Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы программируемой гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме

На правах рукописи

ИВАНЧУК Игорь Иванович

МЕХАНИЗМЫ ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ ЭОЗИНОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск - 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН г. Москва

Огородова Людмила Михайловна

Жданов Вадим Вадимович

Лишманов Юрий Борисович Федорова Татьяна Сергеевна

Защита состоится « »_2005 г. в_°° часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, Россия, Томск, Московский тр., 2)

С диссертацией можно ознакомится в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Россия, Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан « »

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Суханова Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям бронхиальная астма (БА) - заболевание, сопровождающееся хроническим аллергическим воспалением бронхов, обусловливающим повторяющиеся эпизоды бронхиальной обструкции и гиперреактивность дыхательных путей [GINA 2002]. Повсеместно отмечается увеличение распространенности атопических заболеваний, причем достоверные причины роста заболеваемости БА остаются неизвестными [Чучалин А.Г. 2004; Огородова Л.М. 2002; King M.E., 2004]. Последние годы отмечены тенденцией роста смертности от БА [Chang, 2004; King М.Е., 2004].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении БА за последнее десятилетие, благодаря пересмотру концепции патогенеза атопических заболеваний, созданию новых классификаций, методов оценки персистирующего воспаления, возможности терапевтических подходов все еще остаются ограниченными, по существу патогенетическими [Ревякина В.А. 1999; Krishna M.T., 2002; Robinson D.S., 2003]. Во многом такая ситуация обусловлена отсутствием полной картины патогенеза атопических болезней и исчерпывающих данных о первичных наследуемых биологических дефектах, приводящих к возникновению и хронизации воспаления, хотя участие полигенных наследуемых факторов в механизмах формирования различных атопических заболеваний не вызывает сомнения [Федосеев Г.Б., 2001; Пузырсв В.П., 2002; Cookson W., 2002; Gao P.S., 2004].

Атопия, как иммунобиологический феномен, чрезвычайно распространена в популяции. По данным последних исследований, она встречается у 30% -50% населения в разных странах [GINA 2002; King ME., 2004]. В то же время распространенность атопических заболеваний, то есть клиническая манифестация атопии, значительно ниже. Данный факт свидетельствует о наличии группы патогенетических факторов, помимо классического признака атопии - гиперпродукции IgE, приводящих к реализации иммунологических нарушений. В этой связи внимание многих исследователей привлечено к молекулярно-генетическим нарушениям, сопровождающим БА, в частности механизмам изменения программируемой гибели клетки.

Интерес к апоптозу обусловлен прежде всего тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом сигнал-проводящих систем изменение которых имеет большое патогенетическое значение и для БА [Chilvers E.R., 1998; Letuve S., 2002; Duncan C.J., 2003; Simon H.U., 2003]. Кроме этого, сигналы, ингибирую-щие и, напротив, индуцирующие апоптоз, являются ключевыми в патогенезе БА (интерлейкины, ростовые факторы, глюкокортикостероиды и т.д.). Снижение апоптотической активности эозинофилов, ключевых эффекторных клеток воспаления при БА, обусловливает их персистенцию в очаге воспаления, что приводит к усилению инфильтрации стенки бронхов эозинофилами и повреждению эпителия дыхательных путей при БА [Kieilman В., 1994; Desreumaux Р.,1996; Duncan C.J., 2003; Walsh G.M., 2003].

В работах, посвященных изучению молекулярно-генетических механизмов БА, чаще всего рассматривается аспект регуляции активности провоспали-

тельных медиаторов. Немного работ посвящено оценке апоптотической гибели эффекторных клеток, однако, в большинстве случаев они сводятся к феноменологической оценке апоптоза или изучению активности ограниченного числа проксимальных эффекторов клеточной гибели [Jang A.S., 2000; Fine A., 2000]. Интегральная оценка значения пролиферативной, функциональной и апоптотической активности эффекторных клеток при БА практически отсутствует. В незначительном количестве имеющихся обзоров по данной теме прослеживается ряд противоречий. В частности, практически нет данных об участии продукта гена р53 в патогенезе БА. В то же время известно, что транскрипционный фактор р53 является универсальным регулятором клеточного цикла, который способен влиять на пролиферацию, функциональную активность клетки, активировать проапоптотические гены, а также подавлять активность антиапоптотиче-ских генов [Chang N.S., 2003].

Вышеизложенное определяет актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска в области молекулярных механизмов программируемой гибели клетки как возможного патогенетического фактора при БА.

ЦЕЛЬ: установить особенности регуляции и реализации механизмов программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой.

ЗАДАЧИ

1. Изучить активность апоптотической гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

2. Оценить экспрессию проапоптотических (ВАХ, BAD, BCLXS, AIF) и анти-апоптотических (BCL2, BFL1, BCLXL, CIAP1, CIAP2) эффекторов в эози-нофилах периферической крови больных бронхиальной астмой различной тяжести до и после лечения.

3. Установить значение транскрипционных факторов в регуляции экспрессии про- и антиапоптотических эффекторов методом исследования экспрессии генов (NF-kB, p53) и их ДНК-связывающей способности.

4. Исследовать закономерности и механизмы влияния глюкокортикостероид-ной терапии на уровень про- и антиапоптотических эффекторов в эозино-филах периферической крови больных бронхиальной астмой.

5. Выявить особенности механизмов реализации программы апоптоза эозинофилов периферической крови у больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

Научная новизна

Впервые с использованием современных высокоинформативных молеку-лярно-биологических методов проведена комплексная оценка проапоптотиче-ских и антиапоптотических систем в эозинофилах периферической крови больных БА различной степени тяжести, в разные периоды заболевания, включая оценку динамики этих эффекторов на фоне ингаляционной глюкокортикосте-роидной терапии.

Приоритетными являются данные, характеризующие механизм угнетения программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных БА, реализующийся через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов и их преобладание над проапоптотическими. Степень нарушения программируемой гибели эозинофилов периферической крови ассоциирована с тяжестью заболевания и активностью воспаления при Б А.,

Впервые показано, что повышенная экспрессия гена ингибитора циклин-зависимых киназ независимо от тяжести и периода заболевания, яв-

ляется маркером стабильного нарушения внутриклеточного метаболизма в эо-зинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой. Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р21*аП/с,р1 с показателями апоптотической гибели эозинофилов, сильная положительная корреляция с содержанием эозино-филов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспалитель-ных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотическими эффекторами BCLXL, ВСЬ2, ВРЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль в реализации провоспалительных и антиапоптотических эффектов при бронхиальной астме.

Новыми являются данные о том, что в эозинофилах больных БА в период ремиссии, на фоне снижения экспрессии NF-kB-транскрипционно-зависимых провоспалительных и антиапоптотических эффекторов существенно повышена ДНК-связывающая способность нуклеарного фактора -кВ. Это свидетельствует о том, что фоне ингаляционной глюкокортикостероидной терапии формируется механизм селективной транскрипционной активности NF-kB в отношении про-воспалительных и антиапоптотических генов-мишеней.

Приоритетными являются данные о том, что экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 в эозинофилах периферической крови снижены при обострении бронхиальной астмы, повышаются в период ремиссии, не достигая контрольных значений. ДНК-связывающая активность нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию, коррелирует с тяжестью бронхиальной астмы.

Сформулирована новая концепция о роли экспрессии гена р53 и его транскрипционной активности в формировании апоптотического статуса эози-нофилов периферической крови больных БА и его значение в патогенезе БА.

Впервые показано, что эозинофилы периферической крови больных БА имеют высокий антиапоптотический статус, что может свидетельствовать о коммитированости антиапоптотического статуса на этапе дифференцировки эо-зинофилов в костном мозге. Формирование антиапоптотического статуса осуществляется путем селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоп-тотическим стимулам через механизм посттрансляционной модификации функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (NF-kB) и программы клеточной гибели (р53).

Теоретическая и практическая значимость исследования Результаты проведенного исследования дают возможность разрабатывать мероприятия первичной профилактики бронхиальной астмы, посредством раннего выявлением доклинических состояний у лиц с предрасположенностью к

БА, и формировать индивидуальные рекомендации по предупреждению перехода скрытых биологических дефектов в состояние клинической манифестации болезни.

Проведенное комплексное изучение регуляции программируемой гибели эозинофилов больных БА с выделением характерных апоптоз-ассоциированных синдромов создали весомые предпосылки для использования выявленных особенностей транскрипционной и пострансляционной регуляции непосредственно в клинической практике.

Установленные в исследовании новые патогенетически важные для БА молекулярные маркеры могут стать фармакогенетическими мишенями для разработки новых терапевтических подходов в лечении бронхиальной астмы.

Результаты исследований могут быть использованы в процессе последипломного образования аллергологов, иммунологов, пульмонологов.

Положения, выносимые на защиту

1. Содержание эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза снижено у больных БА. Степень снижения ассоциирована с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и диффе-ренцировки эозинофилов (ГМ-КСФ, ИЛ-5) и с активностью воспаления.

2. Нарушение программы гибели эозинофилов периферической крови при БА реализуется через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов, что приводит к снижению апоптоза эозинофилов. Коммитиро-ваность антиапоптотического статуса эозинофилов больных БА наблюдается на уровне периферической крови, что может быть следствием селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоптотическим стимулам на этапе дифференцировки в костном мозге.

3. Апоптозиндуцирующий эффект ингаляционной глюкокортикостероидной терапии у больных легкой и среднетяжелой БА реализуется путем увеличения экспрессии BCLXS, ВАХ и снижения активности ингибиторов кас-паз CIAP1, CIAP2, следствием чего является активация каспазного каскада апоптотической гибели. У больных тяжелой БА ведущим проапоптотиче-ским эффектом глюкокортикостероидов является повышение экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора (AIF) и усиление альтернативного пути апоптоза.

4. Базисным механизмом изменения программируемой гибели эозинофилов периферической крови при БА является посттрансляционная модификация функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (NF-kB) и программы гибели клетки (р53).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН, г. Курск, 2002 г.; на конференции «Functional Genomics» г. Boston, Massachusetts, США, 2002 г.; на конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск, 2003, 2004 г.; на Европейском респираторном конгрессе, г. Вена, 2003 г., г. Глазго, 2004 г.; на XIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2003 г.;

на конгрессе «3-rd Congress of Europian Region International Union against Tu-berkulosis and Lung Diseases (IUATLD)» и 13 конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2004 г.; на IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!", г. Томск, 2004 г.

Внедрение результатов исследований

Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета и кафедре биохимии и молекулярной биологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре патофизиологии Сибирского государственного медицинского университета и кафедре клинической аллергологии и иммунологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Методы РТ-ПЦР апоптотических факторов и метод оценки ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов адаптированы и внедрены в практику научных исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 11 журнальных статей, из которых 9 - в журналах, рекомендованных... ВАК РФ.

Объем и структура диссертации Работа изложена на 207 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, главы собственных наблюдений и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 47 рисунками и 36 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 199 работы, из которых 21 отечественных и 178 зарубежных авторов.

Работа выполнена на базе отдела биохимии (зав. отд.- к.м.н. А.Э. Сазонов) и отдела молекулярной биологии (зав. отд. - к.м.н. И.И. Иванчук) Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Байков), научно-исследовательском учреждении «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук (директор института академик Власов В.В), кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф,- профессор, д.м.н. Л.М. Огородова), кабинета функциональной диагностики Областного детского центра клинической иммунологии-аллергологии областной детской больницы, г. Томск (зав. каб. -И.А. Деев), Астма-центра областной клинической больницы, г. Томск (гл. врач - КМН. Б.Т Серых).

