Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Патогенетические факторы развития и течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей

064613719

На правах рукописи

ШУМИЛОВ Петр Валентинович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ И ТЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ КРОНА И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

У ДЕТЕЙ

14.01.08 - педиатрия 14.01.28 - гастроэнтерология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 5 ноя 2010

Москва-2010

004613719

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий »

Защита состоится «24» декабря 2010 г. в «11°°» часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России» по адресу: 117997, Москва, Ленинский проспект д. 117, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Мухина Юлия Григорьевна Потапов Александр Сергеевич

Римарчук Галина Владимировна

Коровина Нина Алексеевна

Калинин Андрей Викторович

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Чернов В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений, и летальности болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) занимают одно из ведущих мест в структуре болезней ЖКТ (Григорьева Г.А., Мешалкина Н.Ю., 2007).

В последние годы отмечается стремительный рост НЯК и, особенно, БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние десятилетия является увеличение распространенности данной патологии среди молодых людей (Dermot Р.В., et al., 2005). По данным Turunen Р., et al. (2006) заболеваемость БК и НЯК у детей и подростков в Финляндии за последнее десятилетие удвоилась. По данным Behrens R., et al. (1996) примерно у 1/3 пациентов первая манифестация ВЗК происходит до достижения ими 18 лет. Beattie R.M. et al. (2006) указывают, что 25% ВЗК манифестируют в детском возрасте. По данным Buller Н., et al. (2002) распространённость этих заболеваний у детей в разных странах колеблется от 2,2 до 6,8 на 100000 населения. В Англии и Ирландии частота впервые выявленных ВЗК у детей составляет 5,2 на 100 тысяч (Sawczenko А., et al., 2001).

В Российской Федерации было проведено единственное эпидемиологическое исследование БК в 1997г., согласно которому распространённость БК в Московской области равна 3,5 на 100 тысяч взрослого населения, заболеваемость БК составляет 0,3 на 100 тысяч взрослого населения (Белоусова Е.А., 1997). Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в России является поздняя диагностика и преобладание тяжелых осложненных форм с высокой летальностью (в 3 раза выше, чем в большинстве стран). Эпидемиологических исследований ВЗК в детском возрасте в Российской Федерации не проводилось.

Этиология ВЗК до сих пор остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как взаимодействие генетической предрасположенности, нарушенной иммунной реактивности, в первую очередь на уровне слизистой оболочки кишечника, нарушенной барьерной функции кишки и повышенной чувствительности к воздействию факторов внешней среды, в том числе кишечной микрофлоре и специфическим антигенам (Kucharzik Т., et al, 2006). Совокупность этих факторов приводит к патологической иммуно-воспалительной реакции в кишечнике с формированием и поддержанием хронического воспаления в пищеварительном тракте.

Генетическая предрасположенность подтверждается многими зарубежными исследованиями. Высокий, 15-кратный риск развития ВЗК отмечается у родственников первой степени родства (Bourma G., Strober W., 2003). Наиболее высокая конкордантность у монозиготных близнецов отмечается при БК и составляет 72%. Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов NOD2/CARD15, DLG5, OCTN1, OCTN2, TLR4, TNFA, IL-1RA и IL-10 (Тошег G., et al., 2003; Ferraris A., et al., 2006; Weersma RK, et al., 2008; Strober W, et al., 2008; Степанова E.B., 2009). Однако степень влияния полиморфных вариантов этих генов у населения разных стран на развитие ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Частота полиморфизмов генов в разных популяциях существенно различается (Hugot J.P., et al., 2001; Ogura Y., et al., 2001; Hampe J., et al., 2001).

Точные механизмы иммунопатогенеза БК и НЯК остаются до конца не известными. При обоих заболеваниях отмечается дисфункция эффекторных и регуляторных клеток, как приобретенного, так и врожденного звена иммунной системы, гиперпродукция медиаторов воспаления, что приводит к «неконтролируемому воспалению» (Pallone F., et al.; Krajina T., et al. 2003). Однако связь этих процессов с активностью и клиническими проявлениями ВЗК требует уточнения.

С другой стороны, микрофлора кишечника является необходимым и, возможно, ключевым фактором в развитии ВЗК и их поддержании. Этот вывод был подтвержден результатами многочисленных экспериментальных и клинических исследований (Rath Н.С., et al., 2001). У больных с ВЗК было выявлено, что кишечная микрофлора претерпевает большие изменения. Они включают в себя высокую сосредоточенность бактерий в мукозном слое, как в воспаленных, так и невоспаленных участках кишечника (Swidsinski A, et al., 2002). Однако, имеющиеся данные недостаточны для понимания механизмов развития этих заболеваний и их клинических проявлений.

ВЗК характеризуются чрезвычайным разнообразием клинических проявлений, темпов прогрессирования и развития осложнений, особенно в детском возрасте. Это требует дифференцированных подходов в диагностике и подборе разной степени интенсивности проводимой терапии. Для обеспечения адекватной тактики ведения больных необходимы четкие диагностические и прогностические критерии, которые до настоящего времени отсутствуют.

Таким образом, научные исследования, изучающие патогенетические механизмы развития ВЗК, направленные на разработку информативных критериев диагностики и прогноза, крайне актуальны.

Цель исследования: Установить факторы прогноза развития и течения БК и НЯК у детей на основании комплексного изучения полиморфизма генов, показателей иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника при разных клинических вариантах ВЗК для оптимизации диагностики, лечения и профилактики заболеваний. Задачи исследования:

1. Изучить частоту полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-полиморфизм), TNF А (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом, их ассоциацию с заболеваниями и разными клиническими вариантами течения и относительный риск развития.

2. Определить особенности иммунного воспалительного процесса у детей при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита по результатам спонтанной и стимулированной продукции цитоклнов в культуре цельной крови и изолированных моноцитов, экспрессии информационной РНК цитокинов и паттерн-раотознающих рецепторов (TLR4, NOD2) в клетках крови и слизистой оболочки кишечника.

3. Изучить состав пристеночной микрофлоры и оценить значение отдельных ее представителей (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

4. Исследовать характер взаимосвязей генетических, иммунных и микробиологических показателей в особенностях развития и течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

5. Определить диагностически значимые показатели генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника в развитии и течении болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

6. Разработать факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите на основании показателей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Научная новизна:

Впервые проведено комплексное изучение генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

Впервые проведено исследование частоты полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-IRA, -308 g/a гена TNFA, -1082 g/a гена IL-10 y детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом в Российской Федерации, изучены ассоциации генотипов с данными болезнями и рассчитан риск развития заболеваний.

Впервые показана роль полиморфных генотипов в развитии особенностей течения и прогрессирования заболеваний, выявлены факторы прогноза развития для каждой нозологической формы.

Установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей с воспалительными заболеваниями кишечника.

Показана роль пристеночной микрофлоры кишечника, особенности состава и значение отдельных ее представителей при течении разных клинических форм болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

Впервые изучены взаимосвязи генотипа, иммунной реакции и пристеночной микрофлоры кишечника при различных клинических вариантах болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей. Выявлены особенности иммуно-воспалительной реакции у детей с различными вариантами полиморфного генотипа.

Выявлены генетические маркеры прогноза эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Практическая значимость:

Выявленные особенности генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника способствуют ранней диагностики, прогнозированию активности, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Показано, что прогноз течения и исхода болезни Крона и неспецифического язвенного колита должен строиться на комплексной оценке особенностей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Наиболее диагностически значимыми при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей являются: исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-гюлиморфнзм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFA,

определение популяционного уровня Lactobacillus и Bifidobacterium в биоптатах слизистой оболочки кишечника и уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, так как позволяют информативно оценить активность и построить прогноз течения заболеваний и эффективности терапии.

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании уровня цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только сывороточного уровня не отражает истинного характера иммуно-воспалительной реакции.

На основании проведенного исследования выявлены факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Внедрение результатов работы. Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской детской клинической больницы, детской городской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы, отделения гастроэнтерологии НЦЗД РАМН.

Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры госпитальной педиатрии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, отдела гастроэнтерологии с гепатологичсекой группой НЦЗД РАМН, Российской детской клинической больницы и детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы; «Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе» (Москва, 2008); VII Российском конгрессе

«Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); XV, XVI Конгрессах детских гастроэнтерологов России и стран СНГ» (Москва, 2008, 2009); Первом Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); 11-ом Международном Славяно-балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2009» Санкт-Петербург, 2009); 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009» (Санкт-Петербург, 2009); И Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов (Москва, 2009); 11 Международном медицинском форуме «Современные медицинские технологии на службе охраны здоровья россиян» (Нижний Новгород, 2010); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 16 статей опубликовано в журналах, рецензируемых ВАК.

Объём и структура диссертационной работы: диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав материалов собственного исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы,

содержащего_источников (_отечественной и_зарубежной литературы). Работа

проиллюстрирована_таблицами и_рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Работа проводилась в период 2006-2010 годов на базе отделений гастроэнтерологии Российской детской клинической больницы, Научного центра здоровья детей РАМН, Государственного научного центра колопроктологии Росмедтехнологий, ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы и инфекционного отделения №2 ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского г. Москвы.

Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось на базе лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, иммунологические исследования - на базе отдела молекулярной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, микробиологические — на базе кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и лаборатории

иммунохимической диагностики ФГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Всего было обследовано 216 пациентов с ВЗК и 209 человек контрольной группы. Среди пациентов с ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей - НЯК.

Диагноз ВЗК основывался на основании оценки жалоб, данных анамнеза заболевания, клинического осмотра и данных лабораторных инструментальных исследований. В обязательном порядке диагноз БК и НЯК верифицировался морфологически. В соответствии с Монреальской классификацией (2005) все пациенты с ВЗК были определены в подгруппы с учетом возраста к моменту установления диагноза, локализации процесса, характера течения заболевания. Для оценки клинической активности при БК использовался педиатрический индекс активности, у пациентов с неспецифическим язвенным колитом был использован клинический индекс активности Rachmilewitz.

Молекулярно-генетические исследования включали исследование образцов ДНК 88 не родственных пациентов с БК и 101 - с НЯК, а также 126 человек из группы популяционного контроля. Оценивалось наличие полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-IRA (VNTR-полиморфизм), TN F А (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) Образцы ДНК выделены из цельной крови. Забор 1 мл крови проводился одновременно с забором крови для планового биохимического исследования из локтевой вены. Генетическое исследование включало следующие этапы: выделение геномной ДНК, мультиплексную лигазную реакцию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), анализ полиморфизма длин амллифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ), электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Иммунологические исследования включали определение уровня TNF-a, TNF-ß, IFN-y, 1L-2, IL-10, IL-8, 1L-6, IL-4, 1L-5, IL-lb, IL-12p70 с использованием цитометрического метода в нативыой сыворотке и в четырех образцах культуры цельной крови и изолированных моноцитов, прошедших стимуляцию белками бактериальных оболочек: LPS (липополисахарид), MDP (мурамилдипептид) и комбинации LPS и MDP. Исследование проведено с помощью цитометра BDFaxCantoFlowCytomix (США) и набора антител к цитокинам BMS810FF (Bender MedSistem GmbH Viena Austria). Выделение

моноцитов проводилось методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads MyPure Monocyte Kit 2 for Untouched human cells, Invitrogen Осло, Норвегия).

Изучение уровня экспрессии мРНК IL-12p70, IL-l-b,2,4,5,6,8,10,TNF-a, TNF-p, IFN-y, NOD2 и TLR4 проводилось в крови и в биоптатах слизистой оболочки сигмовидной кишки у детей с ВЗК и условно здоровых детей. Забор материала для исследования осуществлялся в пластиковую микропробирку, содержащую фиксатор RNA-Later (Ambion, Texas, USA). Выделялась РНК из архивных образцов с использованием набора «Рибо-Сорб» (АмплиСенс, Россия, Москва) ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора в соответствии с методикой производителя. Постановка реакции обратной транскрипции осуществлялась в соответствии с методикой производителя. ПЦР проводили в автоматическом режиме, используя амплификатор Dyad. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием праймеров синтезированых ЗАО «Синтол» (Россия). Детекция флуоресценции в пробирках в режиме реального времени производилась с использованием двух каналов. Канал Orange использовался для детекции флюоресценции внутреннего контроля (GAPDH-ген), длина волны -возбуждение 585 им, эмиссия 610 нм. Канал Уе11о\у-возбуждение 470 нм, эмиссия 510 нм.

Изучение представителей пристеночной микрофлоры (группа Clostridium coccoides, группа Clostridium Upturn, группа Bacteroides fragilis, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella, и кластер Atopobium) проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с помощью группоспецифических праймеров. Выделение ДНК из образцов проводилось по методу Boom с использованием набора ZR Genomic UNA Tissue MiniPrep (ZYMO RESEARCH) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Постановку реакции ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использование готовых 2,5Х ПЦР-смесей («Синтол») в приборе АНК-32 («Синтол»). Флуоресценция в пробирках детектировалась в режиме реального времени на канале FAM (возбуждение 492 нм, эммиссия 520 нм). Значения пороговых циклов определялись автоматически прибором.

Антитела класса IgG к бифидобактериям и лактобациллам определяли с помощью иммуноферментного анализа. Учет результатов на спектрофотометре при длине волны 492нм. Оптическую плотность растворов в каждой ячейке измеряли с помощью многоканального автоматического горизонтального фотометра "Titertech Multiscan МС" фирмы "Flow Laboratories" (Англия).

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета программ BIOSTAT и STATISTICA 6.0. В обработку результатов входил анализ

распределения признаков и их числовые характеристики. В случае, если выборка подчинялась закону нормального распределения, для анализа использовались критерии параметрической статистики с вычислением средней и стандартного отклонения, при сравнении признаков применялся Т-тест. В случаях ненормального распределения, в анализе полученных результатов использовались критерии непараметрической статистики с вычислением медианы и 25%-ой и 75%-ой перцентилей. При сравнении двух независимых признаков использовался критерий Манна-Уитни, а при сравнении зависимых признаков - парный критерий Уилкоксона. Для сравнения долей использовался критерий углового преобразования Фишера. При сравнении однородных величин различия считались достоверными при р<0,05. В целях выявления характера взаимодействия между показателями, характеризующими изменение в организме ребёнка, анализировалась линейная корреляция Пирсона (R) или ранговая корреляция Спирмена (Rs). Корреляционная связь при коэффициенте корреляции до 0,5 расценивалась как низкая, 0,5-0,7- умеренная, 0,7-0,9- сильная. Также проводился расчет рисков с определением соотношение шансов (OR, Odds Ratio) и относительного риска (RR, Risk Ratio). Значите этих показателей считались значимыми, если их 95% доверительный интервал не включал в себя единицу.

Характеристика исследуемых групп.

Нами было обследовано 216 пациентов с ВЗК в возрасте от 2 месяцев до 33 лет, средний возраст составил 13,2±3,97 лет. Длительность заболевания варьировала от 1 месяца до 16,3 лет и в среднем составила 3,9 ± 0,5 года. Среди больных с ВЗК пациенты мужского пола составили 55,5% (120 пациентов), женского пола - 44,4% (96 пациента). Среди больных ВЗК у 97 (44,9%) больных была диагностирована БК и у 119 (55,1%) детей -НЯК.

