Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патофизиологическое обоснование применения метода криодеструкции при опухолях и опухолеподобных процессах кожи



кописи

Темнова Ирина Владимировна

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА КРИОДЕСТРУКЦИИ ПРИ ОПУХОЛЯХ И ОПУХОЛЕПОДОБНЫХ ПРОЦЕССАХ КОЖИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03. - патологическая физиология 14.01.12. - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 НОЯ 2010

Нижний Новгород - 2010

004613265

Работа выполнена в Нижегородской государственной медицинской академии

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Артифексова Анна Алексеевна доктор медицинских наук Коченов Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Никольский Виктор Олегович

(Военно-медицинский институт ФСБ Российской Федерации,

г. Нижний Новгород)

доктор медицинских наук

Масленникова Анна Владимировна

(Нижегородская государственная медицинская академия,

г. Нижний Новгород)

Ведущая организация: Казанский государственный медицинский университет (г. Казань)

Защита состоится «_»_2010 г. в_часов на заседании диссертационного

Совета Д 208.061.03 при Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина, д.10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии (603104, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. 3 а).

Автореферат разослан «_»_

.2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.А .Дурново

Актуальность исследования

По данным официальной статистики, в Российской Федерации ежегодно регистрируется от 40,5 до 53 тыс. новых случаев злокачественных новообразований кожи, доля которых в общей онкологической заболеваемости населения составляет 10-12%, обеспечивая третье ранговое место в структуре онкопатологии у мужчин и второе - у женщин (Малишевская Н.П., 1999; Кулагин В.И., Сдвижков A.M., Умеренков М.Г., 2001; Старинский В.В., Петрова Г.В., Чиссов В.И. и др., 2002). Что же касается доброкачественных новообразований кожи, то статистика частоты этой патологии в нашей стране никогда не велась, поэтому количественные и качественные показатели заболеваемости ими на сегодняшний день отсутствуют (Молочков В.А., Вавилов A.M., Молочков A.B., 2004). Единичные работы на эту тему сообщают, что высокодифференцированные опухоли, встречаясь во всех возрастных группах, обнаруживаются у 70% людей старше 50 лет, а в сочетании со злокачественными новообразованиями кожи они диагностируются более чем в 90% случаев (Андрияшин Е.В., Николаев И.И., 2004).

В амбулаторной практике для лечения новообразований кожи применяют целый спектр методов лечения, в том числе хирургическое иссечение, электрокоагуляцию, лазерную деструкцию, радиохирургию, СВЧ-деструкцию, криодеструкцию, - различающихся по механизму воздействия на патологический процесс кожи (Шенталь В.В., 1987, Шафранов В.В., Малышева Н.Б., Жаров Б.В., Фомин A.A., Гераськин A.B., 2001, Чиссов В.И., C.JI. Дарьялова, 2007). Все эти методы в разной степени удовлетворяют необходимым требованиям амбулаторной хирургии - простота и удобство применения, предсказуемость результатов, возможность использования в разных возрастных группах, узкий спектр противопоказаний и малое количество осложнений и побочных эффектов. Все эти критерии характерны для метода криодеструкции. Низкотемпературное воздействие получило название «хирургия без скальпеля», благодаря таким важнейшим свойствам, как безболезненность, отсутствие кровотечения и общей реакции организма, физиологичность репаративных процессов (Кожевников В.А., 1986, Bon L.M., 1996, Cooper I.S., 1995).

Большинство практикующих врачей признают приемлемость метода холодового воздействия, а стабильность и предсказуемость положительного эффекта такого метода лечения привела к тому, что накопление клинических данных существенно обогнало рост теоретической базы низкотемпературной деструкции. В настоящее время в связи с развитием этого направления возникла необходимость проведения фундаментальных исследований, ориентированных на выяснение механизмов низкотемпературного разрушения опухолей, оценку и прогнозирование размеров зоны некроза и характеристику особенностей регенерации тканей после холодового воздействия в режиме деструкции. Кроме того, существует крайняя необходимость в определении стандартизированных подходов к выбору

температурного режима криодеструкции на основе различий анатомо-физиологических показателей тканей, подвергающихся разрушению.

Углубленное исследование в этом направлении с применением патофизиологических методик поможет уточнить теоретические основы применения низких температур в режиме деструкции, а также расширить показания к их применению благодаря дальнейшему усовершенствованию методик лечебного криовоздействия.

Цель исследования:

Патофизиологическое обоснование применения метода криохирургического лечения опухолей кожи.

Задачи исследования

1. Изучить в эксперименте ранние топоморфологические критерии прогнозирования крионекроза в опухоли и коже после криооксидеструкции.

2. Определить оптимальные сроки и способы осуществления наиболее информативной раннеотсроченной криобиопсии.

3. Оценить в эксперименте полноту элиминации опухолевых клеток саркомы Плиса при криооксидеструкции.

4. Сравнить результаты применения методики аппликационной криооксидеструкции с раннеотсроченной криобиопсией и метода электроэксцизии у больных с различными опухолями кожи.

5. Усовершенствовать конструкцию портативного криогенного аппарата для достижения наиболее низкой температуры криоаппликатора.

6. Разработать практические рекомендации для внедрения новой лечебной технологии аппликационной криооксидеструкции с раннеотсроченной криобиопсией при опухолях кожи в практическое здравоохранение.

Научная новнзна

1. Впервые проведены исследования природного явления криооксиконденсации на поверхности рабочей части активного азотного криоинструмента, изучено влияние этого явления на интенсивность теплообмена между криоинструментом и биологическими тканями, показана возможность применения визуального эффекта криооксиконденсации для констатации достижения наиболее низкого значения отрицательной температуры на криоаппликаторах.

2. В эксперименте на животных впервые исследованы патофизиологические особенности аппликационной криооксидеструкции, доказана возможность достижения совпадения границ создаваемой при криодеструкции зоны замораживания и будущих границ формирования крионекроза после криооксидеструкции.

3. В эксперименте у животных осуществлен сравнительный анализ ранних

морфотопографических критериев определения будущей демаркационной линии формирования и отторжения крионекроза в здоровой коже и в опухоли, установлены оптимальные временные рамки использования критерия возникновения линии тромбозов для объективной оценки полноты криодеструкции опухоли.

