Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Патогенетическая роль транскрипционных факторов лимфоцитов PAX-5, NF-kB, STAT6 при бронхиальной астме

На правах рукописи

НЁМА Михаил Александрович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ РАХ-5, ОТ-кВ, БТАТ6 ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.01.25 - Пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

7 НО'! 2013

Санкт-Петербург 2013

005537592

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого Государственного образовательного учреждения Высшего Профессионального Образования "Первый Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Валерий Николаевич Минеев

Официальные оппоненты:

заведующая отделом терапевтической пульмонологии НИИ Пульмонологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, доктор медицинских наук, профессор Татьяна Евгеньевна Гембицкая

проректор по клинической работе СЗГМУ им. И.И. Мечникова, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Вадим Иванович Мазуров

Ведущая организация:

ФГКВОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ

Защита диссертации состоится «13" НО№РЯ 2013 г. в

/3>'0О_часов на заседании диссертационного Совета Д.208.090.02

при Первом Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова в Научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, Санкт-Петербург, ул. Рентгена 12, зал заседаний Учёного Совета).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Первого Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова по адресу: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого 6-8.

Автореферат разослан О'С^Я&РЯ 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор А.Л. Александров

ВВЕДЕНИЕ - ■

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем в современной пульмонологии и приобретает всё большую социальную значимость (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова M.A., 2011). При этом, несмотря на появление инновационных стратегий в диагностике и лечении этого хронического заболевания, увеличения количества медикаментозных препаратов, в последние годы, как свидетельствуют различные источники (Илькович М.М. и др., 2007; Чучалин А.Г., Илькович М.М., 2009), отмечается неуклонный рост заболеваемости, растёт распространённость этой патологии во многих странах мира, составляя в настоящее время более 8-10% среди взрослых и не менее 11-17% среди детей. Интенсивная индустриализация сопровождается прогрессированием распространённости аллергического варианта БА. Сохраняются относительно высокими показатели смертности и инвалидизации (Кокосов А.Н., 2005; GINA, 2011). Увеличивается число больных с тяжёлым течением, среди которых значителен процент лиц молодого возраста и детей, растёт количество пациентов, имеющих устойчивость к проводимой терапии. Складывающаяся ситуация требует поиска новых путей решения проблемы диагностики и лечения БА с обязательным обращением к вопросу о механизмах развития бронхолёгочной патологии, генетических аспектах формирования аллергических заболеваний (Келембет H.A., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и др., 2008), центральным дефектом которых является изменение и нарушение функционирования клеточного мембранно-рецепторного аппарата (Минеев В.Н., 2005) и сигнальных систем (Barnes J.Р., 2008).

Одной из сигнальных систем, играющих- решающую роль в патогенезе воспалительных изменений в бронхолёгочной системе, является JAK-STAT (Janus Kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription), которая включает в себя транскрипционные факторы STAT. Транскрипционные факторы регулируют экспрессию белков, значимых для развития и течения бронхиальной астмы, в том числе IL-4, IL-15, IL-13, IgE, рецепторных молекул Fes И, IL4Ra и других, а также для пролиферации ключевых клеток БА — эозинофилов, B-лимфоцитов, Т-хелперов. К настоящему времени роль многих факторов идентифицирована, однако вклад некоторых элементов сети этих транскрипционных факторов в развитие и течение БА не известен. ...

Достаточно подробно структурно-функциональная характеристика STAT-белков (и в частности - STAT6), а также особенности изменений его экспрессии при некоторых видах патологии изложены в ряде источников (Murray P.J., 2007; Barnes J.P., 2008, Сорокина JI.H,, 2010). Однако вопросы посттранскрипционного уровня продукции этого фактора при БА в

литературе освещены неполно, а в отечественной литературе - вообще отсутствуют.

Несколько больше освещены в мировой литературе вопросы активности транскрипционного фактора NF-кВ (nuclear factor kappa В) при бронхо-лёгочной патологии, однако во многом данные о нём и его взаимодействии с фактором STAT6 (особенно в отношении регуляции продукции IgE) носят противоречивый характер.

Транскрипционный фактор РАХ-5 (paired box 5), имеющий большое значение для дифференцировки В-лимфоцитов и их синтетической активности, исследовался преимущественно при онкогематологических заболеваниях; ни в мировой, ни в отечественной литературе нет данных о его вкладе в патогенез БА.

Также нет и определённых сведений о взаимодействии и взаимовлиянии факторов РАХ-5 и STAT6.

В то же время известно, что эти транскрипционные факторы - РАХ-5, NF-кВ и STAT6, принимают непосредственное участие в переключении В-лимфоцитов на синтез IgE, что весьма значимо для патогенеза БА.

Цель работы

Оценить патогенетическую роль транскрипционных факторов лимфоцитов РАХ-5, NF-кВ, STAT6 при бронхиальной астме.

Задачи:

1. Определить экспрессию мРНК РАХ-5, STAT6 и субъединицы р50 NF-кВ при аллергической и неаллергической бронхиальной астме разной степени тяжести в сравнении с контрольной группой.

2. Установить изменения экспрессии РАХ-5 в фазе обострения и ремиссии бронхиальной астмы при разной тяжести течения заболевания.

3. Оценить изменение уровней экспрессии IgE и мРНК его тяжёлых цепей в связи с изменениями экспрессии транскрипционных факторов РАХ-5, STAT6, NF-кВ при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в фазе обострения и ремиссии у больных с разной тяжестью течения заболевания.

4. Определить роль IL-4 в изменении экспрессии РАХ-5 при бронхиальной астме.

Научная новизна исследования

Впервые использована комплексная оценка уровней микросети транскрипционных фаторов РАХ-5, NF-кВ и STAT6 для характеристики БА, и выявлена разнородность и комплексность нарушений взаимоотношения этих транскрипционных факторов при различных вариантах заболевания.

- Впервые изучена эскпрессия мРНК РАХ-5 при БА, показано изменение уровней экспрессии этого транскрипционного фактора при различных вариантах заболевания.

- Впервые изучено влияние IL-4 на синтез мРНК транскрипционного фактора РАХ-5 при АБА, и установлено влияние этого цитокина на угнетение синтеза мРНК РАХ-5.

- Впервые применён разработанный нами индекс отношения уровня экспрессии мРНК STAT6 к уровню экспрессии белка STAT6 ([мРНК STAT6]/[STAT6]) для характеристики течения НАБА.

- Впервые показано снижение экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ в фазе ремиссии НАБА.

- Впервые показано нарастание уровней экспрессии мРНК РАХ-5, мРНК субъединицы р50 NF-кВ и мРНК STAT6 при лечении системными глюкокортикостероидами.

Практическая ценность работы

Анализ уровней экспрессии мРНК STAT6 и/или субъединицы р50 NF-кВ в лимфоцитах периферической крови позволит определить степень нарушения контроля над продукцией IgE у больного АБА, которая может быть дополнительньм критерием к выбору лечебного подхода с использованием моноклональных антител к IgE.

Оценка экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ и/или транскрипционного фактора STAT6, значимо снижающейся в фазе ремиссии НАБА, может быть использована для динамического наблюдения за течением заболевания и эффективностью терапии.