Группу пациентов с БК (п-97) составили дети (75,3%) в возрасте от 2 месяцев до 17 лет 2 месяцев и взрослые больные (24,7%) в возрасте от 18 до 33 лет, заболевание у которых манифестировало в детстве. Средней возраст группы составил 15,9 0,72 лет. Длительность БК в среднем составила 6,7±1,2 года. Распределение пациентов с БК по полу: мужского пола 59 человек (60,8%) и женского пола 38 (39,2%). Группу больных с НЯК (п-119) составили дети в возрасте от 1,5 лет до 17 лет 10 мес. Средний возраст пациентов с НЯК равен 10,8 ± 0,9. Длительность заболевания 3,2±0,7 года. Распределение больных с НЯК по полу: мужского пола 60 детей (50,4%) и женского пола 59 детей (49,6%). Распределение пациентов с ВЗК по возрасту на момент проведения исследования представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение пациентов с ВЗК по возрасту.

Возраст в годах

0-3 4-6 7-11 12-17 18-33

БК 1(1,0%) 2(2,1%) 12(12,4%) 58 (59,8%) 24 (24,7%)

НЯК 15 (12,6%) 14(11,8%) 16(13,4%) 74 (62,2%) 0

ВЗК 16 (7,4%) 16 (7,4%) 28 (13,0%) 132 (61,1%) 24(11,1%)

Контрольную группу составило 209 человек. Для различных исследований использовались разные контрольные группы. При генетических исследованиях в качестве группы сравнения использовался популяционный контроль, который был представлен образцами ДНК (п-126) людей из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, из них лица мужского пола составили 56,6%, женского пола - 46,4%. Средний возраст в этой труппе составил 30,7±22,4 года. Для иммунологических исследований контрольную группу составили 59 соматически здоровых детей, госпитализированных для проведения планового хирургического лечения по поводу не осложненных форм крипторхизма и пупочной грыжи. Забор крови у них проводился в предоперационном периоде. Средний возраст этой группы 9,6 ±1,7 лет, 56,1% оставляли мальчики и 43,1% - девочки. Для микробиологических исследований контрольную группу составили 24 условно здоровых детей. Средний возраст этой группы 11,8 ±1,1 лет, 52,4% оставляли мальчики и 47,6% - девочки.

Манифестация ВЗК происходила во все возрастные периоды от 2 месяцев до 17 лет. Средний возраст манифестации ВЗК в исследуемой группе составил 9,31 ±0,8 лет, в том числе при БК 11,5±1,1 лет, при НЯК - 7,4±0,9 лет. Распределение больных БК и НЯК по возрасту манифестации представлено в таблице 2.

Таблица 2.

Возраст манифестации заболевания при БК и НЯК.

Возраст БК (п-97) НЖ (п-119)

абс. % абс. %

До 1 года 5 5,1 12 10,1

1-3 года 3 3,1 24 20,2

4 - 6 лет 9 9,3 19 16,0

7-10 лет 16 16,5 28 23,5

11 лет и старше 64 66,0 36 30,2

В группе пациентов с БК преобладали больные с илеоколитом (44%), изолированный штеит отмечался у 29%, изолированный колит - у 18%, поражение

12

верхних отделов ЖКТ - у 9%. Среди больных с БК клиническая ремиссия отмечалась у 9%, высокая клиническая активность — у 27%, умеренная клиническая активность - у 32%, низкая-у 32%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 5%, высокая активность-у 18%, умеренная - у 32%, низкая - у 45%. Самым частым вариантом течения БК у исследуемых пациентов было воспалительное (нестенозирующее непенетрирующее) - у 86,4%, стенозирующее - у 13,6%, пенетрирующее - у 9,1%, у одного ребенка отмечались и стенозы, и свищий. Перианальное проажение было выявлено у 13,6% больных. Внекишечные проявления отмечались у 54,5% пациентов с БК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были суставной синдром (31,8%), патология печени (13,6%), поражение кожи и слизистых (9,1%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 27% больных с БК.

В группе детей с НЯК преобладали пациенты с тотальным колитом (63%), левосторонний колит был отмечен у 5,2%, проктосигмоидит - у 21,3%, проктит - у 10,5%. Среди больных с НЯК клиническая ремиссия отмечалась у 36%, высокая клиническая активность — у 20%, умеренная клиническая активность — у 18%, низкая - у 26%. Эндоскопическая ремиссия выявлялась у 10%, высокая активность -у 18%, умеренная -у 26%, низкая - у 46%. Внекишечные проявления отмечались у 28,2% детей с НЯК. Самыми частыми внекишечными проявлениями были патология печени (12,8%), суставной синдром (10,3%), поражение кожи и слизистых (7,69%). Снижение минеральной плотности костных тканей отмечено у 19% детей с НЯК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании с целью изучения частоты встречаемости полиморфных вариантов (ПВ) генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-IRA (VNTR-полиморфизм), TNFA (-308 g/a), IL-10 (-1082 g/a) у детей с БК и НЯК обследовано 196 пациентов с ВЗК, из них 88 пациентов с БК и 108 детей с НЯК. Среди обследованных больных у 180 человек (92,3%) выявлен тот или иной ПВ исследуемых генов. Только у 15 пациентов (7,7%) не были выявлены полиморфные варианты генотипов. Среди пациентов с диким вариантом генотипа у 4 человек был установлен диагноз БК (4,54% от всех больных с БК), а у 11 человек - НЯК (10,2% от всех больных с НЯК).

Полиморфный вариант G908R гена NOD2/CARD15 (табл. 3) обнаружен только у 5 (5,68%) больных с БК и у 6 (5,55%) больных с НЯК. Данный полиморфизм выявлялся только в гетерозиготном состоянии, как у больных с ВЗК, так и в популяционном

контроле. Аллельная частота G908R гена NOD2/CARD15 при БК составила 2,84%, а при НЯК - 2,78%. В контрольной группе аллельная частота равна 1,98%. Частоты аллелей G908R при БК и НЯК в исследуемых и контрольной выборках не имеют статистически значимые отличия (р>0,05), что указывает на отсутствие ассоциации наличия полиморфной аллели G908R гена NOD2 с БК и НЯК.

Таблица 3.

Частота полиморфных вариантов гена NOD2/CARD1S у детей с ВЗК.

Полиморфные аллели

G908R R702W cJ020insC

БК НЯК К БК НЯК К БК НЯК К

п-88 п-108 п-126 п-88 п-108 п-126 п-88 п-108 п-126

Всего полиморфных аллелей (п) 5 6 5 15 8 8 26 8 15

Гетерозиготы (п) 5 6 5 11 8 8 18 4 15

Гомозиготы (п) 0 0 0 2 0 0 4 2 0

Аллельная частота (%) 2,84 2,78 1,98 8.52 3,70 3,17 14,8 3,70 5,95

о(сЮ >0,05 >0,05 <0,01 >0,05 <0,01 >0,05

OR 1,44 1,04 2,84 1,17 3,003 0,61

95%ДИ 0,415,7 0,424,96 1,186,86 0,433,18 1,415,34 0,251,46

Полиморфный вариант R702W гена ЫОт/САПП\5 обнаружен у 13 (14,8%) больных с БК, у 11 больных (12,5%) в гетерозиготном, а у 2 (2,27%) - гомозиготном состоянии. При НЯК ПВ R702W гена К0й2/СЛЯ015 был обнаружен у 8 больных (7,41%) и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота R702W у пациентов с БК составила 8,52%, при НЯК - 3,7%. В контрольной выборке аллельная частота равна 3,17%. Статистически значимые отличия в частоте полиморфизма R702W с популяционным контролем были выявлены только у пациентов с БК (р<0,05), что свидетельствует об ассоциации полиморфизма R702W с БК. У больных с НЯК статистически значимых отличий частоты полиморфной аллели R702W выявлено не было и ассоциации не выявлено.

При исследовании относительного риска развития БК в зависимости от наличия полиморфного генотипа АГ002/СА1Ю15 было установлено, что наличие у пациента полиморфного варианта аллели R702W достоверно (р<0,05) повышает риск БК в 2,84 раза.

Полиморфный вариант с.3020тзС гена Я002/СА1Ю15 выявлен у 22 пациентов с болезнью Крона (25%), в том числе в гомозиготном состоянии у 4 (4,54%) больных, в гетерозиготном состоянии у 18 (20,4%) больных. При НЯК данный полиморфизм был у 6 больных (5,55%), их них у 4 (3,7%) в гетерозиготном, а у 2 (1,85%) - в гомозиготном

состоянии. Аллельная частота с.ЗШОшбС гена МЭ02/СЛЙ0/5 среди больных БК составила 14,8%, при НЯК - 3,7%. Гомозиготы по с.3020тзС выявлены только среди больных и отсутствуют в контрольной группе. Аллельная частота в группе популяционного контроля составила 5,95%. Нами выявлены статистически значимые отличия (р<0,01) в частоте встречаемости полиморфизма с.ЗОЮ'шбС между контрольной и исследуемыми выборками только при БК, что свидетельствует об ассоциации полиморфизма с.3020тзС с БК. Ассоциации аллели с.3020 ¡пвС с НЯК не выявлено. Относительный риск развития БК при наличии аллели с.3020т$С гена ИОВ2/СА1Ю15 достоверно (р<0,05) повышается в 2,74 раза.

Оценка значения гомозиготного полиморфного генотипа МООИСАИО15 в исследуемых группах не представляется возможной из-за отсутствия такого генотипа в контрольной выборке.

Полиморфный вариант ЯЗОС! гена О№5 (табл. 4) выявлен в гетерозиготном состоянии у 16 (19,7%) пациентов с БК и у 14 (13%) больных с НЯК. Аллельная частота ЯЗОО гена у пациентов с БК составила 9,88%, при НЯК - 6,48%. Аллельная частота КЗ0(3 в популяционном контроле составила 8,33%. Частоты встречаемости ЮОО между исследуемой и контрольной группой не имеют статистически значимых отличий (р>0,05), и ассоциация полиморфного варианта 30(2 гена £>¿05 не подтверждена ни с БК, ни с

НЯК.

Таблица 4.

Частота полиморфных вариантов генов /)£С5, ОСТ1У1, ОСТИ2 у детей с ВЗК.

Полиморфные аллели

КЗ оу Ь503Р -207С/С

гена йЮ5 гена ОСТШ гена ОСТЮ

БК НЯК К БК НЯК К БК НЯК К

п-81 п-108 п-126 п-81 п-108 п-126 п-81 п-108 п-126

Всего полиморфных аллелей (п) 16 14 21 59 88 67 68 80 78

Гетерозиготы (п) 16 14 21 37 48 43 36 46 48

Гомозиготы (п) 0 0 0 11 20 12 16 17 15

Аллельная частота (%) 9,88 6,48 8,33 36,4 40,7 25,6 42,0 37,0 31,0

р(сК) >0,05 >0,05 <0,05 <0,01 <0,05 >0,05

ОН 1,21 0,76 1,58 1,90 1,61 1,31

95%ДИ 0,61- 0,38- 1,03- 1,29- 1,07- 0,89-

2,39 1,54 2,42 2,80 2,43 1,93

Полиморфный вариант Ь503Р гена ОСТЫ1 выявлен у 48 пациентов с болезнью Крона (59,3%), в том числе в гомозиготном состоянии у 11 (13,6%) больных, в

гетерозиготном состоянии у 37 (45,7%) больных. При НЖ данный полиморфизм был у 68 больных (63%), их них у 20 (18,5%) - в гомозиготном состоянии. Аллельная частота Ь503Р гена ОСШ1 при БК составила 36,4%, при НЯК - 40,7%. В контрольной выборке полиморфный вариант Ь503И выявлен у 55 из 126 человек (43,6%), из них у 12 человек (9,5%) в гомозиготном состоянии, и аллельная частота 503Р составила 25,6%. Статистически значимые отличия (р<0,05) в частоте данного ПВ выявлены между больными с БК и контрольной выборкой, а также между больными с НЯК и контролем (р<0,01). Это свидетельствует об ассоциации полиморфизма Ь503Р гена ОСШ1, как с БК, так и НЖ. Относительный риск БК при наличии полиморфизма Ь503Р гена ОСШ1 достоверно (р<0,05) повышается в 1,58 раза, а риск развития НЯК возрастает в 1,9 раза (р<0,05).

При анализе роли гомозиготного полиморфного генотипа Ь503Р гена ОСШ1 статистически значимая ассоциация (р<0,05) выявлена только у больных НЖ. Риск развития НЖ при таком генотипе возрастает до 2,16 раза (011=2,16, 95%-ДИ 1,10-4,65, р<0,05).

Полиморфизм -207 Б/С гена ОСШ2 был выявлен у 52 пациентов с болезнью Крона (64,2%), в том числе в гомозиготном состоянии у 16 (19,6%) больных. При НЖ данный ПВ был у 63 больных (58,3%), из них у 46 (42,6%) в гетерозиготном, а у 17 (15,7%) - в гомозиготном состоянии. Аллельная частота -207 в/С гена ОСШ2 при БК составила 42%, при НЯК - 37%. Аллельная частота -207С в группе популяционного контроля составила 31%. Статистически значимые отличия (р<0,05) в частоте встречаемости полиморфизма -207 С/С гена ОСШ2 были выявлены только между больными с БК и контрольной выборкой. При НЯК ассоциация с аллелью -207 ас гена ОСШ2 не выявлено. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа -207 С/С гена ОСШ2 статистически значимой ассоциации не было выявлено ни при БК, ни при НЖ.

При оценке относительного риска развития исследуемых заболеваний в зависимости от наличия полиморфизма -207 в/С гена ОСШ2 было установлено, что наличие у пациента полиморфной аллели достоверно (р<0,05) повышает риск БК в 1,61 раза.

Полиморфный вариант 02990 гена ТЬЯ4 (табл. 5) выявлен у 13 (16%) пациентов с БК, в том числе в гомозиготном состоянии у трех (3,7%) больных, в гетерозиготном состоянии у 10 (12,4%) больных. При НЖ данная полиморфная аллель выявлена у 15 (13,9%) больных, из них у 2 (1,85%) в гомозиготном и у 13 (12%) - в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота 0299в гена Т1Ж4 среди больных с БК составила 9,88%, при

НЯК - 7,87%. В контрольной выборке полиморфные аллели В299С выявлены у 30 человек (23,8%), в трех случаях (2,38%) выявлен в гомозиготном состоянии. Аллельная частота 02990 в группе популяционного контроля составила 13,1%. По данным нашего исследования аллельная частота В2990 при БК и при НЖ ниже, чем в контрольной выборке, и различия в аллельной частоте между исследуемыми и контрольной выборкой статистически незначимы (р>0,05), ассоциация полиморфного варианта 0299й гена Т1Л4 с БК и НЯК не доказана. При анализе гомозиготного полиморфного генотипа также не выявлена статистически значимая ассоциация ни при БК, пи при НЯК

Таблица 5.

Частота полиморфных вариантов генов TLR4, TNFA, IL-10 у детей с B ÎK.

Полиморфные аллели

D299G гена TLR4 -308 g/a гена TNFA -1082 g/a гена IL-1Û

БК п-81 НЖ 11-108 К п-126 БК п-81 НЖ п-108 К п-126 БК п-81 НЖ п-108 К п-126

Всего полиморфных аллелей (п) 16 17 33 18 20 33 2 2 1

Гетерознготы (п) 10 13 27 14 20 31 2 2 1

Гомозиготы (п) 3 2 3 2 0 1 0 0 0

Аллельная частота (%) 9,88 7,87 13,1 1Ы 9,26 13,1 1,23 0,9 0,4

р(сК) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

OR 0,73 0,57 0,83 0,68 3,14 2,35

95%ДИ 0,391,37 0,311,05 0,451,53 0,381,22 0,2834,9 0,2126,0

Полиморфный вариант -308 g/a гена TNFA выявлен у 16 (19,7%) пациентов с БК, из них у 14 (17,3%) пациентов в гетерозиготном, а у 2 (2,47%) - в гомозиготном состоянии. При НЯК данный полиморфизм был выявлен у 20 (18,5%) больных, и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота -308а гена TNFA при БК составила 11,1%, при НЯК - 9,26%, а в популяционном контроле - 8,33%. Частоты встречаемости -308 g/a гена TNFA между исследуемыми и контрольной выборками не имеют статистически значимых отличий (р>0,05), и ассоциация полиморфного варианта -308 g/a гена TNFA не подтверждена ни с БК, ни с НЖ.

