-критерий парных выборок Стьюдента), что может свидетельствовать о более активном расходовании неактивной формы этого транскрипционного фактора на формирование STATö-димеров в процессе активации сигнального пути у больных этой группы. В то же время у больных АБА нами выявлена наиболее высокая способность STAT6 к активации IL-4 (при АБА уровень pSTATö: исходный 0,25±0,2; в условиях активации 1L-4 -1,71±1,18; п=52; р<0,05; t-критерий парных выборок Стьюдента; при НАБА уровень pSTAT6: исходный 0,23±0,2; в условиях активации IL-4 - 0,82±0,4; п=44; р<0,05; t-критерий парных выборок Стьюдента).

Нами также выполнено определение концентрации pSTAT6 на иммуноанализаторе Bio-Plex (Bio-Rad, США) по методу проточной флюориметрии. В условиях активации IL-4 отмечалось значительное нарастание фосфорилированной формы (активной) транскрипционного фактора STAT6 во всех обследованных группах, которое было существенно выше у больных АБА в сравнении с НАБА (р=0,001). Представляют интерес выявленные нами положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови (по методу иммуноб-лоттинга) и концентрацией pSTAT6 (по методу проточной флюориметрии) исходно (г (Пирсон) =0,5; р=0,05; п=16) и в условиях активации IL-4 (г (Пирсон) =0,65; р=0,006; n= 16).

Необходимо подчеркнуть, что максимальная активация данного сигнального пути в мононуклеарах периферической крови наблюдается у больных АБА, что согласуется с данными литературы (Walker С., Bauer W., В raun R.K. et al., 1994; Mullings R.E., Wilson S.J., Puddicombe S.M. et al., 2001; Diel F., Borck H., Horr В., 2004).

Следует обратить внимание, что повышенную способность к активации IL-4 мононуклеары периферической крови больных АБА сохраняют как в фазе обострения, так и в фазе ремиссии заболевания, что может указывать на повышенную Т)12-активность при АБА.

У больных НАБА уровень экспрессии STAT6 имеет зависимость от тяжести течения заболевания (р<0,05; критерий Тьюки), что согласуется с данными литературы о повышении уровня экспрессии STAT6 в бронхиальном эпителии у больных тяжелой БА, которые получали

ингаляционные и пероральные глюкокортикостероиды (Mullings, R.E., Wilson S.J., Puddicombe S.M et al., 2001). Отметим, что у больных АБА подобной зависимости не выявлено (р>0,05; критерий Геймса-Хоуэлла), что, вероятно, может косвенно свидетельствовать о генетически детерминированном повышении экспрессии данного транскрипционного фактора в рамках концепции существования биологических дефектов при аллергической патологии.

При этом обращают на себя внимание выявленные нами отрицательные корреляционные связи между уровнем экспрессии STAT6 в мононуклеарах периферической крови и OOBi (г (Пирсон) = -0,32; п=97; р=0,001) и индексом Тиффно (г (Пирсон) = -0,28; п=97; р=0,006) (Kuperman D., Schofield В., Wills-Karp М. et al., 1998), а также, положительная между уровнем экспрессии STAT6 и суточной дозой парентеральных глюкокортикостероидов ' (г (Кендалл) =0,2; п=92; р=0,011). Вполне закономерно наличие отрицательной корреляционной связи, характеризующей тяжесть течения БА, между ОФВ1 и суточной дозой вводимых парентеральных глюкокортикостероидов (г (Пирсон) =-0,26; р=0,004; п=119) и между индексом Тиффно и суточной дозой вводимых парентеральных глюкокортикостероидов (г (Пирсон) = -0,26; р=0,004; п=119), что указывает на увеличение потребности в системных глюкокортикостероидах при утяжелении заболевания и нарастании бронхиальной обструкции.

Таким образом, можно предположить, что полученные нами изменения экспрессии STAT6 связаны с клинико-патогенетическими особенностями БА и, вероятно, отражают концепции генетической детерминированности биологических дефектов, а также, гетерогенности и комплексности нарушений регуляции сигнальных систем при этом заболевании.

Анализ еще одного транскрипционного фактора, участвующего в развитии ТИ2-фенотипа, - GATA-3 - показал, что для больных АБА (0,37 (0,14; 0,73)) характерно повышение экспрессии данного транскрипционного фактора в мононуклеарах периферической крови, вне зависимости от фазы заболевания, по сравнению с его уровнем у практически здоровых лиц (0,2 (0,06; 0,44); р=0,038; U-критерий Ман-на-Уитни) и больных НАБА (0,21 (0,04; 0,39); р=0,004; U-критерий Манна-Уитни). Это согласуется с данными литературы о нарастании экспрессии GATA-3 при аллергической патологии (Arakawa S., Hatano Y., Katagiri К., 2004; Taha R., Hamid Q., Cameron L. et al., 2005).

Установлено, что GATA-3 может индуцировать развитие Th2-лимфоцитов в отсутствие STAT6. Данный факт может свидетельствовать о существовании параллельных (запасных) сигнальных путей, в свете понятия саногенеза (Кокосов А.Н., 2009), поскольку в условиях нарушения функционирования одного пути, реализация того или иного биологического эффекта или процесса может происходить за счет дублирующей сигнализации (Barnes P.J., 2008; Caramon G., Groneberg D„ Ito K., Casolari P. et al„ 2008).

Следует заметить, что уровень экспрессии GATA-3 при АБА имеет зависимость от тяжести течения заболевания, достигая максимальных значений при тяжелом течении БА (0,8±0,5) (в сравнении: экспрессия GATA-3 при легком течении АБА: 0,33±0,28; р=0,016; критерий Тью-ки), что может играть патогенетическую роль в утяжелении заболевания.

При этом, для больных АБА, получающих пероральную терапию глюкокортикостероидами, характерно значимое нарастание экспрессии GATA-3 (0,87±0,6), по сравнению с больными, вообще не получавшими данной терапии (0,32±0,26; р=0,048; критерий Тьюки).

В этой связи представляется важным наличие существенной положительной корреляционной связи между уровнем экспрессии GATA-3 и тяжестью течения заболевания у больных АБА (г (Спир-мен) =0,36; р=0,018; n=42), а также, выявленной нами значимой отрицательной корреляционной связи между уровнем экспрессии GATA-3 и ОФВ] (г (Пирсон) = -0,33; р=0,035; п=42) и индексом Тиффно (г (Пирсон) = -0,34; р=0,029; п=41), что позволяет предполагать значение данного транскрипционного фактора в нарастании тяжести течения АБА.

Итак, выявленное повышение экспрессии GATA-3 в мононуклеа-рах периферической крови может являться важным фактором в патогенезе БА и, по-видимому, маркерным показателем атопии у больных АБА, а также, в определении механизмов утяжеления данного заболевания.

Обсуждая механизмы формирования нарушений Th2-сигнализации в рамках патогенеза БА, важно рассмотреть вопрос об изменениях, одновременно происходящих в альтернативной системе (рис. 2) Thl-сигнализации, одним из ключевых компонентов которой является транскрипционный фактор STAT4, поскольку установлено, что в отношении Thl и Th2 дифференцировки существует перекрестная регуляция (Kaplan М.Н., Sun Y.L., Hoey T., Grusby M.J., 1996; Kap-

lan M.H., Schindler U., Smiley S.T., Grusby M.J., 1996), которая заключается во взаимном угнетении ее компонентов при активации альтернативного пути дифференцировки (Wurster A.L., Tanaka Т., Grusby M.J., 2000). Известно также, что STAT4 может напрямую вызывать трансактивацию цитокина lFN-y (Xu X., Sun Y.L. Hoey Т., 1996).