Влияние IL-4 на экспрессию мРНК РАХ-5 при АБА может быть использовано для разработки новых лекарственных препаратов, направленных на блокирование взаимодействия STAT6 с РАХ-5.

Положения, выносимые на защиту

1. Для бронхиальной астмы характерны изменения в уровнях экспрессии микросети транскрипционных факторов РАХ-5, STAT6 и NF-кВ в лимфоцитах периферической крови, соответствующие варианту заболевания и его тяжести, а также зависящие от терапии глюкокортикостероидами. Транскрипционные факторы взаимодействуют друг с другом в патогенезе БА, формируя комбинацию уровней экспрессии в лимфоцитах, предрасполагая к формированию определённого клинико-патогенетического варианта бронхиальной астмы: высокие уровни экспрессии STAT6 при сниженных уровнях экспрессии РАХ-5 и повышенных уровнях экспрессии NF-кВ — к формированию и утяжелению течения аллергической БА, а высокие уровни РАХ-5 и NF-кВ - развитию

неаллергической БА. При неаллергической БА высокие уровни экспрессии мРНК STAT6 способствуют утяжелению и обострению течения заболевания, а низкие - индукции ремиссии.

2. IL-4 вызывает снижение экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах больных АБА, действуя через активацию транскрипционного фактора STAT6. Данный феномен может лежать в основе повышенной дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки при аллергической БА.

3. Для больных БА, получающих системную глюкокортикоидную терапию, характерно нарастание уровней экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ, мРНК STAT6, а у больных НАБА дополнительно - увеличение экспрессии мРНК РАХ-5.

4. Транскрипционные факторы РАХ-5 и NF-кВ в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой обладают ключевой ролью в синтезе мРНК тяжёлых е-цепей IgE при БА на фоне дефекта синтеза STAT6 в лимфоцитах, выраженного в индексе отношения уровня экспрессии мРНК STAT6 к уровню экспрессии белка STAT6 ([мРНК STAT6]/ [STAT6]), который может приводить к нарастанию продукции IgE при утяжелении течения неаллергической БА.

Реализация и апробация работы

Материалы диссертации докладывались на 19 Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009); на "Булатовских чтениях" (Санкт-Петербург, 2009, 2011); на 19 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2009), на 20 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Barselona, Spain, 2010), на 21 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Amsterdam, Netherlands, 2011), на 22 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2012), на международных молодёжных медицинских конгрессах (Санкт-Петербург, 2009, 2011), на заседании Научного совета СПбГМУ (май 2011 г.).

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ. Из них 11 статей, в том числе - 10 в журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в арубежной литературе. Проект работы поддержан грантами и субсидиями Правительства Санкт-Петербурга для аспирантов и молодых учёных ВУЗов в 2009, 2010, 2011 и 2012 годах. Серия публикаций в рецензируемых журналах по теме работы удостоена стипендии года для молодых учёных СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в 2011 году. Исполнитель работы удостоен стипендии Президента РФ для аспирантов в 20011-2012 учебном году.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав с результатами собственных наблюдений, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 184 работы (28 отечественных и 156 иностранных авторов). Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами и 17 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика участников исследования

Для решения поставленных задач обследованы 184 человека: 149 больных бронхиальной астмой (БА), 35 практически здоровых лиц. Отбор и обследование больных проводились на базе клиники госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Минздрава РФ. Больные находились на стационарном лечении от 11 до 17 дней и наблюдались амбулаторно. Все обследованные подписали форму согласия, утверждённую локальным этическим комитетом. Диагноз БА устанавливали в соответствии с критериями глобальной инициативы в диагностике, лечении и профилактики БА (США, 2010).

В контрольную группу практически здоровых лиц вошли 35 человек: 16 мужчин (45,7%) и 19 женщин (54,3%). Средний возраст составил 29,46 ± 9,19 года.

Практически здоровых лиц отбирали по следующим критериям: отсутствие бронхолёгочной патологии, отсутствие признаков острого заболевания в течение последнего месяца и отсутствие аллергических заболеваний в анамнезе, неотягощённая наследственность по бронхиальной астме и аллергическим заболеваниям.

Группу больных аллергической БА составили 86 пациентов с аллергической (или преимущественно аллергической) бронхиальной астмой (АБА). Во вторую группу вошли 63 больных с неаллергической бронхиальной астмой (инфекционно-зависимым или преимущественно инфекционно-зависимым вариантом заболевания) (НАБА). В группе больных АБА было 50% женщин и 50% мужчин. В группе больных НАБА -28,6% мужчин и 71,4% женщин. Средний возраст в группе больных АБА (41,13±14,12 лет) был значимо ниже, чем в группе НАБА (55,25±13,83 лет). Длительность заболевания составила 13,98±12,33 лет у больных АБА и 12.81±9.35 лет в группе больных НАБА. Больные АБА с лёгким течением составили 38,4% наблюдений, с течением средней степени тяжести - 47,7%, тяжёлым течением - 14,1%. Среди больных НАБА было меньше пациентов с лёгким течением заболевания (8,2%), больше пациентов с тяжёлым течением

заболевания (31,7%) и 60,3% больных с течением заболевания средней степени тяжести.

Пациенты с различной степенью тяжести болезни значимо отличались друг от друга по характеру получаемой терапии. Больные с лёгким течением БА существенно чаще использовали в терапии интал или тайлед по сравнению с больными со среднетяжёлым и тяжёлым течением заболевания (р<0.05).

Бронхолитики чаще были использованы в терапии больных со средне-тяжёлым и тяжёлым течением заболевания по сравнению с лёгким течением. р2-адреномиметики использовали 67,6% больных с лёгким течением, 91,1% больных со средне-тяжёлым и 100% больных с тяжёлым течением заболевания (р<0.05).

Антибактериальные препараты назначали 8,5% больных с лёгким течением БА и 13,9% больных со среднетяжёлым и тяжёлым течением (р<0.05). Ингаляционные кортикостероиды в терапии больных с лёгким течением болезни использовались существенно реже по сравнению с больными со среднетяжёлым и тяжёлым течением (25,9%, 71,8% и 93,8% соответственно). Среднесуточная доза ингаляционных кортикостероидов была выше у больных с тяжёлым течением БА (р<0.05). Парентеральные глюкокортикостероиды назначали 44,4% больных с лёгким течением, 74,4% больных со среднетяжёлым течением и 84,4% больных с тяжёлым течением БА. Как среднесуточная, так и курсовая дозы парентеральных глюкокортикоидов значимо нарастали с увеличением тяжести течения БА (р<0.05). При этом длительность терапии парентеральными глюкокортикоидами у больных с тяжёлым течением БА была значимо выше по сравнению с больными БА с лёгким и среднетяжёлым течением заболевания. Системные пероральные глюкокортикоидные препараты назначались только больным с тяжёлым течением заболевания.

Методы исследования

Больным проводили стандартное клиническое, лабораторное и рентгенологическое обследование, аллергологическое тестирование с проведением кожных проб с различными аллергенами, а также цитологическое исследование мокроты и смыва из бронхов. Лабораторное обследование включало, в том числе, клинический и биохимический анализы крови. Для оценки состояния функции внешнего дыхания производили запись спирограммы с определением показателей ОФВ1 и ЖЁЛ, анализировали максимальную скорость выдоха на разных уровнях ФЖЕЛ: МОС50, МОС75, ПОС, также определяли бронхиальное сопротивление (Raw) и удельную проводимость бронхов (SGaw).