Полиморфный вариант -1082 g/a гена 1L-10 выявлен у 2 (2,47%) пациентов с БК и у 2 (1,85%) больных с НЯК, и только в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота -1082 g/a гена IL-10 при БК составила 1,23%, при НЖ - 0,9%. В контрольной группе полиморфный вариант -1082 g/a гена IL-I0 обнаружен только у 1 из 126 человек, и его

аллельная частота составила 0,4%. Статистически значимых отличий и ассоциация не выявлено ни при БК, ни при НЯК.

Таблица 6.

Частота полиморфизма VNTR-полиморфизм гена IL-1RA у детей с ВЗК.

Генотип БК, п-80 НЯК, п-108 Контроль, п-126

абс. % абс. % абс. %

402/402 35 43,75 60 55,55 66 52,38

402/230 31 38,75 37 34,26 43 34,13

230/230 7 8,75 8 7,41 15 11,9

402/488 4 5,00 3 2,78 0 0

230/488 0 0 0 0 2 1,59

488/488 1 1,25 0 0 0 0

402/574 1 1,25 0 0 0 0

574/574 1 1,25 0 0 0 0

402 106 66,3 160 74,07 175 69,4

230 45 28,1 53 24,54 75 29,8

488 6 3,74 3 1,39 2 0,80

574 3 1,87 0 0 0 0

р(сК) 230 р>0,05 р>0,05

488 р<0,05 р>0,05

OR 488 4,87 1,76

95%-ДИ 488 0,97-24,4 0,29-10,6

При исследовании тандемных вариабельных повторов (variable number of tandem repeats, VNTR) в интронной зоне 2 гена IL-1RA у детей исследуемых групп было выявлено несколько вариантов полиморфных аллелей: с длиной фрагмента 230, с длиной фрагмента 488 и с длиной фрагмента 574, частота которых в исследуемых выборках представлена в таблице 6. При БК VNTR-полиморфизм гена IL-1RA были выявлены у 45 пациентов (56,2%), в том числе в гомозиготном состоянии у 9 (11,2%) больных. При НЯК данный вид полиморфизма был у 48 больных (44,4%), из них у 8 (7,41%) - в гомозиготном состоянии. Наиболее частыми были полиморфные аллели с длиной фрагмента 230 и с длиной фрагмента 488, они встречались во всех исследуемых выборках. Полиморфная аллель с длиной фрагмента 574 выявлена только у больных с БК. Аллельная частота VNTR гена IL-1RA с длиной фрагмента 230 при БК составила 28,1%, при НЯК - 24,5%, что было ниже, чем в контрольной выборке, где частота этой полиморфной аллели составила 29,8%. Статистически значимых отличий в частоте встречаемости VNTR-полиморфизма гена IL-1RA между исследуемыми и контрольной выборками, а, следовательно, и его ассоциации с БК или НЯК не выявлено. Полиморфный вариант гена

18

И-1ЯА с длиной фрагмента 488 также встречался во всех выборках. Его аллельная частота при БК составила 3,74%, при НЯК - 1,39%, а в контрольной выборке - 0,8%. Статистически значимые отличия (р<0,05) в частоте встречаемости данного полиморфизма гена И-1ЯА были выявлены только между больными с БК и контрольной выборками. Следовательно, и ассоциация УЫТЯ-полиморфизма гена 11-1Ш с длиной фрагмента 488 выявлена только с развитием БК. Однако исследование относительного риска развития БК в зависимости от данной аллели гена 1Ь-1ЯА не дало статистически значимых результатов.

При исследовании влияния сочетания различных генотипов на риск развитие БК и НЯК у детей было установлено, что сочетание трех полиморфизмов гена Ы002/САМ)15 в одном генотипе не было выявлено ни у одного человека, ни в одной из исследуемых выборок. Сочетание двух полиморфных вариантов гена ЫСЮ2/СА1Ю15 было выявлено у 8 пациентов (9,1%) с БК и у одного (0,9%) больного с НЯК (табл. 7). Это вариант генотипа статистически значимо (р<0,01) ассоциирован с БК и повышает риск ее развития в 12,5 раза (р<0,05). Ассоциации этого генотипа с НЯК не выявлено.

Сочетание в одном генотипе полиморфных вариантов генов ОСТЪИ и ОСТЫ2 значительно повышают риск развитие ВЗК. Такое сочетание выявлено у 48,1% больных БК и у 49,1% пациентов с НЯК, и статистически значимо (р<0,01) ассоциировано с развитием, как БК, так и НЯК. Риск развития БК при сочетании в одном генотипе полиморфных вариантов Ь503Р гена ОСТЫ1 и -207 С/С гена ОСТЫ2 повышается в 2,23 раза (р<0,05), а НЯК - в 2,32 раза (р<0,05).

С генотипом, включающим в себя один из полиморфных вариантов гена ЫОй2/САЫ)15 и Ь503Р гена ОСТЫ1, выявлена статистически значимая (р<0,01) ассоциация только БК, и риск развития заболевания при таком генотипе составляет 2,23 (р<0,05). Подобная картина отмечается и при сочетании а одном генотипе полиморфных вариантов гена Ы002/САЯ015 и -207 аС гена ОСШ2. С ним так же статистически значимо (р<0,01) ассоциировано развитие БК, и риск развития составляет 2,66 (р<0,05).

В случае сочетания в одном генотипе трех полиморфных вариантом (ПВ гена №й2/САЫ)15, Ь503Б гена ОСТЫ1 и -207 в/С гена ОСТЫ!) выявлена значимая ассоциация, как с развитием БК (р<0,01), так и развитием НЯК (р<0,05) у детей. Риск развития БК при таком генотипе увеличивается в 5,5 раза (р<0,05). Значение риска развития НЯК в этом случае статистически не значим (р>0,05), так как включает 1,00 в свой доверительный интервал.

Таблица 7.

Относительный риск развития болезни Крона и НЯК при сочетании полиморфных

генотипов.

Группы Кол-во людей с сочетанием ПВ Ассоциация, Р ОН 95%ДИ Р

Сочетание 2 ПВ гена Ш02/СА1и)15

БК (п-88) 8 <0,01 12,5 1,53-101,8 <0,05

НЯК (п-108) 1 >0,05 1,17 0,07-18,9 >0,05

Контроль (п-126) 1

Сочетание ПВ генов 0С7Ш и ОСШ2

БК (п-81) 39 <0,01 2,23 1,25-3,99 <0,05

НЯК (п-108) 53 <0,01 232 1,35-3,97 <0,05

Контроль (п-126) 37

Сочетание ПВ генов №В2/САЯВ15 и ОСТШ

БК (п-81) 20 <0,01 2,23 1,25-3,99 <0,05

НЯК (п-108) 14 >0,05 1,94 0,80-4,67 >0,05

Контроль (п-126) 9

Сочетание ПВ генов тВ2/САКВ15 и ОСТ№

БК (п-81) 19 <0,01 2,66 1,23-5,76 <0,05

НЯК (п-108) 11 >0,05 0,99 0,42-2,30 >0,05

Контроль (п-126) 13

Сочетание ПВ генов №02/СА1Ш15, ОСТЫ и ОСПЯ2

БК (п-81) 15 <0,01 5,5 1,91-15,8 <0,05

НЯК (п-108) 11 <0,05 2,74 0,92-8,16 ><ш

Контроль (п-126) 5

Сочетание ПВ генов ЛГ002/С4ЛЛ75 и ВЮ5

БК (п-81) 7 <0,05 2,88 0,81-10,2 >0,05

НЯК (п-108) 3 >0,05 0,87 0,19-3,98 >0,05

Контроль (п-126) 4

Сочетание ПВ генов ОСТШ и ВЮ5

БК (п-81) 11 <0,05 2,67 0,99-7,20 >0,05

НЯК (п-108) 10 >0,05 1,73 0,64-4,72 >0,05

Контроль (п-126) 7

Сочетание ПВ генов ОСТРИ, ОСт2 и ВЬв5

БК (п-81) 10 <0,05 3,41 1,12-10,4 <0,05

НЯК (п-108) 7 >0,05 1,68 0,52-5,44 >0,05

Контроль (п-126) 5

Сочетание ПВ генов ОСТШ и И-1ЯА

БК (п-80) 30 <0,01 2,69 1,41-5,09 <0,05

НЯК (п-108) 33 <0,05 1,97 1,07-3,62 <0,05

Контроль (п-126) 23

Сочетание ПВ генов ОСТШ, ОСШ2 и П-1ЙА

БК (п-80) 20 <0,05 2,14 1,04-4,39 <0,05

НЯК (п-108) 25 <0,05 1,93 0,98-3,81 >0,05

Контроль (п-126) 17

При сочетании в одном генотипе полиморфного варианта гена ЛЮ02/СА1Ю15 и КЗОО гена йЮ5 была выявлена статистически значимая (р<0,05) ассоциация только с развитием БК у детей. Однако значения риска не были статистически значимыми (р>0,05).

При сочетании в одном генотипе полиморфных вариантов Ь503Р гена ОСТЫ1 и ЯЗОО гена ОЮ5 также была выявлена достоверная (р<0,05) ассоциация с БК у детей, однако риск развития не был статистически значимым (р>0,05). В случае сочетания в одном генотипе полиморфных вариантов Ь5ЮТ гена ОСШ1, -207 С1С гена ОСТЫ2 и Я30(} гена Б№5 помимо ассоциации с развитием БК (р<0,05), также отмечалось повышение риска развития БК у детей в 3,14 раза (р<0,05).

При сочетании в одном генотипе ХТЫТЯ-полиморфизма гена И-1ЯА и Ь503Р гена ОСТЫ1 было выявлено наличие достоверных ассоциаций данного генотипа с развитием БК (р<0,01) и НЯК (р<0,05). Риск развития БК у детей с таким генотипом возрастал в 2,69 раза (р<0,05), а НЖ - в 1,97 раза (р<0,05). В случае сочетания в одном генотипе УЖЛ-полиморфизма гена И-ША и ЬбОЗБ гена ОСТЫ1 и -207 С/С гена ОСТМ2 также была выявлена статистически значимая ассоциация с БК (р<0,05) и НЯК (р<0,05), однако достоверное (р<0,05) повышение риска развития заболевания было выявлено только у пациентов с БК. Риск развития БК при таком варианте полиморфного генотипа повышается в 2,14 раза (р<0,05).

При сочетании в одном генотипе других полиморфных вариантов исследуемых генов не было выявлено статистически значимых ассоциаций с БК и НЯК и повышение риска развития данных заболеваний у детей.

При анализе влияния полиморфного генотипа на манифестацию и клиническое течение болезни Крона у детей было установлено, что полиморфный вариант Я702\У гена Ы002/САШ)]5 ассоциирован с манифестацией БК в пубертатном периоде, в возрасте старше 11 лет (р<0,05), относительный риск заболевания в этом возрасте при наличии данного генотипа составляет 2,84 (95%ДИ 0,67-12,2; р>0,05), однако он не является статистически значимым. С манифестацией БК в возрасте 4-6 лет ассоциирован полиморфный вариант Ю0(3 гена ОЮ5 (р<0,05), и относительный риск манифестации заболевания в этот возрастной период составляет 2,85 (95%ДИ 1,11-7,29; р<0,05). С возрастом манифестации БК на 1 году жизни ассоциирован полиморфный вариант Ь503Р гена ОСТЫ1 (р<0,05), при наличии данной полиморфной аллели риск развития заболеваний уменьшается в 0,29 раза, однако относительный риск статистически не значим (95%ДИ 0,05-1,67; р>0,05).

При оценке влияния полиморфного генотипа на преимущественную локализацию патологического процесса при БК у детей было выявлено, что с носительством полиморфной аллели c.3020insC гена NOD2/CARD15 ассоциировано развитие изолированного илеита (р<0,01). Риск развития илеита при данном варианте полиморфного генотипа у детей с БК возрастает в 2,2 раза (95%ДИ 1,18-4,08; р<0,05). Изолированный колит у детей с БК ассоциирован с ПВ R702W гена NOD2/CARD15 (р<0,01), а относительный риск возрастает в 5,81 раза (95%ДИ 2,15-15,7; р<0,05). Также с изолированным поражением толстой кишки у детей с БК были выявлены ассоциации с.3020 insC гена NOD2/CARD15 (р<0,05) и VNTR-полиморфизма гена IL-IRA (р<0,05). При наличии данных генотипов риск развития изолированных колитов снижался в 0,32 и 0,58 раза соответственно, однако данные показатели относительного риска не были статистически значимыми (RR=0,32 95%ДИ 0,08-1,24 и RR=0,58 95%ДИ 0,29-1,18 соответственно; р>0,05). С поражением верхних отделов ЖКТ выявлена ассоциация с ПВ c.3020insC гена NOD2/CARD15 (р<0,05) и D299G гена TLR4 (р<0,05). У носителей полиморфной аллели c.3020insC гена NOD2/CARD15 риск поражения верхних отделов ЖКТ снижался в 0,32 раза, однако данный показатель статистически не значим (95%ДИ 0,08-1,24; р>0,05). При наличии ПВ D299G гена TLR4 риск развития поражения верхних отделов ЖКТ повышался в 2,33 раза, но относительный риск также не был статистически значимым (95%ДИ 0,98-5,51; р>0,05).

С прианальным поражением у детей с БК были выявлены ассоциации с ПВ R702W гена NOD2/CARD15 (р<0,01), L503F гена OCTN1 (р<0,01) и -308 g/a гена TNFA (р<0,05). При наличии в генотипе детей с БК полиморфной аллели R702W гена NOD2/CARD15 риск перианального поражения возрастает в 7,14 раза (95%ДИ 2,13-23,9; р<0,05). Полиморфная аллель L503F гена OCTN1 снижает риск перианального поражения при БК в 0,66 раза (95%ДИ 0,44-0,98; р<0,05). При ассоциации течения БК у детей с аллелью -308 g/a гена TNFA риск перианального поражения также снижается в 0,43 раза, однако показатель статистически не значим (95%ДИ 0,14-1,36; р>0,05).

При анализе влияния генотипа на характер течения БК у детей было установлено, что стенозирующее течение ассоциировано с полиморфной аллелью c.3020insC гена NOD2/CARD15 (р<0,01), и риск стенозов составляет в 7,14 раза (95%ДИ 2,13-23,9; р<0,05). Пенетрирукяцее течение БК ассоциировано с 3 полиморфными аллелями: R702W гена NOD2/CARD15 (р<0,05), L503F гена OCTN1 (р<0,05) и D299G гена TLR4 (р<0,05). Риск развития кишечных свищей у детей с БК при ПВ R702W гена NOD2/CARDI5 повышался в 2,81 раза (95%ДИ 1,14-6,96; р<0,05). Полиморфные генотипы с аллелями L503F гена

OCTN1 и D299G гена TLR4 снижали риск развития свищей у детей с БК в 0,74 (95%ДИ 0,51-1,08) и 0,21 (95%ДИ 0,03-1,49) раза соответственно, но показатели относительного риска не были статистически значимыми (р<0,05).