Рис. 2. Схема механизмов альтернативной регуляции баланса ТЫ/ТЬ2-клеток.

Нами выявлено выраженное (в 2,4 раза) снижение уровня экспрессии STAT4 (р=0,008; критерий Тьюки) и снижение (в 1,9 раза) экспрессии мРНК IFN-y (р=0,008; критерий Тьюки) у больных АБА по сравнению с группой практически здоровых лиц, что может указывать на нарушение механизмов сигнализации в альтернативном IL-12-сигнальном пути.

В то же время повышение уровня экспрессии STAT4 в мононук-леарах больных БА, получающих терапию глюкокортикостероидами, i наиболее выраженное в группе больных с парентеральной (0,57±0,43) и пероральной терапией глюкокортикостероидами (0,61±0,6) по сравнению с группой больных БА, вообще не получающих терапию глюкокортикостероидами (0,28±0,2; р<0,05; критерий Геймса-Хоуэлла), следует рассматривать, на наш взгляд, как положительный фактор ! восстановления регуляторной роли альтернативного IL-12- ! сигнального пути. I

В этой связи интересны данные литературы, свидетельствующие о снижении продукции ТЬ2-цитокинов и уменьшении гиперреактивности бронхов в результате активации 8ТАТ4-сигнализации (Raman К., Kaplan М.Н., Hogaboam С.М. et al„ 2003; Matsubara Sh„ Takeda K., Ko-dama T. et al., 2006). Примечательно, что уровень экспрессии мРНК

IFN-y у больных БА, получающих терапию системными глюкокорти-костероидами, также существенно выше, чем у больных, не получающих указанную терапию.

Проведенные ранее исследования показали, что введение экзогенного IFN-y приводило к уменьшению эозинофилии в дыхательных путях и к уменьшению гиперреактивности бронхов в ответ на провокацию аллергеном (Iwamoto I., Nakajima H., Endo H., Yoshida S., 1993). При этом следует добавить, что специфическая иммунотерапия (Durham S.R., Till S.J., 1998), а также, терапия глюкокортикостероидами (Bentley A.M., Hamid Q., Robinson D.S., 1996) приводят к повышению продукции IFN-y циркулирующими Т-лимфоцитами.

В результате анализа уровней цитокинов в плазме крови выявлены существенные различия в их концентрациях (пг/мл): у больных АБА преобладают Т112-цитокины, а у больных НАБА - Thl-цитокины.

Важным аспектом является также факт подавления транскрипционных факторов STAT4 и T-bet на фоне избыточной экспрессии GATA-3 (Hwang, E.S., S.J. Szabo, P.L. Schwartzberg, L.H. Glimcher, 2005; Barnes P.J., 2008). При этом положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии STAT4 в мононуклеарах периферической крови и сопутствующей кардиальной (г (Спирмен) =0,37; р=0,001 ; п—75) и гастроэнтерологической (г (Спирмен) —0,41; р=0,0001; п=75) патологией позволяют косвенно свидетельствовать об участии его в патогенезе этих заболеваний. Так, установлена повышенная экспрессия STAT4 при ишемической болезни сердца (Methe H., Brunner S., Wiegand D. et al., 2005) и при патологии желудочно-кишечного тракта (Pang Y.H., Zheng C.Q., Yang X.Z., Zhang W.J., 2007; Martinez A., Varade J., Marquez A., 2008). И, напротив, отрицательная корреляционная связь между уровнем экспрессии STAT4 и наличием аллергического ринита (г (Спирмен) = -0,23; р=0,049; п=75) заставляет предполагать преимущественное вовлечение в процесс аллергического воспаления Т112-сигнального пути.

Таким образом, полученные нами данные, описывающие снижение у больных АБА как уровня экспрессии белка STAT4, так и уровня экспрессии мРНК IFN-y, который может являться результатом активации STAT4, существенными и указывают на нарушение всего IL-12-сигнального пути.

Продолжая рассмотрение изменений в альтернативной системе Thl-сигнализации при БА, необходимо обсудить роль транскрипционного фактора T-bet и его место в патогенезе БА. Данный транскрип-

ционный фактор может смещать баланс между Т-хелперами 1-го и 2-го типов в сторону превалирования Th2, обусловливая патогенетические предпосылки для развития уже в детском возрасте таких аллергических заболеваний, как БА.

При АБА вне зависимости от фазы заболевания в мононуклеарах периферической крови нами выявлено выраженное снижение (в 7,2 раза) уровня экспрессии T-bet (р=0,002; критерий Тьюки) по сравнению с группой практически здоровых лиц. У больных НАБА существенных различий экспрессии T-bet (0,8±0,56) по сравнению с группой практически здоровых лиц (0,69±0,53; р>0,05; критерий Тьюки) не выявлено.

Следует отметить, что в легких больных БА снижено количество CD4+ клеток, экспрессирующих данный ген (ТВХ21) по сравнению с практически здоровыми лицами (Szabo S.J., Kim S.T., Costa G.L. et al., 2000; Finotto S., Neurath M.F., Glickman J.N. et al., 2002).

Представляются также интересными данные литературы, свидетельствующие о снижении экспрессии этого транскрипционного фактора у больных БА (Ко F.W.S., Lun S.W.M., Wong C.K. et al., 2007) в клетках периферической крови. Анализируя роль T-bet в сигнальном каскаде в патогенезе БА, важно обратить внимание, что оценка его вклада в патогенез заболевания не может быть полноценной без выявления взаимосвязей с другими компонентами клеточной сигнализации.

При обсуждении роли транскрипционного фактора T-bet в патогенезе БА, необходимо рассмотреть вопрос взаимодействия его с другим ключевым фактором Thl/Th2 дифференцировки - GATA-3, играющим, по современным представлениям, решающее значение в формировании аллергической патологии.

Несмотря на все возрастающее количество публикаций, касающихся GATA-3/T-bet взаимодействия и взаимовлияния, до сих пор остается не вполне ясным, какой из этих транскрипционных факторов оказывает определяющее действие на клеточную дифференцировку. Согласно одной из последних гипотез (Hwang, E.S., S.J. Szabo, P.L. Schwartzberg, L.H. Glimcher, 2005), T-bet может влиять как на функционирование, так и на уровень экспрессии GATA-3, являясь реци-прокным регулятором активности указанного транскрипционного фактора. Механизм этого влияния заключается, по мнению Hwang, E.S., S.J. Szabo, P.L. Schwartzberg, L.H. Glimcher, 2005, в фосфорили-ровании T-bet с помощью Тес-киназы в процессе ранней Thl-

дифференцировки. Активированный таким образом T-bet физиологически взаимодействует с GATA-3, препятствуя связыванию последнего с промотором гена IL-5. Ранее также было показано, что T-bet может нарушать транскрипцию гена GATA-3 и экспрессию белка (при анализе Western blot).