Материалы и методы исследования

Клинические исследования

В период 2000 - 2004 гг. в Областном детском центре клинической иммунологии-аллергологии областной детской больницы и в Астма-центре областной клинической больницы было обследовано 160 человек в возрасте от 14 до

65 лет: 30 здоровых и 130 больных БА с легкой (п=30), среднетяжелой (п=42) и тяжелой (п=58) формой заболевания.

Критерии включения пациентов с бронхиальной астмой

□ Амбулаторные и стационарные пациенты.

□ Возраст пациентов от 14 до 65 лет.

Р Положительные результаты кожных аллергопроб.

□ Пациенты, имеющие ранее подтверждённый диагноз бронхиальной астмы.

• 1 группа: лёгкая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы чаще, чем 1 раз в неделю, но реже чем 1 раз в день; ночные симптомы чаще 2 раз в месяц, но не чаще 1 раза в неделю; вариабельность ПСВ (ОФВ|) 20 - 30%, при этом ОФВ] > 80% о т должного П(Ж > 89% т персонального лучшего (ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек., ПСВ - пиковая скорость выдоха);

• 2 группа: среднетяжелая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы ежедневные; ночные симптомы чаще 1 раза в неделю; ежедневное использование короткодействующих -агонистов; вариабельность ПСВ (ОФВ|) более 30%, при этом ОФВ1 60 - 80% от должного и ПСВ 60 - 80% от персонального лучшего;

• 3 группа: тяжёлая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы ежедневные; частые ночные симптомы; ограничение физической активности; вариабельность ПСВ (ОФВ1) более 30%, при этом ОФВ| < 60% от должного и ПСВ < 60% от персонального лучшего;

Пациенты, у которых (концентрация метахолина, вызывающая па-

дение ОФВ1 на 20% и более) в метахолиновом тесте < или = 8 мг/мл;

Пациенты, не получавшие (в течение последнего месяца) терапии следующими препаратами: глюкокортикостероиды (системные, ингаляционные, топические), антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные Р? - агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб;

Пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний в течение предшествующих включению в исследование 4 недель;

Пациенты, умеющие правильно пользоваться ингалятором, пикфлоумет-ром, способные адекватно оценивать своё состояние, а также своевременно и верно заполнять дневники самоконтроля (ПСВ - утро, вечер; оценка дневных и ночных симптомов).

Критерии включения в контрольную группу

Возраст пациентов от 14 до 65 лет; отрицательные аллергопробы; ^Е < 100 МЕ/мл; отсутствие аллергических заболеваний на момент включения и в анамнезе; пациенты, не получавшие (в течение последнего месяца) терапии следующими препаратами: глюкокортикостероиды (системные, топические),

антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные ß2 - агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб. Пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний.

Для лечения БА применялись следующие фармакотерапевтические режимы: группа 1 (больные лёгкой персистирующей БА): флутиказона пропионат 200 мкг/сутки; сальбутамол 100 мкг - по требованию; группа 2 (больные сред-нетяжелой персистирующей БА): серетид 50/100 х 2/сутки; сальбутамол 100 мкг - по требованию; группа 3 (больные тяжелой персистирующей БА): серетид 50/250 х 2/сутки; сальбутамол 100 мкг - по требованию.

Больные атопической БА были обследованы в период обострения (до лечения) и ремиссии (спустя 12 недель после начала лечения).

Исследование функции легких

Оценка функциональных тестов была проведена во всех группах пациентов. Для оценки характера нарушений ФВД и доказательства обратимости бронхообструкции были определены OФB1 (спирометрия) и ПСВ (пикфлоумет-рия). Исследование проводилось утром, использовались 3 попытки, регистрировалась наилучшая. Для оценки уровня неспецифической бронхиальной гиперреактивности проводилась метахолиновая проба (ПКго). Функцию легких оценивали с использованием спирографа MasterScope (Erich Jaeger GMBH, Германия) в соответствии с требованиями Американского торакального общества.

Получение периферической крови

Периферическую (венозную) кровь забирали из локтевой вены утром, натощак в стерильную пробирку, содержащую 2,5 мл 3% раствора ЭДТА, в объеме 10 мл.

Определение абсолютного и относительного содержания эозинофилов в периферической крови

Относительное и абсолютное содержание эозинофилов определяли общепринятыми методами [Новицкий В., 1999].

Определение неспецифического IgE в сыворотке крови

Определение неспецифического IgE в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью стандартного набора реагентов «Вектор БЕСТ IgE - ИФА - БЕСТ - стрип» согласно приложенной инструкции.

Определение уровня ИЛ-5

Определение свободного ИЛ-5 в сыворотке крови проводили методом ИФА с использованием стандартного набора реагентов «CyTELISA-IL-5» согласно приложенной инструкции.

Определение уровня ГМ-КСФ

Определение ГМ-КСФ в сыворотке крови проводили методом ИФА с использованием стандартного набора реагентов «Pro Con GM-CSF» согласно приложенной инструкции.

Получение обогащенной суспензии ядросодержащих клеток из периферической крови

Полученную кровь с 3% ЭДТА (4:1), инкубировали 45-60 мин при температуре 37°С. Образовавшийся над эритроцитами слой плазмы осторожно собирали пастеровской пипеткой и переносили в стерильную пробирку. Добавляли 0,9% NaCl (1:1) и центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Затем удаляли супернатант и повторяли процедуру. Супернатант сливали, осадок использовали для дальнейшего исследования.

Вьщеление эозинофилов из периферической крови

Выделение эозинофилов проводили на трех градиентах плотности фиколла (молекулярная масса 400000) и 35% раствора урографина : 1,082, 1,092 и 1,115 г/см3. Клетки над выбранными градиентами плотности (1,115 - эозинофилы нормальной плотности; 1,092 - эозинофилы высокой плотности) собирали пипеткой в центрифужную пробирку и дважды отмывали раствором Хенкса [Берестецкий А. Б., 1997].

Культивирование эозинофилов

Для культивирования использовали культуральную среду следующего состава: среда RPMI - 1640 (Sigma, USA), 10% эмбриональная бычья сыворотка, 100 ЕД/мл пенициллина. Эозинофилы ресуспендировали в 200 мкл культураль-ной среды, определяли клеточность и жизнеспособность и помещали в лунки микропланшеты. Инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Мазки готовили после 24-часового культивирования клеток [Kravtsov V., 1998].

Оценка жизнеспособности клеток (с трипановым синим)

Для определения числа эозинофилов в суспензии и их жизнеспособности использовали 1% раствор трипанового синего на изотоническом растворе хлорида натрия. Подсчет клеток производили в камере Горяева. Окрашивание клеток трипановым синим расценивали как признак необратимого повреждения плазматической мембраны.

Оценка содержания фрагментированной ДНК клеток периферической крови

Для выделения клеточных ядер использовали метод, описанный Сун [Sun D.Y., 1993]. Изолированные ядра центрифугировали при 200g 10 мин. Суперна-тант сохраняли. Осадок дополнительно лизировали и центрифугировали при 10000g в течение 20 мин и 4 °С. Супернатант собирали и сохраняли, осадок ре-суспендировали в 0,5 мл того же раствора. Преципитацию ДНК проводили в 75 % этиловом спирте при 4 °С в течение ночи. Содержание ДНК в осадке и су-пернатанте оценивали на спекрофотометре СЭФ-56 при длинах волн 260, 280, 320 нм. Процент фрагментированной ДНК определяли отношением количества ДНК в супернатанте к общему количеству ДНК (осадок и супернатант) [McCarthy N.J., 1998].

Электрофорез ДНК эозинофилов периферической крови

Данный метод использовали для качественной оценки апоптотической гибели клеток. Выделение ДНК для электрофореза проводили по методу Мармура [Marmur J., 1961]. Электрофорез ДНК проводили в 1,5 % агарозе с добавлением 1 мкг/мл бромистого этидия при напряжении 20 В/см в течение 15-30 мин. Гель фотографировали под ультрафиолетовой лампой. На электрофореграммах апоптотическая фрагментация ДНК выглядела как «лесенка» из фрагментов

ю

ДНК различной длины. Неспецифическая фрагментация ДНК (в случае некротической гибели клеток) представляла собой сплошную светящуюся полосу. Полоса свечения интактной ДНК находилась в районе старта.

Цитоморфологический анализ апоптотической гибели клеток

Морфологический анализ апоптотической гибели клеток проводили на препаратах, приготовленных из культуральной суспензии эозинофилов по общепринятой методике. Мазки окрашивали по Нохта-Максимову (азур И-эозин). Анализ препаратов проводили на микроскопе «БИОЛАМ» (Россия) при увеличении об. 90 х ок. 10. При анализе использовали критерии, характеризующие кариопатологические и цитопатологические изменения в клетках [Allen R.T., 1997]. Подсчитывали не менее 200 клеток.

Оценка апоптотической гибели клеток с помощью люминесцентной микроскопии

Исследуемый клеточный материал после промывки холодным раствором Хенкса инкубировали при 37 °С в темном месте 10-20 мин с раствором, содержащим 1:10000 водного раствора акридинового оранжевого. Подсчитывали число жизнеспособных (со слабо флюоресцирующим ядром) и мертвых (ярко флюоресцирующее ядро) элементов на 100 клеток [Allen R.T., 1997].

Выделение тотальной рибонуклеиновой кислоты (РНК)

Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA» (QIAGEN, Германия). Принцип метода основан на связывании РНК с сорбентом с последующей ее элюцией специальным буфером. Выделение проводили согласно приложенной инструкции.

Анализ экспрессии мРНК

Из тотальной РНК получали полиА-РНК (мРНК). Выделение проводили на колонках с олиго-dT целлюлозой (ICN, США). РТ-ПЦР выполняли с помощью набора «Titan One Tube RT-PCR System» (Roche Diagnostics, Германия) согласно приложенной инструкции. Амплификацию ДНК проводили с использованием специфических праймеров для AIF, BAD, ВАХ, BCL2, BCLXL/S, BFL1, CIAP1, CIAP2, ИЛ-5, ГМ-КСФ, NF-kB, p21, р53. Все праймеры синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе («Биосет», Новосибирск).

Для каждой пары праймеров подбирали соответствующую концентрацию Mg и программу амплификации. Экспрессию мРНК оценивали полуколичественно в сравнении с экспрессией мРНК глицеральдегид-3-фосфат дегидрогена-зы (ГАФДГ). Ген этого фермента относится к постоянно экспрессирующим (house keeping) генам, и его экспрессия является стабильной и постоянной во всех клетках организма. Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 2% агароз-ном геле. Изображения электрофореграмм получали с использованием стационарной видеосистемы и обрабатывали при помощи компьютерной программы «Biotest D» с целью получения количественной информации по каждой пробе. Для каждой пробы результат оценки экспрессии мРНК ГАФДГ принимали в качестве эталонной пробы, а количественное значение - за 100%.

Оценка ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов (EMSA- анализ)

В работе была исследована ДНК-связывающая способность транскрипционных факторов NF-kB и р53. Экстракцию белка проводили методом Bohrer [BohrerH., 1997].