Все показатели оценивали исходно и через 15 минут после ингаляции сальбутамола для определения степени выраженности бронхоспазма.

Вестерн-блоттинг. Для исследования использовали лимфоциты периферической крови здоровых лиц и больных БА, выделенные на градиенте плотности Lymphoseparation Medium («ICN») с использованием стандартной методики выделения мононуклеаров с последующим удалением моноцитов осаждением на пластике в условиях инкубации в среде IMDM при 37°С в течение 40 мин. После инкубации лимфоциты помещались на лёд и все дальнейшие процедуры проводились при 4°С. Клетки промывали один раз холодным фосфатно-солевым буферным раствором. Тотальный лизат получали добавлением к пробам 0,1 мл лизирующего буфера, содержащего ингибиторы протеаз. После инкубации в течение 10 мин при 4°С, клеточный лизат центрифугировали при 10000 об/мин. К надосадку добавляли 'А часть буферного раствора для электрофоретических проб и инкубировали в течение 5 мин при + 100°С. Электрофоретическое разделение белков проводилось в полиакриламидном геле при 30 мА в течение 2 часов. Разделённые белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Иммуноблоттинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols (Amersham). Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую плёнку. Для специфического выявления STAT6 использовали поликлональные STAT6 антитела (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (GAM-HRP, Sigma, CIF).

RT-PCR. Экспрессию мРНК РАХ-5, STAT6, субъединицы р50 NF-кВ, Р-актина, тяжёлых цепей иммуноглобулина Е (СНе) оценивали путём проведения RT-PCR (reverse transcription-PCR - обратная транскрипция -полимеразная цепная реакция (ПЦР)) с нуклеиновыми кислотами, выделенными из лимфоцитов периферической крови. ПЦР проводили в амплификаторе «¡Cycler» (BIORAD) в следующем режиме: инициация при 95°С в течение 4-х минут, 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, гибридизации праймеров при 60°С в течение 30 с и полимеризации при 70°С в течение 30 с. Завершающая полимеризация проводилась при 72°С в течение 7 минут. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле и окраске этидия бромидом. Результат электрофореза после фотографирования в ультрафиолетовом свете анализировался в программе Gel-Pro 3.1. Уровень экспрессии мРНК РАХ-5, STAT6, субъединицы р50 NF-кВ, СНе оценивали относительно уровня экспрессии мРНК р-актина. Праймеры для РАХ-5, STAT6, субъединицы р50 NF-кВ, р-актина и СНе были разработаны на основе известных последовательностей (GenBank).

Инкубация лимфоцитов с интерлейкином 4 в концентрации 10 нг/мл проводилась в течение 24 часов при температуре 37 °С в среде IMDM.

Определение концентрации общего IgE сыворотки. Работа выполнена на базе лаборатории Научно-Методического Центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. И.П. Павлова, при методическом содействии старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук Сысоева Кирилла Александровича.

Определение концентрации общего IgE сыворотки проводилось методом иммуноферментного анализа с применением стандартной методики при использовании коммерческого набора (DRG, Германия) на ИФА-анализаторе BioTek ELx800 с длиной волны 450 нм с построением калибровочной кривой «от точки к точке».

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы SPSS 13.0 с использованием методов и критериев параметрической и непараметрической статистики: сравнение средних, дисперсионный анализ, кластерный анализ, корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование экспрессии транскрипционного фактора РАХ-5.

Значения экспрессии мРНК РАХ-5 (по отношению к экспрессии мРНК Р-актина) в группе больных НАБА были значимо выше, чем в группе больных АБА: 0,61 (0,5; 0,71) и 0,55±0,19 соответственно (для группы больных НАБА указаны медиана и процентили: 25-й и 75-й), для сравнения выборок использован однофакторный дисперсионный анализ с применением апостериорного критерия Геймса-Хоуэлла (р=0,013).

Наиболее частым признаком воспаления бронхов является изменение клеточного состава крови и мокроты. У больных АБА уровни экспрессии мРНК РАХ-5 значимо отрицательно коррелировали с количеством лейкоцитов в мокроте (г Пирсона=-0,369; р=0,037; п=32), относительным количеством базофилов крови и эозинофилов мокроты (по отношению к общему количеству лейкоцитов) (г Пирсона—0,336; р=0,004; п=72 и г Пирсона=-0,393; р=0,029; п=31). При высоких значениях экспрессии мРНК РАХ-5 (более 0,9 по отношению к экспрессии мРНК р-актина) подобная связь наблюдалась и с количеством эозинофилов в периферической крови (р Спирмена =-0,881; р=0,004; п=8). При НАБА наблюдается положительная корреляция уровней экспрессии мРНК РАХ-5 с количеством нейтрофилов крови: г Пирсона=0,266; р=0,048; п=56.

Одной из ключевых молекул в патогенезе БА является иммуноглобулин Е (IgE). Нами проведена оценка экспрессии IgE и мРНК константных частей тяжёлых цепей IgE - е цепей (СНе) и их связи с

экспрессией мРНК РАХ-5. Значимых корреляций уровней экспрессии мРНК РАХ-5 с уровнем общего сывороточного IgE не выявлено, однако выявлены значимые связи между уровнями экспрессии мРНК CHs и мРНК РАХ-5 (р Спирмена =0,564; р=0,028; п=15 в контрольной группе, р Спирмена =0,528; р<0,001; п=53 при АБА и р Спирмена =0,499; р=0,004; п=32 в группе НАБА). Это свидетельствует о более значимой роли РАХ-5 в синтезе константных частей тяжёлых цепей IgE у больных АБА является по сравнению с группой НАБА.

При анализе уровней экспрессии РАХ-5 в группах больных БА с высоким (IgE< 15 ОМЕ/мл) и нормальным (^Е>150МЕ/мл) уровнями сывороточного общего IgE выявлено, что корреляция уровней экспрессии мРНК РАХ-5 и мРНК тяжёлых цепей иммуноглобулина Е (СНе) несколько выше у больных с нормальным содержанием сывороточного общего IgE, чем у пациентов, характеризовавшихся его высокими концентрациями (р Спирмена =0,543; п=53; р<0,001 и р Спирмена=0,474; п=25; р=0,017 соответственно). Это свидетельствует о том, что повышение концентрации IgE, вероятно, обусловлено снижением контроля со стороны РАХ-5 за продукцией тяжёлых цепей IgE и ростом активности других транскрипционных факторов, контролирующих синтез СНе (например, NF-кВ).