У больных АБА нами выявлено выраженное увеличение (в 2,7 раза; р=0,009; U-критерий Манна-Уитни) коэффициента GATA-3/T-bet в мононуклеарах периферической крови по сравнению с группой практически здоровых лиц. При этом у больных НАБА существенных различий данного коэффициента по сравнению с контрольной группой не выявлено (р>0,05; U-критерий Манна-Уитни). Данный феномен свидетельствует о комплексном нарушении регуляторного Thl/Th2 баланса у больных АБА в рамках существования биологических дефектов при атопии и заключается в сдвиге баланса в сторону ТЬ2-иммунного ответа за счет нарушения реципрокного контроля со стороны ключевого транскрипционного фактора Thl-клеток T-bet и дефектности механизмов негативной регуляции.

Учитывая важную регуляторную роль терапевтического эффекта глюкокортикостероидов в лечении БА, нельзя не затронуть вопрос об их влиянии на экспрессию T-bet. In vitro было показано, что дексаме-тазон может тормозить индукцию данного транскрипционного фактора (Tantisira K.G., Hwang E.S., Raby В.А., 2004). При АБА при увеличении тяжести течения заболевания отмечается уменьшение экспрессии T-bet (р<0,05; U-критерий Манна-Уитни). Для больных, получающих системную терапию глюкокортикостероидами, характерно снижение уровня его экспрессии, максимально выраженное в группе больных с пероральной терапией глюкокортикостероидами (р<0,05; U-критерий Манна-Уитни). Установлено, глюкокортикостероиды ин-гибируют транскрипционную активность T-bet, воздействуя на его промотор.

Они также могут супрессировать его на уровне мРНК и на уровне экспрессии белка. Кроме того, глюкокортикоидный рецептор (GRa) физиологически взаимодействует с T-bet, блокируя GR-зависимую транскрипцию, приводя, в итоге, к прекращению связывания T-bet с ДНК. И, наконец, в результате взаимодействия GR/T-bet происходит ингибирование транскрипционной активности T-bet на промотор IFN-у. Все эти выше перечисленные механизмы обусловливают иммуно-супрессивные свойства глюкокортикостероидов (Blaser К., 2008).

При исследовании больных БА с парадоксальной экспрессией транскрипционного фактора Т-Ье1 (повышением экспрессии) в моно-нуклеарах периферической крови (уровень экспрессии Т-Ье1>1,0) нами выявлен симптоматокомплекс (табл. 3), или «синдром повышения Т-ЬеЬ>.

Таблица 3

Основные характеристики группы больных с феноменом повышения уровня экспрессии транскрипционного фактора Т-Ье1

Показатель Значение * Достоверность различии **

Число больных Доля больных

Наличие терапии системными глюко-кортикоидами да 9 0,9 р=0,011

нет 1 0,1

Тяжесть течения БА сред. 3 0,3 р>0,05

тяж. 7 0,7

Наследственность отягощена по аллергическим заболеваниям да 1 0,1 р=0,011

нет 9 0,9

Наличие сопутствующей патологии да 10 1,0 #**

нет 0 0

Наличие кардиологической патологии да 7 0,7 р>0,05

нет 3 0,3

Наличие гастроэнтерологической патологии да 10 1,0 ***

нет 0 0

Наличие эндокринной патологии да 5 0,5 р>0,05

нет 5 0,5

Наличие избыточной массы тела да 9 0,9 р=0,011

нет 1 0,1

Наличие терапии на догоспитальном этапе да 10 1,0 ***

нет 0 0

Наличие терапии р2-агонистами на догоспитальном этапе да 9 0.9 р=0,011

нет 1 0,1

Возраст больных БА (лет) >41 10 1,0 ***

<41 0 0

Примечание:

* - для качественных признаков указаны число и доля больных в группе; ** - при проведении статистического анализа использован критерий у} для качественных признаков;

*** - переменная постоянна, критерий х2 не может быть выполнен (признак встречается в 100% случаев).

Данный симптоматокомплекс характеризуется преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикостероидов и р2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии,

среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта, в основе которого лежит феномен «генетически детерминированной гетерогенности дефектов сигнальных систем».

Этот феномен (уровень экспрессии Т-Ье1 >1,0) явился основой для более детального изучения представителей этой группы. Важно отметить, что при исследовании полиморфизма ге324011 гена белка БТАТб у них выявлены генотипы СС и СТ, характерные для фенотипов с преимущественно тяжелым течением БА. Причем у больных с тяжелым течением БА они наблюдались в 100% случаев. В этой связи представляют интерес данные проведенного нами корреляционного анализа (табл. 4).

Таблица 4

Результаты корреляционного анализа между количеством аллеля С в локусах II клннико-лабораторными показателями у больных БА

Показатель п= Коэффициент корреляции Знак связи Достоверность связи

Тяжесть течения БА 9 0.88** + р=0.002

Распределение по генотипу (СС/СТ/ТТ) 9 1,0 - р=0,0001

Наличие терапии пероральными глюко-кортикоидами (да/нет) 9 0,741** + р=0,022

Суточная доза ингаляционного глюко-кортикоида 8 0,71* + р=0,05

Абсолютное количество моноцитов (л-1) в мокроте 7 0,81 - р=0,028

Примечание:

* - при проведении статистического анализа использован коэффициент корреляции Пирсона для количественных признаков;

** - коэффициент корреляции Спирмена-для качественных признаков.

Отметим, что выявление указанного выше феномена крайне важно, поскольку выраженное повышение уровня экспрессии Т-Ье1 обнаружено нами и у ряда больных молодого и среднего возраста, имеющих в настоящее время легкое течение БА. Еще более существенным является тот факт, что в этой группе (обозначим ее как «латентный синдром повышения Т-ЬеЪ>) отмечается с высокой частотой встречаемость аллеля С (доля лиц с аллелем С=81,3; п=16; р=0,012). В этой связи, представляется актуальным наблюдение таких лиц в динамике в связи с прогнозированием вероятности развития у них в будущем проявлений выявленного нами синдрома.

Функцноннрование JAK-STAT сигнальной системы невозможно без существования механизмов негативной регуляции. Одной из наиболее изучаемых в настоящее время систем негативной регуляции является семейство SOCS-белков (supressors of cytokine signaling), которое насчитывает 8 представителей. При БА ведущее место занимают два представителя этого семейства - негативные регуляторы транскрипции генов, - белки SOCS1 и SOCS3.

SOCS1 может активироваться различными цитокинами и сигнальными молекулами и ингибировать различные сигнальные системы (кроме JAK-STAT), являясь регулятором cross-talk взаимодействий. Установлено, что SOCS1 с помощью IFN-y ингибирует 1L-4, предотвращая одновременную активацию двух альтернативных сигнальных путей IL-4 и IFN-y (Naka Т., Tsutsui Н., Fujimoto М., 2001; Fujimoto М., Naka Т., 2003). Повышенная экспрессия SOCS1 может приводить к угнетению IL-13-индуцированного иммунного ответа в дыхательных путях по механизму отрицательной обратной связи (Matsumoto К., Aizawa Н., Nakanishi Y. et al., 2009). Было также показано, что повышенная экспрессия SOCS1 у В-клеточной линии мышей при действии IL-4 приводила к снижению фосфорилирования JAK1, угнетению фосфорилирования STAT6 и снижению экспрессии CD23 (Losman J.A., Chen Х.Р., Hilton D. et al., 1999).

С другой стороны, IL-4 и IL-13, активируя STAT6, могут одновременно индуцировать белки-регуляторы SOCS1 и SOCS3, приводя к угнетению IFN-y- и TNF-a-сигнальных путей (Albanesi С., Fairchild H.R., Madonna S. et al., 2007).