Реакцию связывания проводили в пробирках (200 мкл) содержащих: 1 мкл (20 нг/мкл) каждой олигонуклеотидной последовательности, содержащей сайты связывания (5'-CACCTCAGAC ATGTCTGGAG ACCCTAGGAC GACAAGCCCA GGGCA-3') для p53 и (5'- TGAGGGGACTTTCCCA -3') для NFkB, 2 мкл экстракта ядерного белка, 2 мкл 5-кратного связывающего буфера (20% глицерина, 5 mM MgCl2, 2,5 тМ ЭДТА, 2,5 тМ ДЦТ, 250 mM NaCl, 50 тМ Tris-HCl, рН 7,5, 0,25 мг/мл poly(dl-dC)) и 5 мкл деионизованной воды. Реакционную смесь инкубировали 15 мин при температуре 37°С. Параллельно ставили пробу контроля специфичности, содержащую 100-кратную концентрацию каждого двухцепочечного олигонуклеотида, без экстракта ядерного белка, и стандартный контроль, содержащий 1 мкл двухцепочечного олигонуклеотида с сайтом связывания для неиндуцибильного транскрипционного фактора ОСТ-1 (5 - TGTCGAATGCAAATCACTAGAA - 3'). ДНК-протеиновые комплексы были фракционированы в 6% полиакрнламидном геле. Детекцию ДНК-протеиновых комплексов проводили в УФ трансиллюминаторе, после окрашивания геля флюороресцентным красителем SYBR Green I. Изображения элек-трофореграмм получали с использованием стационарной видеосистемы и обрабатывали при помощи адаптированной компьютерной программы «Biotest D» с целью получения количественных данных ДНК-связывающей способности факторов транскрипции. Для каждой пробы результат оценки ДНК-связывающей способности факторов транскрипции ОСТ-1 принимали в качестве эталонной пробы, а количественное значение - за 100%. Исследование было выполнено в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, г. Москва (директор, д.м.н., профессор, академик РАМН Кубатиев А.А).

Статистическая обработка результатов

Математические расчеты проводили с помощью пакета программ "Statis-tica for Windows 5.0". Вычисляли среднее арифметическое значение (М), стандартное отклонение (s),. Выявление межгрупповых различий проводили по критерию Крускала-Уоллеса с применением поправки Бонферони. В связи с тем, что распределение полученных цифровых данных не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых совокупностей. Для оценки различий зависимых совокупностей использовали парный критерий Вилкоксона. Для выявления наиболее значимых показателей, по которым наблюдались межгрупповые различия, был проведен пошаговый дискриминантный анализ. Для выявления зависимости между группами факторов были проведены факторный, регрессионный и кластерный анализы. Для оценки корреляционных связей использовали коэффициент корреляции рангов Спирмена. Изменения считались значимыми при достоверности p<0.05.

Результаты и их обсуждение

Клинико-функциональная характеристика больных бронхиальной

астмой

Клинические и параклинические исследования были выполнены во всех группах пациентов (больные легкой, среднетяжелой и тяжелой БА). Оценка функциональных тестов была проведена для верификации

диагноза БА и оценки эффективности лечения. Было установлено, что терапия ингаляционными глюкокортикостероидами (ИГКС) оказалась эффективной во всех группах и привела к значительной положительной динамике показателей функции легких.

Помимо проведения функциональных тестов у пациентов было определено абсолютное и относительное содержание эозинофилов в периферической крови. Динамика абсолютного и относительного содержания эозинофилов в целом совпадала, поэтому при анализе результатов был использован показатель относительного содержания эозинофилов. Лечение привело к снижению уровня

Однако ни в одной из исследуемых групп этот показатель не достиг значений контроля (рис. 1).

В результате морфологической оценки апоптоза эо-зинофилов периферической крови больных БА установлено значительное снижение количества клеток с морфологическими признаками апоптоза по сравнению с показателями в группе контроля (рис.2).

Наблюдаемое количество эозинофилов с признаками апоптотическои морфологии в группах больных легкой и среднетяжелой астмой после курса ИГКС не отличалось от значений в контроле, в то время как у пациентов с тяжелой астмой значения апоптотической гибели эозинофилов оставались после лечения на низком уровне как в сравнении с легкой и среднетяжелой астмой, так и с показателями в контроле (рис. 2).

По результатам дискриминантного, регрессионного и кластерного анализов установлено, что активность апоптотической гибели эозинофилов в большей степени взаимосвязана с показателями функции внешнего дыхания у больных БА. Не отмечено зависимости показателя апоптоза эозинофилов от степени тяжести в период обострения БА.

эозинофилов в периферической крови.

Летая астма Сраднетяжелая Тяжелая астма Контрольная астма

Рис. 1. Количество эозинофилов периферической крови V больных бронхиальной астмой до и после лечения

В период ремиссии наблюдалась достоверная корреляция этого показателя со степенью тяжести (коэффициент Спирмена г=0,34, p=0.001). Показана обратная зависимость значений апоп-тоза эозинофилов до лечения с показателями гиперреактивности после лечения (коэффициент корреляции Спирмена г =-0,36, р= 0,0004). Отмечена корреляция между апоптозом эози-нофилов после лечения и

значениями ПСВ как до, так и после лечения (коэффициенты корреляции Спирмена соответственно).

При оценке уровня общего IgE у больных БА установлено, что данный признак, в первую очередь, отражает патогенетическую структуру заболевания в представленной выборке пациентов. Значения общего IgE у больных БА (легкая форма - 366,3±34,6 МЕ/мл; среднетяжелая -4ЭД7:837,3 м л ; тяжелая -350,5±19,9МЕ/мл) достоверно превышали уровень указанного показателя у представителей группы контроля (47,6±2,7МЕ/мл). Не было выявлено достоверных различий в группах с различной степенью тяжести заболевания.

Экспрессия мРНК экстраклеточных ре1уляторов апоптотической гибели эозинофилов у больных БА

К ключевым факторам, влияющим на индекс пролиферация/апоптоз эозинофилов при БА, относят ИЛ-5 и ГМ-КСФ. Кроме этого ИЛ-5 стимулирует дифференцировку эозинофилов из костномозговых клеток-предшественников, активирует их дегрануляцию и высвобождение активных продуктов воспаления [Baldwin G.C., 1992; Robinson D., 1993].

В результате предварительной оценки уровня экспрессии мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ в клетках периферической крови установлен достаточный для анализа уровень экспрессии этих генов как в группах больных БА так и в контроле (рис. 3). Это позволило включить все выше перечисленные регуляторные факторы в изучаемые показатели во всех исследуемых в данной работе группах.

Проведенный корреляционный анализ между значениями активности мРНК ИЛ-5, ГМ-КСФ в эозинофилах периферической крови и их содержанием в сыворотке крови у больных БА, установленным методом ИФА, выявил достоверную взаимосвязь между этими показателями. Так, коэффициент корреляции Спирмена между экспрессией мРНК ИЛ-5 и уровнем его продукта в сыворотке крови составил Г=0,94, р<0,001, для ГМ-КСФ установлено значение г=0,82, p<0.001.

во

N 40

30 20 100

Юбострмм

|ИР—1ИССНИ I J

iii\

Легкая астма Среднетяжелая Тяжелая астма Контрольная

Рис. 2. Активность апоптотической гибели эозинофилов периферической крови у больных бронхиальной

астмой до и после лечения

Рис. 3. Пример электрофореграммы. Экспрессия мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ у больных Б А. 1 - контроль; 2 - больные легкой БА; 3 - больные легкой БА после лечения; 4 - больные тяжелой БА; 5 - больные тяжелой БА после

лечения._

Данный факт позволил нам в дальнейшем адекватно экстраполировать значения экспрессии мРНК как реальные показатели содержания цитокинов у больных БА.

В результате оценки экспрессии мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ зарегистрировано двукратное увеличение данных показателей в периоде обострения у больных БА по сравнению со значениями в группе контроля (р<0.001) (рис. 4 А, Б). Оценка исследуемых параметров в период ремиссии показала существенное снижение экспрессии мРНК ИЛ-5, и ГМ-КСФ (р<0.001) у больных БА (рис. 4 А, Б). Вместе с тем экспрессия мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ в группе больных легкой (р=0.08; р=0.52, соответственно) и среднетяжелой (р=0.06; р=0.37, соответственно) астмой не только существенно снизилась по сравнению с показателями до лечения, но и не отличалась от значении в группе контроля. Экспрессия мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ у больных тяжелой астмой, несмотря на значительное снижение после курса терапии, по-прежнему оставалась достоверно выше значений в контроле (рис. 4 А, Б).

В результате факторного анализа показателей как до, так и после лечения были выделены две главных компоненты (табл. 1). В период обострения БА в первый фактор вошли параметры, характеризующие обструкцию бронхов

50*-

Лагеая астма Сраднатякалая Тталая астма Контрольная астма группа

Рис. 4. Экспрессия мРНК ИЛ-5 (А) и ГМ-КСФ (Б) у пациентов с легкой, среднетяжелой и тяжелой бронхиальной астмой до и после лечения_

(0ФВ1, ПСВ) - «фактор обструкции». Структура второго фактора включала в себя показатели экспрессии цитокинов воспаления (ИЛ-5, ГМ-КСФ). В целом экспрессия ИЛ-5 и ГМ-КСФ определяет активность пролиферации, дифферен-цировки и силу ответа клеток воспаления, участвующих в патогенезе БА. В связи с этим второй фактор может быть назван как «фактор регуляции клеточного ответа».

Таблица 1

Факторный анализ функциональных и лабораторных тестов у больных БА в период обострения и ремиссии__

Обострение Ремиссия

Фактор 1 Фактор 2 Фактор 1 Фактор 2

Пока- Факторная Показа- Факторная Показа- Факторная Пока- Факторная

затель нагрузка тель нагрузка тель нагрузка затель нагрузка

ОФВ1 -0,88 ИЛ-5 0,70 Апоптоз 0,73 ОФВ1 0,88

ПСВ -0,91 ГМ-КСФ 0,80 ИЛ-5 -0,84 ПСВ 0,78

ГМ-КСФ -0,93

Анализ исследуемых показателей, полученных после лечения, также позволил выделить два основных фактора. Однако необходимо отметить, что в период ремиссии показатели, определяющие обструкцию бронхов (ОФВ1, ПСВ) вошли в фактор 2, причем с положительным знаком влияния на «фактор обструкции». Структура первого фактора включила в себя показатели экспрессии мРНК ИЛ-5 и ГМ-КСФ. Кроме того, в первый фактор с положительной корреляцией вошел показатель активности апоптотической гибели эозинофи-лов. В соответствии с этим обозначение данного компонента как «фактор регуляции клеточного ответа» можно считать обоснованным. При этом значения апоптотической гибели эозинофилов тесно связаны с экспрессией мРНК ГМ-КСФ, что подтверждается анализом корреляционных связей между этими показателями (коэффициент корреляции Спирмена Следует отметить также высокий уровень корреляции между экспрессией ИЛ-5 и активно -стью апоптоза эозинофилов (коэффициент корреляции Спирмена p<0.001).

Таким образом, содержание эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза снижено у больных БА. Степень снижения ассоциирована с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ, ИЛ-5), а также с активностью воспаления.