При оценке взаимосвязи полиморфизма изучаемых генов с наличием внекишечных проявлений у детей с БК нами не было выявлено ассоциаций генотипа, как с общим наличием внекишечных проявлений, так и отдельными их формами.

При анализе влияния генотипа на манифестацию и клиническое течение болезни НЯК у детей не было установлено ассоциаций полиморфных вариантов изучаемых генов с манифестацией НЯК у детей в определенном возрастном периоде.

При оценке влияния полиморфного генотипа на преимущественную локализацию патологического процесса при НЯК у детей было выявлено, что развитие тотального колита ассоциировано с носительством ПВ L503F гена OCTMI (р<0,05) и D299G гена TLR4 (р<0,05). Риск развития тотального колита при НЯК при носительстве аллели L503F гена OCTN1 снижался в 0,79 раза (95%ДИ 0,63-0,92; р<0,05), а при носительстве аллели D299G гена TLR4 - риск снижался в 0,43 раза, однако данный показатель не был статистически значимым (95%ДИ 0,18-1,48; р>0,05). С проктосигмоидитом у детей с НЯК ассоциирован ПВ L503F гена OCTN1 (р<0,05), риск в данном случае возрастал в 1,31 (95%ДИ 1,03-1,67) раза (р<0,05). Также ассоциация с проктосигмоидитом была вывалена у носителей полиморфной аллели D299G гена TLR4 (р<0,05), риск развития в этом случае возрастал в 3,11 раза (95%ДИ 1,30-7,41; р<0,05).

Перианальное поражение при НЯК было ассоциировано с ПВ G908R (р<0,05) и R702W (р<0,05) гена NOD2/CARD15, а также -308 g/a гена TNFA (р<0,05). При носительстве аллели G908R риск развития перианального поражения возрастает в 8,5 (95%ДИ 1,93-37,5; р<0,05), при носительстве R702W гена NOD2/CARD15 - в 4,9 раза (95%ЦИ 0,44-0,98; р<0,05), а при носительстве -308 g/a гена TNFA - в 3,0 раза (95%ДИ 1,21-7,45; р<0,05).

Ассоциаций с полиморфным генотипом внекишечных проявлений при НЯК также не выявлено.

При изучении влияния полиморфного генотипа на характер ответа на проводимую терапию была установлена ассоциация гормонозависимого варианта течения БК с полиморфной аллелью -207 G/C гена OCTN2 (р<0,05), и риск развития гормонозависимости при данном варианте генотипа возрастал в 1,34 раза (95%ДИ 1,061,70; р<0,05). Нами не было выявлено ассоциации полиморфизма изучаемых генов с гормонорезистентным вариантом течения БК у детей. Однако не достаточная

эффективность медикаментозной терапии и необходимость хирургических методов лечения при БК у детей была ассоциирована с полиморфными аллелями R702W (р<0,01) и c.3020insC (р<0,05) гена NOD2/CARD15. Риск хирургического лечения БК при носительстве аллели R702W возрастал в 3,29 раза (95%ДИ 1,23-8,82; р<0,05), в то время как при носительстве полиморфной аллели c.3020insC относительный риск хирургического лечения составлял 1,81 раза, но он был статистически не значимым (95%ДИ 0,95-3,47; р>0,05).

При изучении влияния полиморфного генотипа на характер ответа на проводимую терапию у детей с НЯК была установлена ассоциация гормонозависимого варианта с полиморфной аллелью -207 G/C гена OCTN2 (р<0,05), и риск развития гормонозависимости при данном варианте генотипа возрастал в 1,49 раза (95%ДИ 1,201,85; р<0,05). С гормонорезистентностью также была выявлено ассоциация полиморфного варианта -207 G/C гена OCTN2 (р<0,05), однако снижение риска гормонорезистентности в 0,62 раза статистически не значимо (95%ДИ 0,31-1,22; р>0,05).

При оценке риска хирургических методов лечения и недостаточной эффективности медикаментозной терапии у детей с НЯК было выявлено, что необходимость хирургического лечения была ассоциирована с полиморфными аллелями R702W гена NOD2/CARD15 (р<0,05) и -308 g/a гена TNFA (р<0,05). Риск хирургического лечения НЯК при носительстве аллели R702W возрастал в 7,43 раза (95%ДИ 2,21-24,9; р<0,05), в то время как при носительстве полиморфной аллели -308 g/a гена TNFA относительный риск хирургического лечения возрастал в 4,08 раза (95%ДИ 1,64-10,1; р<0,05), и оба значения относительного риска статистически значимы.

С целью оценки состояния иммунного ответа у детей исследуемых групп мы провели комплексное исследование системы продукции основных про- и противовоспалительных цитокинов, включающее в себя оценку их уровня в нативной сыворотке крови, спонтанную и стимулированную (LPS, MDP, LPS+MDP) продукцию этих цитокинов в культуре цельной крови и культуре изолированных моноцитов периферической крови. Также нами изучена экспрессия генов основных цитокинов (IL-lp, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a, TNF-p) и паттерн-распознающих рецепторов (TLR4 NOD2) в клетках циркулирующей крови и биоптате слизистой оболочки кишечника.

У детей с НЯК в сыворотке крови (рис. 1) отмечается значимо повышенный уровень островоспалительных цитокинов: IL-8 (р<0,05), TL-6, TNF-a (р<0,01), IL-ip, а также повышены уровни IFN-y (р<0,01), IL-10 (р<0,01), IL-2 (р<0,01) по сравнению с

контрольной группой. По сывороточному уровню большинства исследуемых цитокинов, за исключением IL-Iß и TNF-ß, дети с НЯК превосходят пациентов с БК, а в случае TNF-a (р<0,01) и IL-10 (р<0,05) эти различия статистически значимы. В группе детей с БК также отмечается повышенный по сравнению с контролем уровень IL-1 ß, IL-4 (р<0,05), IL-8, ILIO (p<0,05), IFN-y (p<0,01), TNF-a, TNF-ß.

700 600 500

-¿00 J»

Дню 200 100 0

алр 1L-2 Ж.Ч IL-6 1L-I IL-tO IFN-T TNF-a TNF-0 IH2 IL-5

□ БК ШНЯК

ЕЗ Контроль |

Рис. 1. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей, исследуемых групп

(пг/мл)

10000 9000 8000 7000 6000

-С 5ООО

Шш

~ 4000 3000 2000 1000 0

I^tß 11Л 11,4 TJ-i 1-8 ПИО II'H-f TNF-a TNF-ß Ш-12 U.-5

Цглытв кровь спонтанно

□ ЬК

Рис. 2. Уровень цитокинов при спонтанной продукции в культуре цельной крови у детей, исследуемых групп (пг/мл)

При сравнении уровня спонтанной продукции цитокинов клетками периферической крови с их уровнем в нативной сыворотке крови (рис. 2) обращают внимание, что у детей с БК отмечается почти в 2 раза более высокая продукция IL-6, чем при НЯК, и в 25 раз выше, чем в контрольной группе (р<0,01). При БК также отмечается в 2 раза более высокий уровень IL-ip и TNF-a, чем при НЯК. При НЯК отмечался более высокий уровень (на 23%), чем при БК, IL-8, что было ранее отмечено и в сыворотке крови.

При анализе продукции отдельных цитокинов в зависимости от вида стимуляции (рис. 3) минимальные значения IL-ip, IL-6, TNF-a, как у детей с БК, так и НЯК, отмечаются в не стимулированной пробе, с более высокими значениями при стимуляции LPS, MDP, а максимальные значения выявлены в пробах с комплексной стимуляцией (LPS + MDP), эти различия для всех трех цитокинов статистически значимы (р<0,01). У детей с БК несколько выше значения IL-ip (на 22%) и IL-6 (19%), чем при НЯК. По уровню IL-6 в пробах стимулированных LPS и LPS+MDP были выявлены статистически значимые различия между группами с БК и НЯК. Показатели TNF-a у детей с БК и НЯК различаются минимально. У детей с НЯК спонтанная продукция IL-8 была выше на 23%, чем при БК. Стимуляция привела к повышению уровня на 39,4% (р<0,05). При БК изменения IL-8 были также статистически значимы (р<0,05). Более высокий уровень отмечен в пробе со стимуляцией LPS, а максимальное повышение (в 4 раза) при комплексной стимуляции. Продукция IL-4 была выявлена только у детей с БК и только в пробах со стимуляторами (р<0,05).

При анализе продукции цитокинов моноцитами спонтанная продукция IL-8 была отмечена только у детей с НЯК (р<0,01), а IL-4, как у детей с НЯК, так и при БК, но значение их было выше, чем в контрольной группе, в случае НЯК эти различия были статистически значимы (р<0,05). В группе детей с НЯК также отмечалась высокая продукция IL-8, которая имела максимальные значения в спонтанной пробе и при комплексной стимуляции LPS+MDP, на фоне изолированной стимуляции LPS и MDP продукция IL-8 была ниже, причем при стимуляции LPS в 2,3 раза. Данные изменения были статистически значимыми (р<0,01).

При анализе уровня mRNA в клетках крови и слизистой оболочки кишки было установлено, что дети с БК имеют в крови повышенную, по сравнению с контролем и детьми с НЯК, экспрессию IL-8 (р<0,05) и TNF-a, по сравнению с условно здоровыми детьми - уровень экспрессии TLR4. Дети с НЯК имели повышенные значения IL-ip и TLR4, как по сравнению с контролем, так и детьми с БК. В слизистой оболочке кишки и

дети с НЯК, и дети с БК имели уровень экспрессии значительно ниже, чем у детей контрольной группы. У детей с БК уровень экспрессии в биоптате по сравнению с кровью был значительно выше: 11.-6 в 7 раз, П -8 в 7,1 раза (р<0,01), Т№-а в 1,3 раза и ТЫМ в 22 раза, а экспрессия генов 11,-1/) и 1Ш-у была выявлена только в биоптате слизистой оболочки кишки.

Т>Ь<1

Кон-роль

■ Ь'М ¡2 МОР

■ и*ь

О спонтанно

р<0,01

р<0,01

1Ь6

Контроль

1Ь-1

Контроль

1И I

Контроль |

р<0,05

11025.5 ! Г~~] 1104

■

О МОР В ЬРБ

О СИОН13ИНО

Рис. 3. Уровень цигокинов в культуре цельной крови у детей исследуемых групп: спонтанная и стимулируемая продукция (пг/м)

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

1Ь-8

Кэшро;г!>

Ш МПР а 1Р$

; О СИОШ&НШ

Кон:рОЛЬ

У детей с НЯК преобладала экспрессия генов в крови: П.-1 р. ГРЫ-у, 1ЪК4 и N002 экспрессировались только клетками крови, а 1Ь-8 и ТМГ-ч экспрессировались и клетками крови, и клетками слизистой оболочки кишечника. Уровень экспрессия ТОТ-а был в 4 раза выше в крови (р<0,05), а уровень II.-8 в 99 раз выше (р<0,01) в слизистой оболочке кишечника.

П.-1Э 1Ь-2 ПМ П.-6 П.-10 №N-7 ТИГ-Р 1.-12 0.-3

Рис. 4. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с болезнью Крона с различной локализацией (пг/мл)

Нами была выявлена связь активности иммунного воспаления с локализацией патологического процесса, как у детей с БК, так и у детей с НЯК. При БК наиболее выраженные изменения отмечались при изолированном поражении верхних отделов ЖКТ и изолированном илеите. Дети с данной локализацией БК (рис. 4) имели более высокий сывороточный уровень 1Ь-1р, 1Ь-2, 11.-4, П.-6, 1Ь-8, 11.-10, TNF-a, ТЫГ-[3. Они также характеризовались более активной спонтанной и стимулированной продукцией 1Ь-1р, 1Ь-8, ТОТ-а, 11.-2, 11.-5, по сравнению с детьми с изолированным колитом и илеоколитом. При изучении уровня тКЫА в клетках крови и слизистой оболочки кишки данной закономерности установить не удалось. У детей с НЯК зависимость иммунопатологического процесса от локализации была менее выражена, но наибольшая активность иммунного воспаления отмечалась при тотальном и левостороннем колите (рис. 5). Максимальный сывороточный уровень !Ь-8 был отмечен у детей с проктосигмоидитом.

350 300 230 200 150 100 50 0

Рис. 5. Уровень цитокинов в нативной сыворотке крови у детей с НЯК с различной распространенностью (пг/мл)

Также на активность иммунного воспаления оказывали влияние характер течения и наличие внекишечных проявлений. Дети со стенозирующим и/или пенетрирующим течением имели более высокие показатели спонтанной и стимулированной продукции клетками крови (рис. 6) IL-1[3. IL-2, TL-6, IL-8, TNF-a, IL-5 и более низкие значения IL-4 и 1L-10. Подобные изменения отмечались и при оценке уровня mRNA этих цитокинов в клетках крови и в клетках слизистой оболочки кишки. Хотя при исследовании сывороточного спектра цитокинов результаты были противоречивыми: уровень IL-ip, IFN-y, TNF-a был выше при стенозировании и/или пенетрировании, а уровень IL-6 и IL-8 - при не осложненном воспалительном течении. Была выявлена сильная прямая корреляционная связь наличия стенозов и свищей со спонтанной продукцией IL-ip (Rs=0,85 р<0,01) и обратная сильная связь перианального поражения с LPS-стимулированной продукцией IL-10 (Rs=-0,89 р<0,01).

У детей с БК наличие внекишечных проявлений является показателем более активного иммунного воспаления. Эти дети имели более высокие сывороточные значения 1L-1|3, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y (р<0,05), IL-10, IL-12, IL-5, при их отсутствии - повышенный уровень TNF-a, TNF-P, IL-4. При оценке спонтанной и стимулированной продукции клетками крови при наличии внекишечных проявлений отмечена высокая продукция IL-1 р, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y, IL-5. У детей без внекишечных проявлений выявлены максимальные значения IL-4 и LPS+MDP-стимулируемой продукции IL-10. Больные БК с

• □ проктосигмоидит В левост ороииий колит □ тотальный колит

y

n

Л I I I ....... H_ i!............ м

IL-1P IL-2 IL-4 IFN-т TNF-a TNF-P ПЛ2 IL-5

И П.-4 Ц^ч-МПР ¡в И.-4 мрр а 11.-4 ЬРБ □ 11.-4 сномганно

внекишечными проявлениями имели более высокие значения экспрессии клетками крови и тканей ТОТ-а, а также тканевой экспрессии ГТ .-8, значения которой при внекишечных проявлениях было в 1,29 раза выше, чем у детей без этих проявлений. Эти закономерности подтверждены выявленными сильными корреляционными связями наличия внекишечных проявлений со спонтанной продукцией 11,-10 (Г^=0,8 р<0,05) и с ЬРв-стимулированной продукцией II -10 (Ку=-0,8 р<0,05). При исследовании моноцитарной продукции для внекишечных проявлений также было характерным более высокие значения 1Ь-8.

Рис. 6. Продукция цитокинов культурой цельной крови у детей с болезнью Крона с различным течением (пг/мл), (*- р<0,05).