При АБА выявлено снижение уровней экспрессии негативного белка-регулятора транскрипции генов SOCS1 (в группе практически здоровых лиц (i) 0,43 (0,21; 0,74); п=14; при АБА(2) 0,08 (0,022; 0,4); п=40; Р(1Н2)=0,036 и при НАБА{3) 0,42 (0,037; 0,69); n=33; pow3)>0,05; Р(2)-(3)=0,024, U-критерий Манна-Уитни) и мРНК SOCS1 (в группе практически здоровых лиц (1) 0,47±0,24; п=20; при АБА(2) 0,33±0,22; п=61; р(1)-(2г Р=0,048 и при НАБА(3) 0,43±0,24; n=63; p(iH3)>0,05; Р(2)-(3)= 0,041, критерий Тьюки) по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения БА. У больных НАБА существенных различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. Необходимо отметить, что снижение экспрессии SOCS1 и мРНК SOCS1 у больных АБА может указывать на дефектность в системе негативного контроля, заключающуюся, вероятно, в генетически обусловленном нарушении регуляции экспрессии

ключевого негативного регулятора транскрипции генов SOCS1 как на уровне транскрипции и трансляции, так и на уровне самого белка. Выявленный факт, по-видимому, может отражать концепцию нарушения негативной регуляции у больных АБА.

Показано, что SOCS3 является ключевым ингибитором по механизму отрицательной обратной связи различных цитокинов, преимущественно IL-6 и IL-10. Известно, что данный белок-регулятор транскрипции генов преимущественно экспрессирован в ТЬ2-лимфоцитах и ингибирует Thl-дифференцировку (Kubo М., Inoue Н., 2006).

В этой связи интересны данные литературы, свидетельствующие о нарастании экспрессии мРНК SOCS3 в моноцитах периферической крови в условиях действия небольших доз глюкокортикостероидов при невысоком уровне эндогенного кортизола. При этом высокие дозы глюкокортикостероидов приводили к ингибированию экспрессии указанного белка-регулятора (Paul С., Seiliez I., Thissen J.P. et al., 2000; Qin H., Roberts K.L., Niyongere S.A. et al., 2007; Yeager M.P., Pioli P.A., Ward well K. et al., 2008).

При АБА и НАБА нами выявлено нарастание уровней экспрессии негативного белка-регулятора транскрипции генов SOCS3 в мононук-леарах периферической крови (в группе практически здоровых лиц (1) 0,27 (0,13; 0,5); п=14;,при АБА(2, 0,44 (0,24; 0,91); п=40; р(1И2)=0,034 и при НАБА(З) 0,54 (0,35; 0,77); п=33; р(1)ч3)=0,002; р(2КЗ)>0,05, U-критерий Манна-Уитни) по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения Б А, более выраженное у больных НАБА.

При АБА и НАБА наблюдается выраженное увеличение интегрального коэффициента SOCS3/SOCS1 в мононуклеарах периферической крови (в группе практически здоровых лиц (i) 0,58 (0,41; 1,18); п=13; при АБА(2) 2,87 (0,7; 11); п=39; рак2,=0,014 и при НАБА(3) 1,29 (0,71; 34); n=27; р(1).(з)=0,038; Р(2).(3)>0,05, U-критерий Манна-Уитни) по сравнению с группой практически здоровых лиц, более выраженное у больных АБА, что отражает дефектность негативного регуля-торного контроля.

Для больных БА, получающих системные глюкокортикостероиды, характерно повышение экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 (р=0,021, критерий Геймса-Хоуэлла) и SOCS3 (р=0,016, критерий Геймса-Хоуэлла). Это согласуется с данными литературы (Chinenov Y., Rogatsky I., 2007). Так, в частности, было показано, что глюкокортикостероиды индуцируют мРНК SOCS1. При этом

точные механизмы остаются пока до конца не ясными. Тем не менее, в физиологических условиях описанный выше механизм негативных cross-talk взаимодействий между SOCS1 и GR направлен на предупреждение одновременной активации таких мощных внутриклеточных ингибиторов цитокиновой сигнализации, участвующих в противовоспалительном ответе (Rhen Т., Cidlowski J.A., 2005; Yoshimura А., Naka Т., Kubo М., 2007). Так, данные литературы свидетельствуют о нарастании экспрессии мРНК SOCS3 в моноцитах периферической крови в условиях действия небольших доз ГКС при невысоком уровне эндогенного кортизола; при этом было замечено, что высокие дозы глюкокортикостероидов приводили к ингибированию экспрессии указанного белка-регулятора (Paul С., Seiliez 1., Thissen J.P. et al., 2000; Qin H„ Roberts K.L., Niyongere S.A. et al„ 2007; Yeager M.P., Pioli P.A., Wardwell K. et al„ 2008).

Повышение экспрессии SOCS3 может рассматриваться как про-тективный ответ, направленный против выраженного воспалительного процесса. Данный факт, по мнению некоторых авторов, может послужить, основой в разработке новых терапевтических стратегий (Dae-woong J., Liu D., Yao S. Et al., 2005).

И, наконец, представляет интерес, выявленная нами положительная корреляционная связь (г (Спирмен) =0,25; р=0,019; п=86) между уровнем экспрессии белка SOCS3 и распределением по генотипу (СС/СТ/ТТ) полиморфизма rs324011 гена белка STAT6. Наличие этой связи позволяет предполагать, что для генотипа ТТ характерно повышение уровня экспрессии белка SOCS3, что, по-видимому, следует рассматривать как протективное действие данного регуляторного компонента.

В последнее время появляется всё больше новых данных об особенностях функционирования сигнальных систем на уровне рецеп-торного звена. В связи с этим нами были изучены особенности экспрессии IL-4Ra в мононуклеарах периферической крови при БА.

При сравнении уровней экспрессии мРНК IL-4Ra у больных АБА и НАБА существенных различий не обнаружено (р>0,05, U-критерий Манна-Уитни), однако уровень экспрессии мРНК IL-4Ra у больных БА существенно выше, чем у практически здоровых лиц (в группе практически здоровых лиц (i) 0,06 (0,027; 0,11); п=17; при АБА(2) 0,084 (0,05; 0,16); n=49; p(iW2)=0,045 и при НАБА(3) 0,13 (0,06; 0,4); п=52; Р(1Нз)=0,004; р(2)-(3)>0,05, U-критерий Манна-Уитни), причем наиболь-

шее повышение отмечается у больных с тяжёлым течением заболевания (р=0,002, и-критерий Манна-Уитни).

Важно, что при анализе корреляционной связи базального уровня экспрессии мРНК И-4Яа в мононуклеарах периферической крови с изменениями аналогичного показателя в условиях активации их 1Ь-4 у практически здоровых лиц и больных БА при госпитализации в фазе обострения выявлены отрицательные существенные связи: у практически здоровых лиц коэффициент корреляции (г (Спирман) = -0,964; р=0,036; п=4) у больных БА (г (Спирман) = -0,692, р=0,001, п=26). Существенным отличием указанной корреляции у больных БА в фазе затихающего обострения является обнаружение смены знака коэффициента (г (Спирман) =0,511, р=0,04, п=10). Факт разнонаправленных корреляционных связей в зависимости от фазы заболевания может свидетельствовать о влиянии той противовоспалительной терапии, которая применяется при БА, главным образом, глюкокортикостерои-дов.