Активность экспрессии мРНК про- и антиапоптотических эффекторов в эозинофилах у больных БА

Развитие апоптотической гибели клетки зависит от внутриклеточного баланса про- и антиапоптотических эффекторов. В настоящее время к ключевой внутриклеточной системе регуляции апоптоза относят семейство BCL-2-белков, которое включает в себя агонистов (ВАХ, BCLXS, BAD) и антагонистов апоптоза (BCLXL, BCL-2, BFL-1). Не менее важное значение в механизмах апоптоза

имеет система проксимальных ингибиторов каспаз, к которой относятся протеины из семейства IAP (CIAP1, CIAP2). Значительна роль системы, обеспечивающей альтернативный (каспаз-независимый) механизм программируемой клеточной гибели, ключевым эффектором которой является апоптоз-индуцирующий фактор (AIF). Таким образом, соотношение в активности всех вышеперечисленных систем эффекторов в конечном итоге определяет динамику и тип клеточной гибели.

В результате предварительной оценки уровня экспрессии мРНК проапоп-тотических (ВАХ, BCLXS, BAD, AIF) и антиапоптотических (BCLXL, BCL-2, BFL-1, CIAP1, CIAP2) эффекторов в эозинофилах периферической крови больных астмой установлен достаточный для анализа уровень экспрессии данных генов как в группах больных БА, так и в контроле (рис. 5). Это позволило включить все эффекторы в изучаемые показатели во всех исследуемых группах.

В результате оценки экспрессии мРНК про- и антиапоптотических эффекторов в общей выборке больных БА установлено значительное увеличение активности мРНК таких антиапоптотических факторов как BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2 по сравнению с показателями в контроле (рис. 6).

GAPDH BdXi/1 ВсП Вт ОЛИ ЛОГ CIAP1 Bri Bal

Контроль I ^^ ^^ ^Jj m J^J

Обострение ^^ ^^ Щ ^ | ^ Щ Щ

— BSBIIIIIB

Рис. 5. Пример электрофореграммы. Экспрессия мРНК про- и антиапоптотических эффекторов у больных БА

Необходимо отметить порядковое увеличение у больных БА экспрессии ключевого антиапоптотического эффектора BCL2 (11,05±0,20 % против 0,40±0,09 % в контроле) и кратное увеличение активности мРНК BFL1 (16,3±0,62 % при значении в контроле 3,40±0,17 %) (рис. 6). В противоположность антиапоптотическим эффекторам, активность мРНК проапоптотических эффекторов у больных БА была сопоставима с таковыми в группе контроля. Некоторое увеличение экспрессии мРНК у больных БА было отмечено только для проапоптотического эффектора BAD.

Рис. 6. Экспрессия мРНК про- и анти-апоптотических эффекторов в эози-нофилах у больных легкой, среднетя-желой и тяжелой БА до и после лечения (процент изменения экспрессии относительно значений в контроле)

После лечения в группе больных легкой и среднетяжелой БА установлено значительное повышение уровня мРНК ВАХ, ВСТЖ (р<0.05) и снижение экспрессии ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВКЬ1, С1АР1 и С1АР2 (р<0.05), при этом отмечалась нормализация показателя апоптотической гибели эозинофилов. Данные результаты свидетельствуют об обратимости состояния нарушенного апоптоза при легкой и среднетяжелой БА на фоне терапии ИГКС. У больных тяжелой БА экспрессия антиапоптотических эффекторов (ВСЬ2, ВКЬ1, С1АР1 и С1АР2) оставалась повышенной и после лечения. Во всех группах больных отмечалось значительное повышение эффектора альтернативного пути апоптоза АЩ как в период обострения так и в ремиссию (рис. 6).

Таким образом, активная экспрессия антиапоптотических эффекторов ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВЕЫ существенно снижает вероятность реализации митохонд-риального пути апоптоза, а высокий уровень мРНК С1АР1, С1АР2 блокирует и рецепторный механизм программы клеточной гибели в эозинофилах больных БА. У больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой в период обострения программа клеточной гибели реализуется главным образом через активацию апоптоз-индуцирующего фактора (АЩ - альтернативного механизма апоптоза, а в ремиссии ключевым является активация рецепторного пути за счет снижения экспрессии ингибиторов каспаз С1АР1 и С1АР2, что в целом приводит к увеличению апоптоза эозинофилов до значений в контроле. Тяже-

лая бронхиальная астма в период обострения характеризуется драматическим повышением экспрессии антиапоптотических (BCLXL, BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2) и снижением проапоптотических (BCLXS) эффекторов в эозинофилах периферической крови. На фоне лечения наблюдается некоторая активация ми-тохондриальных эффекторов апоптоза (BCLXS, BAX), однако в условиях повышенной экспрессии ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) ключевым механизмом реализации программы клеточной гибели становится повышение экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора (AIF).

Экспрессия мРНК регуляторов программируемой клеточной гибели в эозинофилах больных БА

Ключевым регулятором пролиферативной и апоптотической активности в клетке является продукт гена р53, который относится к транскрипционным факторам и способен активировать проапоптотические гены, а также подавлять активность антиапоптотических генов. Наряду с этим, р53 способен регулировать фактор транскрипции NF-kB, активация которого приводит к продукции широкого спектра провоспалительных цитокинов и антиапоптотических эффекторов. Белок р21 *п/с'р| является р53-транскрипционнозависимым и относится к ингибиторам циклинзависимых киназ из семейства Cip/Kip [Le N. T.V, 2003]. Высокий уровень p21w•f,/ci^,, повышает резистентность клетки к оксида-тивному стрессу, подавляет транскрипционную активность р53 и уменьшает чувствительность клетки к апоптотическим сигналам [Javelaud D., 2002].

В результате оценки экспрессии мРНК р53 у больных БА установлено почти двухкратное изменение данного показателя в период обострения по сравнению со значениями в группе контроля. В ремиссию у больных легкой и среднетяжелой астмой уровень мРНК р53 достоверно повысился по сравнению с обострением и практически не отличался от контрольных значений (табл. 2). У больных тяжелой астмой терапия ИГКС не привела к изменению экспрессии мРНК р53. Уровень мРНК р53 в эозинофилах больных тяжелой БА был значительно ниже, чем у больных легкой и среднетяжелой БА.

Экспрессия мРНК нуклеарного фактора кВ возрастала прямо пропорционально тяжести заболевания. Причем в обострении во всех группах пациентов БА этот показатель был выше чем в контроле. На фоне лечения уровень мРНК NF-kB достоверно снизился только в группе тяжелой БА, но остался повышенным по сравнению с контрольными значениями.

При оценке экспрессии мРНК p21Waf"Clpl у больных БА установлено существенное увеличение уровня этого гена. В период ремиссии экспрессия гена p2jWafi/Cipi значимо снижалась у больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА по сравнению с показателями до лечения, однако во всех группах уровень MPHKp21WafI/Clp' по-прежнему оставался существенно выше контрольных значении.

Таблищ 2

Уровень мРНКр53, NF-kB и p21Wafl/Clpl в эозинофилах больных бронхиальной астмой (М ± т, U-тест Манна-Уитни)

Примечание Рк - значимость различий при сравнении с показателями в контрольной группе; Рс - значимость различий при сравнении с показателями у пациентов со среднетяжелой астмой, Рт - значимость различий при сравнении с показателями у пациентов с тяжелой астмой

Оценка функциональной активности факторов транскрипции (]Е-кВ и р53)

Для оценки функциональной активности нуклеарных факторов (ЫР-кБ и р53) в эозинофилах больных БА был проведен БМ8-тест (екСхорЫогеИс-тоЫШу-вЫй). Оценка ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора ЫР-кБ была выполнена у 36 больных БА до лечения и в период ремиссии (рис. 7).

Функциональная активность нуклеарного фактора р53 исследована у 37 больных БА в период обострения и ремиссии. БМ8-тест нуклеарных факторов был выполнен также у 10 здоровых доноров.

У больных БА в период обострения установлено статистически значимое повышение ДНК-связывающей способности ЫР-кБ и двукратное снижение функциональной активности транскрипционного фактора р53 по сравнению с показателями в контроле (рис. 8). Межгрупповой ана-

Рис 7. Пример электрофореграммы ЕМ8-теста для факторов транскрипции ]\Е-кВ и р53 ДНК-связывающая активность ]\Е-кВ и р53 в эозинофилах здоровых доноров (линия 1), больных легкой (линия 2), среднетяжелой (линия 3) и тяжелой (линия 4) БА в период обострения Линия 5 - контроль специфичности (100-кратная концентрация двухцепочечного олигонуклеотида) Линия 6 - стандартный контроль (неинду-цибельный транскрипционный фактор ОСТ-1)

лиз различий ДНК-связывающей способности транскрипционного фактора ЫР-кБ у больных БА в период обострения показал, что при всех формах БА данный

параметр был существенно выше значений в контрольной группе. Между группами больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА статистически значимых различий по данному показателю не установлено.

Следует отметить, что вопреки ожидаемому, после терапии ИГКС, ДНК- связывающая способность нуклеарного фактора -кВ повысилась в 1,4 раза по сравнению с показателями до лечения и стала в 2 раза выше контрольных значений (рис. 8А).

Интересно, что если экспрессия мРНК КБ-кВ у больных БА в период ремиссии снизилась, то ДНК-связывающая активность КБ-кВ в этот же период, напротив, увеличилась. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии прямой взаимосвязи между экспрессией мРНК КБ-кВ и его функциональной активностью в эози-

Рис. 8. ДНК-связываюшая способность №-кВ (А) и р53 (Б) у пациентов с легкой, среднетяжелой и тяжелой бронхиальной астмой до (обострение) и после (ремиссия) лечения

нофилах периферической крови больных БА. Данный факт подтверждает проведенный корреляционный анализ исследуемых показателей. Так, коэффициент корреляции Спирмена между экспрессией мРНК КБ-кВ и ДНК-связываюгцей способностью ЫГ-кВ у больных БА в период обострения составил 1=0,27 (р=0,01), а в период ремиссии г=0,07 (р=0,48).

ДНК-связывающая способность транскрипционного фактора р53 у больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА в период обострения была существенно ниже значений в контроле. После лечения, несмотря на положительную динамику, в эозинофилах больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА ДНК-связывающая способность р53 оставалась статистически значимо ниже по сравнению с контрольными показателями (рис. 8Б).

Таким образом, в результате комплексной оценки экспрессии генов и функциональной активности транскрипционных факторов р53 и КБ-кВ установлено, что в период обострения у больных БА различной степени тяжести наблюдается увеличение экспрессии гена и функциональной активности фактора транскрипции КБ-кВ и снижение уровня мРНК и ДНК-связывающей способности транскрипционного фактора р53. В период ремиссии у больных БА регистриру-

ется некоторое снижение уровня мРНК нуклеарного фактора КБ-кВ, наряду с этим отмечается почти двухкратное повышение его ДНК-связывающей способности. Функциональная активность и уровень мРНК транскрипционного фактора р53 повысились в эозинофилах больных легкой и среднетяжелой БА. У больных тяжелой БА, напротив, наблюдалось снижение уровня мРНК р53 и отсутствие изменений в функциональной активности этого фактора. На фоне ИГКС терапии ни в одной из групп больных БА исследуемые параметры не достигли значений контроля.

Для оценки взаимосвязи между значениями и

ключевыми клинико-патогенетическими показателями, характеризующими тяжесть БА (активность апоптотической гибели эозинофилов, количество эози-нофилов в ПК, уровень ИЛ-5 и ГМ-КСФ, ОФВ1, ПСВ, ПК20), был выполнен корреляционный анализ. В результате установлена высокая обратная корреляционная взаимосвязь между степенью тяжести заболевания и ДНК-связывающей активностью нуклеарного фактора р53 как в период обострения (г=-0,56, р<0,001), так и в ремиссию (г=-0,84, р<0,001).