Практическая значимость работы

Разработана новая лечебная технология («Способ лечения новообразований» заявка на патент регистрационный № 2009141744 с приоритетом от 13 ноября 2009), соединяющая стандартизированную наиболее интенсивную криооксидеструкцию, раннеотсроченную криобиопсию в первые 3-6 часов после криодеструкции, которая при проведении одного морфологического исследования позволяет идентифицировать морфологический диагноз опухоли, объективно сопоставить границы индивидуального распространения опухоли и прогностические границы достигнутого уже криодеструктивного эффекта, что позволяет корректировать дополнительные лечебные воздействия в ранние сроки после криодеструкции.

Усовершенствован способ криохирургического лечения новообразований кожи позволяющий достичь радикального лечебного эффекта при различных новообразованиях кожи; стандартизировать наиболее интенсивный разрушающий эффект криодеструкции за счет стабилизации наиболее низкого значения температуры криоаппликатора; визуализировать наличие на криоинетрумеите наиболее низкого из возможных на воздухе значений температуры криоаппликатора; сохранить иммуностимулирующий эффект криодеструкции за счет сохранения контакта большей разрушенной холодом части новообразования в составе целостного организма на протяжении всего периода его отторжения в качестве чужеродного нативного субстрата; снизить количество рецидивов и вероятность метастазирования при злокачественных новообразованиях кожи.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Ранним морфотопографическим критерием расположения линии будущего развития необратимых криогенных разрушений и линии отторжения крионекроза в тканях опухолей и здоровых тканях кожи является граница возникновения сплошных тромбозов кровеносных сосудов через 3-6 часов после аппликационной криооксидеструкции. Выполнение в эти сроки после криооксидеструкции раннеотсроченной крибиопсии позволяет в ходе одного морфологического исследования поставить морфологический диагноз, и

индивидуализировано путем сопоставления границ распространения опухоли и линии сплошных тромбозов в тканях объективно прогнозировать полноту охвата опухоли уже нанесенным ей криодеструктивным воздействием, а также формулировать прогноз и планировать дальнейшие лечебные мероприятия.

2. Криооксиконденсация при аппликационной криодеструкции улучшает и стандартизирует качество теплопередачи, усиливает деструктивные эффекты в патологических тканях, обеспечивает совпадение достигаемой в повторяемых циклах замораживания-оттаивания видимой зоны замораживания с границей полного необратимого разрушения и последующего отторжения крионекроза.

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты внедрены в практическую деятельность Научного клинического центра медицинской криологии «онКолор» г. Нижнего Новгорода, МУЗ «Бронницкая городская муниципальная больница» г. Бронницы, ГУЗ «Нижегородский областной кожно-венерологический диспансер» г. Ниж. Новгорода.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы представлены на 2-ой международной научно-практической конференции «Новое в практической медицинской криологии» (Москва, 2005); 2-ой Международной иаучно-практической конференции «Новое в практической медицинской криологии» (Москва, 2005); 1 Международной научно-практической конференции «Криотерапия в России» (Санкт-Петербург, 2008); 15-м Всемирном конгрессе международного общества криохирургов (Санкт-Петербург, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия в XXI веке» (Оренбург, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Опухоли кожи и мягких тканей» (Санкт-Петербург, 2009); на совместном заседании кафедр: патологической анатомии, патологической физиологии, гистологии, нормальной анатомии, нормальной физиологии, биологии, клинической лабораторной диагностики ФПКВ, оперативной хирургии и топографической анатомии НижГМА, анестезиологии и реаниматологии ВМИ ФСБ РФ и кафедры неотложной педиатрии, акушерства и гинекологии с курсом планирования семьи ВМИ ФСБ РФ 10 июня 2010 года (протокол № 3).

Личный вклад автора заключается в самостоятельной постановке и проведении эксперимента, обработке экспериментального материала, включая морфологическое исследование. Самостоятельно проведено обследование и лечение 208 пациентов с опухолями кожи методом криодеструкции и 144 пациентов - электрохирургическим высокочастотным методом. При участии автора были проведены медикотехнические и морфометрические исследования. Автором самостоятельно проведена статистическая обработка результатов исследования.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 123 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, 4-х глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из 100 работ отечественных и 101 работы зарубежных авторов. Работа содержит 21 рисунок и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследований проведена на 160 белых беспородных крысах обоего пола массой 300-350 гр. Животные содержались в условиях вивария при длине светового дня 15 часов, при средней температуре 22°С. Под эфнрным наркозом проводили выстригание волосяного покрова кожи латеральной поверхности бедра обеих задних конечностей, после чего производилась трехкратная аппликационная криооксидеструкция аппаратом «Ледок» здоровой кожи (1 группа - 40 животных), аппаратом «Пингвин» (2 группа - 40 животных). Режимы холодового воздействия представлены в таблице № 1.

Таблица 1

Режимы воздействия в экспериментальном изучении криовоздеНствия на здоровую

кожу и перевитую саркому Плиса

Характеристики аппаратов Криоаппарат «Ледок» Криоаппарат «Пингвин»

Давление подачи азота, атм. 0,1-0,2 6-8

Режим подачи азота Импульсный, периодический Постоянный

Температура аппликатора -182°С -160°С

Наличие дополнительного холодового потенциала Имеется сжижение кислорода Нет сжижения кислорода

Время выхода на рабочий режим, сек. 5-10 600

Расход азота на 3-х кратное аппликационное воздействие, грамм 50-100 5000

Скорость роста фронта замораживания, мм/сек 0,425 0,165

Животным 3 и 4 групп (гр. 3 и 4 соответственно; по 40 животных в каждой) проводили

перевивку саркомы Плиса путем введения гомогената опухолевых клеток в объеме I см3

подкожно в паховую область правой задней конечности. На 7-ой день после перевивки

штамма опухолевых клеток, когда размер опухолевого узла составлял 1,5-2 см, проводили

криодеструкцшо новообразования аппаратами «Ледок» и «Пингвин» в соответствии со

стандартными режимами применения данных методов (табл. 1) также трехкратно. Для

экспериментальных и сравнительных исследований охлаждающей способности

криохирургических аппаратов брали однотипные по форме и размерам наконечники

криоинструментов: округлые, с диаметром 4 мм. Материал для гистологического

7

исследования забирали через 1, 3, 6, 12 часов после криовоздействия, а также 1, 2, 3 и 21 сутки эксперимента.