Полученные данные важны с практической точки зрения, с учётом разрабатываемых новых патогенетических лечебных подходов, которые направлены на рецепторное звено сигнальных систем, реализующих эффект 1Ь-4 и 1Ь-13. Напомним, что 1Ь-4 и 1Ь-13, участвуя в развитии воспаления, взаимодействуют с одним и тем же рецептором. Для ингибирования эффектов 1Ь-4 и/или 1Ь-13 разработаны два подхода: ингаляция растворенного 1Ь-4Я (рецептор к 1Ь-4) - селективного антагониста 1Ь-4 и блокирование 1Ь-4Яа - ключевого сигнального компонента комплекса рецепторов к 1Ь-4 и 1Ь-13.

При обследовании больных БА выявлены множественные корреляции с различными скоростными показателями функции внешнего дыхания: ОФВ| в % от должного (г=-0,142; р=0,042; п=105); отношением ОФВ, в % к ФЖЕЛ (г= -0,187; р=0,005; п=103); МОС50 (г=-0,142; р=0,042; п=105); пиковой объёмной скоростью выдоха - ПОСвыд в % от должного после бронхолитика (г=-0,197; р=0,021; п=107); МОС75 в % от должного (г= -0,131; р=0,047; п=106). Обратим внимание, что все корреляции со скоростными показателями имеют отрицательный знак, что можно трактовать как косвенное указание на возможность опосредованного участия рецепторной активности к 1Ь-4 в патогенезе об-структивных нарушений при Б А.

Нами показано, что особенности экспрессии мРНК 1Ь-4Яа коррелируют с основными клиническими особенностями заболевания (тяжесть течения, показатели функции внешнего дыхания, характери-

зующие обструктивный синдром, применение глюкокортикостерои-дов), что, по-видимому, достаточно прямо указывает на возможную патогенетическую роль экспрессии этого рецептора на претрансляци-онном уровне.

Разрабатываемые на сегодняшний день потенциально возможные фармакологические агенты, способные влиять на приток Th2-лимфоцитов в очаг аллергического воспаления и их активность помогут в ближайшем будущем также понять важность этих клеток и их медиаторов во взаимодействии с другими про- и противовоспалительными клетками и медиаторами, в функционировании сигнальных сетей, определяющих различные варианты БА. Некоторые из разрабатываемых стратегий помогут не только контролировать БА и вообще аллергические заболевания, модифицировать их течение, но и, возможно, даже предупреждать развитие заболевания, точечно воздействуя на биологические дефекты (Caramory G., Groneberg D., Ito К., et al., 2008).

Несмотря на большие успехи, достигнутые в понимании механизмов негативной регуляции JAK-STAT сигнализации, остается много вопросов, требующих дальнейшего изучения этой проблемы (O'Shea J. J., Park H., Pesu M. et al., 2005). Такие исследования могли бы позволить наметить терапевтические «стратегии будущего».

ВЫВОДЫ

1. При исследовании экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови больных АБА и НАБА выявлено существенное повышение, как уровня экспрессии этого транскрипционного фактора, так и интегрального коэффициента STAT6/STAT4 по сравнению с группой практически здоровых лиц, наиболее выраженное у больных АБА, что определяет ТЬ2-сдвиг при БА. При этом у больных НАБА уровень экспрессии STAT6 зависит от тяжести течения заболевания, а у больных АБА подобной зависимости не выявлено. В фазе ремиссии заболевания отмечается снижение уровня экспрессии STAT6 как у больных АБА, так и у больных НАБА.

2. Мононуклеары периферической крови больных АБА по сравнению с НАБА отличаются наиболее высокой способностью транскрипционного фактора STAT6 к активации IL-4 с образованием фосфори-лированной формы (pSTAT6), вне зависимости от фазы и тяжести те-

чения заболевания. Данный феномен может лежать в основе повышенной ТЪ2-активности при АБА.

3. При анализе экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови было выявлено существенное повышение уровня экспрессии этого транскрипционного фактора у больных АБА, вне зависимости от фазы заболевания, по сравнению с группой практически здоровых лиц и больных НАБА. Уровень экспрессии GATA-3 при АБА имеет зависимость от тяжести течения, достигая максимальных значений при тяжелом течении, что может играть патогенетическую роль в утяжелении заболевания.

4. При исследовании экспрессии транскрипционного фактора STAT4, а также экспрессии мРНК IFN-y в мононуклеарах периферической крови в группе больных АБА выявлено снижение уровней экспрессии, как транскрипционного фактора, так и мРНК IFN-y по сравнению с группой практически здоровых лиц и больных НАБА, что может указывать на нарушение в альтернативном 1L-12 сигнальном пути у больных АБА.

5. При оценке экспрессии транскрипционного фактора T-bet в мононуклеарах периферической крови в группе больных АБА при нарастании тяжести течения заболевания и вне зависимости от его фазы выявлено снижение уровня экспрессии по сравнению с группой практически здоровых лиц и больных НАБА с выраженным увеличением интегрального коэффициента GATA-3/T-bet, что может свидетельствовать о сдвиге регуляторного Thl/Th2 баланса в сторону Th2. У больных НАБА существенных различий экспрессии T-bet по сравнению с группой практически здоровых лиц не выявлено.

6. При исследовании больных БА с парадоксальной экспрессией транскрипционного фактора T-bet (повышением экспрессии) в мононуклеарах периферической крови выявлен симптоматокомплекс («синдром повышения T-bet»), который характеризуется преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикоидов и р2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии, среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта.

7. При анализе уровня экспрессии мРНК IL-4Ra у больных БА обнаружено его повышение по сравнению с группой практически здоровых лиц, причем наибольшее повышение отмечается у больных с тяжёлым течением заболевания, без существенных различий между вариантами заболевания. Особенности экспрессии мРНК IL-4Ra корре-

лируют с основными клиническими особенностями заболевания (тяжесть течения, показатели функции внешнего дыхания, характеризующие обструктивный синдром, применение глюкокортикостерои-дов), что, по-видимому, достаточно прямо указывает на возможную патогенетическую роль экспрессии этого рецептора на претрансляци-онном уровне.

8. При АБА выявлено снижение уровня экспрессии регулятора транскрипции генов 80С81 и мРНК 80С81 по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения заболевания. У больных НАБА существенных различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. С другой стороны, при АБА и НАБА выявлено нарастание уровня экспрессии регулятора транскрипции генов 80С83 по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения БА, более выраженное у больных НАБА. Данные факты, наряду с обнаружением увеличения интегрального коэффициента 80С83/80С81, позволяют сделать вывод о дефектности негативного регуляторного контроля в системе 8ТАТ-сигнализации.

9. При БА показано модулирующее влияние глюкокортикостерои-дов в отношении 8ТАТ-сигнализации в мононуклеарах периферической крови, особенно выраженное в группе больных с пероральной глюкокортикостероидной терапией. При этом модулирующий эффект прослеживается на разных уровнях клеточной сигнализации (рецеп-торном, уровне транскрипционных факторов и их регуляторов, в частности, наблюдается повышение уровней экспрессии 8ТАТ6, 8ТАТ4, ОАТА-З, мРНК 1Ь-4Яа, 8<ЭС81, 80С83 и снижение - Т-ЬеГ).