30

1Ь-1 О 1000 2000 3000 4000 5000 6000

"ПЧР-аО 1000 2000 ЗООО 4000

1Ь-4 о

ГЬ-6 о

1Ь-8 о 2000 4000

: Ш П_-1 МБР

а и.-;

У детей с НЯК наличие внекишечных проявлений также указывало на большую агрессивность иммунного воспаления. Дети с внекишечными проявлениями имеют более высокие сывороточные значения всех цитокинов за исключением IL-lß, который был выше при отсутствии внекишечных проявлений. Дети с внекишечными проявлениями НЯК также имели высокие значения спонтанной продукции IL-lß и IL-8, при стимуляции клеток цельной крови данная закономерность не прослеживалась. Дети без внекишечных проявлений имели высокие значения спонтанной и стимулированной продукции IL-12 клетками цельной крови. При исследовании моноцитарной продукции для внекишечных проявлений было характерным более высокие значения IL-8 и IL-4. При оценке уровня mRNA экспрессия TNF-a клетками крови была в 3,5 раза выше при внекишечных проявлениях.

Пристеночная микрофлора в связи со своей непосредственной близостью к пораженным тканям, играть важную роль в патогенезе ВЗК, в связи с этим мы исследовали ее состав и возможную иммуногенную роль у детей с ВЗК.

Анализируя количественный состав пристеночной микрофлоры, было выявлено, что суммарная бактериальная плотность (количество бактерий, которые были идентифицированы методом ПЦР в каждом исследуемом биоптате) у детей с НЯК, БК и группе сравнения не имеет статистически значимых отличий. У детей с ВЗК была выявлена более низкая бактериальная плотность В. fragilis и Prevotella и повышенное количество Lactobacillus по сравнению с группой сравнения. При оценке бактериальной обсемененности пристеночной микрофлоры у детей исследуемых групп было выявлено, что для детей с НЯК характерны более высокие значения С. coccoides. Полученные отличия не были статистически значимыми, за исключением В. fragilis, которые были статистически ниже у пациентов с БК по сравнению с группой сравнения (р<0,05), что возможно связано с особенностями данной нозологии. Полученные результаты представлены в табл. 8.

С целью изучения особенностей пристеночной микрофлоры кишечника у детей с разными нозологическими формами ВЗК, ее связи с клинической и эндоскопической активностью и распространенность поражения нами проанализирован состав микробиоты отдельно у детей с НЯК и БК.

Для детей с НЯК характерно относительно повышенная бактериальная плотность C.coccoides и Lactobacillus, при некотором снижении Bifidobacterium, В. fragilis и Prevotella. В период обострения у детей с НЯК отмечается тенденция к повышению бактериальной плотности до loglO 8,95 0,38, в то время как в период ремиссии она

составляет loglO 8,65 0,28. Максимальная бактериальная плотность отмечается у детей с низкой клинической активностью (log 10 8,65 0,28). По мере повышения клинической активности отмечалась тенденция к снижению показателей бактериальной плотности (loglO 8,46 0,63), что вероятно связано с усилением агрессивности проводимой терапии, в том числе антибактериальной. При высокой клинической активности было снижено содержание представителей всех исследуемых групп, за исключением Lactobacillus, уровень которого был максимальным у детей с высокой активностью НЯК.

Таблица 8.

Результаты ПЦР состава пристеночной микрофлоры рестосигмоидного отдела кишечника у детей, исследуемых групп, (М±о)

Бактериальная группа Праймер Больные НЯК(п=16) Больные БК (n=8) Группа сравнения (п=8)

loglO, клеток/г

Bacteroides fragilis (группа) g-Bfra-F g-Bfra-R 6,45 0,72 6,02 0,25* 6,99 0,59

Prevotella (род) g-Prevo-F g-Prevo-R 6,31 0,82 6,1 1,16 6,53 0,75

Clostridium coccoides (группа) g-Ccoc-F g-Ccoc-R 8,15 1,05 7,72 1,37 7,83 1,07

Clostridium leptum (группа) sg-Clept-F sg-Clept-R3 7,51 0,41 7,3 0,49 7,42 0,43

Atopobium (кластер) c-Atopo-F c-Atopo-R 8,39 0,32 8,48 0,44 8,32 0,21

Lactobacillus (род) g-Lacto-F g-Lacto-R 2,59 0,63 2,56 0,34 2,29 0,58

Bifidobacterium (род) g-Bifi-F g-Bifi-R 7,39 0,15 7,37 0,26 7,63 0,58

*-р < 0,05 по сравнению с группой сравнения

Относительный риск высокой активности НЯК при высоких значениях Lactobacillus составлял 2,92 (RR=2,92, 95%ДИ 1,04 - 9,93). Bifidobacterium у этих детей практически отсутствовали. Максимальные значения Bifidobacterium были отмечены у детей с низкой активностью заболевания, относительная вероятность низкой активности в этом случае составляет 1,32 (RR=1,32, 95%ДИ 1,21 - 15,4). Данные закономерности изменений уровня Lactobacillus и Bifidobacterium подтверждаются выявленными прямыми сильными корреляционными связями Lactobacillus с высокой клинической активностью НЖ (Rs=0,86, р<0,01), a Bifidobacterium с низкой клинической активностью заболевания (Rs=0,79, р<0,05).

При анализе лабораторных показателей с исследуемыми бактериальными группами было выявлено, что для Bifidobacterium характерна прямая сильная корреляционная связь (Rs~0,78, р<0,05) с уровнем IgM в сыворотке крови. Для Lactobacillus была выявлена прямая сильная корреляционная связь с повышением СРБ (Rs=0,83, р<0,001).

При индивидуальном анализе бактериальных групп в зависимости от эндоскопического индекса активности по Rachmilewitz нами было отмечено, что для детей с высокой эндоскопической активностью характерно снижение бактериальной плотности Prevotella, по сравнению с детьми, у которых эндоскопическая картина соответствовала умеренной и низкой активности. Однако это количество было схоже с количеством копий нуклеотидных последовательности Prevotella у детей, находящихся в эндоскопической ремиссии. У детей с умеренной эндоскопической активностью не было выявлено статистически значимых отличий бактериальной плотности исследуемых бактерий по сравнению с эндоскопической картиной у других детей. При низкой клинической активности были выявлены самые высокие количества копий нуклеотидных последовательностей Prevotella по сравнению с другими группами эндоскопической активности и эти отличия были статистически значимы (р<0,05). Эндоскопическая ремиссия у детей с НЯК характеризовалась самой низкой бактериальной плотностью Clostridium leptum и Clostridium coccoides.

Анализируя связь бактериальной плотности с распространенностью патологического процесса при НЯК, было выявлено, что при проктосигмоидитах повышена бактериальная плотность Bacteroides fragilis, Clostridium coccoides по сравнению с проктитами и панколитами. А у детей с проктитами количество копий нуклеотидных последовательностей Bifidobacterium было ниже порогового уровня чувствительности.

Для детей с БК характерно более низкое значение В. fragilis (р<0,05), С. leptum, С. coccoides и Prevotella при некотором нарастании бактериальной плотности Lactobacillus. Уровень Bifidobacterium и Atopobium не отличались от группы сравнения.

При оценке зависимости состава пристеночной микрофлоры от клинической активности у детей с БК было выявлено, что максимальная бактериальная плотность отмечалась у детей с умеренной клинической активностью БК (log 10 9,02 0,36), по мере нарастания активности бактериальная плотность падает до loglO 8,37 0,59, что связано с применением антибактериальной терапии. Детей с низкой клинической активностью в исследовании не было. В стадии ремиссии находился один ребенок, и суммарная бактериальная плотность у него составила loglO 8,79.

Высокая клиническая активность у детей с БК характеризовалась снижением бактериальной плотности C.coccoides и Prevotella по сравнению с бактериальной плотностью у детей с умеренной клинической активностью и ремиссией. При умеренной клинической активности значения бактериальной плотности были схожи с результатами количественного ПЦР исследуемых бактерий у ребенка, находившегося в ремиссии.

При анализе клинических симптомов БК у детей с представителями индигенной микрофлоры была выявлена прямая сильная корреляционная связь между наличием Atopobium и повышением температуры тела (Rs=0,88, р<0,01), С. Leptum и учащением стула до 3 раз в сутки (Rs=0,84, р<0,05), Lactobacillus и примесью крови в стуле (Rs=0,86, р<0,05), в то время как уровень Bifidobacterium имеет обратную сильную корреляционную связь с примесью крови в стуле (Rs=-0,88, р<0,05). Расчет относительного риска симптомов не представляется возможным из-за немногочисленности исследования.

При анализе лабораторных показателей с исследуемыми бактериальными группами было выявлено, что для C.coccoides характерна прямая сильная корреляционная связь (Rs=0,83, р<0,05) с анемией и нейтрофилезом. Для С. leptum также была выявлена прямая сильная корреляционная связь (Rs=0,90, р<0,05) с повышением уровня нейтрофилов в периферической крови у детей с БК. Для Lactobacillus была выявлена прямая сильная корреляционная связь (Rs=0,81, р<0,05) с повышением СОЭ, а также повышением уровня IgG в сыворотке крови (Rs=0,82, р<0,05).

При оценке особенностей эндоскопической картины у детей с БК в зависимости от характера бактериального пейзажа пристеночной микрофлоры было выявлено, что для детей с высокой эндоскопической активностью по SES-CD характерно снижение бактериальной плотности Prevotella, по сравнению с детьми, у которых эндоскопическая картина соответствовала умеренной, низкой активности и эндоскопической ремиссии. Clostridium leptum и Clostridium coccoides были ниже порогового уровня чувствительности.

При оценке состава пристеночной микрофлоры в зависимости от распространенности патологического процесса при болезни Крона было выявлено, что при панколитах бактериальная плотность Prevotella, С. leptum и С. coccoides были выше, чем при илеоколитах. У детей с БК была выявлена прямая сильная корреляционная связь С. leptum и C.coccoides (Rs=0,82, р<0,05 и Rs=0,82, р<0,05, соответственно) с изолированным поражением толстой кишки, и обратная сильная корреляционная связь с вовлечением в патологический процесс подвздошной кишки (Rs=-0,83, р<0,05 и Rs=-0,83, р<0,05, соответственно).

Индивидуальный анализ каждой бактериальной группы с эндоскопической картиной выявил прямую сильную корреляционную связь Л/ороЫит (1^=0,73, р<0,05) с наличием язв слизистой оболочки толстой ктпки и прямую сильную корреляционную связь МороЫит ^=0,75, р<0,05) с воспалительными полипами в толстой кишке.

С целью исследования реакции иммунной системы у детей с ВЗК на антигены индигенной микрофлоры кишечника, на примере лактобацилл и бифидобактерий, мы оценивали уровень ^О-антител к лактобациллам и бифидобактериям у детей с различными вариантами течения ВЗК.

Результаты исследования показали, что повышение уровня антител к бактериальным антигенам лактобацилл и бифидобактерий характерно для больных с НЯК. Повышение уровня ^О-аитител было выявлено у 55% детей с НЖ и только у одного ребенка с БК.

Повышенный уровень 1§Ст-антител к лакто- и бифидобактериям значимо чаще встречается в активный период заболевания (р<0.05). В период обострения уровень хватите л был повышен у 71 % детей с НЖ, в то время как в период ремиссии этот показатель был повышен только в 17% случаев (р<0,05). Повышенный уровень этих показателей чаше встречается у детей с НЯК при высокой клинической активности (36%), в то время как максимальная доля детей с нормальным уровнем ^О-антител приходится на клиническую ремиссию НЯК (рис.7). Нами была выявлена статистически значимая ассоциация повышенного уровня ^О-ангител к лакто- и бифидобактериям с высокой клинической активностью НЯК ((р=2,073, р<0,05), а риск развития высокой клинической активности возрастает в 2,33 раза (КК=2.33, 95%ДИ 1,06 - 5,13, р<0,05).

клиническая ремиссия

низкая активность

умеренная активность

высокая

активность

0% 10% 20% 30% 40%

□ дети с НЯК без повышэния уровня Ь <3-антигеп В дети с НЯК с повышенным уровнеи1д (З-внтгел

Рис. 7. Клиническая активность по индексу 1*ас111ш1еи'Иг у детей с НЯК с различным уровнем антител к лактобациллам и бифидобактериям

При оценке клинических симптомов НЯК у детей с различным уровнем антител не было выявлено значимых различий, за исключением частоты анемии и дефицита массы тела. Если у детей с повышенным уровнем ^в-антител анемия отмечалась в 45,5%, а дефицит массы тела в 45,0% случаев, то в группе с нормальным уровнем ^О-антител эти клинические симптомы не были выявлены ни у одного пациента. Это, вероятно, связано с большей тяжестью и высокой клинической активностью патологического процесса в группе с высоким уровнем ^О-антител к лакто- и бифидобактериям.

При анализе эндоскопической картины нами было отмечено, что для детей с повышенным уровнем ^в-антител к лактобациллам и бифидобактериям характерная большая распространенность и активность патологических эндоскопических изменений. Анализируя данные распространенности патологического процесса при НЯК, было выявлено, что повышение уровня ^О-антител к лакто- и бифидобактериям чаще встречается среди детей с тотальным поражением толстой кишки. У 73% детей повышенный уровень ^в-антител к лактобациллам и бифидобактериям сочетался с панколитом, и лишь в 27% случаев повышение уровня антител отмечалось при локализованных формах. Нами была вьивлена статистически значимая ассоциация повышенного уровня ^О-антигел к лакто- и бифидобактериям с панколитом при НЯК (ф=2,787, р<0,01), а риск панколита возрастает в 2,33 раза (№=4,00, 95%ДИ 1,11 - 14,3, р<0,05). Дети с НЯК, у которых не было выявлено повышение уровня 1§С-антител по сравнению с контрольной группой, преобладали локализованные формы (рис.8).

«%

»0% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

78%

27%

22%

проктит и проктоскгмоидет

□ дета с НЯК (сз повыше ВдетасНЯКс!

I урома Тщ С-»нгг*гед 1 уровнем 1ц С-ажгкгел

Рис. 8. Распространенность поражения ЖКТ у детей с НЯК с различным уровнем ^С-антител к лактобациллам и бифидобактериям.

В данной работе нами были сопоставлены установленные патогенетические факторы с целью выявления возможного их взаимодействия и влияния на развитие БК и НЯК и их клиническое течение у детей.

При исследовании иммунной воспалительной реакции у детей с различными полиморфными генотипами нами было установлено, что дети с БК, имеющие в своем генотипе хоть один из известных ПВ гена 1\'002/СЛШ)!5 (0908Я, Я702\У, с.ЗОгОшэС), характеризуются выраженным провоспалительным иммунным ответом (рис.9). При наличии ПВ гена ИСЮ2/СА 1Ю15 у детей с БК отмечаются более высокие значения основных провоспалительных цитокинов (1Ь-1Р, 1Ь-6,ЮТ-а, 1РЫ-у ), как в нативной сыворотке крови, так и при спонтанной и стимулированной продукции в культуре клеток периферической крови, чем у детей с диким вариантом генотипа. А в случае продукции 1Ь-6 культурой клеток, стимулированной ЬР8+МОР, эти различия статистически значимы (р<0,05). Уровень противовоспалительных интерлейкинов (1Ь-10,1Ь-4) был ниже.

У детей с НЯК (рис.10) такой генотип сочетается с повышенной продукцией, как провоспалительных (11.-6,1Ь-8, ЮТ-а, 1Ш-у, 1Ь-2), так и противовоспалительных (11,-10) цитокинов. Однако все различия в продукции цитокинов у детей с НЯК не были статистически значимыми (р>0,05).