Основным исследованием, объективно характеризующим течение БА, является исследование функции внешнего дыхания; мы проанализировали корреляционные связи спирометрических показателей с экспрессией транскрипционного фактора РАХ-5. При АБА значимые положительные корреляции наблюдались с индексом Тиффно (р Спирмена=0,366; р=0,007; п=53), МОС50выд/МОС50вд (р Спирмена=0,366; р=0,007; п=53) и МОС50выд (% от должного) (р Спирмена=0,279; р=0,041; п=54). Таким образом, при АБА снижение уровней экспрессии РАХ-5 статистически значимо связано с усилением бронхообструктивных процессов и ростом сопротивления бронхов воздушному потоку. Для НАБА значимых связей не выявлено. Эти данные соотносятся с анализом показателей цитологического анализа мокроты больных БА и свидетельствуют о возможном блокировании фактором РАХ-5 процессов аллергического воспаления, а, следовательно, улучшением показателей исследования ФВД.

Основным цитокином в патогенезе БА считается IL-4, действие которого опосредовано транскрипционным фактором STAT6. Мы оценили экспрессию мРНК РАХ-5 в лимфоцитах, инкубированных в среде с содержанием IL-4 в концентрации 10 нг/мл и без присутствия IL-4. В группе больных АБА наблюдалось значимое снижение экспрессии мРНК РАХ-5 при воздействии IL-4 (р=0,039; n=17, t=2,244), в группе здоровых лиц это

снижение не было значимым (р=0,950; п=8, 1=0,065) (критерий Стьюдента). При использовании критерия Вилкоксона-Манна-Уитни результат аналогичен: г=-2,201; р=0,028 для группы больных АБА и 2=-0,140; р=0,889 для контрольной группы (рис. 1).

Рис. 1. Средние уровни экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах больных аллергической БА и практически здоровых лиц (по отношению к экспрессии мРНК р-актина) в условиях 24-часовой инкубации в среде IMDM без IL4 (IMDM) и с добавлением IL4 (1MDM+IL4) (М±о).

При аллергической БА под действием IL-4 наблюдается значимое снижение экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах периферической крови по сравнению с изначальным уровнем (у практически здоровых лиц значимо не меняется).

Основными препаратами для базисной терапии бронхиальной астмы являются глюкокортикостероиды (ГКС), Значимые различия наблюдались при анализе групп больных НАБА, принимавших только ингаляционные глюкокортикостероиды, и тех, кто дополнительно к этому получал глюкокортикостероиды внутривенно: уровень экспрессии мРНК РАХ-5 значимо повышался. В группе больных АБА различия были статистически незначимыми (рис. 2).

IMDM □ IMDM+IL-4

Здоровые лица

□ икс

■ икс+в/в

Рис. 2. Медианы уровней экспрессии мРНК РАХ-5 в группах больных аллергической БА (АБА) и неаллергической БА (НАБА) (по отношению к экспрессии мРНК Р-актина), принимавших ингаляционные кортикостероиды (ИКС) и комбинацию ИКС и внутривенных кортикостероидов (ИКС+В/В) (показаны уровни значимости критерия Вилкоксона-Манна-Уитни).

Также была выявлена значимая положительная корреляция между уровнем экспрессии мРНК РАХ-5 и суточной дозой ингаляционных ГКС у больных БА (г Пирсона =0,254; р=0,034; п=70).

Транскрипционный фактор РАХ-5 обладает несколькими функциями. Он не только переключает В-лимфоциты на продукцию ^Е, но и обеспечивает приверженность В-клеток своей линии дифференцировки, препятствуя их апоптозу и превращению в плазматические клетки за счёт угнетения плазмоцит-специфических генов. Несмотря на то, что РАХ-5 способствует синтезу ^Е, увеличение экспрессии РАХ-5 в лимфоцитах больных БА, тем не менее, связано с улучшением потоковых показателей ФВД и регрессом воспалительных изменений мокроты и её эозинофилии. В то же время РАХ-5 значимо больше экспрессирован при НАБА. Можно предположить, что нарастание экспрессии РАХ-5 ведёт к продлению жизненного цикла В-лимфоцитов и их активности, выражающейся, в том числе, в усиленной презентации растворимых антигенов Т-хелперам. Малое количество РАХ-5, вероятно, недостаточно для блокирования дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые

лишаются поверхностных рецепторных комплексов и молекул главного комплекса гистосовместимости II, утрачивая, таким образом, возможность быть антиген-презентирующими клетками (Фрейдлин И.С., Тотолян Арег А., 2000). Снижение концентраций РАХ-5, таким образом, способствует, по всей видимости, преимущественному развитию ТЬ2-пути иммунного ответа и аллергического варианта БА. Это может быть подтверждено снижением концентрации РАХ-5 при утяжелении течения БА. Кроме того, можно предположить, что инициирующее переключение фактором РАХ-5 В-лимфоцитов на синтез IgE, тем не менее, слабо отражается на концентрации этого иммуноглобулина в сыворотке. Основными продуцентами IgE являются именно плазмоциты, в которых РАХ-5 уже супрессирован. По всей видимости, на этой стадии дифференцировки B-клеток основной вклад в синтез IgE вносят уже другие факторы (например, STAT6), что косвенно подтверждается фактом снижения корреляции экспрессий РАХ-5 и СНе у пациентов с высокими уровнями сывороточного IgE. В связи с этим, нельзя исключить, что два этих белка (РАХ-5 и STAT6) обладают взаимным ингибирующим влиянием друг на друга. Ранее нами было выявлено утяжеление проявлений БА у больных с высокими экспрессии STAT6 (Минеев В.Н, Сорокина Л.Н., Нёма М.А., 2009).

Связь приёма ГКС с уровнем экспрессии РАХ-5, вероятно, отражает возможную зависимость синтеза этого белка от транскрипционной активности стероидов. В то же время, увеличение экспрессии РАХ-5 и соответствующее угнетение превращения B-лимфоцитов в секреторно-активные плазматические клетки может лежать в основе противовоспалительного (противоаллергического) действия ГКС.

Исследование экспрессии транскрипционного фактора NF-kB.

В связи с важной ролью субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ р50, связывающейся с ДНК в B-лимфоцитах, мы изучили экспрессию мРНК этой субъединицы в лимфоцитах периферической крови больных аллергической и неаллергической БА. Значения экспрессии мРНК р50 NF-kB (по отношению к экспрессии мРНК ß-актина) в группе больных НАБА были значимо выше, чем в группе больных АБА: 0,44±0,26 и 0,3 (0,22; 0,38) соответственно (для группы больных АБА указаны медиана и процентили: 25-й и 75-й), для сравнения средних использован однофакторный дисперсионный анализ с применением апостериорного критерия Тьюки (р=0,028).

Уровни экспрессии NF-кВ в лимфоцитах периферической крови больных НАБА значимо выше по сравнению с уровнем у практически здоровых лиц и больных АБА (в 1,46 раза), что соотносится с данными литературы о повышенной экспрессии данного транскрипционного фактора

при тяжёлых формах обструктивиой лёгочной патологии, в особенности -связанной с инфекцией (Kobayashi Y., Wada Н., Rossios С. et al., 2013; Lee K.Y., Ho S.C., Chan Y.F. et al., 2012). При анализе динамики экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ (субъединицы р50) в зависимости от фазы заболевания выявлено, что лимфоциты больных НАБА в стадии обострения характеризуются более высокими уровнями экспрессии субъединицы р50 NF-кВ, чем в стадии ремиссии заболевания (0,54±0,26 и 0,28±0,12 соответственно (по отношению к бета-актину) (п=10; р=0,012; критерий Вилкоксона для 2-х связанных выборок).