10. Полученные данные, характеризующие 8ТАТ-сигнализацию при БА, позволяют выдвинуть концепцию множественности и гетерогенности регуляторных нарушений на различных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, на уровне транскрипционных факторов, регуляторов транскрипции генов), в основе которых лежат дефекты негативного контроля.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для проведения дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического вариантов бронхиальной астмы рекомендуется разработанный способ (патент на изобретение №2391663 МПК С0ШЗЗ/48), заключающийся в сопоставлении уровней экспрессии активной формы транскрипционного фактора 8ТАТ6.

2. Рекомендуется использовать для прогнозирования тяжелого течения бронхиальной астмы и коррекции терапии выявленный нами клинический симптоматокомплекс («синдром повышения T-bet»),

3. Выявленные изменения в STAT-сигнализации, множественные и гетерогенные, создают базис для поиска новых терапевтических мишеней в разработке лечебных «стратегий будущего».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Минеев В.Н., Нестерович И.И., Лалаева Т.М., Иванова В.В., Яблонская В.Н., Булатова Н.Ю., Лукашевская H.H., Сорокина Л.Н., Ра-бик Ю.Д., Супранович И.Ю., Болотина Н.В., Волченкова О.С. Сигнальные системы при бронхиальной астме // Ученые записки СПб государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова. -2001.-Т. VIII.-№ 1. - С. 17-21.

2. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии // Аллергология. - 2005. - № 4. - С.38-44.

3. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии: механизмы негативной регуляции // Аллергология. - 2006. - № 1. - С.49-55.

4. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Бибкова A.A. Современные положения о роли новой сигнальной системы JAK-STAT при бронхиальной астме // Ученые записки СПб государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. - 2006. - Т. XIII. - № 3. - С. 1518.

5. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Экспрессия STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных аллергической бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2007. - Т.9. -№4-5. - С.405-411.

6. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А. Роль полиморфизмов белка STAT6 в развитии бронхиальной астмы // Учёные записки СПб государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова. - 2008. - Т. 15. - №4. - С.72-73.

7. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Берестовская B.C., Нёма М.А., Петровская Н.В. Особенности содержания лептина в плазме крови при бронхиальной астме // Клиническая медицина. - 2009. - №7. - С.ЗЗ-37.

8. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Дубина М.В., Янчина Е.Д. Полиморфизм гена белка 8ТАТ6 у пациентов с бронхиальной астмой // Центрально-Азиатский медицинский журнал. - 2009. - Т.ХУ, Приложение 1.-С.21-22.

9. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А. Влияние 1Ь4 на активность транскрипционного фактора 5ТАТ6 в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. -2009. -Т.П. -№2-3. - С. 177-184.

10. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Иванов В.А., Сысоев К.А., Трофимов В.И. Экспрессия рецептора к интерлейкину 4 в лимфоцитах при бронхиальной астме П Респираторная медицина: Материалы V Конгресса Евро-Азиатского респираторного общества / -Приложение 1. - Бишкек, 2009. - С. 31 -32.

11. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А. Полиморфизм гена белка БТАТ6 и бронхиальная астма // Казанский мед.ж. - 2009. - Т.90. -№1. -С.102-109.

12. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Иванов В.А., Сысоев К.А., Трофимов В.И. Экспрессия рецептора к интерлейкину 4 при бронхиальной астме // Сборник трудов XIX Национального конгресса по болезням органов дыхания / - М.: ДизайнПресс, 2009. - С. 43-44.

13. Саногенез / Под ред. А.Н. Кокосова. - СПБ.: «ЭЛБИ-СПб». -

2009.-237с.

14. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Дубина М.В., Янчина Е.Д. Интронный полиморфизм ^324011 гена белка 8ТАТ6 у пациентов с различной тяжестью течения бронхиальной астмы // Казанский мед.ж.-2010.-Т.91.-№1.-С.12-16.

15. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Трофимов В.И. Экспрессия транскрипционного фактора вАТА-З в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2010. - Т.12. - №1 -2. - С.21 -28.

16. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И., Нёма М.А., Иванов В.А. Рецепторы к 1Ь-4 и 1Ь-13: строение, функция и генетический полиморфизм // Пульмонология. -2010. -№3. - С.113-120.

17. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А., Тотолян Арег.А., Сысоев К.А. Экспрессия альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину 4 при бронхиальной астме // Вестник Санкт-Петерб. ун-та, 11-я серия. -

2010. - №2. - С.86-93.

18. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И. Фундаментальные и клинические аспекты JAK-STAT сигнализации / СПб.: ВВМ, 2010,- 120с.

19. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И. Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы: патент Рос. Федерация. 2391663 МПК GO 1 N33/48/- №2008151226/15; заявл. 23.12.2008; опубл. 10.06.2010, Бюл. № 16. 6с.

20. Mineev V.N., Sorokina L.N. Disturbances of STAT6 signaling in steroid-free asthma // Eur. Respir. J. - 2006. - Vol.28, Suppl.50. - № E2900, P. 502s.

21. Mineev V.N., Sorokina L.N., Bibkova A.A. The way to improve the steroid sensitivity of target cells of patients with severe therapy resistant asthma // Eur. Respir. J. - 2006. - Vol.28, Suppl.50. -№ El 803, P. 313s.

22. Sorokina L.N., Mineev V.N., Radionova M.V. Analysis of cytokine signaling through the STAT6 activation in patients with atopic steroid-free asthma // Eur. Respir. J. - 2007. - Vol.30, Suppl.51. - № El672, P. 266s-267s.

23. Mineev V.N., Sorokina L.N., Radionova M.V. The level of STAT6 as a marker of disturbances in steroid-free asthma // Eur. Respir. J. - 2007. - Vol.30, Suppl.51. - № El 350, P. 220s.

24. Mineev V.N., Sorokina L.N., Radionova M.V. Severity of bronchial asthma: possible mechanisms // Eur. Respir. J, - 2007. - Vol.30, Suppl.51. -№ P2213, P. 369s-370s.

25. Mineev V., Sorokina L., Radionova M., Hudoley M. Analysis of cytokine signaling pathway through their activation in patients with asthma // Eur. Respir. J. - 2008. - Vol.32, Suppl.52. - № P3540, P. 617s.

26. Sorokina L., Mineev V., Nyoma M., Trofimov V. New aspects of the action of IL-4 on the activity of the transcription factor STAT6 in allergic and non-allergic asthma // Eur. Respir. J. - 2009. - Vol.34, Suppl.53. -№ P2152, P. 371s.

27. Mineev V., Sorokina L., Berestovskaya V., Nyoma M., Trofimov V. Leptin as a specific marker of risk factors in severe bronchial asthma // Eur. Respir. J. - 2009. - Vol.34, Suppl.53. -№ El 861, P. 313s.

28. Mineev V., Sorokina L., Nyoma M., Dubina M., Yanchina E., Trofimov V. Intronic polymorphism rs324011 of STAT6 gene in patients with different courses of bronchial asthma // Eur. Respir. J. - 2009. - Vol.34, Suppl.53. -№P854, P. 137s.

29. Mineev V., Sorokina L., Nyoma M., Sysoev K., Trofimov V. Expression of lymphocyte IL-4-receptor alpha chain in patients with severe

asthma as a marker of severity of disease // Eur. Respir. J. - 2009. - Vol.34, Suppl.53.-№ E1859, P. 312s.

30. Sorokina L„ Mineev V., Nyoma M., Ivanov V.A., Trofimov V. Transcription factor GATA-3 as a specific marker of allergic bronchial asthma // Eur. Respir. J. - 2010. - Vol.36, Suppl.54. - № E3949, P. 591.