20000 18000 16000 14000 Ш00

Цоооо "юоо 6000 4000 2000 0

Пл1 1Ь-4 Огб М 1Ь-10 Шв

~ БК

я Ш!У002+ и то 2-

1

1

г

1 =______

„ ! 1 ~ 1

"Ж 1 •л ^ шт

1 щЦ;; ] НЕ-П^

Рис. 9. Уровень ЬР8+МГ)Р-сгимулированш>й продукции цитокинов у детей с БК в зависимости от ПВ гена !\'0П2/САЯ015 (* - р<0,05)

Рис. 10. Уровень ЬРБ+1УГОР-стимулированной продукции цитокинов у детей с НЯК в зависимости от ПВ гена NOD2/CARD15

пл

Ъг4

1Ь-6

1ь-а

ОгЮ

ТЭТа

Рис. 11. Уровень ЬР8+МОР-стимулированной продукции цитокинов у детей с БК в зависимости от ПВ 0299С гена Т1К4

ГЦ Ш-4 1ИО ТИР«

Рис. 12. Уровень ЬРв+МОР-стимулированнон продукции цитокинов у детей с НЯК в зависимости от ПВ П299С гена ИЛ-/

При исследовании влияния ПВ Б2990 гена ТЬК4 на иммунный ответ было отмечено, что у детей с БК, несущих данную полиморфную аллель, (рис. 11) при спонтанной и стимулированной продукции цитокинов культурой клеток крови отмечаются повышенные концентрации противовоспалительных интерлейкинов (11,-10. ТЬ-4) и сниженные значения провоспалительных ТЬ-6,11,-8, ТЫР-и. IР-1Р (за исключением ЬР8+МЛР комбинированной стимуляции). Уровень ТОТ-а при данном полиморфном генотипе был снижен всегда: и в сыворотке крови, и в стимулированных и спонтанных пробах культуры клеток периферической крови. У больных с НЯК с данным полиморфным генотипом (рис.12) отмечены существенно более высокие значения, как провоспалительных цитокинов (1Ир, 11,-2, 1Р-6, 1Р-8, ГЫР-а, ГП^-у), так и противовоспалительного 1Р-10. Исключение составляет только ГР-4. который во всех пробах секретировался только у детей с НЯК, имеющих дикий генотип.

При оценке иммуно-воспалительной реакции у детей с БК в зависимости от наличия в генотипе ПВ Ь503Р гена ОСШ1 были выявлены разнонаправленные закономерности. При анализе спонтанной продукции все исследуемые цитокины были несколько выше у детей без полиморфизма. При стимуляции культуры клеток цельной крови, особенно МБР и Ц^+МБР, концентрация 1Р-1р, 1Ь-6, ТЫР-а была выше у детей, имеющих полиморфизм Р503Р гена ОС1Ы1, при примерно одинаковых значениях продукции 1Ь-4, 1РЫ-у и 1Р-8 с детьми с диким генотипом. При оценке спонтанной и

стимулированной продукции полиморфный генотип по [,503 Г гена ОСТМ1 у детей с НЯК сочетался с повышением уровня островоспалительных цитокинов: 1Ь-1р и 1Г.-8. при снижении продукции 11,-2, [[.-4, 1Ь-6, ТМР-а и [НО. Все различия в изучаемых показателях у детей данных групп не были статистически значимыми (р>0,05).

Рис. 13. Уровень ЬРв+МОР-стимулированной продукции цитокинов у детей с БК в зависимости от ПВ -207 в/С гена ОСТЮ

20(100 11000 16000 14000 11000 Зоооо М00 «000 4000

шоо о

1Ь-1 IЪА 1Ь-6 Ш4 1Ь-и ТИГа

Рис. 14. Уровень ЬР8+МШ'-стиму.1иропанной продукции цитокинов у детей с НЯК в зависимости ПВ -207 в/С гена ОСТЮ (* - р<0,05)

При оценке иммуно-воспалительной реакции у детей с БК в зависимости от ПВ -207 G/C гена OCTN2 (рис.13) было установлено, что данный полиморфный генотип сочетается с повышенной продукцией основных провоспалителъных цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a), при угнетении продукции противовоспалительных интерлейкинов IL-4 и, особенно, IL-10. В случае LPS-стимулированной продукции IL-10 эти различия статистически значимы. (р<0,05). У больных НЯК с ПВ -207 G/C гена OCTN2 (рис.14) отмечается снижения продукции основных провоспалительных (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a) и противовоспалительных (IL-10, IL-4) цитокинов, по сравнению с детьми-носителями дикого генотипа. Различия по спонтанной и стимулированной продукции клетками цельной крови IL-6 были статистически значимыми (р<0,05). Исключение составляет продукция IL-ip, которая повышена только у детей больных НЯК, имеющих в генотипе полиморфную аллель -207 G/C гена OCTN2.

Оценить влияние VNTR-полиморфизма гена IL-1RA, R30Q гена DLG5, -308 g/а гена TNFA и -1082 g/a гена IL-10 на характер и выраженность иммуно-воспалительной реакции у детей с ВЗК в нашем исследовании не удалось.

При исследовании зависимости продукции TNF-a у детей с ВЗК от наличия в генотипе ПВ -308 g/а гена TNFA было показано, что полиморфный генотип, как у детей с БК, так и с НЯК вызывает повышение, как спонтанной, так и стимулированной продукции TNF-a в культуре клеток цельной крови. Однако выявленные различия не были статистически значимыми (р>0,05).

При исследовании состава пристеночной микрофлоры у детей с ВЗК с различными вариантами полиморфного генотипа было установлено, что дети с БК (табл. 9) при наличии в генотипе одного из полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 имели более низкие популяционные уровни С. leptum (р<0,05), C.coccoides (р<0,05) и Prevotella (р>0,05), при несколько повышенном уровне Lactobacillus (р<0,05). Наличие полиморфного варианта D299G гена TLR4 у детей с БК сочеталось с более чем 10-кратным снижением уровня C.coccoides (р>0,05). Полиморфные варианты генов OCTN1 и OCTN2 сочетались со снижением популяционного уровня Prevotella, С. leptum и C.coccoides в составе пристеночной микрофлоры толстой кишки. Однако все выявленные различия не были статистически значимыми (р>0,05).

При анализе состава пристеночной микрофлоры у детей с НЯК в зависимости от различных полиморфных генотипом не выявлено существенных различий, за исключением снижения популяционного уровня Lactobacillus при наличии полиморфных

вариантов генов ОСТШ и ОСШ2, однако данные изменения не были достоверными (р>0,05).

Таблица 9.

Состав пристеночной микрофлоры у детей с БК в зависимости от полиморфного генотипа М002/САМ>15 ^10, клеток/г), (* - р<0,05)

Генотип Atopobium С1. coccoides CI. leptum В. fragilis Prevotella Lacto-bacillus Bifldo-bacterium

NOD2+ 8,33 7,49-8,75 5,93* 5,93-6,10 6,47* 6,476,82 6,03 5,986,12 5,08 5,06-5,14 2,70* 2,693,05 7,33 7,30-7,37

NOD2- 8,60 8,57-8,72 8,29 8,22-8,59 7,37 7,357,39 6,11 6,116,12 7,03 6,47-7,08 2,42 2,172,57 7,42 7,18-7,59

Учитывая выявленную нами высокую диагностическую ценность повышения уровеня IgG- антител к лактобациллам и бифидобактериям у детей с НЯК, нами проанализирована ее возможная взаимосвязь с различными вариантами полиморфного генотипа в данной группе больных детей. Однако статистически значимых ассоциаций полиморфных вариантов изучаемых нами генов с повышением уровня IgG- антител к лакто- и бифидобактериям выявлено не было.

Таким образом, наше исследование показало, что развитие и течение ВЗК у детей обусловлены взаимодействием ряда патогенетических факторов, включающих генетические, иммунологические и микробиологические нарушения. Нами выделены прогностические факторы, определяющие прогноз развития, клинического течения и неэффективность проводимой терапии при БК и НЯК у детей.

Факторы прогноза развития БК у детей:

- полиморфизм R702W гена NOD2/CARD15 повышает риск развития БК в 2,84 раза;

- полиморфизм с.3020 insC гена NOD2/CARD15 повышает риск развития БК в 2,74 раза;

- полиморфизм L503F гена OCTN1 повышает риск развития БК в 1,58 раза;

- полиморфизм -207 G/C гена OCTN2 повышает риск развития БК в 1,61 раза;

- сочетание 2 ПВ гена NOD2/CARD15 повышает риск развития БК в 12,5 раза;

- сочетание ПВ L503F гена OCTN1 и -207 G/C гена OCTN2 повышает риск развития БК в 2,23 раза;

- сочетание ПВ 1 ПВ NOD2/CARD15 и L503F гена OCTN1 повышает риск развития БК в 2,23 раза;

- сочетание 1 ПВ ЛЮ02/СА1Ю15 и -207 &С гена ОСТЫ2 повышает риск развития БК в 2,66 раза;

- сочетание 1 ПВ №ЭШ/СЛЙО/5, Ъ503Р гена ОСТЫ1 и -207 С/С гена ОСТЫ2 повышает риск развития БК в 5,5 раза;

- сочетание ПВ Ь503Б гена ОСТЫ!, -207 О/С гена ОСТЫ2 и ЯЗОО гена ОШ5 повышает риск развития БК в 3,14 раза;

- сочетание ПВ Ь503Р гена ОСШ1 и У№П1-полиморфизма гена 11-¡ИЛ повышает риск развития БК в 1,97 раза (р<0,05);

- сочетание ПВ Ь503Б гена ОСШ1, -207 О/С гена ОСТЫ2 и \гЫТК-полиморфизма гена Л,-1ЯА повышает риск развития БК в 2,14 раза.

Факторы прогноза неблагоприятного клинического течения БК у детей:

- полиморфизм 11300 гена £>/.05 повышает риск манифестации БК у детей в возрасте старше 4-6 лет в 2,85;

- полиморфизм с.3020т$С гена Ы002/СА!Ю15 повышает риск изолированного илеита при БК в 2,2 раза;

- полиморфизм 1?.702\У гена ЫОй2/САМ)15 повышает риск изолированного колита при БК в 5,81 раза;

- полиморфизм Я702\У гена ЫОИ2/СА1Ю15 повышает риск перианального поражения при БК в 7,14 раза;

- полиморфизм с.3020тзС гена Ы002/СА1Ш15 повышает риск стенозирующее течение БК в 7,14 раза;

- полиморфизм Я702\У гена Ы002/СА1Ф15 повышает риск пенетрирующее течение БК в 2,81 раза;

Факторы прогноза высокой активности иммуио-воспалительного процесса

при БК у детей:

- полиморфизмы генов ЫОВ2/СА1Ю15, -207 в/С гена ОСТЫ2;

- изолированное поражение верхних отделов ЖКТ при БК;

- изолированный илеит при БК;

- наличие спенозирующего и/или пенетрирующего течения при БК;

- наличие внекишечных проявлений при БК.

Факторы прогноза благоприятного клинического течения БК у детей:

- полиморфизм Ь503Р гена ОСТЫ1 снижает риск перианального поражения при БК в 0,66 раза.

Факторы прогноза низкой активности иммуно-воспалительного процесса при БК у детей:

- полиморфизм D299G гена TLR4.

Факторы прогноза неэффективности лечения при БК у детей:

- полиморфизм -207 G/C гена OCTN2 повышает риск гормонозависимости при БК в 1,34 раза;

- полиморфизм R702W гена NOD2/CARD15 повышает риск хирургического лечения при БК в 3,29 раза.

Наиболее неблагоприятные варианты течения БК у детей ассоциированы с ПВ R702W гена NOD2/CARD15 и -207 G/C гена OCTN2. При носительстве полиморфной аллели высок риск развития осложненного течения БК с высокой степенью активности иммуно-воспалительного процесса в сочетании с неэффективностью медикаментозной терапии и повышенным риском хирургического лечения. У носителей полиморфного генотипа 207 G/C гена OCTN2 при БК высока вероятность развития высоко активного иммунного воспаления в сочетании с гормонозависимостью.

Факторы прогноза развития НЯК у детей:

- полиморфизм L503F гена OCTN1 повышает риск развития НЯК в 1,9 раза;

- гомозиготный генотип L503F гена OCTN1 повышает риск развития НЯК в 2,16 раза;

- сочетание ПВ L503F гена OCTN1 и -207 G/C гена OCTN2 повышает риск развития НЯК в 2,32 раза;

- сочетание ПВ L503F гена OCTN1 и VNTR-полиморфизма гена IL-1RA повышает риск развития НЯК в 1,97 раза.

Факторы прогноза неблагоприятного клинического течения НЯК у детей:

- полиморфизм L503F гена OCTN1 повышает риск проктосигмоидита при НЯК в 1,31 раза;

- полиморфизм D299G гена TLR4 повышает риск проктосигмоидита при НЯК в 3,11 раза;

- полиморфизм G908R гена NOD2/CARD15 повышает риск перианального поражение при НЯК в 8,5 раз;

- полиморфизм R702W гена NOD2/CARD15 повышает риск перианального поражение при НЯК в 4,9 раза;

- полиморфизм -308 g/a гена TNFA повышает риск перианального поражение при НЯК в 3,0 раза;

Факторы прогноза высокой активности иммуно-воспалителыгого процесса при НЯК у детей:

- полиморфизмы генов NOD2/CARD15, D299G гена TLR4;

- тотальный колит при НЯК;

- наличие внекишечных проявлений при НЯК;

- высокие значения Lactobacillus в составе пристеночной микрофлоры, риск высокой активности НЯК повышается в 2,92 раза;

- повышенный уровень IgG-антител к лакто- и бифидобактериям, риск с высокой клинической активностью НЯК возрастает в 2,33 раза, а риск панколита повышается в 2,33 раза.

Факторы прогноза благоприятного клинического течения НЯК у детей:

- полиморфизм L503F гена OCTN1 снижает риск тотальный колит при НЯК в 0,79 раза.

Факторы прогноза низкой активности иммуно-воспалнтелыюго процесса при НЯК у детей:

- полиморфизм -207 G/C гена OCTN2-,

- высокие значения Bifidobacterium в составе пристеночной микрофлоры, вероятность низкой клинической активности повышается в 1,32 раза.

Факторы прогноза неэффективности лечения при НЯК у детей:

- полиморфизм -207 G/C гена OCTN2 повышает риск гормонозависимости при НЯК в 1,49 раза;

- полиморфизм R702W гена NOD2/CARD15 повышает риск хирургического лечения при НЯК в 7,43 раза;

- полиморфизм -308 g/a гена TNFA повышает риск хирургического лечения при НЯК в 4,08 раза.

Учет полученных нами прогностических факторов риска крайне важен для построения прогноза течения заболевания у детей и подбора адекватной программы терапии.

выводы

1. Развитие и особенности течения воспалительных заболеваний кишечника определяются комплексным взаимодействием патогенетических факторов: генетических, иммунологических и микробиологических. Генетическая предрасположенность является ведущей, обусловливая степень активности иммуно-воспалительных реакций, клинических проявлений и прогрессирования патологического процесса у детей.

2. Развитие болезни Крона у детей ассоциировано с полиморфными вариантами R702W (р<0,01, OR=2,84), c.3020insC (р<0,01, OR=3,00) гена NOD2/CARD15, L503F (р<0,05, OR=l,58) гена OCTNI, -207 G/C (р<0,05, OR=l,61) гена OCTN2, VNTR-полиморфизмом с длиной фрагмента 488 гена IL-IRA (р<0,05). Риск развития болезни Крона возрастает при сочетанных полиморфных генотипах и максимален при сочетании двух полиморфных аллелей гена NOD2/CARD15 (OR=12,5 р<0,05).

3. Развитие неспецифического язвенного колита у детей ассоциировано с полиморфным вариантом L503F (р<0,01, OR=1,90) гена OCTN1. Повышенный риск развития неспецифического язвенного колита отмечен при сочетании L503F гена OCTN1 с -207 G/C гена OCTN2 (OR=2,32 р<0,05) и L503F гена OCTN1 с VNTR-полиморфизмом гена IL-1RA (OR=l,97 р<0,05).