При АБА значимая положительная корреляция наблюдалась с Raw выд. (р Спирмена=0,366; р=0,007; п=37) и отрицательная - с SGaw (г Пирсона=-0,334; р=0,043; п=37). Это может указывать на связь выраженности экспрессии данного транскрипционного фактора со степенью тяжести течения АБА. Заметим, что при НАБА подобных значимых корреляций не выявлено.

При оценке ассоциации экспрессии мРНК р50 NF-кВ с мРНК тяжёлых цепей IgE (СНе) выявлены значимая корреляцинная связь между экспрессиями этих молекул (г Пирсона=0,442; р=0,001; п=49 при АБА и г Пирсона=0,311; р=0,028; п=49 при НАБА).

Исследование экспрессии транскрипционного фактора STAT6.

Значения экспрессии STAT6 (по отношению к экспрессии р-актина) в группах больных АБА и НАБА были значимо выше, чем в группе контроля: 0,65±0,35 и 0,70±0,34 соответственно против 0,41±0,25 (р=0,037 и р=0,009 соответственно), для сравнения средних использован однофакторный дисперсионный анализ с применением апостериорного критерия Геймса-Хоуэлла для сравнения выборок с неравной дисперсией. Подобная закономерность прослеживалась и в отношении мРНК STAT6. Эти факты соответствуют данным литературы (Сорокина Л.Н., 2010). В группе больных НАБА наблюдалась положительная корреляционная связь между уровнем экспрессии STAT6 и тяжестью течения БА (р Спирмена =0,357; р = 0,005; п=60).

Рассмотрим связь экспрессии белка STAT6 и его мРНК с экспрессией значимых при БА цитокинов и иммуноглобулина Е, а также мРНК тяжёлых цепей IgE (s-цепей) (таблица 1).

Отрицательная связь уровня STAT6 с экспрессией мРНК СНе свидетельствует о неоднозначной роли этого транскрипционного фактора в патогенезе АБА: с одной стороны, он наряду с РАХ-5 и NF-кВ участвует в переключении В-лимфоцитов на синтез IgE, с другой - увеличение его экспрессии ведёт к снижению продукции мРНК СНе и не оказывает значимого эффекта на количество общего IgE.

Для НАБА значимых корреляций экспрессии STAT6 и его мРНК с цитокинами не выявлено.

Таблица 1.

Связь экспрессии белка БТАТ6 и его мРНК с экспрессией цитокинов, общего

^Е и мРНК тяжёлых цепей ^Е (е-цепей - СНе) у больных АБА _(коэффициент корреляции Пирсона г)._

STAT6 мРНК STAT61

Показатель n Коэффициент корреляции Значимость связи n Коэффициент корреляции Значимость связи

Уровень общего сывороточногоIgE 47 -0,076 0,612 54 -0,043 0,757

мРНК СНе 42 -0,387* 0,011 45 -0,085 0,579

IFNy 14 -0,607* 0,021 15 0,017 0,952

IL-2 14 -0,557* 0,039 15 -0,158 0,575

TNFa 13 -0,569* 0,042 14 0,061 0,835

IL-4 13 0,155 0,614 14 0,590* 0,026

IL-5 14 0,035 0,905 15 -0,632* 0,011

Примечание:

статистически значимые корреляции отмечены знаком *;

1 для выборок, не подчиняющихся нормальному распределению, указаны значения коэффициента корреляции Спирмена

Для уточнения взаимосвязи мРНК STAT6 и белка STAT6 в процессе продукции IgE, мы оценили индекс отношение уровней экспрессии ([мРНК STAT6]/ [STAT6]) этих молекул при БА. Было выявлено, что значения этого индекса значимо положительно коррелировали с уровнем сывороточного IgE у больных НАБА (г Пирсона=0,508; р=0,001; п=42). У больных НАБА тяжёлого течения эта корреляция была очень сильной: г Пирсона=0,927; р<0,001; п=18)

Данные факты, по-видимому, свидетельствуют о том, что STAT6, влияет не только на синтез цепей IgE, но и на его дальнейший процессинг и выведение из клетки, и именно с этим связан его эффект в патогенезе АБА и НАБА.

Взаимодействие транскрипционных факторов РАХ-5, NF-кВ и STAT6 в патогенезе аллергической бронхиальной астмы

Внутриклеточные системы лимфоцитов являются, как известно, ключевыми факторами развития различных патологических процессов: опухолей, аллергического воспаления, иммунодефицитов. Ранее мы уже рассматривали роль сигнальной системы JAK-STAT (Janus-kinase - signal transductor and activator of transcription) в развитии и течении бронхиальной астмы). Мы также анализировали роль в патогенезе БА транскрипционного фактора РАХ-5, который как и фактор STAT6 в B-лимфоцитах участвует в процессах синтеза иммуноглобулина Е и рецептора к нему FceR II (CD23). Участие этих двух белков в процессах, значимых в патогенезе бронхиальной астмы, позволяет предположить взаимовлияние этих транскрипционных факторов, поэтому целью нашей работы было выявление возможного взаимодействия РАХ-5 и STAT6 в механизмах развития бронхиальной астмы (БА). Канонической последовательностью ДНК, которую распознаёт STAT6, считается олигонуклеотидный участок 5 ' -TTC-(N4)-GAA-3 ', где N соответствует любому нуклеотиду. Сайт связывания STAT6 может содержать 3 или 2 N. В известной последовательности гена РАХ-5 (NCBI Reference Sequence: NMO 16734.1) нет подобных участков. Однако возможные участки связывания STAT6 есть в некодирующей белок области гена молекулы Id2 (NCBI Reference Sequence: NM_002166) и в нетранслируемой области транскрипционного фактора Е2А (NCBI Reference Sequence: NM_003200.3). Кофактор Id2 (Inhibitor of DNA binding 2) угнетает связывание с ДНК ряда транскрипционных факторов, в том числе связывание транскрипционного фактора Е2А с регуляторными участками гена РАХ-5. Таким образом, можно предположить, что рост экспрессии STAT6 ведёт к увеличению концентрации кофактора Id2, который препятствует связыванию с промотером гена РАХ-5 транскрипционных факторов Е2А, что в итоге влечёт к снижению экспрессии РАХ-5 (рис. 3).

С другой стороны, можно предположить, что STAT6 регулирует и транскрипцию фактора Е2А. Cavalcanti Е et al., анализируя состояние CD8+ Т-лимфоцитов при почечно-клеточном раке, показали, что в этих клетках отмечается однонаправленное снижение концентрации как фактора STAT6, так и кофактора Id2. По данным ряда исследователей, STAT6 может не только активировать транскрипцию, но и угнетать её.

- 18 -

+ C$TAT6"I>TAT6>

Рис. 3. Предполагаемая схема регуляции экспрессии РАХ-5 фактором STAT6.

Эти предполагаемые взаимодействия и тот факт, что при бронхиальной астме с одной стороны уменьшается сила и значимость корреляции между STAT6 и мРНК РАХ-5 по сравнению со здоровыми лицами, а с другой - усиливается эта корреляция при нарастании эозинофилии крови и мокроты, по-видимому, указывают на дисбаланс взаимоотношения транскрипционных факторов при БА. Ранее нами было выявлено утяжеление проявлений БА у больных с высокими уровнями экспрессии STAT6. Возможно, это явление опосредовано через угнетение РАХ-5 путём активации транскрипции Ы2 и угнетения - Е2А.