31. Mineev V., Nyoma M., Sorokina L., Dubina M., Yanchina E. Protective effect of intronic polymorphism rs324011 of STAT6 gene on asthma severity // Eur. Respir. J. - 2010. - Vol.36, Suppl.54. - № P4287, P. 777s.

СОРОКИНА Л.Н. Патогенетические и клинические аспекты нарушений регуляции сигнализации транскрипционного фактора 8ТАТ6 при бронхиальной астме // Дисс. ... док. мед. наук: 14.01.25. - СПб.: Изд-во «ВВМ», 2010. - 36 с.

Подписано в печать с оригинал-макета 10Л 1.2010. Объем 2,5 усл. п.л. Гарнитура тайме. Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии ФХ СПбГУ СПб., Ст. Петергоф, Университетский пр., 26.

Актуальность темы Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем в современной пульмонологии и приобретает все большую социальную значимость (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006). При этом, несмотря на появление новых инновационных стратегий в диагностике и лечении этого хронического заболевания, возрастание арсенала медикаментозных средств, в последние годы, как свидетельствуют различные источники (Илькович М.М. и др., 2007; Чучалин А.Г., Илькович М.М., 2009), отмечается неуклонный рост заболеваемости, увеличивается распространенность этой патологии во многих странах мира, составляя в настоящее время более 10% среди детей и 4-10% - среди взрослых.

Сохраняются высокими показатели смертности и инвалидизации (Кокосов А.Н., 2005; G1NA, 2009). Растет число больных с тяжелым течением, среди которых велик процент лиц молодого возраста и детей, увеличивается количество пациентов, имеющих резистентность к проводимой терапии.

Сложившаяся ситуация требует поиска новых путей решения проблемы диагностики и лечения БА (Oh С.К., Geba G.P., Molfino N., 2010) с обязательным обращением к вопросу о патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии, генетических аспектах формирования аллергических заболеваний (Келембет H.A., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и др., 2008), центральным дефектом которых является изменение и нарушение функционирования клеточного мембранно-рецепторного аппарата (Минеев В.Н., 2005) и сигнальных систем (Barnes J.P., 2008).

Одной из новых сигнальных систем, играющих решающую роль в патогенезе БА, является JAK-STAT (Janus Kinases — Signal Transducer and Activator of Transcription), которая вовлекается в патогенез при различных патологических процессах. К настоящему времени эта система относительно хорошо изучена в эксперименте. У животных и человека она трансдуцирует множество цитокиновых сигналов и ростовых факторов, которые обеспечивают клеточную пролиферацию, дифференциацию, миграцию и апоптоз. Достаточно подробно структурно-функциональная организация этой системы, а также особенности изменений этой системы при некоторых видах патологии изложены в целом ряде обзоров (Murray P.J., 2007; Barnes J.P., 2008).

Что касается бронхиальной астмы, то данные литературы о функционировании этой системы в клетках-мишенях при указанном виде патологии единичны и противоречивы (Rawlings J.S. et al., 2004, Schindler C.W., 2002; Pernis A.B., Rothman P.B., 2002), а в отечественной литературе -вообще отсутствуют.

Цель работы

Определить патогенетическое и клиническое значение нарушений регуляции сигнализации транскрипционного фактора STAT6 при различных вариантах бронхиальной астмы.

Задачи исследования

1. Изучить экспрессию и активацию транскрипционного фактора STAT6 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

2. Оценить изменение уровня транскрипционного фактора GATA3 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в различные фазы заболевания.

3. Изучить экспрессию транскрипционного фактора STAT4 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

4. Исследовать экспрессию транскрипционного фактора Т-Ье1 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

5. Изучить мРНК 1Ь-4Яа при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

6. Выявить нарушения регуляции транскрипционного фактора БТАТ6 на основе анализа экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов ЗОСБЗ и 80С81 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.

Научная новизна работы

- Впервые установлены особенности сигнализации транскрипционного фактора 8ТАТ6 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы исходно и в условиях активации ее 1Ь-4. При этом сопоставление компонентов 8ТАТ-сигнализации (8ТАТ4 и 8ТАТ6) в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы дало возможность разработки методов дифференциальной диагностики вариантов заболевания.

- Впервые проведено исследование экспрессии транскрипционного фактора вАТА-З в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой в сравнении с группой практически здоровых лиц в зависимости от клинико-патогенетических особенностей заболевания, и показана роль этого транскрипционного фактора в механизмах утяжеления аллергической бронхиальной астмы.

- Впервые сопоставлены особенности экспрессии транскрипционного фактора 8ТАТ4 и мРНК 1РТч[-у в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

- Впервые показаны особенности экспрессии транскрипционного фактора T-bet у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой, а также, выделен и охарактеризован "синдром повышения T-bet", свидетельствующий о тяжелом течении заболевания.

- Впервые показано нарушение баланса уровней экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы и проводимой терапии.

- Впервые разработано и проведено комплексное исследование особенностей экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в STAT-сигнализации, в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

Практическая ценность работы

- Разработан метод дифференциальной диагностики бронхиальной астмы, основанный на сопоставлении уровней активной формы транскрипционного фактора STAT6 у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

- Нами охарактеризован новый симптоматокомплекс ("синдром повышения T-bet"), включающий наличие парадоксальной экспрессии T-bet в сочетании с тяжелым течением заболевания, необходимостью применения применения системных глюкокортикостероидов и |32-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии.

- Выявленные разноуровневые нарушения в системе STAT-сигнализации можно рассматривать как мишени для разработки новых лечебных "стратегий будущего".

Положения, выносимые на защиту 1. Для бронхиальной астмы характерны множественные изменения экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в STATсигнализации, и регуляторные нарушения на различных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, на уровне транскрипционных факторов, негативных регуляторов транскрипции генов), в основе которых лежат дефекты негативного контроля.

2. Аллергическая БА характеризуется разнонаправленными изменениями уровней экспрессии транскрипционных факторов 8ТАТ6 и 8ТАТ4 в мононуклеарах периферической крови, с активацией 1Ь-4 и одновременно угнетением альтернативного 1Ь-12 сигнального пути, что может указывать на повышенную Т112-активность при данном варианте заболевания.

3. Для аллергической бронхиальной астмы характерно разнонаправленное изменение экспрессии транскрипционных факторов вАТА-З и Т-Ье1 с выраженным увеличением интегрального коэффициента ОАТА-3/Т-Ье1;, что может свидетельствовать о сдвиге регуляторного ТИ1/ТЬ2 баланса в сторону ТЬ2-ответа.

4. Наличие парадоксальной экспрессии Т-Ье1 (повышение экспрессии) у больных бронхиальной астмой определяет симптоматокомплекс ("синдром повышения Т-Ье!:"), проявляющийся преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикоидов и Р2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии, среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта.

5. При Б А глюкокортикостероиды проявляют свое модулирующее влияние в отношении БТАТ-сигнализации в мононуклеарах периферической крови на разных уровнях клеточной сигнализации, особенно выраженное в группе больных с пероральной глюкокортикостероидной терапией.

6. Дефектность негативного регуляторного контроля в системе БТАТ-сигнализации проявляется на уровне супрессоров цитокиновой сигнализации

SOCS1 и SOCS3 в мононуклеарах периферической крови, что связано с нарушением их баланса.