Взаимосвязь экспрессии мРНК р53 с тяжестью заболевания также имела значимые коэффициенты корреляции Спирмена (обострение г=-0,29, р=0,006; ремиссия г=-0,34, р<0,001), однако данная зависимость носила нелинейный характер. Данный факт, возможно, связан с особенностями конформационной структуры белка р53 у больных БА и, соответственно, иными или новыми его внутриклеточными эффектами, в меньшей степени зависящими от экспрессии гена.

Показана значительная взаимосвязь экспрессии мРНК ГМ-КСФ с матричной активностью р53 у больных БА как в период обострения (г= 0,87, р<0,001) так и в ремиссию Однако следует обратить внимание, что ес-

ли в период обострения данная зависимость была положительной, то после лечения ИГКС приобрела отрицательный характер.

Анализ корреляционных зависимостей между активностью КБ-кВ и ключевыми показателями, характеризующими тяжесть БА, продемонстрировал прямую положительную взаимосвязь активности фактора (экспрессия мРНК и ДНК-связывающая активность) и тяжести заболевания в период обострения

соответственно). Данная ассоциация вероятно реализуется путем влияния на функцию легких, с параметрами которой (ОФВ1, ПСВ и ПК20) показатели экспрессии мРНКМР-кВ продемонстрировали отрицательную корреляционную взаимосвязь в период обострения

соответственно). Интересно отметить отсутствие корреляции между активностью КБ-кВ (экспрессия мРНК и ДНК-связывающая активность) и экспрессией его транскрипционнозависимых генов-мишеней (ИЛ-5, ГМ-КСФ, ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВРЬ1, С1АР1, С1АР2). Возможно этим объясняется и отсутствие взаимосвязи с показателями апоптоза эозинофи-лов.

Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р21ЧГаП/С|р' с показателями апоп-тотической гибели эозинофилов, положительная корреляция с содержанием эо-

зинофилов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспали-тельных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотических эффекторов ВСЕХЪ, ВСЬ2, ВБЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль р21*аШС'р1 в реализации провоспалительных и антиапоптотических эффектов ИЛ-5 и ГМ-КСФ у больных бронхиальной астмой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных исследований можно заключить, что в эози-нофилах периферической крови больных БА увеличена активность антиапоптотических проксимальных эффекторов, способных ингибировать апоптоз как митохондриального так и рецепторного пути, и не изменена активность про-апоптотических эффекторов (рис.9).

дйодаш

Рис. 9., Гипотетическая схема взаимодействия про- и антиапоптотических эффекторов и регуляторов апоптоза в клетке.

Подобный дисбаланс в системе апоптоза может быть связан либо с генетическим дефектом в регуляторных и/или эффекторных генах, либо с особенностями коммитирования механизмов апоптоза на этапе дифференцировки эози-нофилов.

Повышение апоптотической активности эозинофилов периферической крови больных легкой и среднетяжелой БА в период ремиссии на фоне существенного дисбаланса апоптотических факторов в сторону антиапоптотических эффекторов, по всей видимости, связан с глюкокортикостероид-опосредованным увеличением экспрессии ВСЬХЗ, ВАХ и снижением активности ингибиторов каспаз (С1АР1, С1АР2). В свою очередь, повышение апоптотической гибели эо-

зинофилов у больных тяжелой БА на фоне активации антиапоптотических эффекторов связано, вероятно, с высоким уровнем экспрессии апоптоз-активирующего фактора (АШ).

В условиях многофакторности механизмов воспалительного ответа важно разделять эффекторы, изменение активности которых является патогенетически важным, от эффекторов, которые являются сопутствующими основному процессу и косвенно связаны с реальным механизмом конкретного нарушения. В случае такой патологии как БА изменение в балансе про- и антиапоптотических факторов в клетке и, в целом, снижение апоптотической активности, в частности эозинофилов, на наш взгляд является сопутствующим эффектом, отражающим более серьезную системную молекулярную патологию.

В настоящее время БА рассматривается как полиэтиологическое хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей с наследственной компонентой. БА может быть вызвана воздействием на организм аллергенов инфекционного происхождения (вирусы, микоплазмы, бактерии, грибы), атопической природы (пыльца растений, пыль, шерсть животных, пищевые продукты), а также химических, механических, физических и метеорологических факторов. Совершено очевидно, что при столь разнообразной природе этиологических факторов, имеющих совершенно различные молекулярные и физико-химические механизмы влияния на живые системы, но в конечном итоге приводящих к типичной при БА патоморфологической и клинической картине, в организме должна быть общая критическая мишень воздействия этих факторов.

На наш взгляд такой мишенью может быть транскрипционный фактор р53, контролирующий широкий спектр регуляторных и эффекторных генов через регуляцию транскрипции и прямое (белок-белковое) взаимодействие. При этом допустимо предположение, что у больных БА существует ряд незначительных генетических и, как следствие, функциональных дефектов как в самом гене р53, так и в генах регуляторной группы, которые при благоприятных условиях могут быть компенсированными.

Так, например, установленное нами снижение матричной и функциональной активности (возможно в результате мутации) транскрипционного фактора р53, может привести к сужению нормы реакции периферических контролируемых им функциональных систем, в частности к ослаблению контроля пролиферации, роста и дифференцировки клетки, к некомпетентности антиоксидантной системы в условиях оксидативного стресса и т.д.

Таким образом, наблюдаемые нами стабильные изменения в экспрессии апоптотических и апоптоз-ассоциированных генов у больных БА как до, так и после лечения являются следствием системной ошибки в регуляции клеточного ответа. Высокий базальный уровень экспрессии антиапоптотических эффекторов при низкой функциональной активности р53 и слабом, в ряде случаев неадекватном, ответе на ИГКС терапию (повышение ДНК-связывающей активности NF-kB) свидетельствует о том, что клетка находится в состоянии рефрак-терности как к экстраклеточным так и внутриклеточным апоптотическим сигналам. Использование в терапии больных астмой ингаляционных глюкокорти-

костероидов, исключающее их прямое действие на эозинофилы периферической крови, предполагает, что наблюдаемые нами на фоне лечения изменения в значениях исследуемых параметров связаны с продукцией дистантных медиаторов воспаления.

Поскольку изменения в регуляторно-эффекторных механизмах апоптоза установлены нами в эозинофилах периферической крови, следовательно, формирование рефрактерного состояния происходит, по всей видимости, на этапе дифференцировки эозинофилов по механизму, схожему с формированием иммунной системы в эбриогенезе. Вероятно, в процессе деления, роста и особенно дифференцировки эозинофилов на фоне высокой оксидативной и цитокиновой нагрузки происходит селекция эозинофилов с высоким антиапоптотическим статусом эффекторного и регуляторного звена апоптоза. Возможно также, что подобный механизм селекции является общим для всех эффекторных клеток воспаления при БА. Необходимо отметить, что эффекты выявленных нами нарушений в системе внутриклеточной регуляции не ограничены исключительно механизмами апоптоза и могут иметь проявления во всех системах регуляции клеточного метаболизма.

Таким образом, в эозинофилах больных БА установлены серьезные нарушения в системе регуляции активности транскрипционных факторов МР-кБ и р53 и, возможно, связанное с ними конститутивное доминирование экспрессии антиапоптотических эффекторов над проапоптотическими. Из полученных нами результатов также следует, что в эозинофилах больных БА, в первую очередь, нарушен (или изменен) механизм посттрансляционной функциональной активации транскрипционных факторов. Причиной посттрансляционной модификации активности факторов транскрипции может быть повышенная экспрессия р21^п/С|р', Высокий у р о дйньмо ж е т быть причиной потери взаимосвязи между экспрессией гена р53 и его ДНК-связываюгцей способностью. Аналогичные эффекты р21,^аП/Сф' могут иметь место и в отношении фактора транскрипции ЫР-кБ, а именно: увеличение ДНК-связывающей способности ЫР-кБ на фоне снижения экспрессии его гена и экспрессии ЫР-кБ-транскрипционно-зависимых генов. Системными последствиями пострансля-ционной модификации активности р53 может стать ослабление контроля пролиферации, снижение репарации, снижение апоптоза, усиление неоангиогенеза и т.д. Модификация транскрипционной активности ОТ-кБ может быть причиной неадекватного (гипер- или гипо-) иммунного ответа и развитие хронического воспаления.

Возможно установленные нарушения генетически детерминированы (компенсированные мутации в основных функциональных и регуляторных доменах) или являются эффектом экзогенного (экстраклеточного) воздействия каких-либо факторов, например, повышения цитокиновой и/или оксидативной нагрузки. Не исключен вариант кооперативного проявления описанных выше механизмов. Из полученных данных следует, что формирование нарушений в системе регуляции активности транскрипционных факторов ЫР-кБ, р53 и апопто-тического статуса очевидно происходит в эозинофилах на этапе дифференци-ровки в костном мозге.

выводы

1. Количество эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза значительно снижено при бронхиальной астме, независимо от тяжести заболевания, и ассоциировано с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ и ИЛ-5). На фоне терапии ингаляционными глюкокортикостероидами уровень эозинофилов с признаками апоптоза повышается, достигая значений контроля при легкой и среднетяжелой астме, и оставаясь достоверно ниже контроля при тяжелой форме заболевания.

2. Уровень мРНК антиапоптотических (BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2) и проапоптотических (BAD, AIF) эффекторов повышен в эозинофилах периферической крови больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой в период обострения. На фоне ингаляционной кортикостероидной терапии уровень мРНК BCL2, BFL1, BCLXL снижается, экспрессия генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) достигает контроля, а проапоптотических генов BCLXS и ВАХ увеличивается при легкой и среднетяжелой астме. При обострении тяжелой астмы увеличена экспрессия всех антиапоптотических эффекторов (BCL2, BFL1, BCLXL CIAP1, CIAP2) и снижена экспрессия гена BCLXS. Отличительной особенностью динамики данных показателей у больных тяжелой астмой на фоне лечения является сохранение высокого уровня экспрессии генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) и увеличение экспрессии апоптоз-идуцирующего фактора AIF.

3. Экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 в эозинофилах периферической крови снижены при обострении бронхиальной астмы, повышаются в период ремиссии, не достигая контрольных значений.

4. Выявлена обратная корреляционная зависимость между тяжестью бронхиальной астмы и ДНК-связывающей активностью нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию. Установлена сильная положительная корреляционная связь экспрессии р53 с матричной активностью ВАХ и BCLXS и отрицательная - с группой антиапоптотических эффекторов BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2 в период ремиссии бронхиальной астмы.

5. Экспрессия гена транскрипционного фактора NF-kB значительно повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой как в обострении так и в ремиссии. Ингаляционная глюкокортикостероидная терапия не сопровождается изменением экспрессии мРНК NF-kB, однако на ее фоне существенно увеличивается ДНК-связывающая способность NF-kB.

6. Проапоптотический механизм ингаляционной глюкокортикостероид-ной терапии у больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой реализуется путем увеличения экспрессии BCLXS, ВАХ и снижения активности ингибиторов каспаз CIAP1, CIAP2, у больных тяжелой астмой - путем повышения экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора AIF.

7. Экспрессия гена ингибитора циклинзависимых киназ p21Wafl/C,pl повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой, независимо от тяжести и периода заболевания. Уровень мРНК р21 Wafl/c,P1 отрицательно коррелирует с количеством апоптотических эозинофилов, и положительно с уровнем эозино-филов периферической крови, с экспрессией мРНК ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоп-тотическими эффекторами BCLXL, BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2 (обострение и ремиссия).