В В-лимфоцитах, вероятно, существует разветвлённая сеть взаимодействующих транскрипционных факторов и кофакторов, регулирующих секреторную и антиген-представляющую активность этих клеток. Нарушение этого баланса может лежать в основе развития БА. В частности, увеличение экспрессии STAT6, возможно, путём угнетения синтеза факторов Е2А и активации транскрипции Ы2, вызывает снижение продукции РАХ-5. В то же время известно, что STAT6 наряду с РАХ-5 участвует в переключении В-лимфоцитов на синтез IgE. Угнетение экспрессии РАХ-5 с одной стороны препятствует избыточному переключению на IgE, являясь, таким образом, элементом обратной связи для этого процесса, а с другой стороны, по-видимому, позволяет В-клеткам активнее дифференцироваться в плазматические клетки.

Взаимодействие транскрипционных факторов NF-кВ и STAT6 обсуждается относительно недавно, ранее мы предполагали, что полиморфизм гена STAT6 ведёт к нарушению его взаимодействий с NF-кВ (Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А, 2008). Кроме того, С.-Н. Shen и J. Stavnezer

продемонстрировали, что STAT6 физически взаимодействует с субъединицей р50 NF-кВ в экспериментах in vitro и in vivo (Shen C.-H., Stavnezer J., J 998). Взаимодействие этих двух факторов приводило к следующим эффектам: повышалась трансактивационная способность STAT6, увеличивалось сродство STAT6 с его сайтом связывания на ДНК. В то же время способность STAT6 активировать транскрипцию изолированно, даже при наличии нескольких сайтов связывания в промотерах контролируемых генов, оказалась крайне мала. Таким образом, синергизм NF-кВ и STAT6, обусловлен не только их функциональным, количественным взаимодействием, за счёт присутствия сайтов связывания для них в промотерах одних генов, но и качественным изменением свойств STAT6 при его взаимодействии с NF-кВ. С другой стороны, была показана способность STAT6 ингибировать фософорилирование белка IkBa и таким образом препятствовать высвобождению из ингибиторного белкового комплекса субъединицы р65 NF-кВ (Wei, 2002).

При анализе корреляции уровней экспрессии мРНК субъединицы р50 транскрипционного фактора NF-кВ и форм STAT6 у больных БА значимых связей не выявлено. У больных АБА средней степени тяжести имеет место средней силы отрицательная связь между уровнями экспрессии STAT6 и р50 NF-кВ (р=-0,576; р=0,025; п=15).

У здоровых лиц наблюдается значимая положительная корреляция экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ с индексом [мРНК STAT6]/ [STAT6] (р=0,648; п=36, р=0,012). Из этого можно заключить, что у здоровых лиц, по-видимому, имеет место определённый контроль со стороны NF-кВ за экспрессией мРНК STAT6, который нарушается у больных БА.

В то же время факт отрицательной связи уровня экспрессии NF-кВ с уровнем STAT6 при АБА, согласуется с данными Y. Abu-Amer (Abu-Amer Y., 2001) об угнетении интерлейкином 4 остеокластогенеза: STAT6 действует как ингибитор ДНК-связывания фактора NF-кВ в клетках моноцитарно-макрофагального ряда, что препятствует активации генов, необходимых для дифференцировки в остеокласты. Предполагается, что STAT6 может перекрывать сайты связывания NF-кВ с ДНК и таким образом подавлять активность многих NF-кВ-зависимых генов, в том числе ингибировать экспрессию субъединиц самого NF-кВ. По-видимому, STAT6 в разных обстоятельствах действует через разные механизмы. При низком уровне экспрессии STAT6 фактор NF-кВ усиливает его активность, а при высоких концентрациях молекулы STAT6 начинают занимать больше сайтов связывания в промотерах е-зародышевого транскрипта (e-GLT), препятствуя активности NF-kB.

Уровни экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ были значимо положительно связаны с уровнями экспрессии мРНК РАХ-5 в

обследованных группах (г Пирсона=0,488; р=0,018 п=23 в группе контроля; г Пирсона=0,434; р<0,001; п=65 в группе больных АБА; г Пирсона=0,488; р=0,018; п=23 при НАБА).

Возможно, большое количество БТАТ6 приводит к угнетению продукции РАХ-5, что влечёт за собой снижение экспрессии другого транскрипционого фактора □ БСЬб, и тот освобождает сайт связывания в промоторе е-СЬТ (рис. 4). Тогда 8ТАТ6 связывается с этим сайтом и препятствует связыванию со своим сайтом субъединицы р50 ОТ-кВ.

Рис. 4. БТАТ6 конкурирует с транскрипционным фактором ВСЬб за сайт связывания в промоторе ¡;-(ЗЬТ.

Таким образом, при исследовании экспрессии мРНК РАХ-5 было выявлено, что при НАБА РАХ-5 экспрессирован в большей степени, чем при АБА. Это наблюдение соответствует дополнительным данным, полученным при анализе лабораторных показателей: положительная корреляция с уровнями лейкоцитов крови, в том числе - нейтрофилов у больных НАБА. С учётом основной функции фактора РАХ-5, эти факты можно объяснить тем, что РАХ-5, препятствуя дифференцировке В-клеток в плазмоциты, обеспечивает функционирование В-лимфоцитов, в том числе - их антиген-представляющую функцию, то есть В-клетки сохраняют возможность, перерабатывая растворимые антигены, поддерживать иммунный ответ, характерный в данном случае для неаллергической - инфекционно-зависимой БА. В то же время, определённую роль РАХ-5 играет и при АБА. В пользу этого утверждения свидетельствуют факты положительной связи экспрессии мРНК с показателями исследования ФВД (уменьшение явлений бронхообструкции), отрицательной корреляции с эозинофилией мокроты, снижение экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах периферической крови у больных АБА после действия 1Ь-4.

Таким образом, РАХ-5, улучшает, по-видимому, течение АБА, уменьшая степень аллергического воспаления в бронхолёгочной системе и снижая степень бронхообструкции. Это может быть связано с тем, что,

препятствуя дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки, РАХ-5, следовательно, уменьшает образование сывороточного IgE, основным продуцентом которого и являются плазмоциты. Меньший уровень IgE, соответственно, в меньшей степени вызывает дегрануляцию тучных клеток, на поверхности которых присутствуют FcE-рецепторы I типа для связывания IgE, тем самым уменьшая активность экзоцитоза медиаторов аллергического воспаления, в том числе, гистамина. Ингибирование подобной активности тучных клеток, вероятно, способствует уменьшению ими и выделения IL-5, а значит и уменьшению пролиферации и миграционной активности эозинофилов.