Реализация и апробация работы

Результаты исследования внедрены в лечебную практику пульмонологического отделения клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова.

Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научно-практической конференции «Бронхиальная астма - вчера, сегодня, завтра» (Санкт-Петербург, 2007); на "Булатовских чтениях" (Санкт-Петербург, 2007, 2008); на 16-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006); на 18-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2008); на 19-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009); на пульмонологической секции Санкт-Петербургского научно-практического общества терапевтов имени С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2008); на 17 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Stockholm, Sweden, 2007); на 18 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Berlin, Germany, 2008), на 19 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2009).

По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа. Из них 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 12 работ в зарубежной литературе, 1 изобретение "Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы"; авторы: Минеев В.Н., Сорокина JI.H., Трофимов В.И. (патент на изобретение № 2391663), 1 глава в монографии "Саногенез" и монография "Фундаментальные и клинические аспекты JAK-STAT сигнализации".

По результатам конкурса докладов молодых ученых в рамках 16 Национального Конгресса по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006) доклад "Особенности JAK-STAT сигнализации при бронхиальной астме" занял первое место и был награжден стипендией Главного терапевта России.

По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект '\FAK-STAT сигнализация как базис формирования аллергических заболеваний: фундаментальные и прикладные аспекты" стал победителем конкурса 2007 года. Шифр гранта: РД 07-4.0-86.

По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект "Новая сигнальная система 1АК-8ТАТ: разработка инновационного подхода к комплексному исследованию патогенетических и клинических основ" стал победителем конкурса 2008 года. Шифр гранта: 28-04/17.

По результатам конкурса грантов НИР в 2008 году СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова на лучшую научную работу, конкурсный проект: "Патогенетические и клинические аспекты нарушений регуляции 8ТАТ6-сигнализации при бронхиальной астме", стал победителем конкурса 2008 года.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании экспрессии транскрипционного фактора ЭТАТб в мононуклеарах периферической крови больных АБА и НАБА выявлено существенное повышение, как уровня экспрессии этого транскрипционного фактора, так и интегрального коэффициента 8ТАТ6/8ТАТ4 по сравнению с группой практически здоровых лиц, наиболее выраженное у больных АБА, что определяет ТЪ2-сдвиг при БА. При этом у больных НАБА уровень экспрессии 8ТАТ6 зависит от тяжести течения заболевания, а у больных АБА подобной зависимости не выявлено. В фазе ремиссии заболевания отмечается снижение уровня экспрессии 8ТАТ6 как у больных АБА, так и у больных НАБА.

2. Мононуклеары периферической крови больных АБА по сравнению с НАБА отличаются наиболее высокой способностью транскрипционного фактора 8ТАТ6 к активации 1Ь-4 с образованием фосфорилированной формы (р8ТАТ6), вне зависимости от фазы и тяжести течения заболевания. Данный феномен может лежать в основе повышенной ТЪ2-активности при АБА.

3. При анализе экспрессии транскрипционного фактора ОАТА-З в мононуклеарах периферической крови было выявлено существенное повышение уровня экспрессии этого транскрипционного фактора у больных АБА, вне зависимости от фазы заболевания, по сравнению с группой практически здоровых лиц и больных НАБА. Уровень экспрессии ОАТА-З при АБА имеет зависимость от тяжести течения, достигая максимальных значений при тяжелом течении, что может играть патогенетическую роль в утяжелении заболевания.

4. При исследовании экспрессии транскрипционного фактора 8ТАТ4, а также экспрессии мРНК ШЧ-у в мононуклеарах периферической крови в группе больных АБА выявлено снижение уровней экспрессии, как транскрйпционного фактора, так и мРНК 1Р1Ч-у по сравнению с группой практически здоровых лиц и больных НАБА, что может указывать на нарушение в альтернативном 1Ь-12 сигнальном пути у больных АБА.

5. При оценке экспрессии транскрипционного фактора Т-Ье1 в мононуклеарах периферической, крови в группе больных АБА. при нарастании тяжести течения заболевания и вне зависимости от его- фазы выявлено снижение уровня* экспрессии по сравнению с группой практически здоровых лиц и-больных НАБА с выраженным увеличением интегрального коэффициента ОАТА-3/Т-Ье1, что может свидетельствовать о сдвиге регуляторного ТЬ1/ТЬ2 баланса в сторону ТЬ2. У больных НАБА существенных различий экспрессии Т-Ье1 по сравнению с группой практически здоровых лиц не выявлено.

6. При исследовании больных БА с парадоксальной' экспрессией' транскрипционного фактора Т-Ье1 (повышением экспрессии) в мононуклеарах периферической крови выявлен симптоматокомплекс ("синдром повышения Т-Ье1"), который характеризуется преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикоидов и р2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии, среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта.

7. При анализе уровня экспрессии мРНК 1Ь-411а у больных БА обнаружено его повышение по сравнению с группой практически здоровых лиц, причем наибольшее повышение отмечается у больных с тяжёлым течением заболевания, без существенных различий между вариантами заболевания. Особенности экспрессии мРНК 1Ь-4Яа коррелируют с основными клиническими особенностями заболевания (тяжесть течения, показатели функции внешнего дыхания, характеризующие обструктивный синдром, применение глюкокортикостероидов), что, по-видимому,

1 достаточно прямо указывает на возможную патогенетическую роль экспрессии этого рецептора на претрансляционном уровне.

8. При АБА выявлено снижение уровня экспрессии регулятора транскрипции генов БОС81 и мРНК 80С81 по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения заболевания. У больных НАБА существенных различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. С другой стороны, при АБА и НАБА выявлено нарастание уровня экспрессии регулятора транскрипции генов 80С83 по сравнению с группой практически здоровых лиц, вне зависимости от фазы и тяжести течения БА, более выраженное у больных НАБА. Данные I факты, наряду с обнаружением увеличения интегрального коэффициента 80С83/80С81, позволяют сделать вывод о дефектности негативного регуляторного контроля в системе 8ТАТ-сигнализации.

9. При Б А показано модулирующее влияние глюкокортикостероидов в ! отношении 8ТАТ-сигнализации в мононуклеарах периферической крови, особенно выраженное в группе больных с пероральной I глюкокортикостероидной терапией. При этом модулирующий эффект прослеживается на разных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, уровне транскрипционных факторов и их регуляторов, в частности, наблюдается повышение уровней экспрессии 8ТАТ6, 8ТАТ4, вАТА-З, мРНК 1Ь-4Яа, 80С81, 80С83 и снижение - Т-Ье1;).

10. Полученные данные, характеризующие 8ТАТ-сигнализацию при БА, позволяют выдвинуть концепцию множественности и гетерогенности регуляторных нарушений на различных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, на уровне транскрипционных факторов, регуляторов транскрипции генов), в основе которых лежат дефекты негативного контроля. 1

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для проведения дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического вариантов бронхиальной астмы рекомендуется разработанный способ (патент на изобретение №2391663 МПК ООШЗЗ/48), заключающийся в сопоставлении уровней экспрессии активной формы транскрипционного фактора 8ТАТ6.

Рекомендуется использовать для прогнозирования тяжелого течения бронхиальной астмы и коррекции терапии выявленный нами клинический симптоматокомплекс ("синдром повышения Т-Ье1:").

Выявленные изменения в ЭТАТ-сигнализации, множественные и гетерогенные, создают базис для поиска новых терапевтических мишеней в разработке лечебных "стратегий будущего".

234