Клинический материал был получен от 208 пациентов в возрасте от 10 лет до 83 лет, которые проходили амбулаторное лечение в Центре медицинской криологии «онКолор» г.Нижний Новгород, МУЗ «Бронницкая городская муниципальная больница» г. Бронницы. Пациентам проводилась криооксидеструкция новообразований по новой лечебной технологии.

Контрольную группу составили 144 пациента, в возрасте от 10 до 59 лет, имеющие тот же профиль новообразований кожи, которые получали лечение в ГУЗ «Нижегородский областной кожно-венерологический диспансер» г. Нижний Новгород. Удаление новообразований кожи пациентам этой группы проводили электрохирургическим высокочастотным аппаратом «Фотек» в режиме «резание» (табл. 2).

Таблица 2

Номинальные мощности аппарата «Фотек» в рабочих режимах

Режим Резание Смесь Моно-коаг. Спрей Би-коаг,

Номинальная мощность, Вт 80±20% 80±20% 80±20% 30±20% 80±20%

Максимальное напряжение, не более, В 700 1200 1200 2500 700

Частота импульса, кГц 440±2% 440±2% 440±2% 26-29 440±2%

Экспериментальный и клинический материал (биоптаты кожи и новообразований) подвергался макро- и микроскопическому исследованию. Проводили внешний осмотр, изменения и оценку состояния опухолевого узла с применением дерматоскопа Heine Delta 20.

Для гистологического исследования биоптаты нормальной кожи и опухоли фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, проводили по спиртам восходящей крепости и заливали в парафин. Препараты толщиной 6 мкм окрашивали с применением обзорных окрасок и просматривали в световой микроскоп при увеличении 200,400 и 600 раз. Морфометрическому анализу подвергались зоны некроза, площадь сосудистого русла и соотношение этих зон. Измерения производили на микроскопе ЛОМО Микмед ВО-1 с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15.

Расчет статистических показателей проводился на персональном компьютере с помощью программного пакета Microsoft Office Excel 7,0 для Windows ХР и пакета прикладных программ Statistica 6,0. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариациоиной статистики, с вычислением средней арифметической и ее ошибки, среднего квадратичного отклонения. Для статистических расчетов использовался

8

метод проверки статистических гипотез с помощью критерия Стьюдента. Различия между сравниваемыми показателями считались достоверными при р< 0,05, т.е. когда вероятность была выше 95%.

Работа осуществлялась на базе кафедры патологической анатомии НижГМА, ЦНИЛ НижГМА.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Меднкотехннческпе исследования

В ходе усовершенствования портативного ручного криогенного аппарата «Ледок» (рис. 1), было создано и испытано в экспериментах и при клиническом использовании несколько вариантов конструкции аппарата, а сравнение его работоспособности мы производили с криогенной азотной базовой установкой «Пингвин». Конструктивная особенность аппарата «Ледок» (из «Набора инструментов для медицинской криологии по доктору В.И.Коченову» ТУ 9437-001-59631960-2008) позволяет обеспечивать предельно низкую температуру на поверхности аппликатора.

Существенными преимуществами «Ледка» являются малое время, необходимое для выхода на рабочий режим, экономичное расходование азота, наличие дополнительного холодового потенциала, возможность визуального контроля за минимальной температурой

аппликатора.

Рис. 1. Окончательный вариант конструкции аппарата «Ледок»:

1 - емкость для хладоагента; 2 - герметизирующая крышка; 3 - канал подъема давления; 4 - канал подачи хладоагента; 5 - канал отвода хладоагента; 6 - канюля; 7 -аппликатор; 8 - раструб; 9 -конусообразная пробка; 10 -эластичная трубка для подсоединения к источнику подъема давления; 11 - полость в герметизирующей крышке; 12 - отверстие в крышке; 13 -отводящая трубка; 14- изолирующая трубка; 15 - перемычки.

Объективным критерием достижения на аппликаторах криоинструментов минимальной температуры является визуализация появления струящейся пленки пассивно сжижающегося газа из окружающего воздуха. Простое сопоставление температуры

сжижения азота - -196°С и кислорода - -182°С позволило предположить, что криоконденсирующееся вещество - это кислород.

Для объективного исследования состава криоконденсирующейся, пассивно сжижающейся на аппликаторах атмосферной фракции произведены физические и химические эксперименты (совместно с кафедрой химии НижГМА - зав. кафедрой, д.м.н., профессор А. С. Гордецов). Анализируя эти физические и химические эксперименты, можно утверждать, что сжижающийся криоконденсирующийся на криоаппликаторе аппарата «Ледок» газ - это кислород, температура сжижения которого -182°С. Факт наличия криооксиконденсации на поверхности криоаппликатора и дистальной части канюли возникает только при наиболее низком охлаждении поверхности рабочей части криоинструмента. Поэтому нет необходимости измерять температуру инструмента, так как это температура находящегося на поверхности жидкого кислорода. Этот феномен прекрасно визуализируется, следовательно, отпадает необходимость в наличии датчика температуры криоаппликатора. Как следует из сведений обзора, чем ниже температура криоаппликатора и чем интенсивнее мы сможем обеспечить теплообмен, тем качественнее происходит процесс криодеструкции. Жидкий кислород, стекая по канюле в плоскость контакта аппликатора и ткани, обеспечивал дополнительную интенсификацию процесса охлаждения ткани.

Для сравнения замораживающих возможностей криоаппаратов «Пингвин» и «Ледок» провели исследования на замораживании модели, в качестве которой был использован желатиновый гель. При замораживании геля аппаратом «Ледок» со сжижением кислорода за 60 секунд получили полусферу размером 33 мм в ширину и 18 мм в высоту, средняя скорость роста фронта замораживания составила 0,425 мм/сек

При замораживании без сжижения 120 секунд получили полусферу размером 27 мм в ширину и 14 мм в высоту, средняя скорость фронта замораживания составила 0,165 мм/сек. На основании данного экспериментального исследования выяснили, что криооксидеструкция превосходит в 3 раза криодеструкцию без сжижения кислорода по скорости формирования зоны замораживания. Учитывая, что реальная скорость фронта замораживания в ткани будет несколько меньше, чем в геле, провели экспериментальные исследования на лабораторных животных.