Уменьшение экспрессии РАХ-5 в лимфоцитах периферической крови при АБА под действием IL-4, происходит, по-видимому, через посредство транскрипционного фактора STAT6, который передаёт сигнал от IL-4. Экспрессия STAT6 как на белковом уровне, так и на уровне мРНК этого транскрипционного фактора значимо выше при БА, чем у практически здоровых лиц. Кроме этого, экспрессия STAT6 повышена у больных НАБА тяжёлого течения, а в фазе ремиссии НАБА наблюдается уменьшение экспрессии этого транскрипционного фактора.

Данные факты согласуются с результатами корреляционного анализа экспрессии мРНК STAT6 и STAT6 с показателями клеточного состава мокроты: при НАБА экспрессия STAT6 положительно коррелирует с уровнем нейтрофилов, а экспрессия мРНК STAT6 - отрицательно с уровнем эозинофилов. В то же время при АБА наблюдается положительная связь экспрессии мРНК STAT6 с уровнем базофилов, хотя при нарастании экспрессии мРНК STAT6 снижается уровень IL-5. Вероятно, это связано с тем, что при развитии иммуного ответа по ТЬ2-пути, первыми продуцентами IL-5 являются Th2, в которых не экспрессирован РАХ-5, и эта, первая часть IL-5, обеспечивает миграцию и пролиферацию эозинофилов. Затем повышенные концентрации IL-4, также продуцируемого Th2, запускают синтез повышенного уровня мРНК STAT6, что ведёт, вероятно, к постепенному, но отложенному по времени нарастанию экспрессии белка STAT6 (в том числе - в В-лимфоцитах). При высоких концентрациях STAT6 уровни экспрессии РАХ-5 также имеют тенденцию к повышению, благодаря ослабленному контролю со стороны pSTAT6, и тогда РАХ-5 препятствует образованию плазмоцитов, что предотвращает избыточную продукцию IgE, и, вероятно, меньшую активность базофилов и тучных клеток по продукции IL-5, которая, по-видимому, вносит больший вклад в общее количество IL-5.

При АБА уровень экспрессии STAT6 отрицательно связан со значениями показателей исследования ФВД, отражающих бронхиальную проходимость: повышенные уровни STAT6 ассоциированы с нарастанием бронхообструкции.

Причина низкой чувствительности РАХ-5 именно к высоким уровням экспрессии STAT6 может быть, на наш взгляд, обусловлена следующими факторами: РАХ-5 активирует продукцию транскрипционного фактора BCL6, который конкурирует за сайт связывания в промотере e-GLT со STAT6 (рис. 4). Высокие уровни STAT6, вероятно, обусловливают повышенное его связывание с этим сайтом за счёт вытеснения BCL6, тогда STAT6 в меньшей степени связывается с регуляторными участками в гене И2, что ослабляет его контроль за продукцией РАХ-5 (рис. 3).

В фазе ремиссии БА уровни экспрессии STAT6 снижаются, причём при НАБА это снижение является статистически значимым. Снижение экспрессии STAT6, по-видимому, влечёт вытеснение его из сайта связывания в промоторе «е-зародышевого транскрипта» (e-GLT) (транскрипция которого необходима для переключения на синтез IgE и продукции £-тяжёлых цепей), фактором BCL6, тогда свободный STAT6 начинает негативно регулировать экспрессию РАХ-5, и это ведёт к снижению функций В-лимфоцитов. С другой стороны, BCL6 репрессирует ген prdml, с которого транскрибируется фактор Blimp 1, способствующий дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки. По данным A.L. Shaffer et al. (Shaffer A.L., K.I. Lin, T.C. Kuo et al., 2002), Blimpl блокирует экспрессию STAT6 и переключение синтеза иммуноглобулинов, а также может угнетать экспрессию РАХ-5. Таким образом, можно предположить, что, когда STAT6 вытесняет BCL6 из сайта связывания, то свободный BCL6 снимает негативное влияние Blimpl на РАХ-5 и тот начинает экспрессироваться несколько больше. Когда экспрессия РАХ-5 превышает определённый порог, то большие количества BCL6 с одной стороны вытесняют STAT6 из сайта связывания, а с другой стороны - угнетают блокатор транскрипции фактора STAT6 и его экспресссия повышается.

С учётом возможного взаимодействия NF-кВ и STAT6, можно предположить, что РАХ-5 и NF-кВ при АБА, присоединяясь к своим сайтам связывания, обеспечивают транскрипцию СНе, при этом NF-кВ, также связываясь непосредственно со STAT6 усиливает его сродство к ДНК, при этом связь NF-кВ со STAT6 является определяющей. Изолированное повышение STAT6, наоборот, ведёт к угнетению транскрипции СНе, так как без содействия РАХ-5 и NF-кВ активировать её он не может, но также и репрессирует (по-видимому, опосредованно) экспрессию РАХ-5, что ведёт к уменьшению транскрипции СНе.

Таким образом, для продукции СНе РАХ-5 является ключевым фактором, NF-кВ - второстепенным, a STAT6 - вспомогательным и предотвращающим повышение синтеза СНе. При НАБА, которая является преимуществено инфекционно-зависимой, липополисахарид совместно с CD40-CD40L взаимодействием активирует NF-кВ, и, если наблюдается

изначально высокая экспрессия мРНК р50 ЫР-кВ, то можно говорить о большей степени предрасположенности к активации этого сигнального пути, таким образом, высокие уровни мРНК р50 ОТ-кВ предрасполагают к развитию НАБА.

Таким образом, можно предположить, что полученные нами данные о характере экспрессии транскрипционных факторов в микросети РАХ-5, №-кВ и 8ТАТ6 связаны с кпинико-патогенетическими особенностями БА и, вероятно, отражают генетическую детерминированность биологических дефектов, а также, разнородность и комплексность нарушений взаимоотношения транскрипционных факторов при этом заболевании.

Течение БА, её патогенетический вариант и тяжесть, по крайней мере, отчасти, предопределяются сложными соотношениями в микросети транскрипционных факторов В-лимфоцитов.

Дальнейшее изучение и проверка этих предполагаемых взаимодействий позволят анализировать патогенез БА на новом уровне, что может выразиться в разработке новых лекарственных мишеней.

ВЫВОДЫ

1. При бронхиальной астме в лимфоцитах периферической крови выявлены изменения в уровнях экспрессии микросети транскрипционных факторов РАХ-5, ЭТАТб и ОТ-кВ, соответствующие варианту заболевания и его тяжести, а также зависящие от терапии глюкокортикостероидами.

2. Для АБА характерно снижение уровней экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах периферической крови. Кроме этого, повышенные уровни экспрессии 8ТАТ6 и мРНК БТАТб также способствуют ухудшению течения заболевания, возможно, за счёт усиления выраженности аллергического воспаления и бронхообструкции. Напротив, пониженные уровни экспрессии мРНК субъединицы р50 транскрипционного фактора ОТ-кВ при АБА способствуют, вероятно, уменьшению бронхообструкции и, таким образом, улучшению течения заболевания. При АБА в фазе ремиссии не выявлено изменений уровней экспрессии как мРНК РАХ-5, 8ТАТ6, мРНК БТАТб, так и уровней экспрессии мРНК субъединицы р50 фактора №-кВ.