8. Механизм клеточной гибели эозинофилов у больных легкой и средне-тяжелой бронхиальной астмой реализуется в период обострения через активацию апоптоз-индуцирующего фактора AIF, в период ремиссии за счет снижения экспрессии ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2). Особенностью тяжелой бронхиальной астмы является более значимое повышение экспрессии анти-апоптотических эффекторов (BCLXL, BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2) в сравнении с легкой и среднетяжелой астмой, отсутствие нормализации экспрессии ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) и активация альтернативного пути апоптоза в период ремиссии.

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Зависимость содержания клеток с цитогенетическими нарушениями и активности апоптотической гибели лейкоцитов периферической крови от уровня персистенции вируса Эпштейна-Барр // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2001. Приложение 1. С. 63-65 (совместно Н.В. Иванова, А.Э. Сазонов, С.В.Рыжов, Т.М. Исаева).

2. Induction of lymphocyte apoptosis in peripheral blood of the patients with mammary and lung cancer in vitro and of activity of apoptosis of peripheral blood leukocytes disorders // Analytical cellular pathology. 2001, V.22, № 1,2. P.33-34/

3. Апоптотическая реакция лимфоидных клеток при инфекционном моно-нуклеозе// Бюллетень Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. 2001. №З.С. 100-102 (совместно В. В. Новицкий, О. И. Уразова, А.П. Помогаева, Л.С. Литвинова, О.А. Козич, И.О. Наследнико-ва)

4. Продукция интерлейкина-5 (ИЛ-5) у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести // Сборник работ 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН / Под ред. А.В. Завьялова, А.И. Конопли. В 2-х частях. Часть 1. - Курск: КГМУ. - 2002. - С. 96-97 (совместно с Копьевой А.П., Лещевой И.С., Сазоновым А.Э.).

5. Bcl-2 family mRNA and IL-5 mRNA expression in peripheral blood eosino-phils of mild - to - moderate asthmatics // Functional Genomics - Boston, Massachusetts. - 2002. - P. 128 (совместно с A E Sazonov., Petrovsky F.I., Ageeva E.S).

6. Роль интерлейкина-5 в механизмах апоптотической гибели эозинофилов больных бронхиальной астмой // Бюллетень Сибирской медицины. - 2003.

- № 2. - С. 38 - 41 (совместно с Сазоновым А.Э., Петровским Ф.И., Леще-вой И.С., Копьевой А.П., Петровой И.В.),

7. Экспрессия мРНК гомологов семейства Вс1-2 и ИЛ-5 в эозинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой // Журнал Российского медицинского университета. Вестник РГМУ. 2003. № 2 (28). С. 143 (совместно Е.С. Агеева М.А. Сорокина).

8. Экспрессия интерлейкина-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2003. - Т.135. - № 4. - С. 437-440 (совместно с Петровским Ф.И., Сазоновым А.Э., Геренг Е.А., Огородовой Л.М.).

9. The particularity of eosinophils programmed cell death in bronchial asthma // Modern Methods in Cell Biology. - Heidelberg. - 2003. -P. 322. (совместно A E Sazonov, FI Petrovski, L M Ogorodova V V Novitskiy).

10.The role of IL-12 receptor in corticosteroid depended eosinophil apoptosis activation // The 6th World Congress on Inflammation Vancouver. - 2003. -P. 183. (совместно A E Sazonov, FI Petrovski, L M Ogorodova V V Novitskiy).

11.The particularity of eosinophils programmed cell death in bronchial asthma // International Congress of Biochemestry and Molecular Biology. - Toronto. -Canada. -2003. P. 68. (совместно A E Sazonov, E S Ageeva, M V Sorokina FI Petrovski, L M Ogorodova V V Novitskiy).

12.Клиническая значимость определения интерлейкин-5 (IL-5) различными методами в сыворотке крови и мокроте больных бронхиальной астмой // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №4. - С. 38-41 (совместно с Огородовой Л.М., Сазоновым А.Э., Кобяковой О.С., Геренг Е.А., Копьевой А.П.).

13.1ncreased interleukin-5 mRNA expression and Bcl-2 depended eosinophils apoptosis suppression in atopic asthmatics // European Respiratory Society. Annual Congress. - Vienna. - 2003. - P. 455 (совместно с A Sazonov., Ageeva E.S., Petrovski F.I., Ogorodova L.M., Novitskiy V.V.).

14. Induced sputum free interleukin-5 level and its mRNA expression in atopic asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. - Vienna. - 2003. -P. 548 (совместно с A Sazonov., Kobyakova O.S., Ivanova U.V., Kopieva A.P., Lescheva I.S., Ogorodova L. M.).

15.1nterleukm-12 receptor mRNA expression and corticosteroid depended eosinophil apoptosis in asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. -Vienna. - 2003. - P. 223 (совместно с Petrovski F.I., A Sazonov., Petrovskaia I.A., Ogorodova L.M.).

16.Клиническое значение исследования экспрессии гена IL-5 при бронхиальной астме. Пульмонология. - 2004. - №4. - С. 54-59 (совместно с Огородовой Л.М., Кобяковой О.С., Сазоновым А.Э., Петровским Ф.И., Леще-войИ.С).

17.Антагонистические эффекты изоформ рецептора интерлейкина 5 при бронхиальной астме // Медицинская иммунология. - 2004. - № 1-2. - С. 121-126 (совместно с Сазоновым А.Э., Огородовой Л.М., Лещевой И.С., Копьевой А.П., Петровой И.В., Малышевым И.Ю.).

18.Влияние рекомбинантного интерлейкина - 5 на апоптотическую гибель эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2004. - № 1-2. - С. 117-120 (совместно с А.Э. Сазоновым, Огородовой Л.М., Лещевой И.С., Копьевой А.П., Петровой И.В., Малышевым И.Ю.).

19.Изменение экспрессии апоптотических факторов в эозинофилах при бронхиальной астме // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. -Томск: СибГМУ. - 2004. - С. 200-201 (совместно с Поповой И.С., Агеевой Е.С., Петровой И.В., Сазоновым А.Э).

20.Эффекты рецептора интерлейкина 5 при бронхиальной астме // «Науки о человеке» - Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ. - 2004. - С. 213214. (совместно с Копьевой А.П., Сазоновым А.Э.., Поповой И.С.).

21.Linkage between NO synthases polymorphisms and asthma // European Respiratory Society. Annual Congress. - Glasgow. - 2004. - P. 136 (совместно с Petrova I. V.,. A Sazonov., Deyev I.A., Ogorodova L.M.).

22. Activity of pro- and anti- apoptotic factors mRNA expression in eosinophils of asthmatics // European Respiratory Society. Annual Congress. - Glasgow. -2004. - P. 321 (совместно с A Sazonov., Ageeva E. S., Petrova I. V., Ogoro-dova L. M.).

23.Роль нарушения регуляции апоптоза эозинофилов при бронхиальной астме у детей // Сборник научных трудов по итогам IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!". -Томск. - 2004. - С. 82-96 (совместно с Сазоновым А.Э.., Деевым И.А., Никитиной Л.Ю., Агеевой И.П.).

24.Экспрессия мРНК интерлейкина-5, мембраносвязанной и растворимой формы а-субъединицы рецептора интерлейкина-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Физиология и патология иммунной системы. -2004. - Т. 8. - № 6. - С. 29 - 31. (совместно с Огородовой Л.М., Кобяко-вой О.С., Копьевой А.П., Сазоновым А.Э., Лещевой И.С.)

25.3начение транскрипционного фактора р53 в механизмах апоптоза эозинофилов больных бронхиальной астмой // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т. 19. - № 4. - С. 57 - 59. (совместно с Иванчуком И.И., Огородовой Л.М., Петровой И.В., Агеевой Е.С., Кармалитой Е.Г., Вась-ковскиим Н. В.)

26.Bcl-2 family mRNA and IL-5 mRNA expression in peripheral blood eosinophils of mild-to-moderate asthmatics // Medical Science Monitor. -2005. T. 11. - №2. -P. 43-49. (совместно A Sazonov, F Petrovsky, E Ageeva, L Ogorodova, V. Novitsky, E. Manukhina, I. Malyshev).

Условные сокращения

БА - бронхиальная астма

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа ГКС - глюкокортикостероиды

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ЕРО - пероксидаза эозинофилов (eosonophile peroxidase)

ЕСР - катионный протеин эозинофилов (eosinophil cationisches protein)

ИГКС - ингаляционные глюкокортикостероиды

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОФВ] - объем форсированного выдоха за первую секунду

ПК20 - концентрация метахолина, вызывающая падение ОФВ1 на 20% и более

ПКГ - программируемая клеточная гибель

ПСВ - пиковая скорость выдоха

р300/СВР - кофактор транскрипции

Р53 - транскрипционный фактор

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с предварительной реакцией обратной

транскрипции (reverse transcription polymerase chain reaction)

ФНО-а - фактор некроза опухоли-a

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

АР - транскрипционный фактор

NF-kB - транскрипционный фактор кВ «n 1 Wafl/Cipl п

р21 - ингибитор циклинзависимых киназ

/

1151

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям бронхиальная астма - заболевание, сопровождающееся хроническим аллергическим воспалением бронхов, обусловливающим повторяющиеся эпизоды бронхиальной обструкции и гиперреактивность дыхательных путей [GINA 2002]. Повсеместно отмечается увеличение распространенности атопических заболеваний, причем достоверные причины роста заболеваемости астмой остаются неизвестными [Чучалин А.Г. 2004; Огородова Л.М. 2002; King М.Е., 2004]. Последние годы отмечены тенденцией роста смертности от Б A [Chang, 2004; King М.Е., 2004].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении бронхиальной астмы за последнее десятилетие, благодаря пересмотру концепции патогенеза атопических заболеваний, созданию новых классификаций, методов оценки персистирующего воспаления, возможности терапевтических подходов все еще остаются ограниченными, по существу патогенетическими [Ре-вякина В.А. 1999; Krishna М.Т., 2002; Robinson D.S., 2003]. Во многом такая ситуация обусловлена отсутствием полной картины патогенеза атопических болезней и исчерпывающих данных о первичных наследуемых биологических дефектах, приводящих к возникновению и хронизации воспаления, хотя участие полигенных наследуемых факторов в механизмах формирования различных атопических заболеваний не вызывает сомнения [Федосеев Г.Б., 2001; Пузырев В.П., 2002; Cookson W., 2002; Gao P.S., 2004].

Атопия, как иммунобиологический феномен, чрезвычайно распространена в популяции. По данным последних исследований она встречается у 30% - 50% населения в разных странах [GINA 2002; King М.Е., 2004]. В то же время распространенность атопических заболеваний, то есть клиническая манифестация атопии, значительно ниже. Данный факт свидетельствует о наличии группы патогенетических факторов, помимо классического признака атопии - гиперпродукции IgE, приводящих к реализации иммунологических нарушений. В этой связи внимание многих исследователей привлечено к молекулярно-генетическим нарушениям, сопровождающим бронхиальную астму, в частности механизмам изменения программируемой гибели клетки.