4. Активность иммуно-восполительной реакции определяет особенности развития клинических форм и течения воспалительных заболеваний кишечника у детей. Показателями высокой активности при болезни Крона является изолированный илеит, поражение верхних отделов пищеварительного тракта, стенозирукмцее и/или пенетрирующеей течение и наличие внекишечных проявлений. При неспецифическом язвенном колите высокая активность проявляется тотальным колитом и наличием внекишечных проявлений.

5. Популяционные уровни отдельных представителей пристеночной микрофлоры кишечника (Bacteroides fragilis, Lactobacillus, Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Atopobium, Bifidobacterium) отличаются при разных формах воспалительных заболеваний кишечника у детей. Наиболее информативны изменения микрофлоры при неспецифическом язвенном колите. Повышение уровня Lactobacillus ассоциировано с высокой клинической активностью (RR=2,92 р<0,05), а повышенные значения Bifidobacterium - с низкой клинической активностью (RR=1,32 р<0,05) неспецифического язвенного колита.

6. У детей с неспецифическим язвенным колитом отмечается нарушение иммунологической толерантности к представителям облигатной микрофлоры кишечника. Повышение уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям у них увеличивает риск развития высокой клинической активности (RR=2,07 р<0,05) и тотального колита (RR=2,33 р<0,05).

7. Наличие в генотипе полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15, -207 G/C гена OCTN2 у детей с болезнью Крона и полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15, D299G гена TLR4 у детей с неспецифическим язвенным колитом сочетаются с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов и угнетением противовоспалительной активности. Генотипы с D299G гена TLR4 при БК и 207 G/C гена OCTN2 при НЖ вызывают низкую активность иммунного воспаления.

8. Носительство полиморфной аллели -207 G/C гена OCTN2 ассоциировано с гормонозависимостью и повышает ее риск у детей с болезнью Крона (RR=1,34 р<0,05) и неспецифическим язвенным колитом (RR=1,49 р<0,05).

9. Повышенный риск хирургического лечения ассоциирован с полиморфизмом R702W гена NOD2/CARD15 у детей с болезнью Крона (RR=3,29 р<0,05) и полиморфизмами R702W гена NOD2/CARD15 (RR=7,43 р<0,05) и -308 g/a гена TNFA (RR=4,08 р<0,05) у детей с неспецифическим язвенным колитом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения клинических форм и особенностей течения воспалительных заболеваний кишечника у детей необходимо исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена 1L-1RA, -308 g/a гена TNFA, имеющих важное значение для прогноза прогрессирования заболеваний и эффективности терапии.

2. Детям с болезнью Крона, носителям полиморфных аллелей R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15 и -207 G/C гена OCTN2, и больным с неспецифическим язвенным колитом, носителям полиморфных аллелей G908R, R702W гена NOD2/CARD15, L503F гена OCTN1, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена 1L-1RA, показана тактика ведения с более интенсивной противовоспалительной и иммуносупрессивной терапией из-за риска высокой активности иммунного воспаления и необходимости хирургического лечения.

3. Для прогнозирования эффективности стероидной и иммуносупрессивной терапии у детей с воспалительными заболеваниями кишечника рекомендовано исследование полиморфного варианта -207 G/C гена OCTN2.

4. Лицам, имеющим отягощенную наследственность по воспалительным заболеваниям кишечника, показано исследование полиморфных вариантов R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA с целью определения риска развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита.

СПИСОК РАБОТ, О ПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мухина Ю.Г., Дубровская М.И., Шумилов П.В., Макаров B.JI. Применение лактулозы у детей с аномалиями развития толстой кишки // Вопросы современной педиатрии. -2004. - Т. 3, приложение № 1, С. 297.

2. Мухина Ю.Г., Нетребенко O.K., Дегтярева М.В., Дубровская М.И., Шумилов П.В., Чубарова А.И. Возрастные особенности микрофлоры кишечника и особенности диетической коррекции. // Пособие для врачей. - Москва, 2005. - 50 с.

3. Чубарова А.И., Мухина Ю.С., Шумилов П.В., Степанова Н.В. Роль медиаторов воспаления в патогенезе некротизирующего энтероколита новорожденных // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2005. -№ 5/6. - С. 93-99.

4. Мухина Ю.Г., Косицкая О.Г., Дубровская М.И., Шумилов П.В., Михеева A.A., Чечельницкая С.М. Результаты диспансеризации подростков с жалобами на боли в животе. Признаки соматического неблагополучия // Трудный пациент. - 2006. -Т.4, №2 - С. 9-14.

5. Шумилов П.В., Нетребенко O.K., Мухина Ю.Г., Дубровская М.И. Возможности нутрититивной коррекции окислительного стресса у детей с патологией толстой кишки // Трудный пациент. - 2006. - Т.4, №6 - С. 5-9.

6. Мухина Ю.Г., Дубровская М.И., Кафарская Л.И., Шумилов П.В. Современные представления о механизмах формирования иммунного ответа слизистой оболочки кишечника у детей раннего возраста // Трудный пациент. - 2006. - Т.4, №6 - С. 914.

7. Мухина Ю.Г., Чубарова А.И., Дубровская М.И., Шумилов П.В. Применение пребиотиков при функциональных нарушениях деятельности желудочно-

кишечного тракта у новорожденных и детей раннего возраста // Вопросы практической педиатрии. - 2007. - Т. 2, № 2 . - С. 46-50.

8. Шумилов П.В., Юдина О.В., Мухина Ю.Г., Дубровская М.И., Тертычный A.C. Эозинофильные воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и пищевая аллергия у детей // Вопросы современной педиатрии. - 2007. - Т. 6, №4. -С. 43-53.

9. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Осипова Е.Ю., Карпина Л.М. // Индукция цитокинов под влиянием белков бактериальных оболочек у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008,- Т. XVIII, №5- Приложение №32 «Материалы XIV Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., Москва. - С.64.

10. Шумилов П.В., Малахинова H.A., Сапрыкина Е.А., Цимбалова Е.Г., Степанова Е.В., Щагина O.A., Поляков A.B., Потапов A.C. Особенности генотипа при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008.- Т. XVIII, №5-Приложение №32 «Материалы XIV Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., Москва. -С.65.

11. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Цимбалова Е.Г.,Осипов Г.А., Хромова С.С., Бобрынина В.О., Щиголева Н.Е. Микробный фактор при воспалительных заболеваниях кишечника у детей.// Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.- 2008.- Т.18.-№5.- стр.58.

12. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Цимбалова Е.Г., Цветков П. М., Румянцев С.А., Мухина Ю.Г. Особенности экспрессии цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Сборник материалов Седьмого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2008 г. — С. 65.

13. Дубровская М.И., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г. Запоры у детей. Современные подходы и тактика лечения // Лечащий врач. - 2008. - №7. - С.43-48.

14. Малахинова H.A., Шумилов П.В., Поляков A.B., Перепанова Т.С., Карпина Л.М. Влияние полиморфизмов гена NOD2 на течение воспалительных заболеваний кишечника у детей // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. - Москва. - 2009 - С. 168-169.

15. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Ястребова Н.Е., Потапов A.C. Нарушение иммунного ответа к индигенной микрофлоре при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // журнал Педиатрия им. Г.Н.Спиранского. - 2009. - Т. 88, № 6. -С. 55-59.

16. Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Малахинова H.A., Ипатова М.Г., Румянцев С.А., Потапов A.C. Роль иммунных нарушений и микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы детской диетологии. — 2009,- Т.7, №4. - С. 13-19.

17. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Осипов Г.А., Ястребова Н.Е., Цимбалова Е.Г. Особенности пристеночной микробиоты при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Сборник материалов 2-ого международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009», Санкт-Петербург 28-30 октября 2009 г. - 2009. - С. 16.

18. Мухина Ю.Г., Шумилов П.В. Глава 42. Воспалительные заболевания кишечника. Педиатрия: национальное руководство: в 2 т. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. —Т. 1. - 1024 е. —С. 771-781.

19. Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Мухина Ю.Г. Иммунная система желудочно-кишечного тракта. Лекции по педиатрии том 9 «Иммунология». Под ред. В.Ф.Демина, С.О. Ключникова Москва 2009 400с. - С. 72-83.

20. Хандамирова О.О., Шумилов П.В., Румянцев С.А. Особенности неспецифической иммунной реакции на микробные антигены у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // Российский иммунологический журнал. — 2009. - Т. 3(12), №3-4.-С. 318-325.

21. Шумилов П.В., Щиголева Н.Е., Ипатова М.Г., Матина И.А., Пономарева А.П., Болотов A.A., Карпина Л.М. Антицитокиновая терапия при болезни Крона у детей // Вопросы практической педиатрии. - 2010. - Т. 5, № 1. - С. 23-30.

22. Тертычный A.C., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г., Е Цымбалова.Г., Андреев А.И. Трудности морфологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника на материале эндоскопических биопсий у детей // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2010. - № 1. - С. 48-52.

23. Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Ипатова М.Г., Пащенко А.Б., Потапов A.C. Особенности иммунного воспаления у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите // Вопросы детской диетологии. — 2010. - Т.8, № 2.-С 13-18.

24. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Шкопоров А.Н., Ястребова Н.Е., Кафарская Л.И., Потапов А.С., Мухина Ю.Г. Дисрегуляция иммунного ответа на индигенную микрофлору у детей с воспалительными заболеваниями кишечника // журнал Педиатрия им. Г. Н. Сперанского. - 2010. - Т. 89, № 2. - С. 45- 49.

25. Малахинова Н.А., Шумилов П.В., Поляков А.В., Мухина Ю.Г., Щагина О.А., Карпина JI.M., Потапов А.С., Михайлова Т.Л., Капинцева В.А., Курохтина И.С. Влияние полиморфных маркеров генов NOD2, DLG5, TLR4 на вероятность развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита // VI Российский генетический конгресс: Тезисы докладов. -Ростов-на Дону. 2010,- С. 35.

26. Малахинова Н.А., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г. Роль полиморфных вариантов генов NOD2/CARD 15, DLG5, TLR4 при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите // Якутский медицинский журнал.- 2010. -№ 2. - С. 50-54.

27. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Кафарская Л.И., .Шкопоров А.Н., Мухина Ю.Г.. Особенности пристеночной микрофлоры у детей с воспалительными заболеваниями кишечника и ее клиническое значение // Вопросы детской диетологии. - 2010. - Т. 8, №5, С. 20-23.

28. Шумилов П.В. Нерешенные вопросы патогенеза воспалительных заболеваний кишечника у детей. Роль пристеночной микрофлоры кишечника // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Т.7, №5, С. 18 - 22.

29. Шумилов П.В., Ипатова М.Г., Кафарская Л.И., Шкопоров А.Н.. Клиническое значение пристеночной микрофлоры у детей с неспецифическим язвенным колитом II Педиатрическая фармакология - 2010. - Т.7, №5, С. 12-17.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

LPS - липополисахарид

MDP - мурамилдипептид

mRNA — матричная рибонуклеиновая кислота

БК - болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ДИ - доверительный интервал

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

К - контрольная группа

НЯК- неспецифический язвенный колит

ПВ - полиморфный вариант

Подписано в печать 22.10.2010 г. Тираж 100 экз. Заказ № 2614 Отпечатано в типографии «АллА Принт»

г. Москва, Лубянский пр-д, д.21, стр.5 Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.nj

Актуальность проблемы

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) до настоящего времени остаются одной из наиболее серьезных и нерешенных проблем в педиатрии и гастроэнтерологии. По тяжести течения, частоте осложнений, и летальности болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) занимают одно из ведущих мест в структуре болезней ЖКТ [1,9].

В последние годы отмечается стремительный рост НЯК и, особенно, БК во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние десятилетия является увеличение распространенности данной патологии среди молодых людей [184]. По данным Тигипеп Р., е! а1. (2006) заболеваемость БК и НЯК у детей и подростков в Финляндии за последнее десятилетие удвоилась [261]. Примерно у 1/3 пациентов первая манифестация ВЗК происходит до достижения ими 18 лет. ВеаШе Я.М. е1 а1. (2006) указывают, что 25% ВЗК манифестируют в детском возрасте [66]. По данным Ви11ег Н., е1 а1. (2002) распространённость этих заболеваний у детей в разных странах колеблется от 2,2 до 6,8 на 100000 населения [81]. В Англии и Ирландии частота впервые выявленных ВЗК у детей составляет 5,2 на 100 тысяч [237].

В Российской Федерации было проведено единственное эпидемиологическое исследование БК в 1997г., согласно которому распространённость БК в Московской области равна 3,5 на 100 тысяч взрослого населения, заболеваемость БК составляет 0,3 на 100 тысяч взрослого населения [21]. Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в России является поздняя диагностика и преобладание тяжелых осложненных форм с высокой летальностью (в 3 раза выше, чем в большинстве стран). Эпидемиологических исследований ВЗК в детском возрасте в Российской Федерации не проводилось.

Этиология ВЗК до сих пор остается неизвестной. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как взаимодействие генетической предрасположенности, нарушенной иммунной реактивности, в первую очередь на уровне слизистой оболочки кишечника, нарушенной барьерной функции кишки и повышенной чувствительности к воздействию факторов внешней среды, в том числе кишечной микрофлоре и специфическим антигенам [164]. Совокупность этих факторов приводит к патологической иммуно-воспалительной реакции в кишечнике с формированием и поддержанием хронического воспаления в пищеварительном тракте.

Генетическая предрасположенность подтверждается многими зарубежными исследованиями. Высокий, 15-кратный риск развития ВЗК отмечается у родственников первой степени родства [18, 39]. Наиболее высокая конкордантность у монозиготных близнецов отмечается при БК и составляет 72% [75].

В результате трёх различных исследований в 2001 году у больных с БК на длинном плече 16-ой хромосомы в пределах локуса IBD1 был идентифицирован ген NOD2 [137, 147, 203]. Три наиболее частых ПА 702W, 908R, с3020/ш,С в гене NOD2/CARD15 полиморфных варианта в этом гене, по данным King Kathy (2006), повышают риск развития заболевания в гетерозиготном состоянии в 2-4 раза, а в гомозиготном состоянии в 20-40 раз [161].

Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов NOD2/CARD15, DLG5, OCTN1, OCTN2, TLR4, TNFA, IL-1RArJL-J0 [32, 114, 250, 257, 271]. Однако степень влияния этих полиморфных вариантов генов у населения разных стран на развитие ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Частота полиморфизмов генов в разных популяциях существенно различается [58, 73, 154, 197, 229].

В российской популяции у пациентов с манифестацией БК и НЯК в детском возрасте неизвестна частота полиморфных вариантов генов

NOD2/CARD15, DLG5, OCTN1, OCTN2, TLR4, TNFA, IL-1RA и IL-10, не определен риск развития БК и НЯК при наличии полиморфных генотипов. Большой интерес представляет исследование особенностей клинической картины и течения БК и НЯК в детском возрасте в зависимости < от полиморфных вариантов генов, выявление генетических критериев, которые позволили бы предупредить о развитии вероятных осложнений у пациентов с ВЗК. Однако до настоящего времени подобное исследование у детей с ВЗК в российской популяции не проводилось.