Результаты экспериментальных исследований

Результаты проведенного экспериментального исследования по сравнительному изучению динамики альтеративных и репаративных процессов в коже и опухолевой ткани экспериментальных животных при использовании криохирургических аппаратов с различными параметрами криовоздействия показали, что, независимо от параметров криовоздействия, в зоне криоповреждеиия формируются три пространственно взаимосвязанные зоны. Нами зона А определена как зона первичной (прямой) альтерации,

вследствие непосредственного разрушения льдом; зона В1 - зона вторичного (ишемического) некроза, зона В2 - собственно некробиотических изменений, в которой сохраняются жизнеспособные клетки. Зоны А и В1 впоследствии формируют область полного разрушения клеточных элементов ткани. Зона С - зона обратимых дистрофических нарушений.

Сразу после криовоздействия в зоне А определялась деструкция эпидермиса с образованием полостей, которые расслаивали эпидермис, в сосочковом слое отмечалось разрушение мелких сосудов, тромбнрование мелких и средних сосудов. В зоне В - спазм и расширение сосудов, увеличение их проницаемости, отек, уменьшение кровотока в поверхностном сосудисто-соединительнотканном отделе дермы, накопление эритроцитов в просветах капилляров и уменьшение кровотока. Зона С характеризовалась умеренно выраженным расширением капилляров и отеком.

Зона А в течение первых суток эксперимента характеризовалась усугублением некротических изменений. Установлено, что в сроке до 12 часов некротическими изменениями была не затруднена морфологическая идентификация опухоли после осуществления криодеструкции.

Граница между зонами В1 и В2 начинала формироваться через 3 часа после криодеструкции и проявлялась развитием тромбоза мелких кровеносных сосудов. Через 6 часов после криовоздействия вокруг очага некроза развивалась линия демаркации между зонами В[ и В2 В этой зоне появлялось большое количество лейкоцитов и формировались сплошные тромбозы всех кровеносных сосудов кожи. В течение 6-12 часов заканчивалось формирование зоны ишемического некроза (зоны В1). Зона С характеризовалась ишемическимн нарушениями различной степени выраженности. Через 1 сутки после криовоздействия зона полного некроза, сформированная из зон А и В], имела отчетливые границы за счет деструкции эпидермиса и формирования обширных полостей в сосочковом слое дермы. Морфологическая идентификация опухоли была не возможна.

В основной группе некротические изменения в ткани развивались на протяжении 6 часов, после чего площадь некроза не изменялась в течение 3-х дней, по иному выглядели зоны некробиоза и дистрофии. Максимальные некробиотические изменения наблюдались через 12 часов после криовоздействия, максимальные дистрофические изменения - через 24 часа. Подобная динамика наблюдалась и при криодеструкции саркомы Плиса.

200,96

площадь зоны замораживания

площадь некроза через 1 час в здоровой коже

площадь некроза через 1 час,, саркома

Рис. 2. Сравнение зоны замораживания и зоны первичного некроза в группах исследования через 1 час после криовоздействия.

При одинаковой площади замораживания равной 200,96 мм2 в течение первого часа наблюдались достоверные различия в разрушающем действии криохирургических аппаратов (рис. 2): площадь прямого некроза при применении «Ледка» составила 111,57±5,29 мм" в здоровой коже (табл. 3) и 113,08±2,08 мм2 в саркоме (табл. 4), при применении «Пингвина» -колебалась в значительных пределах и составила 71,52±10,95 мм2 (р<0,01) и 81,5±11,55 мм" (р<0,05) соответственно.

Таблица 3

Сравнительная характеристика морфологических изменений в здоровой коже в основной и контрольной группах

Критерии Основная группа Контрольная группа Досгов ерность различ ий

М(Х)±Дх, мм при р=0.95 о, мм" М(Х)±Ах,мм": при р=0,95 ё, % о, мм"

8 некроза через ] час, мм" 111,57±5,29 4,74 3,81 71,52±10,95 15,31 21,88 ['<0,01*

в некроза через 6 часов, мм2 198,99±7,04 3,54 5,9 143,36± 16,81 11,73 30,76 Р<0,01*

в зоны некробиотическ их изменений через 12 часов, мм 473,63±20,7 4,37 14,85 340,4+16,42 4,82 32.84 Р<0,01*

в зоны дистрофических изменений через 72 часа, мм" 1002,08±60,32 6,02 43.51 987,14±84,84 8,59 152,3 Р>0,6

1 150

е

3

о с

"Ледок" "Пингвин"

группы исследования

Примечание. Лх - абсолютная ошибка для данной доверительной вероятности (отклонение от величины истинного значения); в - площадь; М(Х) - математическое ожидание (истинное значение величины): ё - относительная погрешность измерения - оценка отклонения измеренного значения величины от ее истинного значения; о — среднеквадратичное отклонение (рассеивание случайной величины относительно ее математического ожидания); *- статистически достоверно с показателями группы контроля.

250 200

£ 150

г

л ч

I 100

о с

Площадь замораживания

Площадь замораживания через 6 часов в здоровой коже

Площадь замораживания через 6 часов в саркоме

0 "Ледок" "Пингвин"

группы исследований

Рис. 3. Соответствие зоны замораживания зоне некроза через 6 часов после криовоздействия

Через 6 часов площадь зоны полного некроза (рис. 3) при криооксидеструкции составила в здоровой коже 198,99±7,04 мм2, в саркоме Плиса - 200.9±2.76 мм2, что приблизилось к первоначальной площади замораживания; в контрольной группе площадь некроза имела больший разброс значений и составила 143,36± 16,81 мм2 (р<0,01) в здоровой коже (табл. 3) и 157,37±16,23 мм2 (р<0.05) в лимфосаркоме (табл. 4). что достоверно меньше зоны замораживания в основной группе. В результате экспериментального исследования выяснили, что при использовании криохирургического аппарата «Пингвин» полная деструкция ткани осуществлялась в основном за счет зоны А, в то время как зона В становилась не четкой, увеличивалась зона обратимых ишемических нарушений, следовательно, был больше и объем не полностью разрушенной ткани, клеток способных к восстановлению функций.