Интерес к апоптозу обусловлен прежде всего тем, что этот процесс тесно связан с целым рядом сигнал-проводящих систем изменение которых имеет большое патогенетическое значение и для астмы [Chilvers E.R., 1998; Letuve S., 2002; Duncan C.J., 2003; Simon H.U., 2003]. Кроме этого, сигналы, ингибирующие и, напротив, индуцирующие апоптоз, являются ключевыми в патогенезе бронхиальной астмы (интерлейкины, ростовые факторы, глюко-кортикостероиды и т.д.). Снижение апоптотической активности эозинофилов, ключевых эффекторных клеток воспаления при астме, обусловливает их пер-систенцию в очаге воспаления, что приводит к усилению инфильтрации стенки бронхов эозинофилами и повреждению эпителия дыхательных путей [Kieilman В., 1994; Desreumaux Р., 1996; Duncan С .J., 2003; Walsh G.M., 2003].

В работах, посвященных изучению молекулярно-генетических механизмов астмы, чаще всего рассматривается аспект регуляции активности провоспалительных медиаторов. Немного работ посвящено оценке апоптотической гибели эффекторных клеток, однако в большинстве случаев они сводятся к феноменологической оценке апоптоза или изучению активности ограниченного числа проксимальных эффекторов клеточной гибели [Jang A.S., 2000; Fine А., 2000]. Интегральная оценка значения пролиферативной, функциональной и апоптотической активности эффекторных клеток при бронхиальной астме практически отсутствует. В незначительном количестве имеющихся обзоров по данной теме прослеживается ряд противоречий. В частности, практически нет данных об участии продукта гена р53 в патогенезе бронхиальной астмы. В то же время известно, что транскрипционный фактор р53 является универсальным регулятором клеточного цикла, который способен влиять на пролиферацию, функциональную активность клетки, активировать проапоптотические гены, а также подавлять активность антиапопто-тических генов [Chang N.S., 2003].

Вышеизложенное определяет актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска в области молекулярных механизмов программируемой гибели клетки как возможного патогенетического фактора при бронхиальной астме.

Цель: установить особенности регуляции и реализации механизмов программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой.

Задачи:

1. Изучить активность апоптотической гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

2. Оценить экспрессию проапоптотических (ВАХ, BAD, BCLXS, AIF) и антиапоптотических (BCL2, BFL1, BCLXL, CIAP1, CIAP2) эффекторов в эо-зинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой различной тяжести до и после лечения.

3. Установить значение транскрипционных факторов в регуляции экспрессии про- и антиапоптотических эффекторов методом исследования экспрессии генов (NF-kB, р53) и их ДНК-связывающей способности.

4. Исследовать закономерности и механизмы влияния глюкокортикостеро-идной терапии на уровень про- и антиапоптотических эффекторов в эозино-филах периферической крови больных бронхиальной астмой.

5. Выявить особенности механизмов реализации программы апоптоза эозинофилов периферической крови у больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести заболевания и активности воспаления.

Научная новизна

Впервые с использованием современных высокоинформативных моле-кулярно-биологических методов проведена комплексная оценка проапоптотических и антиапоптотических систем в эозинофилах периферической крови больных астмой в зависимости от степени тяжести, в разные периоды заболевания, включая оценку динамики этих эффекторов на фоне ингаляционной глюкокортикостероидной терапии.

Приоритетными являются данные, характеризующие механизм угнетения программируемой гибели эозинофилов периферической крови больных бронхиальной астмой, реализующийся через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов и их преобладание над проапоптотиче-скими. Степень нарушения программируемой гибели эозинофилов периферической крови ассоциирована с тяжестью заболевания и активностью воспаления при астме.

Впервые показано, что повышенная экспрессия гена ингибитора цик-линзависимых киназ р21У¥аП/Сф1, независимо от тяжести и периода заболевания, является маркером стабильного нарушения внутриклеточного метаболизма в эозинофилах периферической крови больных бронхиальной астмой. Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р21ЧУаП/С1р1 с показателями апопто-тической гибели эозинофилов, сильная положительная корреляция с содержанием эозинофилов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспалительных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотическими эффекторами ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВБЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль р211Л?аП/Сф1 в реализации провоспалительных и антиапоптотических эффектов при бронхиальной астме.

Новыми являются данные о том, что в эозинофилах больных бронхиальной астмой в период ремиссии, на фоне снижения экспрессии МР-кВ-транскрипционно-зависимых провоспалительных и антиапоптотических эффекторов существенно повышена ДНК-связывающая способность нуклеар-ного фактора -кВ. Это свидетельствует о том, что фоне ингаляционной глюкокортикостероидной терапии формируется механизм селективной транскрипционной активности Т^-кВ в отношении провоспалительных и антиапоптотических генов-мишеней.

Приоритетными являются данные о том, что экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 снижена в эозинофилах периферической крови больных астмой. ДНК-связывающая активность нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию, коррелирует с тяжестью бронхиальной астмы.

Сформулирована новая концепция о роли экспрессии гена р53 и его транскрипционной активности в формировании апоптотического статуса эо-зинофилов периферической крови больных астмой и его значение в патогенезе бронхиальной астмы.

Впервые показано, что эозинофилы периферической крови больных бронхиальной астмой имеют высокий антиапоптотический статус, что может свидетельствовать о коммитированости антиапоптотического статуса на этапе дифференцировки эозинофилов в костном мозге. Формирование антиапоптотического статуса осуществляется путем селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоптотическим стимулам через механизм посттрансляционной модификации функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (№-кВ) и программы клеточной гибели (р53).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Результаты проведенного исследования дают возможность разрабатывать мероприятия первичной профилактики бронхиальной астмы, посредством раннего выявлением доклинических состояний у лиц с предрасположенностью к астме, и формировать индивидуальные рекомендации по предупреждению перехода скрытых биологических дефектов в состояние клинической манифестации болезни.

Проведенное комплексное изучение регуляции программируемой гибели эозинофилов больных бронхиальной астмой с выделением характерных апоптоз-ассоциированных синдромов создали весомые предпосылки для использования выявленных особенностей транскрипционной и пострансляци-онной регуляции непосредственно в клинической практике.

Установленные в исследовании новые патогенетически важные для астмы молекулярные маркеры могут стать фармакогенетическими мишенями для разработки новых терапевтических подходов в лечении бронхиальной астмы.

Результаты исследований могут быть использованы в процессе последипломного образования аллергологов, иммунологов, пульмонологов.

Положения, выносимые на защиту

1. Содержание эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза снижено у больных бронхиальной астмой. Степень снижения ассоциирована с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ, ИЛ-5) и с активностью воспаления.

2. Нарушение программы гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме реализуется через стабильное увеличение экспрессии антиапоптотических эффекторов, что приводит к снижению апоптоза эозинофилов. Коммитированость антиапоптотического статуса эозинофилов больных астмой наблюдается на уровне периферической крови, что может быть следствием селекции эозинофилов с высокой резистентностью к апоп-тотическим стимулам на этапе дифференцировки в костном мозге.

3. Апоптозиндуцирующий эффект ингаляционной глюкокортикостероид-ной-терапии у больных легкой и среднетяжелой астмой реализуется путем увеличения экспрессии ВСЬХ8, ВАХ и снижения активности ингибиторов каспаз С1АР1, С1АР2, следствием чего является активация каспазного каскада апоптотической гибели. У больных тяжелой бронхиальной астмой ведущим проапоптотическим эффектом глюкокортикостероидов является повышение экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора (А1Р) и усиление альтернативного пути апоптоза.

4. Базисным механизмом изменения программируемой гибели эозинофилов периферической крови при бронхиальной астме является посттрансляционная модификация функциональной активности ключевых транскрипционных факторов воспалительного ответа (ОТ-кВ) и программы гибели клетки (Р53).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук ЦентральноЧерноземного научного центра РАМН, г. Курск, 2002 г.; на конференции «Functional Genomics» г. Boston, Massachusetts, США, 2002 г.; на конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», г. Томск, 2003, 2004 г.; на Европейском респираторном конгрессе, г. Вена, 2003 г., г. Глазго, 2004 г.; на XIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2003 г.; на конгрессе «З-rd Congress of Europian Region International Union against Tuberkulosis and Lung Diseases (IUATLD)» и 13 конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва, 2004 г.; на IV межрегиональной научно - практической конференции "Здоровье детей - наше будущее!", г. Томск, 2004 г.

Внедрение результатов исследований

Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета и > кафедре биохимии и молекулярной биологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре патофизиологии Сибирского государственного медицинского университета и кафедре клинической аллергологии и иммунологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Методы РТ-ПЦР апоптотических факторов и метод оценки ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов адаптированы и внедрены в практику научных исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 11 журнальных статей, из которых 9 представлены в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 210 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, главы собственных наблюдений и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 48 рисунками и 36 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 199 работы, из которых 22 отечественных и 177 зарубежных авторов.

Работа выполнена на базе отдела биохимии (зав. отд.- к.м.н. А.Э. Сазонов) и отдела молекулярной биологии (зав. отд. - к.м.н. И.И. Иванчук) Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Бай-ков), научно-исследовательском учреждении «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук (директор института академик Власов В.В), кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф.- профессор, д.м.н. Л.М. Огородова), кабинета функциональной диагностики Областного детского центра клинической иммунологии-аллергологии областной детской больницы, г. Томск (зав. каб. - И.А. Деев), Астма-центра областной клинической больницы, г. Томск (гл. врач - к.м.н. Б.Т Серых).

выводы

1. Количество эозинофилов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза значительно снижено при бронхиальной астме, независимо от тяжести заболевания, и ассоциировано с уровнем экспрессии мРНК ключевых факторов роста и дифференцировки эозинофилов (ГМ-КСФ и ИЛ-5). На фоне терапии ингаляционными глюкокортикостероидами уровень эозинофилов с признаками апоптоза повышается, достигая значений контроля при легкой и среднетяжелой астме, и оставаясь достоверно ниже контроля при тяжелой форме заболевания.

2. Уровень мРНК антиапоптотических (BCL2, BFL1, CIAP1, CIAP2) и проапоптотических (BAD, AIF) эффекторов повышен в эозинофилах периферической крови больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой в период обострения. На фоне ингаляционной кортикостероидной терапии уровень мРНК BCL2, BFL1, BCLXL снижается, экспрессия генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) достигает контроля, а проапоптотических генов BCLXS и ВАХ увеличивается при легкой и среднетяжелой астме. При обострении тяжелой астмы увеличена экспрессия всех антиапоптотических эффекторов (BCL2, BFL1, BCLXL CIAP1, CIAP2) и снижена экспрессия гена BCLXS. Отличительной особенностью динамики данных показателей у больных тяжелой астмой на фоне лечения является сохранение высокого уровня экспрессии генов ингибиторов каспаз (CIAP1, CIAP2) и увеличение экспрессии апоптоз-идуцирующего фактора AIF.

3. Экспрессия гена и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора р53 в эозинофилах периферической крови снижены при обострении бронхиальной астмы, повышаются в период ремиссии, не достигая контрольных значений.

4. Выявлена обратная корреляционная зависимость между тяжестью бронхиальной астмы и ДНК-связывающей активностью нуклеарного фактора р53 как в период обострения, так и в ремиссию. Установлена сильная положительная корреляционная связь экспрессии р53 с матричной активностью ВАХ и ВСЬХБ и отрицательная - с группой антиапоптотических эффекторов ВСЬ2, ВИЛ, С1АР1, С1АР2 в период ремиссии бронхиальной астмы.

5. Экспрессия гена транскрипционного фактора №-кВ значительно повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой как в обострении так и в ремиссии. Ингаляционная глюкокортикостероидная терапия не сопровождается изменением экспрессии мРНК №"-кВ, однако на ее фоне существенно увеличивается ДНК-связывающая способность №ЧсВ.