3. Больные НАБА характеризуются повышением экспрессии мРНК РАХ-5 и мРНК субъединицы р50 НБ-кВ, а также повышением экспрессии 8ТАТ6 и мРНК БТАТ6 в лимфоцитах периферической крови. При этом повышенная экспрессия мРНК БТАТб, связана с нарастанием тяжести течения заболевания за счет усиления бронхообструкции. При НАБА в фазе ремиссии наблюдается снижение экспрессии 8ТАТ6 и уровней экспрессии мРНК субъединицы р50 ОТ-кВ.

4. IL-4 вызывает снижение экспрессии мРНК РАХ-5 в лимфоцитах больных АБА, действуя через активацию транскрипционного фактора STAT6. Данный феномен может лежать в основе повышенной дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки при АБА.

5. Для больных Б А, получающих системную глюкокортикоидную терапию характерно нарастание уровней экспрессии мРНК субъединицы р50 NF-кВ, мРНК STAT6, а у больных НАБА дополнительно - увеличение экспрессии мРНК РАХ-5.

6. Транскрипционные факторы РАХ-5 и NF-кВ в лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астме обладают ключевой ролью в синтезе мРНК тяжёлых е-цепей IgE при БА на фоне дефекта синтеза STAT6 в лимфоцитах, выраженного в индексе отношения уровня экспрессии мРНК STAT6 к уровню экспрессии белка STAT6 ([мРНК STAT6]/ [STAT6]), который может приводить к нарастанию продукции IgE при утяжелении течения НАБА.

7. Транскрипционные факторы РАХ-5, STAT6 и NF-кВ взаимодействуют друг с другом в патогенезе БА, формируя комбинацию уровней экспрессии

в лимфоцитах, предрасполагая, вероятно, к формированию определённого клинико-патогенетического варианта бронхиальной астмы: высокие уровни экспрессии STAT6 при сниженных уровнях экспрессии РАХ-5 и повышенных уровнях экспрессии NF-кВ - к формированию и утяжелению течения АБА, а высокие уровни РАХ-5 и NF-кВ - формированию НАБА. При НАБА высокие уровни экспрессии мРНК STAT6 способствуют утяжелению и обострению течения заболевания, а низкие - индукции ремиссии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

¡.Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А. Роль полиморфизмов белка STAT6 в развитии бронхиальной астмы // Учёные записки СПб государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова. -2008. - Т.15. - №4. - С.72-73.

2.Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Дубина М.В., Янчина Е.Д. Полиморфизм гена белка STAT6 у пациентов с бронхиальной астмой // Центрально-Азиатский медицинский журнал. — 2009. - T.XV, Приложение 1. - С.21-22.

3. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А. Влияние IL4 на активность транскрипционного фактора STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2009. - Т.Н. - №2-3. - С. 177-184.

4.Минеев В.Н., Сорокина, JI.H., Нёма М.А., Иванов В.А., Сысоев К.А., Трофимов В.И. Экспрессия рецептора к интерлейкину 4 в лимфоцитах при бронхиальной астме // Респираторная медицина: Материалы V Конгресса Евро-Азиатского респираторного общества / - Приложение 1. - Бишкек,

2009.-С. 31-32.

5.Минеев В.Н., Сорокина, JI.H., Нёма М.А. Полиморфизм гена белка STAT6 и бронхиальная астма // Казанский мед. ж. - 2009. - Т.90. -№1.-С.102-109.

6.Минеев В.Н., Сорокина, JI.H., Нёма М.А., Иванов В.А., Сысоев К.А., Трофимов В.И. Экспрессия рецептора к интерлейкину 4 при бронхиальной астме // Сборник трудов XIX Национального конгресса по болезням органов дыхания / - М.: ДизайнПресс, 2009. - С. 43-44.

7.Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М.А., Дубина М.В., Янчина Е.Д. Интронный полиморфизм rs324011 гена белка STAT6 у пациентов с различной тяжестью течения бронхиальной астмы // Казанский мед. ж. - 2010. - Т.91. - №1. - С.12-16.

8.Минеев В.Н., Сорокина, JI.H., Нёма М.А., Трофимов В.И. Экспрессия транскрипционного фактора GATA-3 в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2010. - Т.12. - №1-2. - С.21-28.

9.Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И., Нёма М.А., Иванов В.А. Рецепторы к IL-4 и IL-13: строение, функция и генетический полиморфизм // Пульмонология. - 2010. - №3. - С.113-120.

10. Минеев В.Н., Сорокина JI.H., Нёма М.А., Тотолян Арег.А., Сысоев К.А. Экспрессия альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину 4 при бронхиальной астме // Вестник Санкт-Петерб. ун-та, 11-я серия. -

2010. - №2. — С.86-93.

11. Минеев В.Н., Сорокина JI.H., Нёма М.А., Иванов В.А., Линкин Г.И. Роль транскрипционного фактора РАХ-5 в иммунологических процессах // Медицинская иммунология. - 2011. -Том 13. - №6. - С. 569-580.

12. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А., Иванов В.А., Липкин Г.И. Роль транскрипционного фактора РАХ-5 в патогенезе бронхиальной астмы // Медицинская иммунология. - 2012. - Том 14. -№4-5. - С. 347-352.

13. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А., Успенская Ю.К. Эпигенетические механизмы действия транскрипционных факторов в патогенезе бронхиальной астмы // Учёные записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова. - 2012. - Том 11.- №1.- С. 6-11.

14. Трофимов В.И., Минеев В.Н., Сорокина JI.H., Нёма М.А., Лим В.В., Еремеева A.B. Значение кооперации транскрипционных факторов STAT6, STAT4, GATA-3 и T-bet при бронхиальной астме // Медицинский академический журнал. - 2013. -Том 13. -№1-2. — С. 21-28.

15. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Еремеева A.B., Нёма М.А.,

Беденко A.C. Патогенетическая роль кооперативных взаимодействий транскрипционных факторов FOXP3, GATA-3, РАХ-5 при бронхиальной астме // Медицинская иммунология. - 2013. - Том 15. -№4.-С. 303-312.

16. Sorokina L., Mineev V., Nyoma М., Trofimov V. New aspects of the action of IL-4 on the activity of the transcription factor STAT6 in allergic and non-allergic asthma // European Respiratory Journal. - 2009. -Vol. 34. - Suppl. 53.-P. 371s.

17. Sorokina L., Mineev V., Nyoma M., Dubina M., Yanchina E. Intronic polymorphism rs324011 of STAT6 gene in patients with different courses of bronchial asthma // European Respiratory Journal. - 2009. -Vol. 34. - Suppl. 53. -P. 137s.

18. Mineev V., Nyoma M., Sorokina L., Dubina M., Yanchina E., Trofimov V. Protective effect of intronic polymorphism rs324011 of STAT6 gene on asthma severity // European Respiratory Journal. - 2010. -Vol. 36. - Suppl. 54. - P. 777s.

19. Sorokina L., Mineev V., Nyoma M., Ivanov V., Trofimov V. Protective effect of transcription factor PAX-5 (BSAP) on asthma severity // European Respiratory Journal.-2011.-Vol. 38.-Suppl. 55.-P. 115s.

Подписано в печать 16.10.2013 Усл..печ.л. 2,0 Формат 60*84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 1/1704 199178, г. Санкт-Петербург, В.О., 11-я линия, 22 ИП Златов С. А.