Таблица 4

Сравнительная характеристика морфологических изменений в перевивной саркоме Плиса в основной и контрольной группах

Критерии Основная группа Контрольная группа Достове

М(Х)±Дх, £,% а, мм2 М(Х)±Дх,мм £,% а, мм рность

мм2 при р=0,95 различи

при р=0,95 и

8 некроза 113,08±2,08 1,84 4.05 81,5±11,55 14,17 23.1 Р<0,05*

через 1 час, мм2

в некроза 200.9±2.76 1,38 8,37 157,37±16,23 10,31 32,43 Р<0,05*

через 6

часов, мм2

8 зоны 493,81±4.02 0,81 7,79 339,14±16,42 4,84 32,86 Р<0,01*

некробиотич

еских

изменении

через 12

часов, мм2

8 зоны 1065,52±11,78 1,11 23,74 1027,15±55,93 5,45 111,9 Р>0.6

дистрофичес

ких

изменений

через 72

часа, мм2

Примечание. Дх - абсолютная ошибка для данной доверительной вероятности (отклонение от величины истинного значения); в - площадь; М(Х) - математическое ожидание (истинное значение величины); £ - относительная погрешность измерения - оценка отклонения измеренного значения величины от ее истинного значения; о - среднеквадратичное отклонение (рассеивание случайной величины относительно ее математического ожидания); *- статистически достоверно с показателями группы контроля.

Площадь зоны некробиотических изменений при криооксидеструкции превышала таковую при криодеструкции аппаратом «Пингвин» как в здоровой коже (табл. 3), так и в опухоли (табл. 4) и составляла в здоровой коже 473,63±20,7 мм2, в опухоли - 493,81±4.02 мм2, при использовании аппарата «Пингвин» соответственно 340,4±16,42 мм2 и 339,14±16,42 мм2. Разброс значений при использовании криоаппарата «Ледок» был в несколько раз ниже, чем в контрольной группе (табл. 3 и 4). Площадь дистрофических изменений в основной и контрольной группах, измеренная через 3-е суток после эксперимента, не имела достоверных

различий, как в здоровой коже, так и в опухоли, за счет низкой точности измерений и большого разброса значений (табл. 3 и 4)

На основании статистических исследований можно сделать вывод, что криооксидеструкция более точна и предсказуема, то есть в 95 случаях из 100 зона некроза при криодеструкции в заданном объеме будет находиться в более узких пределах, с незначительными отклонениями.

Глубина некротических изменений при использовании аппаратов, также была различна: при применении «Ледка» зона некроза захватывала нижний этаж сетчатого слоя, тогда как при использовании «Пингвина» локализовалась в основном в сосочковом слое дермы.

Через 12 часов после криовоздействия зона полного некроза, сформированная из зон А и В1 имела отчетливые границы за счет формирования лейкоцитарного вала, деструкции эпидермиса и формирования обширных полостей в сосочковом слое дермы. Морфологическая идентификация опухоли была затруднена.

Как показали результаты наших исследований, срок наступления первого признака локализации будущей демаркационной линии составил 3 часа, и признаком этим стала линия наступления сплошных тромбозов всех кровеносных сосудов в ткани. Причем в эксперименте мы показали, что четкость наступления границы будущего крионекроза и отторжения ткани по границе сплошных тромбозов возникла в указанный срок, только после наиболее интенсивной аппликационной криооксидеструкцин, осуществленной с адгезией с температурой аппликатора, при которой визуализировалось сжижение кислорода воздуха на криоинструменте. Криодеструкция при меньших отрицательных значениях температуры не давала четкой границы будущей демаркационной линии за 6 часов и граница крионекроза не совпадала с границей линии замораживания и тромбозов, а находилась внутри этой зоны, таким образом, процесс криодеструкции при меньших, чем -182°С температурах оказался не столь эффективным.

Исследование полноты элиминации опухолевых клеток у экспериментальных животных при замораживании опухоли Плнса также выявило различия при использовании различных криогенных аппаратов (табл. 5). В обеих группах животных к окончанию первых суток после криодеструкции наблюдались активные некротические изменения в опухоли. Зона крионекроза была отграничена демаркационным воспалением, которое характеризовалось расширением капилляров, полнокровием, отеком, лейкоцитарным валом. На 2-е сутки эксперимента после криооксидеструкцин опухоль имела желеобразную консистенцию, по периферии располагались островки опухолевых клеток, заключенные в некротизированные массы, при использовании аппарата «Пингвин» в зоне деструкции отмечалось присутствие полей опухолевых клеток с наличием многочисленных зон некроза.

Таблица 5.

Наличие опухолевых клеток у экспериментальных животных в различные сроки

эксперимента.

Способ криовоздействия Продолжительность эксперимента

1 сутки (п=5) 2 сутки (п=5) 3 сутки (п=5) 21 сутки (п=5)

Криооксидеструкция (аппарат «Ледок») Нет в демаркационной зоне. Группы клеток в зоне демаркации, заключенные в некротизирован-ные массы у 1 животного У 1 животного наличие опухолевых клеток, митозы за зоной демаркации У 4-х животных полная деструкция первичной опухоли. Мелкие отдаленные метастазы

Криодеструк ция без оксиконденсации (аппарат «Пингвин») Есть у 5-ти животных Поля опухолевых клеток с наличием некробиотических изменений у 5-ти животных Наличие массивов опухолевых клеток, митозы у всех животных У всех животных крупный очаг некроза в центре первичной опухоли. Крупные отдаленные метастазы.

Через 72 часа различия становились более выраженными: в основной группе - зоны некроза с наличием резкого расстройства кровообращения в виде полнокровия сосудов и кровоизлияний; в контрольной - наличие массивов мономорфных опухолевых клеток с большим количеством митозов, то есть наблюдалось развитие активного неопластнческого процесса по периферии зоны замораживания.

На 21 сутки после криооксидеструкции у 4-х животных отмечалась полная деструкция первичного опухолевого очага с частичным восстановлением кожного покрова и брюшной стенки, наличие мелких отдаленных метастазов в районах ворот печени, легких, позвоночного столба. У одного животного морфологически было выявлено присутствие полей опухолевых клеток с наличием зон некроза в районе первичной опухоли и регионарные лимфатические узлы объемом 1-2 см3. При криодеструкции аппаратом «Пингвин» у всех животных в центральной части опухоли наблюдалось образование очага некроза до 1,5 см в диаметре и до 2,5 см в глубину, отдаленные метастазы вдоль позвоночного столба, в районе шейных лимфатических узлов.

В результате проведенных сравнительных исследований установили, что криооксидеструкция саркомы Плиса способствовала более выраженному эффекту элиминации опухолевых клеток, торможению метастазпрования, так как эффект оксиконденсации усиливает активность аппликационного глубокого локального замораживания ткани, а также увеличивает точность и предсказуемость криовоздействия.

Таким образом, по результатам экспериментального исследования выяснили что, криовоздействие привело к глубокому некрозу тканей кожи, который сопровождался выраженными гемоцнркуляторными нарушениями по границе воздействия. Четко указывала на расположение края крионекроза граница развития тромбоза мелких кровеносных сосудов, проявляющаяся через 3 часа после криодеструкции. Лейкоцитарный вал контурировал будущую демаркационную линию, располагаясь снаружи от нее, через 6 часов после криодеструкции. Граница тотальной клеточной деструкции определялась морфологически через 24 часа. Граница крионекроза и в здоровой коже и в экспериментальной опухоли Плиса после криооксидеструкции с адгезией при температуре сжижения кислорода воздуха и трехкратном замораживанием ткани в одном и том же объеме практически полностью совпадала с границей зоны замораживания.

Способ лечения новообразований кожи

В результате экспериментальных исследований был предложен способ лечения новообразований (заявка на патент регистрационный № 200914)744 с приоритетом от 13 ноября 2009 года), повышающий качество лечения опухолей кожи.

Поставленная задача в данном способе лечения достигалась тем, что через 3-6 часов после криооксидеструкции, осуществляемой трехкратным замораживанием-оттаиванием с адгезией при температуре рабочей части инструмента ниже -182°С, о чем судили по видимому сжижению атмосферной фракции кислорода окружающего воздуха на открытой части криоаппликатора с охватом всего клинически определяемого объема новообразования зоной замораживания, осуществляли забор тканей новообразования для морфологического исследования овальными разрезами с отсечением эллипсовидного кусочка вытянутого по радиусу новообразования в сторону наиболее интенсивных инфильтративных изменений. В зоне отсекаемых не подвергавшихся замораживанию клинически здоровых тканей осуществляли местную анестезию. Отсечение фрагмента тканей производили единым блоком по подвергшимся замораживанию тканям и не замороженным окружающим, используя радиоволновой скальпель. После извлечения фрагмента тканей проводили морфологическую идентификацию новообразования и сопоставляли границу наличия патологических изменений с границей наступления тромбоза мелких кровеносных сосудов на поверхности и по глубине. При отсутствии выхода патологических тканей за пределы границ тромбоза криогенное разрушение новообразования заканчивали, а при констатации выхода патологически измененных тканей за пределы границ тромбоза осуществляли дополнительную, более глубокую и широкую криооксидеструкцию, причем учитывали определенное в ходе гистологического исследования расстояние, на которое выходит патологически измененная ткань за пределы границы тромбоза. После дополнительной криодеструкции через 3-6 часов после ее осуществления повторяли забор тканей для

морфологического исследования. При констатации радикальной криодеструкции осуществляли антисептический уход за зоной крнонекроза до его отторжения и заживления раны. Местное лечение в течение первых дней после криодеструкции состояло в обработке новообразований 70% медицинским спиртом или спиртовой настойкой календулы до самопроизвольного отторжения струпа. Раннее отторжение струпа не желательно: чем дольше сохранялась его связь с подлежащими тканями, тем полноценнее была эпителизация.

Результаты клинических исследований

Клинический материал исследования был представлен данными обследования 208 пациентов с различными формами новообразований кожи, которым в условиях медицинского центра «онКолор», МУЗ «Бронницкая городская больница» за период с 2006 по 2008 гг. была проведена криодеструкция по новой лечебной технологии, а также 144 пациентами с новообразованиями кожи, которым в условиях ГУЗ «НОКВД» производилось удаление новообразований электрохирургическим высокочастотным аппаратом «Фотек». Результаты проведенного нами клинического обследования показали, что основную часть составили пациенты трудоспособного возраста 20-59 лет - 292 пациента (83,78%); из них женщин - 180 (61,64%) и мужчин - 112 (38,36%).

Таблица 6

Распределение больных с новообразованиями кожи по полу и возрасту

Пол Возраст (лет) Всего

10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89

Мужчины - 8 29 38 37 8 13 4 137

Женщины 6 32 48 59 41 13 10 6 215

Итого 6 40 77 97 78 21 23 10 352

Преобладающими морфологическими типами новообразований у пациентов, получавших криооксидеструкцию, были папилломы кожи - 59 (28,37%), базалиомы - 52 (25%) и невусы - 30 (14,42%). Пациенты в возрасте 20-59 лет составили 71,63% (149 пациентов) из них 63,76% (95) женщин и 36,24% (54) мужчин (табл. 7).

У пациентов, которым производилось удаление новообразований кожи токами высокой частоты (табл. 8), преобладающими морфологическими типами были папилломы кожи - 63 (43,75%), капиллярные гемангиомы - 24 (16,67%) и невусы - 19 (13,19%). Преобладали пациенты трудоспособного возраста - 143 человека (99,31%) из них женщин 85 (59,44%) и мужчин - 58 (40,56%). Группы сопоставимы по возрасту и основным морфологическим типам новообразований.

Таблица 7

Распределение пациентов, подвергнутых криооксидеструкцин, по возрасту и

основным морфологическим типам новообразований

Тип Возраст, лет Всего (%)

новообразова 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89

НИ II

Папиллома 3 4 11 16 17 4 3 1 59(28,4%)

Гемангиома:

капиллярная венозная - 1 1 2 3 1 2 3 1 - 3 (1,4%) 11 (5,3%)

смешанная 2 2 1 3 1 - - - 9(4,3%)

Фиброма - 1 2 5 3 1 - - 9(4,3%)

Базалиома - - 5 8 14 4 13 8 52(25%)

Гипер- и - - 1 - - 4 4 - 9 (4,3%)

дисплазии

Кожный рог - - - 1 1 - - - 2 (0,96%)

Невус - 6 8 8 5 2 - 1 30(14,4%)

Себорейный - - 2 6 8 3 2 - 21(10,1%)

кератоз

Итого 5 14 31 52 52 ГТ1 23 10 208(100%)

Таблица 8

Распределение пациентов, подвергнутых электроэксцнзпн, по возрасту и

основным типам новообразований

Тип Возраст, лет Всего (%)

новобразования 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59

Папиллома 1 20 21 15 6 63(43,75%)

Себорейный - - - 4 6 10(6,9%)

кератоз

Гемангиома:

капиллярная - 2 10 12 - 24(16,8%)

венозная - - 2 3 3 8(5,55%)

смешанная - 1 2 - - 3(2,1%)

Невус - 2 10 3 4 19(13,2%)

Базалиома - - - 6 7 13(9,03%)

Кожный рог - 1 1 2 - 4 (2,8%)

Итого 1 26 46 45 26 144(100%)

Как показали результаты нашего исследования (табл. 9), полное клиническое излечение отмечено у 138 (95,8%) пациентов получавших лечение токами высокой частоты и у 200 (96,15%) пациентов, получавших криодеструкцию по новой лечебной технологии, причем 192 (92,3%) пациентам, потребовалась одна процедура криодеструкции. 8-ти пациентам потребовалось повторная отсроченная дополнительная криодеструкция с более широким и глубоким охватом окружающих тканей, так как при морфологическом исследовании было констатировано наличие выхода патологической ткани за пределы границ тромбоза. Дополнительную криодеструкцию провели через 7-10 дней после первого

воздействия. Данная мера потребовалась 2-м пациентам с невусами кожи и 6-ти пациентам с базальноклеточным раком кожи.

Таблица 9

Сравнительные результаты лечения пациентов методами электроэксцнзии и

крнод естру кц и и

Показатель Токи высокой частоты Крнодеструкция

Количество пациентов 144 208

Преимущественный тип новообразований Папиллома-63 (43,75%) Капиллярные гемангиомы-24 (16,67%) Невус-19 (13,19%) Папиллома-59 (28,37%) Базалиома-52 (25%) Невус-30 (14,42%)

Необходимость обезболивания + -

Средняя площадь одного новообразования, мм2 178,5±15,96 176,6±20,69

Средняя площадь открытого раневого дефекта, мм2 178,5±15,96 12,56±3,24

Сроки эпителизации 25±2,8 21±3,2

Наличие органотипической регенерации - +

Частота рецидивов 4,17% (6 пациентов) 3,85% (8 пациентов)

Частота осложнений 17,36% (25 пациентов) 7,21 % (15 пациентов)

Сроки эпителизации, т.е. период времени от проведения манипуляции до момента самопроизвольного отторжения струпа, был меньше при использовании криодеструкции и составил 21±3,2 дня, что меньше, чем при электроэксцнзии (25±2,8 дня), так как уровень операционной травмы гораздо ниже при криодеструкции (площадь открытого раневого дефекта 12,56±3,24 мм2) по сравнению с другими оперативными методами (площадь открытого раневого дефекта при электроэксцизии 178,5±15,96 мм2), что способствовало и меньшему количеству воспалительных осложнений (7,21%, против 17,36% при электроэксцизии). Поврежденные коллагеновые структуры длительно сохранялись в области повреждения. В этих условиях они играли роль матрицы, способствуя направленному формированию регенерата, что позволяло сократить сроки восстановления структуры ткани и сформировать регенерат, близкий по строению к органотипическому. Исходя из этого, можно заключить, что применение у пациентов с новообразованиями кожи криооксидеструкции имеет преимущества перед электроэксцизией: обладает абластичностью, минимальной травматичностью, уменьшает частоту осложнений лечения, а также вероятность рецидивов и метастазирования, течение тканевых репаративных процессов носит более физиологичный характер, что обеспечивает восстановление нормальной структуры кожи и, как следствие, хорошие косметические результаты, отсутствие деформации органа.

выводы

1. Толографо-морфологическим критерием прогнозирования границы криокекроза является наличие тромбоза в сосудах микроциркуляторного русла, развивающегося через 3 часа после криовоздействия, что позволяет контролировать полноту криодеструкции как в здоровой, так и в опухолевой ткани.

2. Ткани после криодеструкции сохраняют свою анатомическую целостность и пространственное расположение волокон при наличии некроза клеток и деструкции сосудов микроциркуляторного русла кожи. Раннеотсроченная криобиопсия, взятая в сроки 3-6 часов после криовоздействия, позволяет одновременно провести морфологическую идентификацию опухоли, сопоставить границы наличия патологических изменений с будущей линией демаркации, при необходимости провести дополнительные лечебные мероприятия.

3. Зона некроза опухолевых клеток при саркоме Плиса, индуцированная воздействием аппарата «Ледок», превосходит по площади и глубине деструкции изменения, возникающие при воздействии аппаратом «Пингвин», что снижает вероятность рецидивирования и тормозит метастазирование опухоли.

4. Аппарат «Ледок» дает более низкую температуру замораживания, что в сочетании с эффектом оксиконденсации, приводит к ускорению формирования фронта замораживания, увеличению площади некроза, 1раница которого сопоставима с границей зоны замораживания.

5. Некротизированный участок кожи фактически является «матрицей» и играет роль струпа при заживлении. Восстановление ткани завершается формированием регенерата, близкого по строению к органотипическому. Течение тканевых репаративных процессов после криодеструкции носит более физиологичный характер, чем при электрокоагуляции, что обеспечивает восстановление нормальной структуры кожи и хорошие косметические результаты лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Криоаппараты для лечения опухолей кожи должны обеспечивать сжижение кислорода воздуха на охлажденной рабочей поверхности криоинструмента. Криооксиконденсация при аппликационной криодеструкции улучшает и стандартизирует качество теплопередачи, усиливает деструктивные эффекты в патологических тканях, обеспечивает совпадение достигаемой в повторяемых циклах замораживания-оттаивания зоны замораживания с границей полного необратимого разрушения и отторжения крионекроза.

2. Криооксидеструкцию с раннеотсрочегаюй биопсией следует использовать при различных кожных опухолях до 2 см в диаметре, особенно в сложных анатомо-топографических зонах. Она проста в применении, так как при ее проведении достаточно добиваться распространения видимой зоны замораживания до желаемых границ будущего крионекроза.

3. При морфологической оценке расположения линии необратимых криогенных разрушений в тканях опухолей и здоровых тканей кожи после криодеструкции необходимо ориентироваться на границу возникновения сплошных тромбозов кровеносных сосудов, начинающую формироваться через 3 часа после криодеструкции.

4. Контрольную биопсию, позволяющую одновременно поставить морфологический диагноз и дать заключение о достаточности уже осуществленной криодеструкции, необходимо осуществлять не ранее, чем через 3 часа после криовоздействия. Раннеотсроченная криобиопсия позволяет в первый же день лечения сформулировать прогноз и уточнить план дальнейшего лечения пациента с опухолью кожи. Через 24 часа после криодеструкции морфологическая идентификация опухоли невозможна.

5. Разработанный способ лечения новообразований обеспечивает абластичность, минимальную травматичность, сокращает сроки заживления, уменьшает частоту осложнений лечения, вероятность рецидивов и метастазирования, стимулирует течение регенерации.

Список научных работ, опубликованных но теме диссертации

1. Новые возможности микроморфотопографической диагностики патологических очагов при криобиопсии и прогнозирование полноты крнодеструктивггого эффекта/ И.В.Темнова [и др.] //Новое в практической медицинской криологии: материалы 2-ой международной науч.-практ. конф. (Москва, 2005 г.). - Москва, 2005. - С.22-23.

2. Темнова И.В. Криобиопсия - преимущества и перспективы / И.В.Темнова,

A.А.Артифексова. В.И.Коченов //Новое в практической медицинской криологии: материалы 2-ой международной науч.-практ. конф. (Москва, 2005 г.). - Москва, 2005. - С. 61-62.

3. Криобиопсия кожи: методика, преимущества и перспективы / А.А.Артифексова, И.В.Темнова, В.И.Коченов [и др.] //Медицинская криология: сб. науч. тр./под ред.

B.И.Коченова. - Н. Новгород: Изд-во «Дятловы горы», 2006. - Вып. 6. - С. 86-88.

4. Темнова И.В. Особенности регенерации кожи при криобиопсии / И.В.Темнова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - СПб, 2007. - С. 64-66.

5. Темнова И.В. Особенности репаративнон регенерации кожи при различных методах проведения биопсии / И.В.Темнова //Актуальные проблемы патофизиологии: материалы межгородской конф. молодых ученых (Санкт-Петербург, 24-25 апреля, 2007 г.) /под ред. Н.А.Гавришевой, В.И.Николаева. - СПб, 2007. - С. 120-121.

6. Общая экстремальная аэрокриотерапия в комплексных лечебно-профилактических программах медицинской криологии /В.И.Коченов, Цыбусов С.Н., Темнова И.В. [и др] // Криотерапия в России: материалы 1 международной науч.-практ. конф. (Санкт-Петербург, 2008 г.) - СПб, 2008. - С. 36-37.

7. Исследование воздушной криоконденсации / И.В.Темнова [и др.] //Криотерапия в России: материалы 1 международной науч.-практ. конф. (Санкт-Петербург, 2008 г.) - СПб, 2008.-С. 118-119.

8. Выбор инструмента и метода глубокого локального замораживания при опухолях кожи / С.Н.Цыбусов, В.И Коченов, И.В. Темнова [и др.] // Криотерапия в России: материалы 1 международной науч.-практ. конф (Санкт-Петербург, 2008 г.)- СПб, 2008. - С. 127-128.

9. Рассечение замороженной ткани радиоволновым скальпелем в криохирургии (Incision of Flözen Tissue by Radiowave Scalpel in Cryosurgery) /Е.А.Ермакова, В.И.Коченов, И.В.Темнова [и др.] // Материалы 15-го всемирного конгресса международного общества криохирургов (Санкт-Петербург, 1-4 октября, 2009 г.) - СПб, 2009. - С .35-36.

10. Экспериментальное исследование ранних критериев прогноза линии крионекроза внутри тканей после криодеструкции кожи и перевивных опухолей у животных /И.В.Темнова, А.А.Артифексова, B.IJ.Коченов [и др.] //Морфологические ведомости. - 2009. - №3. - С. 234-235.

11. Экспериментальное исследование ранних критериев прогноза линии крионекроза внутри тканей после криодеструкции кожи и перевивных опухолей у животных /И.В.Темнова [и др.] // Опухоли кожи и мягких тканей: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. (Санкт-Петербург, 3-4 сентября 2009 г.). - СПб.: Аграф+, 2009. - С. 108-111.

12. Новые принципы, инструменты и методы медицинской криологии при лечении воспалительных, опухолевых заболеваний ЛОР органов и кожи головы и шеи /В.И.Коченов, В.А.Охотников, И.В.Темнова [и др.) //Российская оториноларингология. -2009.- №1.-С. 33-38.

13. Последовательности комплексного использования инструментов из набора для медицинской криологии по доктору В.И.Коченову при лечении различных патологических состояний /С.Н.Цыбусов, В.В.Козяйкин, И.В.Темнова [и др.] //Медицинская криология: сб. науч. тр. /под ред.В.И.Коченова. - Н.Новгород-. Изд-во «Дятловы горы», 2009. - Вып. 7. - С. 186-189.

14. Способ лечения новообразований 1 В.И.Коченов, С.Н.Цыбусов, И.В.Темнова [и др.] // Медицинская криология: сб. науч. тр./ под ред. В.И. Коченова. - Н.Новгород: Изд-во «Дятловы горы», 2009. - Вып. 7. - С. 239-248.

15. Особенности криохирургического лечения кожных новообразований /И.В.Темнова [и др.] // Международный журнал по иммунореабилитации. - 2009. - Т. 11, №1. - С. 36.

Подписано в печать 14.10.2010 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л. 1,0. Заказ№ 706 .Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г. Нижний Новгород, ул. Трудовая, 6 Тел.: 436-86-40