Точные механизмы иммунопатогенеза БК и НЯК остаются до конца не известными. С современных позиций патогенез ВЗК рассматривают как генетически детерминированную дисрегуляцию иммунной системы хозяина на патоген-ассоциированные молекулы, в том числе резидентную микрофлору кишечника и антигены пищи. В первую очередь эта дисрегуляция проявляется на уровне слизистой оболочки кишечника, где происходит максимальное взаимодействие микрофлоры с различными компонентами иммунной системы. В результате изменений функций клеток, участвующих в поддержании адекватного локального иммунного ответа происходит не контролируемое высвобождение растворимых медиаторов воспаления, итогом чего является развитие патологии, в том числе ВЗК [213].

Иммунопатогенез БК и НЯК отличаются уровнем дифференцировки и активации Т-клеточного звена иммунитета. При обоих заболеваниях идет активация Т-клеток, но при БК в силу преобладания в слизистой CD4-icneTOK с фенотипом Т-хелперов 1 типа (Thl) идет продукция преимущественно IFNy, TNFa и IL-23. В то время как при НЯК в слизистой отмечается повышение СБ4-клеток с фенотипом Т-хелперов 2 типа (Th2) и, следовательно, гиперпродукция IL-5 и IL-13 [76, 163, 263]. Подобная активация Thl возможно связана с подавлением контролирующих механизмов, в частности регуляторных клеток (CD4+CD25+,Th3) [258]. Важную роль в этом процессе играют и функциональные нарушения Trl-клеток, которые секретируют в высоких дозах IL-10, цитокин, подавляющий активность Thl-клеток [131]. Детальные исследования на лабораторных животных показали, что длительная стимуляция продукции цитокинов Thl-клетками вызывает активацию макрофагов, которые, в свою очередь, продуцируя IL-12, IL-18 и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, вызывая дальнейшую стимуляцию Thl-клеток. Активированные макрофаги в свою очередь так же продуцируют спектр различных воспалительных цитокинов - TNF, IL-1, IL-6, что, в конечном счете, приводит к продукции неспецифических медиатров воспаления и повреждению тканей, а, следовательно, манифестации заболевания [258]. Итогом чрезмерной Т-клеточной активности при ВЗК является возникновение чрезмерного и продолжительного синтеза цитокинов в очаге воспаления.

С другой стороны накоплено достаточно много новой информации о роли врожденного иммунитета в патогенезе ВЗК, что ставит под сомнение первичность Thl и Th2 ответов в возникновении БК и НЯК. Возможно, эти ответы являются следствием дефектов, в механизмах врожденных иммунных ответов. Процесс распознавания микробных агентов с помощью врожденного иммунитета, происходит через То11-подобные рецепторы (TLR), которые располагаются на мембране клеток, и протеинами NOD, располагающимися в цитоплазме. Эти рецепторы обладают строгой специфичностью. Возможно, функциональная активность TLR и NOD нарушены при ВЗК. Трансфекционные исследования показали, что мутации NOD2 приводят к дефектной способности отвечать на липополисахариды (LPS) при БК [153].

Все эти исследования совместно с наблюдением животных моделей и генетическими ассоциациями, являются серьезными фактами, объясняющими огромную роль дефектов врожденного иммунитета в качестве ключевого компонента в основе развития ВЗК и, особенно, БК. Достаточно ли одиночных дефектов иммунитета или только их комбинация необходима для запуска и поддержания воспалительного процесса пока неизвестно, и требует дальнейшего исследования.

При обоих заболеваниях отмечается дисфункция эффекторных и регуляторных клеток, как приобретенного, так и врожденного звена иммунной системы, гиперпродукция медиаторов воспаления, что приводит к «неконтролируемому воспалению» [163, 213]. Однако связь этих процессов с активностью и клиническими проявлениями ВЗК требует уточнения.

С другой стороны, микрофлора кишечника является необходимым и, возможно, ключевым фактором в развитии ВЗК и их поддержании. Микрофлора ЖКТ состоит более чем на 1014 бактериальных клеток, что примерно в 10 раз больше количества соматических и гаметных клеток в теле человека. [60]. Такая высокая концентрация микрофлоры в просвете кишечника может служить причиной того, что многие микробные патогены могут быть потенциальным этиологическим фактором ВЗК. Хотя конкретная инфекционная причина ВЗК не установлена, современные клинические и экспериментальные исследования свидетельствуют об утрате иммунологической толерантности к нормальной микрофлоре при развитии хронического воспаления в кишечнике при ВЗК. [244]. Это подтверждают данные, полученные при изучении экспериментальных моделей ВЗК у животных, у которых было выявлено, что в стерильных условиях симптомы воспаления у них носят маловыраженный характер [70, 107, 189, 206, 218, 222, 225, 241, 255], а типичные проявления экспериментального колита проявляются только после экспозиции обычным микробным сообществом. [107, 222, 241]. У пациентов с ВЗК было отмечено, что пассаж фекальных масс по кишечнику усиливает симптомы воспаления вовлеченных тканей. 95% пациентов с болезнью Крона с локализацией в толстой кишке чувствуют улучшение после хирургического отвода пассажа кала через илеостому, но при этом у этих же пациентов после восстановления пассажа кала по кишечнику симптомы быстро возвращались [140].

В клинических исследованиях у больных с ВЗК было выявлено, что интестинальная микрофлора претерпевает большие изменения. Они включают в себя высокую сосредоточенность бактерий в мукозном слое, как в воспаленных, так и невоспаленных участках кишки [252]. Однако, имеющиеся данные недостаточны для понимания механизмов развития этих заболеваний и их клинических проявлений.

ВЗК характеризуются чрезвычайным разнообразием клинических проявлений, темпов прогрессирования и развития осложнений, особенно в детском возрасте. Это требует дифференцированных подходов в диагностике и подборе разной степени агрессивности проводимой терапии. Для обеспечения адекватной тактики ведения больных необходимы четкие диагностические и прогностические критерии, которые до настоящего времени отсутствуют.

Таким образом, научные исследования, изучающие патогенетические механизмы развития ВЗК, направленные на разработку информативных критериев диагностики и прогноза, крайне актуальны.

Цель исследования

Установить факторы прогноза развития и течения БК и НЯК у детей на основании комплексного изучения полиморфизма генов, показателей иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника при разных клинических вариантах ВЗК для оптимизации диагностики, лечения и профилактики заболеваний.

Задачи исследования

1. Изучить частоту полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (G908R, R702W, c.3020insC), DLG5 (R30Q), OCTN1 (L503F), OCTN2 (-207 G/C), TLR4 (D299G), IL-1RA (VNTR-полиморфизм), TNFA (-308 g/a), IL-10 (1082 g/a) y детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом, их ассоциацию с заболеваниями и разными клиническими вариантами течения и относительный риск развития.

2. Определить особенности иммунного воспалительного процесса у детей при разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита по результатам спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре цельной крови и изолированных моноцитов, экспрессии информационной РНК цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов (TLR4, NOD2) в клетках крови и слизистой оболочки кишечника.

3. Изучить состав пристеночной микрофлоры и оценить значение отдельных ее представителей (группа В. fragilis, группа С. leptum, группа C.coccoides, род Bifidobacterium, род Lactobacillus, род Prevotella и кластер Atopobium) при' разных вариантах течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

4. Исследовать характер взаимосвязей генетических, иммунных и микробиологических показателей в особенностях развития и течения болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

5. Определить диагностически значимые показатели генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника в развитии и течении болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей.

6. Разработать факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите на основании показателей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Научная новизна исследования

Впервые проведено комплексное изучение генотипа, иммунного воспаления, пристеночной микрофлоры кишечника у детей при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите.

Впервые проведено исследование частоты полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC tqkzNOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена

IL-1RA, -308 g/a гена TNFA, -1082 g/a гена IL-10 y детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом в Российской Федерации, изучены ассоциации генотипов с данными болезнями и рассчитан риск развития заболеваний.

Впервые показана роль полиморфных генотипов в развитии особенностей течения и прогрессирования заболеваний, выявлены факторы прогноза развития для каждой нозологической формы.

Установлены особенности иммунного воспаления в зависимости от клинических форм, локализации процесса и течения у детей с воспалительными заболеваниями кишечника.

Показана роль пристеночной микрофлоры кишечника, особенности состава и значение отдельных ее представителей при течении разных клинических форм болезни Крона и неспецифического язвенного .колита у детей.

Впервые изучены взаимосвязи генотипа, иммунной реакции и пристеночной микрофлоры кишечника при различных клинических вариантах болезни Крона и неспецифического язвенного колита у детей. Выявлены особенности иммуно-воспалительной реакции у детей с различными вартантами полиморфного генотипа.

Выявлены генетические маркеры прогноза эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Практическая значимость

Выявленные особенности генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника способствуют ранней диагностики, прогнозированию активности, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Показано, что прогноз течения и исхода болезни Крона и неспецифического язвенного колита должен строиться на комплексной оценке особенностей генотипа, иммунного воспаления и пристеночной микрофлоры кишечника.

Наиболее диагностически значимыми при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей являются: исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFA, определение популяционного уровня Lactobacillus и Bifidobacterium в биоптатах слизистой оболочки кишечника и уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям, так как позволяют информативно оценить активность и построить прогноз течения заболеваний и эффективности терапии.

Показано, что оценка иммунного воспаления должна базироваться на комплексном исследовании уровня цитокинов в нативной сыворотке, их спонтанной и стимулированной продукции в культуре крови и экспрессии их генов в крови и тканях, так как исследование только сывороточного уровня не отражает истинного характера иммуно-воспалительной реакции.

На основании проведенного исследования выявлены факторы прогноза развития, течения и эффективности проводимой терапии при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите у детей.

Внедрение в практику

Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской детской клинической больницы, детской городской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова г. Москвы, отделения гастроэнтерологии НЦЗД РАМН.

Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры госпитальной педиатрии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, отдела гастроэнтерологии с гепатологичсекой группой НЦЗД РАМН, Российской детской клинической больницы и детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы; «Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе» (Москва, 2008); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); XV, XVI Конгрессах детских гастроэнтерологов России и стран СНГ» (Москва, 2008, 2009); Первом Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); 11-ом Международном Славяно-балтийском научном форуме «Санкт-Петербург -Гастро-2009» Санкт-Петербург, 2009); 2-ом международном конгрессе по пробиотикам «Санкт-Петербург - Пробиотики-2009» (Санкт-Петербург, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов (Москва, 2009); 11 Международном медицинском форуме «Современные медицинские технологии на службе охраны здоровья россиян» (Нижний Новгород, 2010); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 16 статей опубликовано в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 459 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав материалов собственного исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, содержащего 280 источников (45 отечественной и 235 зарубежной литературы). Работа проиллюстрирована 213 таблицами и 99 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Развитие и особенности течения воспалительных заболеваний кишечника определяются комплексным взаимодействием патогенетических факторов: генетических, иммунологических и микробиологических. Генетическая предрасположенность является ведущей, обусловливая степень активности иммуно-воспалительных реакций, клинических проявлений и прогрессирования патологического процесса у детей.

2. Развитие болезни Крона у детей ассоциировано с полиморфными вариантами R702W (р<0,01, OR=2,84), c.3020insC (р<0,01, OR=3,00) гена NOD2/CARD15, L503F (р<0,05, OR=l,58) гена OCTN1, -207 G/C (р<0,05, OR=l,61) гена OCTN2, VNTR-полиморфизмом с длиной фрагмента 488 гена IL-1RA (р<0,05). Риск развития болезни Крона возрастает при сочетанных полиморфных генотипах и максимален при сочетании двух полиморфных аллелей tqk&NOD2/CARD15 (OR=12,5 р<0,05).

3. Развитие неспецифического язвенного колита у детей ассоциировано с полиморфным вариантом L503F (р<0,01, OR=1,90) гена OCTN1. Повышенный риск развития неспецифического язвенного колита отмечен при сочетании L503F гена OCTN1 с -207 G/C гена OCTN2 (OR=2,32 р<0,05) и L503F гена OCTN1 с VNTR-полиморфизмом TznalL-lRA (OR=l,97 р<0,05).

4. Активность иммуно-восполительной реакции определяет особенности развития клинических форм и течения воспалительных заболеваний кишечника у детей. Показателями высокой активности при болезни Крона является изолированный илеит, поражение верхних отделов пищеварительного тракта, стенозирующее и/или пенетрирующеей течение и наличие внекишечных проявлений. При неспецифическом язвенном колите высокая активность проявляется тотальным колитом и наличием внекишечных проявлений.

5. Популяционные уровни отдельных представителей пристеночной микрофлоры кишечника {Bacteroides fragilis, Lactobacillus, Clostridium leptum, Clostridium coccoides, Atopobium, Bifidobacterium) отличаются при разных формах воспалительных заболеваний кишечника у детей. Наиболее информативны изменения микрофлоры при неспецифическом язвенном j колите. Повышение уровня Lactobacillus ассоциировано с высокой клинической активностью (RR=2,92 р<0,05), а повышенные значения Bifidobacterium - с низкой клинической активностью (RR=1,32 р<0,05) неспецифического язвенного колита.

6. У детей с неспецифическим язвенным колитом отмечается нарушение иммунологической толерантности к представителям облигатной микрофлоры кишечника. Повышение уровня IgG-антител к лактобациллам и бифидобактериям у них увеличивает риск развития высокой клинической активности (RR=2,07 р<0,05) и тотального колита (RR=2,33 р<0,05).

7. Наличие в генотипе полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15, -207 G/C гена OCTN2 у детей с болезнью Крона и полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15, D299G гена TLR4 у детей с неспецифическим язвенным колитом сочетаются с повышенной продукцией провоспалительных цитокинов и угнетением противовоспалительной активности. Генотипы с D299G гена TLR4 при БК и 207 G/C гена OCTN2 при НЯК вызывают низкую активность иммунного воспаления.

8. Носительство полиморфной аллели -207 G/C гена OCTN2 ассоциировано с гормонозависимостыо и повышает ее риск у детей с болезнью Крона (RR=1,34 р<0,05) и неспецифическим язвенным колитом (RR=1,49 р<0,05).

9. Повышенный риск хирургического лечения ассоциирован с полиморфизмом R702W гена NOD2/CARD15 у детей с болезнью Крона (RR=3,29 р<0,05) и полиморфизмами R702W гена NOD2/CARD15 (RR=7,43 р<0,05) и -308 g/a гена TNFA (RR=4,08 р<0,05) у детей с неспецифическим язвенным колитом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения клинических форм и особенностей течения воспалительных заболеваний кишечника у детей необходимо исследование полиморфных вариантов G908R, R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, -308 g/a гена TNFA, имеющих важное значение для прогноза прогрессирования заболеваний и эффективности терапии.

2. Детям с болезнью Крона, носителям полиморфных аллелей R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15 и -207 G/C гена OCTN2, и больным с неспецифическим язвенным колитом, носителям полиморфных аллелей G908R, R702W гена NOD2/CARD15, L503F гена OCTN1, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA, показана тактика ведения с более интенсивной противовоспалительной и иммуносупрессивной терапией из-за риска высокой активности иммунного воспаления и необходимости хирургического лечения.

3. Для прогнозирования эффективности стероидной и иммуносупрессивной терапии у детей с воспалительными заболеваниями кишечника рекомендовано исследование полиморфного варианта -207 G/C гена OCTN2.

4. Лицам, имеющим отягощенную наследственность по воспалительным заболеваниям кишечника, показано исследование полиморфных вариантов R702W, c.3020insC гена NOD2/CARD15, R30Q гена DLG5, L503F гена OCTN1, -207 G/C гена OCTN2, D299G гена TLR4, VNTR-полиморфизм гена IL-1RA с целью определения риска развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита.