Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патофизиологические механизмы регенерации кожи под действием мезенхимальных клеток

На правах рукописи

ШВЕЦОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3468489

Москва-2009

003468489

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и в лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН Ткаченко Сергей Борисович доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Онищенко Нина Андреевна Дубовая Татьяна Клиониковна

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов,

Автореферат разослан «_»_2009 года

Защита диссертации состоится_2009 года в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.003.01 при ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, улица Балтийская, дом 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Скуратовская Лариса Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастные изменения кожи как часть общебиологического старения развиваются в соответствии с изменениями, происходящими во всех тканях организма. До настоящего времени остаются малоизученными причины и механизмы их возникновения. Известно, что все причины, запускающие механизмы старения, можно разделить на две большие группы — внешние и внутренние. К внешним относятся УФ излучение, аллергены, механические повреждения; среди внутренних причин называют генетические, нейрогенные, иммунные, гормональные и другие факторы (EI-Domiaty et al., 2002). Ряд авторов указывает на ряд молекулярных механизмов развития возрастных изменений кожи, однако наиболее значимыми считают активацию процессов свободнорадикального окисления и активацию процессов гликации коллагена и эластина (Должникова Э.М., 2003; Ахтямов С.Н. и др., 2004; Dyer D.G. et al., 1993; Harman D., 2003).

Показано, что с возрастом большие изменения претерпевают фибробласты кожи, теряющие активность, особенно на участках, подвергшихся инсоляции. Они приобретают шаровидную форму, нарушается их синтетическая функция: снижается синтез фибриллярных белков, таких как коллаген, фибронектин, эластин и повышается продукция протеаз, что приводит к деградации структуры внеклеточного матрикса, и, как следствие, к снижению эластичности кожи. (Шехтер А.Б, Милованова З.П., 1975; Gogly В. et al., 1997). Особое значение придается снижению синтеза сигнальных молекул, что приводит к нарушению эпидермально-дермальных взаимодействий, уменьшению пролиферации кератиноцитов базального слоя и, в результате, к снижению самообновления кожи и ее регенераторных возможностей.

В настоящее время существует большое количество методов коррекции возрастных изменений кожи (Holland R.L., Brown М.С., 1981; Tennstedt D., Lachapelle J.M., 1997; Heme K.B., Zachary C.B., 2000). К ним относятся массажи, применение питательных и увлажняющих кремов, масок, мезотерапия, пилинги, дермабразия, введение имплантатов, ботулотоксина, пластическая хирургия. Все эти методы направлены, в конечном счете, на борьбу с уже существующими изменениями и напрямую зависят от состояния клеток кожи, и прежде всего фибробластов. По данным клинических наблюдений известно, что с возрастом успех от проведенной антивозрастной терапии снижается, так как снижается уровень обменных процессов в клетках кожи и их способность к активации в ответ на стимулирующее действие процедур (Makeux R. et al., 1994).

Поиск новых методов эффективной коррекции инволюционных изменений кожи выделяется в перспективное направление современной дерматокосметологии (Виссарионов В.А. и др., 2003). В последние годы в литературе появились сообщения о применении культивированных мезенхимальных клеток для улучшения регенерации, что вполне соответствует современным представлениям о роли межклеточных

взаимодействий в регенерационных процессах тканей и, в частности, о регуляторной функции фибробластов в поддержании тканевого гомеостаза (Хрупкин В.И. и др., 1998; Берк Г.С. и др, 2000; Келлер Г. и др, 2000). В литературе представлены данные о клиническом применении культуры фибробластов человека в лечении глубоких ожогов, которые были получены Д.С. Саркисовым и соавторами (Саркисов Д.С. и др., 1994). В настоящее время метод трансплантации аллогенных культивированных клеток (фибробластов и кератиноцитов) успешно применяется в комбустиологии, в лечении длительно незаживающих гранулирующих кожных ран, трофических язв и свищей, в лечении ран после операций пластической хирургии (Колокольчикова Е.Г. и др., 2001; Расулов М. Ф., 2007; Yonezawa М. et al., 2007; Nie X. et al., 2007). Также имеются отдельные сведения о том, что стволовые клетки, полученные из жировой ткани и мезенхимальныс клетки костного мозга (МККМ) ускоряют заживление ран (Шумаков В.И. и др., 2003; Kim W.S. et al., 2007; Lee C.H. et al., 2007). Несмотря на большое количество работ, посвященных результатам применения мезенхимальных клеток при раневом заживлении, вопрос о процессах, происходящих при внутрикожном введении этих клеток при ее инволюционных процессах, изучен недостаточно. Не проведено сравнительного изучения функциональных возможностей мезенхимальных клеток из разных источников (дермальных фибробластов, мезенхимальных клеток костного мозга, мезенхимальных клеток, полученных из жировой ткани) и сравнительного изучения профиля поверхностных маркеров этих клеток. Остался малоизученным вопрос о площади миграции введенных внутрикожно мезенхимальных клеток, также не изучалась тканевая реакция при их трансплантации. Особую практическую значимость могли бы иметь исследования, направленные на разработку клеточной конструкции, пригодной для использования в качестве трансплантата для оптимизации регенерации кожи. Не меньшую значимость при использовании мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи могли бы иметь исследования отдельных функциональных параметров в модельных опытах in vitro и in vivo. Однако таких исследований мы в литературе не обнаружили. Между тем такие данные могли бы способствовать углублению наших представлений о патогенезе возрастных изменений кожи и поиску путей их устранения и профилактики.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы являлось изучение механизмов влияния мезенхимальных клеток из разных источников на восстановление структурно-функциональных параметров кожи в моделях инволюционных процессов кожи in vitro и m vivo. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование фенотипических характеристик различных типов мезенхимальных клеток и изучить их способность к индукции контракции коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы.

2. Разработать клеточную конструкцию дермального эквивалента (аллогениые фибробласты на желатиновых микроносителях), пригодную для внутридермального введения и обеспечения эффективной и безопасной коррекции структуры и функций кожи при ее инволюционных изменениях.

3. Обосновать безопасность внутридермального введения в. организм дермального эквивалента с аллогенными фибробластами у свиней и показать возможность коррекции деструктивных изменений кожи при ее инволюционных изменениях или рубцовом повреждении.

4. Изучить механизмы коррекции структуры и фуикции деструктивно и инволюционно измененной кожи при внутридериальном введении клеточного дермального эквивалента.

Научная новизна исследования.

Впервые в опытах с моделированием инволюционных изменений кожи in vitro и in vivo изучен механизм коррекции структурно-функциональных изменений дермы под влиянием инъецированных мезенхимальных клеток. Показано, что в трехмерной структуре дермы фибробласты приобретают фенотип миофибробластов, экспрессируют альфа-актин, контрастируют дерму.

Впервые проведена комплексная оценка и анализ поверхностных маркеров мезенхимальных клеток, полученных из трех основных источников — дермы кожи человека, жировой ткани и костного мозга, для подтверждения их фенотипической принадлежности к мезенхимальным клеткам.

Впервые продемонстрировано, что все 3 типа мезенхимальных клеток из разных источников позитивны по большинству поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых клеток. Произведена оценка функциональной активности разных типов мезенхимальных клеток взорослого организма по способности трансформироваться в миофибробласты и индуцировать контракцию флотирующего Зх-мерного коллагенового геля в сравнении со способностью индуцировать контракцию геля фетальными фибробластами. Установлена способность фибробластов к миграции с поверхности микроносителей в матрикс, а также отсутствие тканевой воспалительной реакции в ответ на их введение в дерму свиней породы мини. Установлено, что под действием трансплантированных мезенхимальных клеток улучшается эластичность кожи, восстанавливаются ее барьерные функции, а также нормализуется ее структура.

Впервые был разработан дермальный эквивалент — клеточная конструкция, состоящая из мезенхимальных клеток и биодеградируемых желатиновых микроносителей, обеспечивающая адекватную внутридермальную доставку клеток в физиологически активном состоянии, что позволяет использовать ее для оптимизации регенерации кожи.

Научно-практическая значимость работы. Получены новые факты о регулирующей роли мезенхимальных клеток, в частности фибробластов, в процессах восстановительной регенерации кожи. Установлена способность этих клеток индуцировать контракцию коллагенового геля — основного структурного компонента дермы, а также мигрировать в глубину дермы, обеспечивая непосредственный контакт этих клеток с собственными клетками дермы. Отражением этих регулирующих воздействий мезенхимальных клеток служит восстановление функций кожи (повышение эластичности кожи, восстановление ее барьерной функции) и нормализация ее структуры у пациентов с инволюционными и деструктивными (рубцовые деформации) изменениями кожи. Полученные результаты исследований на коже животных и человека, могут стать основой для разработки нового направления в использовании аллогенных и аутологичных мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи и при ее повреждении. Сходство фенотипического состава мезенхимальных клеток различного происхождения позволяет расширить источник получения донорских мезенхимальных клеток для осуществления клеточной терапии. Установленные в работе закономерности влияния мезенхимальных клеток на восстановление стурктурных компонентов кожи, могут быть использованы в лекционных курсах для преподавания физиологии, патофизиологии, клеточной биологии, а так же служить основой для дальнейших разработок биомедицинских технологий.

Результаты работы используются в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и в лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», шифр - «2007-21.2-06-02-177» в рамках темы: «Разработка гистотипических живых тканевых эквивалентов на основе стволовых клеток для восстановления структуры и функции тканей».

Положения, выносимые на защиту:

1. Мезенхимальные клетки из различных источников (жировой ткани, костного мозга, кожи) фенотипически идентичны по большинству поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых клеток, а также имеют сходную способность индуцировать контракцию коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы in vitro.

2. Дермальный эквивалент в виде клеточной конструкции с использованием желатиновых микроносителей позволяет увеличить конечную концентрацию используемых клеток, защищает их от травматизации при манипуляциях и позволяет доставлять клетки внутридермально в физиологичном для них состояния.

3. Внутрикожная инъекция аллогенных мезенхимальных клеток на микроносителях не препятствует миграции вводимых клеток с микроносителей в дерму, способствует их трансформации в миофибробласты, не индуцирует образование моноцитарно-макрофагальной реакции в дерме на их введение, что указывает Fia безопасность применения и сохранение высокой функциональной активности мезенхимальных клеток на микроносителях.

4. Повышение биомеханических свойств кожи, восстановление ее барьерной функции, нормализация гистотипического строения при внутридермальном введении дермального эквивалента просиходит вследствие доставки жизнеспособных и функционально активных мезенхимальных клеток в зоны повреждения, их миграции с микроносителей в дерму, частичной дифференцировки этих клеток в миофибробласты, развития и стойкого сохранения эффекта контракции коллагеновых структур дермы, а также ремоделирования основных структурных компонентов кожи.

Апробация работы: Основные положения и результаты исследования были представлены на IV Международном конгрессе эстетической медицины (Москва, 2004), V Международном конгрессе эстетической медицины (Москва, 2005), Первом международный симпозиум «Клеточные технологии в эстетической медицине» (Москва, 2005), IV Международном симпозиуме по эстетической медицине (Москва, 2005), V Международном симпозиуме по эстетической медицине (Москва, 2006), совместной научно-практической конференции лаборатории ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории ИБР РАН (Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы. Диссертация содержит 3 таблицы и 23 рисунка. Библиографический указатель содержит 34 отечественных и 198 иностанных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась с использованием фетальных фибробластов человека (ФФБ), полученных из коллекции клеточных культур лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Мезенхимальные клетки костного мозга (МККМ) были любезно предоставлены д.б.н. Ю.А. Романовым (Научно-практическая лаборатория стволовых клеток человека Института экспериментальной кардиологии Кардиокомплекса Минздравсоцразвития РФ). Постнатальные дермальные фибробласты человека (ПФБ) и мезенхимальные клетки

жировой ткани человека (МКЖТ) выделяли из биоптатов кожи и липоаспирата, полученных в результате пластических операций и с добровольного согласия доноров. Донорский материал был любезно предоставлен Э.М. Должиковой (ЗАО "Институт красоты" г.Москва). Дермальные фибробласты свиней породы мини получали путем биопсии кожи. После ферментативной обработки биоптатов и липоаспирата мезенхимальные клетки культивировали в среде ДМЕМ (Sigma, США) с глутамином (0,3мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сывороткой в С02 инкубаторе (Sanyo, Япония) при 37°С. Смену питательной среды проводили через каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя. Для проведения экспериментов использовались мезенхимальные клетки 5-7 пассажа. Для получения дермального эквивалента фибробласты культивировали на биодеградируемых желатиновых пористых микроносителях (использовали микросферы диаметром 180-200 мкм) (Sigma, США).

Для определения фенотипического профиля мезенхимальных клеток использовали метод проточной цитофлуориметрии. Для исследования готовили пробирки, промаркировав их номером образца и типом вносимых антител (изотипический контроль или моноклональные антитела к HLA-1, HLA-DR, CD 105, CD 106, CD 117, CD 13, CD 29, CD 34, CD 44, CD 45, CD 54, CD 71, CD 73, CD 90). В пробирки, автоматическим дозатором вносили по 20 мкл соответвующего моноклоналыюго антитела (моноклональные антитела к CD 105, CD 71 (FITC Becton Dickinson, USA) HLA-1, HLA-DR, CD 106, CD 117, CD 13, CD 29, CD 34, CD 44, CD 45, CD 54, CD 73, CD 90 (PE Becton Dickinson, USA)), затем вносили по 50 мкл исследуемого образца клеток. После инкубации и центрифугирования производили измерение проб на проточном цитофлюориметре (Beckman Coulter (Cell Lab Quantra SC), USA) (таблица 1).

Для определения способности мезенхимальных клеток к индукции контракции использовали живой эквивалент дермы, представляющий собой трехмерный коллагеновый гель заселенный клетками.

Контракцию коллагенового геля рассчитывали, измеряя диаметр геля в 24-луночных платах (Nunk, Дания) с помощью линейки, отмечая степень контракции геля, как отношение площади контрастирующего геля к площади его первоначального состояния. Первое измерение диаметра геля, еще не начавшего контрастировать, принимали за 100%. На каждый срок проводили по три измерения каждого типа клеток (таблица 1).

Для иммуногистохимического окрашивания клеток в геле на гладкомышечный альфа-актин сконтрактировавший коллагеновый гель замораживали и при температуре -18°С из него готовили криосрезы толщиной 5 мкм, которые фиксировали в 4% парафармальдегиде в течение 8 минут. После этого криосрезы окрашивали антителами к гладкомышечному альфа-актину (a-SMA) (Cymbys biotechnology, Англия) по стандартной методике. После этого 4-5 раз промывали материал в ОДМ р-ре фосфатно-

солевого буфера (PBS) и инкубировали в растворе вторых антител А1еха-488 на 1М PBS в течение 40 минут.

Таблица !.

Общее количество исследований и проб, проанализированных в работе.

№ Название Кол-во Кол-во Кол-во точек в Общее кол-во

исследования проведенных экспериментов исследуемых проб за 1 точку 1 эксперименте проб в исследовании

1 Определение фенотипа клеток 9 15 1 135

2 Способность клеток к индукции контракции 80 1 7 560

3 Цитотоксичность 6 1 1 6

4 Опт. посадочная концентрация 6 1 7 42

5 Опт. 10 режим 12 1 5 60

6 Миграционная активность 12 10 2 240

7 Трансформация в миофибробласты 12 10 1 120

8 Тканевая реакция 12 10 2 240

|а трансплатацию

9 Эластичность кожи 12 1 3 36

10 Сальность кожи 15 4 2 120

11 Влажность кожи 15 1 2 30

12 УЗИ кожи 15 2 2 60

Общее количество проанализированных проб 1649

Для разработки клеточной конструкции дермального эквивалента оценивали цитотоксичность тестируемых желатиновых биодеградируемых микроносителей (Sigma, США) и их влияние на эффективность прикрепления и пролиферации клеток. Определение цитотоксичности изучаемых образцов микроносителей проводили согласно требованиям Методических рекомендаций 96/ 247 «Тестирование лекарственных препаратов наружного применения в культуре клеток кожи человека», утвержденных МЗ РФ (1996) путем подсчета жизнеспособных клеток в культуральных планшетах после 2 часов инкубации с желатиновыми микроносителями. Контролем служили планшеты с клетками без микроносителей.

Эффективность прикрепления и пролиферации клеток на образцах микроносителей оценивали по количеству клеток, их морфологии и плотности прикрепления на поверхности микроносителей. Оптимальную посадочную концентрацию определяли, сравнивая две концентрации 2*105 и 4*105 клеток/мл. Количество клеток, выращенных на тестируемых микроносителях, определяли прямым подсчетом клеток в камере Горяева после смыва клеток раствором трипсина - Версена. Измерение проводили ежедневно в течение 7 суток (таблица 1). Для оценки распределения клеток

на поверхности микроносителей, а также проведения визуального контроля условий культивирования и роста клеток использовали окрашивание прикрепленных к микроносителям клеток зеленым мембранным трейсером DIO (Sigma, США) и ядерным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США).

Для оценки количества жизнеспособных клеток использовали окраску витальными красителями. Для этого клетки переводили в суспензию инкубацией в смеси трипсина с раствором Версена при + 37° С. 200 мкл клеточной суспензии смешивали с 200 мкл 0,2%-ного раствора трипанового синего (Sigma, США). Затем полученную суспензию вносили в камеру Горяева и подсчитывали количество живых (неокрашенных) клеток. Процентное содержание жизнеспособных (не включивших краситель) клеток определяли по формуле: жизнеспособность = (число окрашенных клеток/общее число клеток) *100%.

Оптимальный температурный режим для транспортировки и хранения клеточной конструкции определяли путем подсчета количества жизнеспособных клеток на поверхности микроносителей, помещенных в бессывороточную транспортную среду при различных вариантах постоянной температуры (+ 37°С — оптимальная температура для роста и жизни клеток, поддерживаемая в С02 инкубаторах и + 4°С — рекомендуемая температура для хранения и перевозки вакцин, сывороток, тканевых и органных трансплантатов, сохранность которых обеспечивается за счет снижения интенсивности обменных процессов).

Оценку реакции кожи на клеточный трансплантат в организме проводили на 12 свиньях породы мини, весом 35-40 кг (Центральный питомник лабораторных животных РАМН). Для выделения фибробластов из дермы у свиней (под местной анестезией 0,1% раствором лидокаина, Биосинтез, Россия) забирали биоптаты кожи спины, из которых по стандартной методике получали фибробласты. Биоптаты механически измельчали, ферментативно обрабатывали с использованием 0,5% раствора коллагеназы I типа. После ферментативной обработки фибробласты культивировали в среде Игла с глутамином (0,3мг/мл) и 10% эмбриональной телячьей сывороткой в С02 инкубаторе при 37°С. Смену среды проводили через каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя. Для этого эксперимента использовали фибробласты 6-10 пассажей. Дермальный эквивалент с использованием аллогенных дермальных свинных фибробластов вводился свиньям внутрикожно в область спины, общим объемом 4 мл и концентрацией в нем клеток 1 млн./мл серией множественных точечных инъекций (папульно) в объеме менее 0,1 мл одновременно. Для идентификации трансплантированных клеток производили предварительную окраску дермальных фибробластов ядерным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США). Для этого клетки, прикрепленные к культуральному пластику, инкубировали в течение получаса в среде ДМЕМ без сыворотки с добавлением Hoechst 33342 в концентрации 5 мкг/мл при 37°С. Затем фибробласты пассировали на биодеградируемые желатиновые пористые микроносители (микросферы размером 200 мкм) (Sigma, США),

что позволяло сохранять их жизнеспособность в процессе транспортировки и трансплантации, а также обеспечивало пролонгированное действие клеток после инъекций трансплантата в дерму. Фибробласты на микроносителях инъецировали свиньям внутрикожно в область спины. Реакция оценивалась на 5 и 28 сутки после трансплантации. На этих сроках у свиней поизводилась биопсия. Часть биоптатов фиксировалась в формалине и последующая обработка проводилась по стандартной методике. Другую часть биоптатов замораживали, после чего получали криостатные срезы толщиной 10 мкм для оценки миграции клеток после трансплантации (таблица 1).

Для гистологического исследования подготовку препаратов осуществляли двумя способами. Фиксацию биоптатов проводили в течение 1 часа при комнатной температуре в 4% растворе параформальдегида. После этого промывали материал PBS и погружали в 20% раствор сахарозы для пропитки на 8-12 часов до полного погружения кусочков. Подготовленный таким образом материал замораживали в парах азота и хранили при -70°С. Срезы биоптатов толщиной 15 мкм готовили на криостате. Криосрезы докрашивали маркером на альфа-актин (a-SMA) (Cymbys biotechnology, Англия), а также использовали для оценки миграции фибробластов на микроносителях после трансплантации и трансформации фибробластов в миофибробласты.

Для оценки реакции организма свиней на введение дермального эквивалента производили стандартное гистологическое исследование (окраска гематоксилином-эозином) биоптата кожи с фибробластами на микроносителях. Микроскопирование срезов проводили на инвертированном микроскопе «Leica DM IL» (Leica, Германия).

Для оценки возможности коррекции инволюционных изменений кожи с помощью мезенхимальных клеток было проведено клинико-лабораторное исследование на 15 добровольцах после их информированного согласия в возрасте 28-64 года с инволюционными или Рубцовыми изменениями кожи. Было выполнено два вида наблюдений (таблица 1). Первый включал 12 женщин в возрасте от 49 до 64 лет с клиническими проявлениями сенильных изменений кожи, а второй — 3 человека (1 женщина и 2 мужчин) с деструктивными (рубцовыми) изменениями кожи. Всем испытуемым проводили внутрикожные инъекции дермального эквивалента общим объемом 4 мл и концентрацией в нем клеток 1 млн./мл за 1 процедуру с интервалом в 2 недели. Количество процедур определялось с учетом клинических особенностей пациентов. Количество процедур в 1-й группе составило в среднем - 3, а общая продолжительность исследования - 1,5-2 месяца. Во 2-й группе было проведено в среднем - 5 процедур, при продолжительности исследования - 3,5 месяцев. В большинстве случаев использовали папульную технику введения (дермальный эквивалент вводили серией множественных точечных инъекций) в объеме менее 0,1 мл одновременно. Процедуры проводились в осенний, зимний и весенний периоды, всем пациентам рекомендовалось избегать пребывания под

открытыми лучами солнца, при необходимости пользоваться солнцезащитной косметикой с высокой степенью защиты.

Результаты исследования анализировали по следующей схеме: оценка клинической картины (цвет кожи, глубина и количество морщин, площадь рубцов, тургор и лифтинг кожи) и биомеханических свойств кожи до начала терапии, через 1 месяц после ее начала, а также при достижениии клинического улучшения (через 1,5-2 месяца для первой группы добровольцев и через 3,5 месяца для второй группы). Проводилось также измерение эхоструктурных особенностей эпидермиса и дермы, измерение барьерной функции кожи (влажность и сальность) до начала терапии, а также через 1,5-2 месяца для первой группы и через 3,5 месяца для второй группы.

Биомеханические свойства кожи были изучены методом эластометрии, путем оценки степени втягивания и распрямления кожи под действием отрицательного давления 450-500 мбар на аппарате «Cutometer МРА 580» (CK electronic, Германия). Данные обрабатывались в приложении для Windows, где оценивались биомеханические свойства кожи по нескольким параметрам. При анализе результатов использовался основной параметр эластических свойств кожи - R2. Полученные результаты отражали способность исследуемого участка кожи распрямляться до исходного состояния после окончания действия на нее отрицательного давления, выраженную в процентах.

Изучение эхоструктурных особенностей эпидермиса и дермы проводилось методом двумерного ультразвукового сканирования на аппарате «DUB (Digital Ultrasound Imagine System)» (Tpm GmbH, Германия).

Барьерную функцию кожи оценивали используя методы себуметрии (измерение сальности) и корнеометрии (измерение влажности кожи) на аппарате SKIN-0-MAT (Cosmomed, Германия). Метод себуметрии основан на фотометрии, измерении интенсивности света, проникающего сквозь адсорбированное на измерительной ленте кожное сало, полученное значение выражалось в мкг/мл. Метод корнеометрии основан на измерении электрической емкости, то есть отличии диэлектрической постоянной воды от диэлектрических постоянных других сред, данное отношение выражается в условных корнеальных единицах (уке).

Статистическая обработка результатов. Все полученные данные обрабатывались параметрическим (критерий Стьюдента) и непараметрическим (критерий Уилкоксона) методами математической статистики с применением пакета прикладных программ Statistica 7,0 (Statsoft, США) для Windows. Количественные данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (25%; 75%). При проверке статистических гипотез наличие статистической значимости определялось при р- < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Определение фенотшшческого профиля мезенхимальиых клеток

Была проведена сравнительная оценка фенотипического профиля мезенхимальиых клеток, наиболее часто используемых для улучшения регенерации кожи. К ним относятся клетки, выделенные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи. В исследовании были использованы МККМ и МКЖТ, выделенные по протоколам для получения стволовых клеток, которые были обозначены как мезенхимальные. Для определения иммунофенотипического профиля был выбран ряд поверхностных маркеров принятый для идентификации мезенхимальиых стволовых клеток. По этому же набору поверхностных маркеров нами были охарактеризованы постнатальные фибробласты. Исследования экспрессии поверхностных маркеров по трем типам мезенхимальиых клеточных культур показали большое сходство в экспрессии этих маркеров (таблица 2).

Таблица 2.

Сравнительная характеристика мезенхимальиых клеток по экспрессии поверхностных

маркеров.

МКЖТ, % МККМ, % ФБ, %

маркер позитивных клеток позитивных клеток позитивных клеток

ЫС 0,27 0,21 0,32

НЬА-1 21,55 37,2 48,25

НЬА-ОЯ 0,13 7,43 0,22

СО 105 13,91 30,81 20,17

СО 106 0,13 7,26 0,31

СО 117 0,16 0,27 0,36

СО 13 99,72 99,8 98,75

СО 29 98,5 99,15 98,95

СО 34 1,15 0,24 0,57

СО 44 99,57 99,54 98,84

СО 45 0,24 0,23 0,44

СО 54 44,73 24,79 74,19

СО 71 0,31 0,44 3,87

СО 73 97,97 99,36 98,54

СО 90 99,43 99,59 99,33

Все три типа клеток оказались положительными по НЬА-1, СБ 105, СБ 13, СО 29, СО 44, СО 54 (1САМ-1). Клетки не экспрессировали СО 117, СО 34, СО 45. МКЖТ и МККМ не экспрессировали СО 71 (рецепторы к трансферрину), тогда как незначительная доля фибробластов несла на поверхности этот маркер. По СО 106 МКЖТ и ПФБ оказались отрицательными, а МККМ - положительными, что является характерным для этих клеток. По маркерам антигенов главного комплекса гистосовместимости

120

0 -I-1-1-1-1-1-1-

0 1 2 3 4 5 6 7

сутки

Рис.1. Контракция коллагенового геля при внесении в него фетальных дермальных фибробластов (ФФБ), постнатальных дермальных фибробластов (ПФБ), мезевхимальных клеток костного мозга (МККМ) и мезепхимальных клеток, полученных из жировой ткани (МКЖТ). По оси абсцисс - сутки, по оси ординат -диаметр геля в процентах от контроля.

все три типа клеток имели небольшой процент экспрессирующих НЬА-1 клеток, по НЬА-БЯ МКЖТ и ПФБ были отрицательны, среди МККМ отмечалось незначительное количество позитивных клеток. В целом все три типа клеток можно было охарактеризовать как обладающие низкой иммуногенностью. Полученные данные согласуются с данными литературы, где было отмечено сходство СККМ и СКЖТ, как по морфологии, так и по СБ-профилю (7ик е1 а1., 2004). Вероятно, это связано с тем, что и жировая ткань, и костный мозг происходят из эмбриональной мезенхимы. При исследовании экспрессии поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых клеток, ПФБ показали сходпые данные с СККМ и СКЖТ. Это позволяет рассматривать кожу в качестве источника мезенхимальных стволовых клеток, а также использовать эти клетки для разработки технологий, предназначенных улучшения показателей регенерации кожи.

Оценка контракции коллагенового геля мезенхимальными клетками из различных источников

Спустя 1 сутки после приготовления коллагенового геля с клетками отмечалась контракция геля, площадь которого уменьшалась затем каждые сутки. Так, на 4-е сутки ФФБ сконтрактировали гель до 39±6% от первоначального диаметра, в то время как ПФБ, МКЖТ и МККМ сконтрактировали коллагеновый гель в значительно меньшей степени. На 8-е сутки площадь коллагенового геля с ФФБ уменьшилась до 7±2% ПФБ, МКЖТ и МККМ к 8-м сутки сконтрактировали гель только до 51±6%, 62±7%, 55±7% от начального диаметра соотвественно. При этом клетки

Рис. 2. Контракция коллагенового геля при внесении в него постнатальных дермальных фибробластов (ПФБ) и постнатальных дермальных фибробластов (ПФБ) на микроносителях (МН). По оси абсцисс - сутки, по оси ординат - диаметр геля в процигтах от контроля.

оставались жизнеспособными. При одинаковом количестве клеток ФФБ контрастировали коллагеновый гель сильнее, чем ПФБ, МКЖТ и МККМ (рис. 1).

Для подтверждения клеточного механизма контракции коллагенового геля, т.е. подтверждения приобретения фибробластами характеристик миофибробластов, клетки были окрашены на маркер миофибробластов -гладкомышечный альфа-актин. Все типы клеток независимо от источника имели значительное количество позитивных по этому маркеру клеток. При этом средняя интенсивность свечения в ФФ оказалась почти в 2 раза больше, чем средняя интенсивность свечения остальных типов клеток. При измерении контракции мезенхимальных клеток на микроносителях (МН) на примере ПФБ в течение первых двух суток площадь коллагенового геля уменьшалась незначительно и соответствовала изменению площади коллагенового геля без клеток, используемого в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля были использованы ПФБ введенные в коллагеновый гель в виде суспензии. На 2 сутки ПФБ в коллагеновом геле сконтрактировали его до 85±8% от начального диаметра, в то время как ПФБ, находящиеся на поверхности МН, не проявляли контрактильных свойств.

При микроскопическом исследовании было обнаружено, что ПФБ мигрировали с поверхности МН в гель к 5 суткам. С этого времени ПФБ, введенные в коллагеновый гель на МН, начали его контрастировать, но отсроченно проявляя те же контрактильные способности, что и ПФБ, введенные в коллагеновый гель в виде суспензии (рис. 2). Таким образом, экспериментрально было показано, что ПФБ, МККМ, МКЖТ обладают сходной способностью контрастировать коллагеновый гель. Эта способность

почти в 6 раз уступает контрактильной способности фетальных фибробластов. Окраска на альфа-актин, маркер миофибробластов, доказывает клеточную природу контракции геля во всех наблюдениях. При исследовании контрактильной способности ПФБ, введенных в коллагеновый гель на МН, было показано, что степень контракции не зависела от того в каком состоянии были введены ПФБ (в виде суспензии или прикрепленными к МН).

Разработка клеточной конструкции дермального эквивалента

При определении цитотоксичности микроносителей, предназначенных для разработки дермального эквивалента, была использована культура ПФБ. Было установлено, что добавление микроносителей к клеточной культуре не вызывает клеточной гибели (процент погибших клеток равен 0%), также как в контроле (клеточная культура без микроносителей). Клетки прикрепляются к поверхности микроносителей и растут на них. Эти наблюдения позволили заключить, что желатиновые микроносители не обладают цитотоксичностью, обладают хорошо выраженной адгезивной поверхностью и не тормозят клеточный рост.

При оценке эффективности прикрепления к поверхности образцов микроносителей и пролиферации ПФБ на них суммировали результаты трех независимых экспериментов по подсчету клеток в камере Горяева. Так, при подобранной посадочной концентрации клеток 4* 105клеток/мл и концентрации микроносителей 5 мг/мл, на 1-3 сутки количество ПФБ увеличивалось незначительно, а к 4 суткам наблюдалось резкое увеличение скорости роста клеток. На 6 сутки количество ПФБ достигло 1,6*106 клеток/мл, а на 7 сутки увеличения количества ПФБ не наблюдалось, что могло быть объяснено эффектом контактного торможения клеток при достижении ими конфлюэнтности.