6. Проапоптотический механизм ингаляционной глюкокортикостеро-идной терапии у больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой реализуется путем увеличения экспрессии ВСЬХБ, ВАХ и снижения активности ингибиторов каспаз С1АР1, С1АР2, у больных тяжелой астмой - путем повышения экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора АН7.

7. Экспрессия гена ингибитора циклинзависимых киназ р21ЧУаП/с,р1 повышена в эозинофилах больных бронхиальной астмой, независимо от тяжести и периода заболевания. Уровень мРНК р21у/аП/С|р1 отрицательно коррелирует с количеством апоптотических эозинофилов, и положительно с уровнем эозинофилов периферической крови, с экспрессией мРНК ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотическими эффекторами ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВРЫ, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия).

8. Механизм клеточной гибели эозинофилов у больных легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой реализуется в период обострения через активацию апоптоз-индуцирующего фактора А№, в период ремиссии за счет снижения экспрессии ингибиторов каспаз (С1АР1, С1АР2). Особенностью тяжелой бронхиальной астмы является более значимое повышение экспрессии антиапоптотических эффекторов (ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВРЫ, С1АР1, С1АР2) в сравнении с легкой и среднетяжелой астмой, отсутствие нормализации экспрессии ингибиторов каспаз (С1АР1, С1АР2) и активация альтернативного пути апоптоза в период ремиссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивность исследований проблемы апоптоза в последние годы связана с рядом обстоятельств. Прежде всего, появились методические возможности регистрации различных проявлений апоптоза и анализа его молекулярных механизмов, которые тесно связаны с механизмами других важных процессов (например, активация клеток и связанная с ней биологическая сигнализация). Кроме того, изучение апоптоза оказалось очень продуктивным для понимания ряда важнейших процессов, включая иммунный гомео-стаз и онкогенез. Наконец, в связи с апоптозом возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ патофизиологии. Вместо прежних представлений о гибели клеток многоклеточного организма как отрицательном по значимости явлении, идентифицируемом с некрозом, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым процессом, и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций. Менее очевидной представляется роль апоптоза в развитии патологических процессов. Создается впечатление, что эта форма гибели клеток (в отличие от некроза) не является обязательной составляющей типовых патологических процессов; скорее можно говорить о нарушениях самого апоптоза как основе ряда заболеваний.

В обзоре [Fine А., 2000], подводящем итог 10-летних исследований роли апоптоза в патогенезе заболеваний легких, однозначным является только констатация факта изменения активности апоптотической гибели различных типов клеток при легочной патологии. Однако патогенетическое значение нарушения апоптоза тех или иных клеток остается вопросом открытым до сегодняшнего дня.

По результатам наших исследований можно сделать заключение, что в эозинофилах больных БА увеличена активность антиапоптотических проксимальных эффекторов, способных ингибировать апоптоз как митохондриального так и рецепторного пути, и не изменена активность проапоптотических эффекторов. Подобный дисбаланс в системе апоптоза может быть связан либо с генетическим дефектом в регуляторных и/или эффекторных генах, либо с особенностями коммитирования механизмов апоптоза на этапе дифференцировки эозинофилов.

Повышение апоптотической активности эозинофилов периферической крови больных легкой и среднетяжелой БА в период ремиссии на фоне существенного дисбаланса апоптотических факторов в сторону антиапоптотических эффекторов по всей видимости связан с ГКС-опосредованным увеличением экспрессии BCLXS, ВАХ и снижением активности ингибиторов кас-паз (CIAP1, CIAP2). Повышение апоптотической гибели эозинофилов у больных тяжелой БА на фоне повышенной активности антиапоптотических эффекторов связано с высоким уровнем экспрессии апоптоз-активирующего фактора (AIF) и запуском механизма параптотического типа гибели клетки.

В условиях многофакторности воспалительного ответа важно разделять эффекторы, изменение активности которых является патогенетически важным, от эффекторов, которые являются сопутствующими основному процессу и косвенно связаны с реальным механизмом конкретного нарушения. В случае такой патологии как БА изменение в балансе про- и антиапоптотических факторов в клетке и, в целом, снижение апоптотической активности, в частности эозинофилов, на наш взгляд является сопутствующим эффектом, отражающим более серьезную системную молекулярную патологию.

В настоящее время БА рассматривается как полиэтиологическое хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей с наследственной компонентой. БА может быть вызвана воздействием на организм аллергенов инфекционного происхождения (вирусы, микоплазмы, бактерии, грибы), атопической природы (пыльца растений, пыль, шерсть животных, пищевые продукты), а также химических, механических, физических и метеорологических факторов. При этом, все этиологические факторы являются опосредованными пусковыми механизмами развития и хронизации Б А, и каждый класс факторов формирует свою индивидуальную систему механизмов реализации патологического процесса. Совершено очевидно, что при столь разнообразной природе этиологических факторов, имеющих совершенно различные молекулярные и физико-химические механизмы влияния на живые системы, но в конечном итоге приводящих к типичной при БА патоморфоло-гической и клинической картине, в организме должна быть общая критическая мишень для их воздействия.

На наш взгляд такой мишенью может быть транскрипционный фактор р53, контролирующий широкий спектр регуляторных и эффекторных генов через регуляцию транскрипции и прямое (белок-белковое) взаимодействие. При этом допустимо предположение, что у больных БА существует, ряд незначительных генетических и, как следствие, функциональных дефектов в самом гене р53, и в генах регуляторной группы, которые при благоприятных условиях могут быть компенсированными. Так, например, установленное нами снижение матричной и функциональной активности (возможно в результате мутации) транскрипционного фактора р53, может привести к сужению нормы реакции периферических контролируемых им функциональных систем, в частности к ослаблению контроля пролиферации, роста и диффе-ренцировки клетки, к некомпетентности антиоксидантной системы в условиях оксидативного стресса и т.д. Как показали полученные в работе результаты, важное влияние на снижение активности р53 может оказывать повышенная экспрессия ингибитора циклинзависимых киназ р21¥/аП/с,р1. Высокая экспрессия гена р21^п/Сф1, независимо от тяжести и периода заболевания, является маркером стабильного нарушения внутриклеточного метаболизма в эо-зинофилах больных бронхиальной астмой, характеризующего хроническое воспаление при БА. Обнаруженная отрицательная взаимосвязь р2^УаП/С1р1 с показателями апоптотической гибели эозинофилов, сильная положительная корреляция с содержанием эозинофилов в периферической крови больных, с экспрессией мРНК провоспалительных цитокинов ИЛ-5, ГМ-КСФ и антиапоптотических эффекторов ВСЬХЬ, ВСЬ2, ВБЬ1, С1АР1, С1АР2 (обострение и ремиссия) доказывает важную роль р21ШаП/Сф1 в реализации провоспа-лительных и антиапоптотических эффектов при бронхиальной астме.

Использование в терапии больных астмой ингаляционных глюкокор-тикостероидов, исключающее их прямое действие на эозинофилы периферической крови, предполагает, что наблюдаемые нами на фоне лечения изменения в значениях исследуемых параметров связаны с продукцией дистантных медиаторов воспаления. По всей видимости, наблюдаемые нами стабильные изменения в экспрессии апоптотических и апоптоз-ассоциированных генов у больных БА как до, так и после лечения являются следствием системной ошибки в регуляции клеточного ответа. Высокий ба-зальный уровень экспрессии антиапоптотических эффекторов при низкой функциональной активности р53 и слабом, в ряде случаев неадекватном, ответе на ИГКС терапию (повышение ДГЖ-связывающей активности №ЧсВ) свидетельствует о том, что клетка находится в состоянии рефрактерности как к экстраклеточным так и внутриклеточным апоптотическим сигналам. Поскольку изменения регуляторно-эффекторных механизмов апоптоза установлены нами в эозинофилах периферической крови, следовательно, формирование рефрактерного состояния происходит, по всей видимости, на этапе роста и дифференцировки эозинофилов по механизму, схожему с формированием иммунной системы в эмбриогенезе. Мы предполагаем, что в процессе деления, роста и особенно дифференцировки эозинофилов на фоне высокой оксидативной и цитокиновой нагрузки, происходит селекция эозинофилов с высоким антиапоптотическим статусом эффекторного и регуляторного звена апоптоза. Возможно, что подобный механизм селекции может быть общим для всех эффекторных клеток воспаления при БА. Необходимо отметить, что эффекты выявленных нами нарушений в системе внутриклеточной регуляции не ограничены исключительно механизмами апоптоза и могут иметь проявления во всех системах клеточного метаболизма.

Таким образом, нами установлены серьезные нарушения в системе регуляции активности транскрипционных факторов Т^ПЧсВ и р53 и, возможно, связанное с ним конститутивное доминирование экспрессии антиапоптоти-ческих эффекторов над проапоптотическими в эозинофилах больных БА. Из полученных нами результатов также следует, что в эозинофилах больных БА, в первую очередь, нарушен механизм посттрансляционной функциональной активации транскрипционных факторов. Следствием этого являются инвариантный ответ транскрипционно-зависимых генов-мишеней и изменение в экспрессии самих нуклеарных факторов. Возможно установленные нарушения генетически детерминированы компенсированные мутации в основных функциональных и регуляторных доменах) или являются эффектом экзогенного (экстраклеточного) воздействия каких-либо факторов, например, повышения цитокиновой и/или оксидативной нагрузки. Не исключен вариант кооперативного проявления описанных выше механизмов. Из полученных данных следует, что формирование нарушений в системе регуляции активности транскрипционных факторов 1ЧР-кВ, р53 и апоптотического статуса очевидно происходит в эозинофилах на этапе роста и дифференцировки в костнЯрвиювгаеским использованием полученных в работе результатов, на наш взгляд, является возможность применения у больных БА современных молекулярных методов ген-направленной регуляции (рис. 48).

Акцент ген-направленного воздействия должен быть сделан на модуляции экспрессии и функции гена р53 (как фактора транскрипции так и ци-тозольного регуляторного эффектора). В настоящее время, в связи активным и многолетним исследованием участия р53 в процессе онкогенеза, разработан широкий спектр методов и терапевтических подходов в регуляции и компенсации функциональной недостаточности р53, включая технологию з11ША-модулирования активности ингибиторных генов и направленной активации транскрипции генов-гомологов р53 (рбЗ, р73).

Рис. 48. Схема направленной терапевтической коррекции внутриклеточной дисфункции транскрипционных факторов р53 и ИР-кВ

Вторым важным звеном направленной модуляции эффектов как р53 так и ИР-кВ является регуляция киназных каскадов передачи сигнала (р21у/аП/Сф1, СОК), модулирование этапа транслокациии транскрипционного фактора в ядро и внутриядерная активация ДНК-связывающей способности транскрипционных факторов. Для этого могут быть использованы как общие подходы, например, антиоксидантная терапия для нормализации оксидатив-ного статуса клетки, так и целевые, направленные на конкретные звенья воспалительного процесса, например, цитокиновой регуляции клеточного ответа (анти - ИЛ-5, ГМ-КСФ и т.д.).

На наш взгляд использование современных геномных и постгеномных подходов в лечении БА является актуальным и целесообразным, а с учетом полученных данных о возможных фармакогенетических мишенях, может стать значительно более эффективной в сравнении с традиционными терапевтическими подходами в лечении бронхиальной астмы.