При окраске ПФБ, прикрепленных к микроносителям, с помощью зеленого мембранного трейсера DiO и Hoechst 33342 был выявлен равномерный характер распределения клеток по поверхности микроносителей (рис. 3). Рост клеток отмечался не только на поверхности микроносителей, но и внутри. Размеры и поверхность пор микроносителей оказались также удобными для роста клеток, что особенно важно, так как позволяет выращивать клетки, заселяющих большую площадь микроносителей, а также позволяет избежать дополнительной травматизации клеток, при различных манипуляциях с микроносителями, например, при пипетировании. При разработке клеточного трансплантата большое значение имеет не только разработка биосинтетических материалов для клеточной конструкциии, и выбор клеточной культуры, но и подбор оптимальных условий для транспортировки и хранения клеточной конструкции.

Оптимальным температурным режимом для дермального эквивалента оказался режим +37°С, так как мезенхимальные клетки, будучи субстратзависимыми, оказываются в физиологичном для себя состоянии и

нта жизнеспособных клеток (95% суток) при переводе на транспортную азом, полученные результаты позволяют атурный режим +37°С как наиболее «фибробласты на микроносителях», альным эквивалентом. С помощью я условия для доставки значительно ых клеток в зоны повреждения дермы.

мезенхимальных клеток и реакция ие дермального эквивалента

идермально в область спины вводили кроносителях. Реакцию на введение трансплантации. На сроках 5 и 28 суток

епленных к микроносителям с помощью зеленое окрашивание мембраны) и Hoechst личение объектива х4, окуляра х10.

б)

инъецированным дермальным эквивалентом и Hoechst 33342. а) Увеличение объектива х4, фрагмент изображения а) с позитивными по а-

а)

Рис.5. Дермальные фибробласты свиньи на свиньи, на 5 сутки. Окраска гематоксилин-эо х10, б) объектива х4, окуляра х20.

Рис. 6. Дермальные фибробласты свиньи на свиньи, на 28 сутки. Окраска гематоксилин-эо хЮ, б) объектива х4, окуляра х40.

При оценке криосрезов у свине жизнеспособные трансплантированные флюоресценцией этих клеток, которая ук функциональную активность. На среза мигрировали с микроносителей в толщ встраивались в ВКМ. В результате имм полученных криосрезов на маркер м альфа-актин (a-SMA) (Sigma, США) свечение трансплантированных клеток, фибробласты встраивались во внеклет гистотипическое положение (рис. 4). исследования было показано, что фибро суток, после чего постепенно лизировали

экспериментах отсутствовала выраженная воспалительная реакция (рис. 5 и рис. 6). В дерме признаки отека отсутствовали, отмечалась слабая пролиферация фибробластов, вокруг введенных фибробластов на микроносителях формировались тонкие пучки коллагеновых фибрилл, капилляры в зонах инъекции фибробластов не были расширены, периваскулярная инфильтрация отсутствовала, структурная организация внеклеточного матрикса была практически не изменена. Таким образом, исследования показали возможность успешной трансплантации аллогенных культивируемых фибробластов. Трансплантация не вызывала выраженной реакции воспаления, при этом клетки эффективно воздействовали на структуру и функциональные показатели дермы кожр.

Возможности коррекции инволюционных и рубцовых изменений кожи с помощью мезенхимальных клеток дермального эквивалента

В обеих группах исследований отмечался стойкий положительный эффект в виде коррекции структурных и функциональных изменений кожи. В первой группе с инволюционными изменениями кожи наблюдалось выравнивание тона кожи, улучшение микроциркуляции выраженном в появлении более здорового (розового) оттенка кожи; сужение пор,

80 75 70 65

60

55

50

% эластичноеги до иссл-я через мес. через 1,5-2 мес.

т т V-Ж; \

а ¿Г •

-1-

Рис. 7. Показатель эластичности кожи у пациентов с возрастными изменениями кожи до введения дермального эквивалента, через 1 месяц и через 1,5-2 месяца.

разглаживание мелких морщин, улучшение макрорельефа кожи; повышение тонуса и эластичности кожи. Во второй группе в зонах рубцовых изменений кожи наблюдалась нормализация ее структуры, восстановление барьерной функции, улучшении микроциркуляции, за счет появления новых сосудов.

Показатели эластичности кожи у испытуемых с возрастными изменениями оценивали в области лба до введения дермального эквивалента, через месяц после начала исследования и после его окончания, то есть через 1,5-2 месяца после начала исследования. Критерием завершения исследования служило достижение клинического улучшения состояния кожи испытуемых. При начальном измерении показатель эластичности кожи добровольцев имел значение 51,9 % (48,9 %; 57,2 %) [Ме (25%; 75%)], что соответсвовало их возрастным нормам 49-59 лет. Через месяц после начала лечения показатель эластичности достоверно увеличился на 4,1 % (3,6 %; 5%) [Ме (25%; 75%)] (критерий Уилкоксона, р=0,043) и составил 59,2 % (52,5 %; 62,2 %) [Ме (25%; 75%)]. При оценке эластичности кожи после завершении исследования показатель эластичности достоверно увеличился на 6,7% (5,6%; 11%) [Ме (25%; 75%)] (критерий Уилкоксона, р=0,043) по сравнению с начальными значениями и составил 67,8% (59,2%; 77,9%) [Ме (25%; 75%)] (рис. 7).

Следовательно, можно предположить, что в результате проведенного исследования показатели эластичности кожи пациентов приближались к соответствию с нормами для людей, моложе 1 группы испытуемых на 10 лет.

Барьерную функцию кожи оценивали измеряя параметры влажности методом корнеометрии и сальности методом себуметрии до введения дермального эквивалента и после окончания исследования, то есть через 1,52 месяца после начала исследования для первой группы и через 3,5 месяца для второй группы. Показатели влажности у людей с возрастными изменениями кожи колебались в пределах 40,5 уке (27 уке; 50,5 уке), 39 уке (36 уке; 50 уке), 42,5 уке (34 уке; 52 уке) и 54 уке (43 уке; 57 уке) [Ме (25%; 75%)] для различных областей лица (лоб, подбородок, щеки, веки соответственно), что для влажности кожи различных зон было достоверно ниже (р<0,05) влажности кожи здоровых молодых людей (И > 55 уке). В результате проведенного исследования показатели влажности достоверно увеличивались на 14,5 уке (8,5 уке; 20 уке), 10 уке (7 уке; 17 уке), 3,5 уке (2 уке; 5 уке) и 4 уке (2 уке; 6 уке) [Ме (25%; 75%)], (критерий Уилкоксона, р=0,0022) (рис. 8).

50

40

30

20

уке лоб уке подбородок

уке щеки уке веки

Рис. 8. Показатель влажности кожи в разных зонах лица у людей с возрастными изменениями кожи до введения дермального эквивалента и через 1,5-2 месяца (при достижении улучшения после его введения). По оси ординат - условные корпеальные единицы (уке), по оси абсцисс - различные зоны лица.

мкг/кв.см.

Рис. 9. Показатели сальности кожи у испытуемых с возрастными и деструктивными (Рубцовыми) изменениями кожи до введения дермального эквивалента и через 1,5-3 месяца (при достижении улучшения). По оси ординат - значения сальности кожи в мкг./кв.см., по оси абсцисс - ряд значений сальности кожи в области лба для каждого человека до введения дермального эквивалента и после окончания исследования.

Данные, полученные при себуметрии позволяют думать о вариабельности показателей жирности кожи у испытуемых. При измерении показателей сальности до начала исследования выяснилось, что у добровольцев обеих групп имелись нарушения барьерной функции кожи, связанные с деятельностью сальных желез.

У большинства испытуемых наблюдалось снижение продукции кожного сала, а в нескольких случаях повышение продукции по сравнению с нормой (70-130 мкг./мл в области щеки). После проведенного исследования отмечалась нормализация показателей сальности кожи (рис. 9).

При ультразвуковом исследовании кожи у пациентов первой группы были отмечены изменения структуры дермы и эпидермиса после исследования по сравнению с исходным состоянием. Происходило утолщение и уплотнение исходно-истонченного эпидермиса, его выравнивание, особенно заметное в области морщин (носогубная складка). При этом эхогенность эпидермиса становилась равномерной на всем его протяжении.

Этот ультразвуковой признак структурной нормализации эпидермального слоя, наблюдаемый после исследования, свидетельствует об улучшении процесса регенерации эпидермиса вследствие активации

пролиферативной активности клеток эпидермиса и нормализации процессов кератинизации.

В коже испытуемых наступало более равномерное, по сравнению с исходным состоянием, распределение эхосигнала в дерме, уменьшение гипоэхогенных участков дермы и увеличение акустической плотности дермы. Этот феномен свидетельствовал о совершенствовании структурной организации дермы и уменьшении признаков деформации ее волокнистого каркаса, уменьшении признаков избыточного скопления интерстициальной жидкости в дерме. В результате проведенного исследования имело место достоверное увеличение толщины общей дермы на 172 мкм (112 мкм; 260 мкм) в области виска и на 156 мкм (156 мкм; 312 мкм) в области носогубной складки, [Me (25%; 75%)], (критерий Уилкоксона, р=0,0022). При этом преимущественно увеличении толщины дермы происходило за счет верхних слоев дермы (достоверное увеличение толщины верхних слоев дермы на 107 мкм (32 мкм; 154 мкм) в области виска и на 282 мкм (250 мкм; 332 мкм) в области носогубной складки), [Me (25%; 75%)], (критерий Уилкоксона, р=0,0022), что свидетельствует о повышении синтетической активности фибробластов в дерме, в частности о продукции ими фибриллярных белков (рис. 10).

Кроме того, при ультразвуковом исследовании кожи у испытуемых второй группы с рубцовой деформацией кожи после введения дермального эквивалента было отмечено утолщение исходно-истонченного эпидермиса и его выравнивание, нормализация толщины общего слоя дермы, а также снижение ее акустической плотности, что соответствовало процессу

2300

носогубная складка

носочная складка

а) б)

Рис. 10. Ультразвуковая оценка состояния кожи различных отделов лица (висок, носогубная складка) до начала исследования и после его окончания, а) Измерение толщины общей дермы, б) Измерение толщины верхних слоев дермы.

ремоделирования рубцово-измененного волокнистого каркаса.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи имеют одинаковые регенераторные потенции, о чем свидетельствует их иммунофенотипический профиль, а также контрактильная способность. По степени контракции коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы значимых различий между этими типами клеток вывленно не было. Все постнатальные мезенхимальные клетки в модели живого эквивалента дермы, а также при внутрикожной инъекции трансформировались в миофибробласты, что подтверждалось специфической окраской на гладкомышечный альфа-актин.

При изучении миграции клеток с поверхности микроносителей в дерму при введении в кожу свиней было выявлено, что происходит она на 5 сутки, после чего клетки встраиваются в матрикс и проявляют контрактильные усилия, что соответствует данным полученным, in vitro в модели живого эквивалента дермы. При этом, отсутствие выраженной моноцитарно-макрофагальной реакции на введение аллогенной клеточной конструкции, делает возможным ее применение для успешной трансплантации с целью коррекции возрастных, а также постравматических изменений кожи.

Полученные результаты позволили разработать дермальный эквивалент, клеточную конструкцию, состоящую из мезенхимальных клеток на микроносителях. Данная конструкция обеспечивает физиологичные условия для доставки клеток, минимизирует их травматизацию при внутрикожном введении, а также способствует коррекции деструктивных изменений, что выражалось в повышении ее эластичности и барьерной функции кожи, нормализации ее гистотипического строения).

ВЫВОДЫ

1. Мезенхимальные клетки, выделенные из различных источников (жировой ткани, костного мозга, кожи) имеют экспрессию одинаковых поверхностных маркеров, используемых для идентификации мезенхимальных стволовых клеток. Невыраженная экспрессия антигенов гистосовместимости I класса и практическое отсутсвие экспрессии антигенов гистосовместимости II класса указывает на низкую дифференцированность этих клеток и неполное созревание их антигенов гистосовместимости.

2. Постнатальные мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи обладают сходной способностью контрастировать коллагеновый гель. Эта способность значительно уступает способности фетальных фибробластов к индукции контракции коллагенового геля. Выявление альфа-актина, маркера

миофибробластов, в мезенхимальных клетках из различных источников указывает на клеточную природу контрации гелей.

3. Дермальный эквивалент в виде мезенхимальных клеток адгезированных на желатиновых микроносителях позволяет увеличить конечную концентрацию жизнеспособных клеток, защищает их от травматизации при манипуляциях и при хранении в транспортных средах, поддерживая их в физиологичном (распласстанном) состоянии.

4. Внутрикожная инъекция аллогенных мезенхимальных клеток на микроносителях не препятствует миграции вводимых клеток с микроносителей в дерму, способствует их трансформации в миофибробласты, не индуцирует образование моноцитарно-макрофагальной реакции в дерме на их введение (отсутствие воспалительной клеточной инфильтрации), что указывает на безопасность применения и сохранение высокой функциональной активности мезенхимальных клеток на микроносителях.

5. Повышение биомеханических свойств кожи, восстановление ее барьерной функции, нормализация гистотипического строения при внутридермальном введении дермального эквивалента просиходит вследствие доставки жизнеспособных и функционально активных мезенхимальных клеток в зоны повреждения, их миграции с микроносителей в дерму, частичной дифференцировки этих клеток в миофибробласты, развития и стойкого сохранения эффекта контракции коллагеновых структур дермы, а также ремоделирования основных структурных компонентов кожи.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Швецова Е.В.. Патогенетические механизмы влияния трансплантированных фибробластов на структуру кожи // Онтогенез. -2005. - Т.36. - С.397.

2. Терских В.В., Васильев A.B., Киселев И.В., Швецова Е.В., Потекаев H.H., Ткаченко С.Б., Иванов A.A. Способ коррекции структурно-функциональныз изменений соединительной ткани. Патент на изобретение №2277423 от 07.04.05.

3. Швецова Е.В., Роговая О.С., Киселев И.В., Потекаев H.H., Васильев

A.B., Ткаченко С.Б.. Модели для исследования кожи // Клиническая дерматология. - 2006. - №4. - С. 47 - 49.

4. Швецова Е.В., Ткаченко С.Б., Иванов A.A., Васильев A.B., Терских

B.В. Оценка воспаления при ксеногенной, аутологичной и аллогенной трансплантации клеток // Молекулярные и клеточные основы иммунорегуляции. - 2006. - Т8. - № 2-3. - С. 191.

5. Швецова Е. В., О. С. Роговая, С. Б. Ткаченко, И. В. Киселев, А. В. Васильев, В. В. Терских. Контрактильная способность фибробластов различного происхождения в модели живого эквивалента дермы II Известия Российской Академии Наук. Серия биологическая. — 2008. -№2. - С.169 - 173.

6. Васильев А.В., Терских В.В., И.В. Киселев, Швецова Е.В., О.С. Роговая. Клеточные модели и технологии в эстетической медицине // Материалы IV Международного конгресса эстетической медицины. Москва. 24-25.09. 2004,- 2004,- С.7.

7. Швецова Е.В., Панова О.С., Колмакова Е.Ф. Патогенетические механизмы влияния фибробластов на структуру и функции кожи в практике эстетической медицины // Вестник эстетической медицины. -2005. -№1. - С.ЗЗ.

8. Швецова Е.В. Характеристика дермальных фибробластов и клеток стромы костного мозга в моделях in vivo и in vitro // Материалы V Международного конгресса эстетической медицины. Москва, 15-17 сентября, 2005. Вестник эстетической медицины.- 2005.-№3.- С31.

9. Швецова Е.В. Новые подходы к коррекции возрастных изменений кожи // Тезисы IV Международного симпозиума по эстетической медицине. Москва. - 2005. - С. 36.

Ю.Швецова Е.В.. Характеристика дермальных фибробластов и клеток стромы костного мозга в моделях in vivo и in vitro // Вестник эстетической медицины. - 2005. - №4. - С.4 - 6.

П.Швецова Е.В.. Использование клеточных конструкций в эстетической и реконструктивной хирургии. Лечение глубоких дефектов роговицы // Эстетическая медицина. -2005,-ТIV. -№1. - С.36. -40.

12.Швецова Е.В. Результаты применения клеточной конструкции (Цитосфер) в дерматокосметологической практике // Тезисы V Международного симпозиума по эстетической медицине. М. - 2006. -С. 32.

13.Панова О.С., Васильев А.В., Ткаченко С.Б., Санчес Е.А., Швецова Е.В., Буровик Е.П.. Возможности сочетания фракционного фототермолиза с клеточными технологиями для решения эстетических проблем // VI Международный конгресс им. Евгения Лапугана. — 2007. -С. 16.

14.Васильев А.В., Киселева Е.В., Воротеляк Е.А., Швецова Е.В., Дашинимаев Э.Б., Иванов А.А., Терских В.В.. Аутологичные и аллогенные клеточные трансплантаты - достоинства и недостатки // Тезисы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогенеторные клетки: экспериментальные и клинические достижения». М. - 2008. - С.15.

Pathophysiological Mechanisms of Using Mesenchymal Cells for Optimized

Skin Regeneration

The purpose of this project was to study biological properties of the mesenchymal cells obtained from adipose tissue, marrow, and derma fibroblast. The results show that all three types of cells demonstrate a similar expressivity level of surface markers, which are specific to the mesenchymal stem cells. The investigation of the ability of these cells to contract the collagen gel in the model of the living derma equivalent reveals that all postnatal mesenchymal cells have a similar contractile ability that is approximately 6 times weaker than the contractile ability of fetal fibroblasts. This work also presents a novel cell construction that can be used to develop biomedical technologies.

Подписано в печать:

16.04.2009

Заказ № 1868 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы. Возрастные изменения кожи как часть общебиологического старения развиваются в соответствии с изменениями, происходящими во всех тканях организма. До настоящего времени остаются с малоизученными причины и механизмы их возникновения. Известно, что все причины, запускающие механизмы старения, можно разделить на две большие группы — внешние и внутренние. К внешним относятся УФ излучение, аллергены, механические повреждения; среди внутренних причин называют 1 генетические, нейрогенные, иммунные, гормональные и другие факторы (Е1-Domiaty et al., 2002). Ряд авторов .указывает на ряд молекулярных механизмов развития возрастных изменений^ кожи, однако наиболее значимыми считают активацию процессов свободнорадикального окисления и активацию процессов гликации коллагена и эластина (Должникова Э.М., 2003; Ахтямов С.Н. и др., 2004; -Dyer D.G. et al., 1993; Harman D., 2003).

Показано, что с возрастом большие изменения претерпевают фибробласты кожи, теряющие активность, особенно на участках, подвергшихся инсоляции. Они приобретают шаровидную форму, нарушается их синтетическая функция: снижается синтез фибриллярных белков, таких как коллаген, фибронектин, эластин и повышается продукция протеаз, что приводит к деградации структуры внеклеточного матрикса, и, как следствие, к снижению эластичности кожи. (Шехтер А.Б, Милованова З.П., 1975; Gogly В. et al., 1997). Особое значение придается снижению синтеза сигнальных молекул, что приводит к нарушению эпидермально-дермальных взаимодействий, уменьшению пролиферации кератиноцитов базального слоя и, в результате, к снижению самообновления кожи и ее регенераторных возможностей.

В настоящее время существует большое количество методов коррекции возрастных изменений кожи (Holland R.L., Brown М.С., 1981; Tennstedt D., Lachapelle J.M., 1997; Heme K.B., Zachary C.B., 2000). К ним относятся массажи, применение питательных и увлажняющих кремов, масок, мезотерапия, пилинги, дермабразия, введение имплантатов, ботулотоксина, пластическая хирургия. Все эти методы направлены, в конечном счете, на борьбу с уже существующими изменениями и напрямую зависят от состояния клеток кожи, и прежде всего фибробластов. По данным клинических наблюдений известно, что с возрастом успех от проведенной антивозрастной терапии снижается, так как снижается-уровень обменных процессов в клетках кожи и их способность к активации в ответ на стимулирующее действие процедур (Makeux R. et al., 1994).

Поиск новых методов эффективной коррекции инволюционных изменений кожи выделяется в перспективное направление современной дерматокосметологии (Виссарионов В.А. и др., 2003). В последние годы в литературе появились сообщения о применении культивированных мезенхимальных клеток для улучшения регенерации, что вполне соответствует современным представлениям о роли межклеточных взаимодействий в регенерационных процессах тканей и, в частности, о регуляторной функции фибробластов в поддержании тканевого гомеостаза (Хрупкин В.И. и др., 1998; Берк Г.С. и др, 2000; Келлер Г. и др, 2000). В литературе представлены данные о клиническом применении культуры фибробластов человека в лечении глубоких ожогов, которые были получены. Д.С. Саркисовым и. соавторами (Саркисов Д.С. и др., 1994). В настоящее время метод трансплантации аллогенных культивированных клеток (фибробластов и кератиноцитов) успешно применяется в комбустиологии, в лечении длительно незаживающих гранулирующих кожных ран, трофических язв и свищей, в лечении ран после операций пластической хирургии (Колокольчикова Е.Г. и др., 2001; Расулов М. Ф., 2007; Yonezawa М. et al., 2007; Nie X. et al., 2007). Также имеются отдельные сведения о том, что стволовые клетки, полученные из жировой ткани и мезенхимальные клетки костного мозга (МККМ) ускоряют заживление ран (Шумаков В.И. и др., 2003; Kim W.S. et al., 2007; Lee C.H. et al., 2007). Несмотря на большое количество работ, посвященных результатам применения мезенхимальных клеток при раневом заживлении, вопрос о процессах, происходящих при внутрикожном введении этих клеток при ее инволюционных процессах, изучен недостаточно. Не проведено сравнительного изучения функциональных возможностей мезенхимальных клеток из разных источников (дермальных фибробластов, мезенхимальных клеток костного мозга, мезенхимальных клеток, полученных из жировой ткани) и сравнительного изучения профиля поверхностных маркеров этих клеток. Остался малоизученным вопрос о площади миграции введенных внутрикожно мезенхимальных клеток, также не изучалась тканевая реакция при их трансплантации. Особую практическую значимость могли бы иметь исследования, направленные на разработку клеточной конструкции, пригодной для использования в качестве трансплантата для оптимизации регенерации кожи. Не меньшую значимость при использовании мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи могли бы иметь исследования-отдельных функциональных параметров в модельных опытах in vitro и in vivo. Однако таких исследований мы в литературе не обнаружили. Между тем такие данные могли бы способствовать углублению наших представлений о патогенезе возрастных изменений кожи и поиску путей их устранения и профилактики.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы являлось изучение механизмов влияния мезенхимальных клеток из разных источников на восстановление структурно-функциональных параметров кожи в моделях инволюционных процессов кожи in vitro и in vivo.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование фенотипических характеристик различных типов мезенхимальных клеток и изучить их способность к индукции контракции коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы.

2. Разработать клеточную конструкцию дермального эквивалента (аллогенные фибробласты на желатиновых микроносителях), пригодную для внутридермального введения и обеспечения эффективной и безопасной коррекции структуры и функций кожи при ее инволюционных изменениях.

3. Обосновать безопасность внутридермального введения в организм дермального эквивалента с аллогенными фибробластами у свиней и показать возможность коррекции деструктивных изменений кожи при ее инволюционных изменениях или рубцовом повреждении.

4. Изучить механизмы коррекции структуры и функции деструктивно и инволюционно измененной кожи при внутридериальном введении клеточного дермального эквивалента.

Научная новизна исследования.

Впервые в опытах с моделированием инволюционных изменений кожи in vitro и in vivo изучен механизм коррекции структурно-функциональных изменений дермы под влиянием! инъецированных мезенхимальных клеток. Показано, что в трехмерной структуре дермы фибробласты приобретают фенотип миофибробластов, экспрессируют альфа-актин, контрастируют дерму.

Впервые проведена комплексная, оценка и анализ поверхностных маркеров мезенхимальных клеток, полученных из трех основных источников — дермы кожи человека, жировой ткани и костного мозга, для подтверждения их фенотипической принадлежности к мезенхимальным клеткам.

Впервые продемонстрировано, что все 3 типа мезенхимальных клеток из разных источников позитивны по большинству поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых клеток. Произведена оценка функциональной активности разных типов мезенхимальных клеток взорослого организма по способности трансформироваться в миофибробласты и индуцировать контракцию флотирующего Зх-мерного коллагенового геля в сравнении со способностью индуцировать контракцию геля фетальными фибробластами. Установлена способность фибробластов к миграции с поверхности микроносителей в матрикс, а также отсутствие тканевой воспалительной реакции в ответ на их введение в дерму свиней породы мини.

Установлено, что под действием трансплантированных мезенхимальных клеток улучшается эластичность кожи, восстанавливаются ее барьерные функции, а также нормализуется ее структура.

Впервые был разработан дермальный эквивалент — клеточная конструкция, состоящая из мезенхимальных клеток и биодеградируемых желатиновых микроносителей, обеспечивающая адекватную внутридермальную доставку клеток в физиологически активном состоянии, что позволяет использовать ее для оптимизации регенерации кожи.

Научно-практическая значимость работы. Получены новые факты о регулирующей роли мезенхимальных клеток, в частности фибробластов, в процессах восстановительной регенерации кожи. Установлена способность этих клеток индуцировать контракцию коллагенового геля - основного структурного компонента дермы, а также мигрировать в глубину дермы, обеспечивая непосредственный контакт этих клеток с собственными клетками дермы. Отражением этих регулирующих воздействий мезенхимальных клеток служит восстановление функций кожи (повышение эластичности кожи, восстановление ее барьерной функции) и нормализация ее структуры у пациентов с инволюционными и деструктивными (рубцовые деформации) изменениями кожи. Полученные результаты исследований на коже животных и человека, могут стать основой для разработки нового направления в использовании аллогенных и аутологичных мезенхимальных клеток для коррекции возрастных изменений кожи и при ее повреждении. Сходство фенотипического состава мезенхимальных клеток различного происхождения позволяет расширить источник получения донорских мезенхимальных клеток для осуществления клеточной терапии. Установленные в работе закономерности влияния мезенхимальных клеток на восстановление стурктурных компонентов кожи, могут быть использованы в лекционных курсах для преподавания физиологии, патофизиологии, клеточной биологии, а так же служить основой для дальнейших разработок биомедицинских технологий.

Результаты работы используются в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии; развития им. Н.К. Кольцова РАН и в лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной' медицины ММА им: И.М. Сеченова.

Работа выполнена в рамках: федеральной целевой программы «Исследования и разработки; по приоритетным направлениям развития . научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», шифр — «2007-2-1.2-06-02177» в рамках темы: «Разработка гистотипических живых тканевых эквивалентов? на основе стволовых клеток для восстановления! структуры и функции тканей».

Положения, выносимые на защиту:

1. Мёзенхимальные клетки из различных источников (жировой ткани; :костного мозга, кожи) фенотипически идентичны по большинству поверхностных маркеров, характерных для мезенхимальных стволовых:. клеток, а> также имеют сходную способность индуцировать контракцию коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы in vitro;

2. Дермальный эквивалент в виде клеточной конструкции с использованием желатиновых микроносителей позволяет увеличить конечную концентрацию используемых клеток, защищает их от травматизации при манипуляциях и позволяет доставлять клетки внутридермально в физиологичном для них состояния.

3: Внутрикожная инъекция аллогённых; мезенхимальных клеток на микроносителях не , препятствует миграции вводимых клеток с микроносителей в дерму, способствует их трансформации в миофибробласты, не индуцирует образование моноцитарно-макрофагальной реакции в дерме на их введение, что указывает на безопасность применения и сохранение высокой функциональной активности мезенхимальных клеток на микроносителях.

4. Повышение биомеханических свойств кожи, восстановление ее барьерной функции, нормализация гистотипического строения при внутридермальном введении дермального эквивалента просиходит вследствие доставки жизнеспособных и функционально активных мезенхимальных клеток в зоны повреждения, их миграции с микроносителей в дерму, частичной дифференцировки этих клеток в миофибробласты, развития и стойкого сохранения эффекта контракции коллагеновых структур дермы, а также ремоделирования основных структурных компонентов кожи.

ВЫВОДЫ

1. Мезенхимальные клетки, выделенные из различных источников (жировой ткани, костного мозга, кожи) имеют экспрессию одинаковых поверхностных маркеров, используемых для идентификации мезенхимальных стволовых клеток. Невыраженная экспрессия антигенов гистосовместимости I класса и практическое отсутсвие экспрессии антигенов гистосовместимости II класса указывает на низкую дифференцированность этих клеток и неполное созревание их антигенов гистосовместимости.

2. Постнатальные мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи обладают сходной способностью контрактировать коллагеновый гель. Эта способность значительно уступает способности фетальных фибробластов к индукции контракции коллагенового геля. Выявление альфа-актина, маркера миофибробластов, в мезенхимальных клетках из различных источников указывает на клеточную природу контрации гелей.

3. Дермальный эквивалент в виде мезенхимальных клеток адгезированных на желатиновых микроносителях позволяет увеличить конечную концентрацию жизнеспособных клеток, защищает их от травматизации при манипуляциях и при хранении в транспортных средах, поддерживая их в физиологичном (распласстанном) состоянии.

4. Внутрикожная инъекция аллогенных мезенхимальных клеток на микроносителях не препятствует миграции вводимых клеток с микроносителей в дерму, способствует их трансформации в миофибробласты, не индуцирует образование моноцитарно-макрофагальной реакции в дерме на их введение (отсутствие воспалительной клеточной инфильтрации), что указывает на безопасность применения и сохранение высокой функциональной активности мезенхимальных клеток на микроносителях.

5. Повышение биомеханических свойств кожи, восстановление ее барьерной функции, нормализация гистотипического строения при внутридермальном введении дермального эквивалента просиходит вследствие доставки жизнеспособных и функционально активных мезенхимальных клеток в зоны повреждения, их миграции с микроносителей в дерму, частичной дифференцировки этих клеток в миофибробласты, развития и стойкого сохранения эффекта контракции коллагеновых структур дермы, а также ремоделирования основных структурных компонентов кожи.

Благодарности

Автор благодарит своих научных руководителей д.б.н. А.В. Васильева и д.м.н. С.Б.Ткаченко за помощь в проведении экспериментов и обработке результатов, ценные замечания по работе.

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Ю. А. Романову за помощь в проведении экспериментов по определению иммунофенотипического профиля мезенхимальных клеток с помощью проточной флуориметрии. Автор выражает благодарность всему коллективу Лаборатории проблем клеточной пролиферации ИБР РАН за моральную поддержку и за проявленный интерес к работе.

102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты свидетельствуют о том, что мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга, жировой ткани и дермы кожи имеют одинаковые регенераторные потенции, о чем свидетельствует их иммунофенотипический профиль, а также контрактильная способность. По степени контракции коллагенового геля в модели живого эквивалента дермы значимых различий между этими типами клеток вывленно не было. Все постнатальные мезенхимальные клетки в модели живого эквивалента дермы, а также при внутрикожной инъекции трансформировались в миофибробласты, что подтверждалось специфической окраской на гладкомышечный альфа-актин.

При изучении миграции клеток с поверхности микроносителей в дерму при введении в кожу свиней было выявлено, что происходит она на 5 сутки, после чего клетки встраиваются в матрикс и проявляют контрактильные усилия, что соответсвует данным полученным, in vitro в модели живого эквивалента дермы. При этом, отсутствие выраженной моноцитарно-макрофагальной реакции на введение аллогенной клеточной конструкции, делает возможным ее применение для успешной трансплантации с целью коррекции возрастных, а также постравматических изменений кожи.

Полученные результаты позволили разработать дермальный эквивалент, клеточную конструкцию, состоящую из мезенхимальных клеток на микроносителях. Данная конструкция обеспечивает физиологичные условия для доставки клеток, минимализирует их травматизацию при внутрикожном введении, а также способствует коррекции деструктивных изменений (повышает ее эластичность, барьерную функцию, нормализует ее гистотипическое строение).

99