Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патофизиологические и биохимические механизмы развития диабетических ангиопатий и патогенетическое обоснование их коррекции в эксперименте

На правах рукописи

ДЗУГКОЕВ СЕРГЕЙ ГАВРИЛОВИЧ

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКИХ АНГИОПАТИЙ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИХ КОРРЕКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.16. - патологическая физиология 03.00.04. - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владикавказ - 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель. Заслуженный деятель науки PCO-Алания,

доктор медицинских наук, профессор

ХЕТАГУРОВА Лариса Георгиевна

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

ДЗУГКОЕВА Фира Соломоновна

Официальные оппоненты*. доктор медицинских наук, профессор

ОВСЯННИКОВ Виктор Григорьевич

доктор медицинских наук, профессор ГИЛЬМИЯРОВА Фрида Насыровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 22 апреля 2008 года в 1400 на заседании диссертационного совета Д 208 095 01 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 362019, PCO-Алания, г Владикавказ, ул Пушкинская, 40

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СевероОсетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан 20 марта 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, д м н

ИГ Джиоев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Диабетическая ангио- и нефропатия являются не только частым осложнением СД, но и его интегральным патогенетическим звеном, частота и выраженность которых коррелирует с длительностью заболевания и степенью метаболических нарушений Микроциркуляторные изменения носят органоспецифический характер и отмечаются в сосудах сетчатки, почек и системной гемодинамики Так, по данным Дедова И И, Сунцова Ю И, Кудряковой С В и др , 1997, из 82,7% обследованных больных СД, ретинопатия у 61,1%, нейроангиопатия - 50,5%, диабетическая нефропатия - 28,2% При экспериментальном сахарном диабете имеет место нарушение кровоснабжения нервов и уменьшение плотности сосудов (Schratzberger Р, Walker DH, Ritting К, Bahlmann FH et al, 2001) Диабетическая нефропатия - одно из наиболее тяжелых последствий СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И И, Шестакова М В , Бондарь И А и др , 2003), важным компонентом которой являются диабетические ангиопатии

В развитии структурно-функциональных аномалий, лежащих в основе диабетических ангиопатий и ассоциированных с ними патологий (изменения свертывающей системы крови, артериальной гипертензии), участвует множество взаимосвязанных между собой процессов, одним из которых является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов и усиление неконтролируемых свободно-радикальных реакций (СРР), называемое окислительным или оксидативным стрессом - стандартным завершением патологических процессов, представляющим собой состояние превышения внутриклеточного уровня активных форм кислорода и азота над возможностями устранения их системами антиоксидантной защиты (Бондарь Т П , Муратова А Ю , Пол-Тарабатько Н П , 2004, Хаютина Т JI, Балаболкин М И , Коновалова ГА и др , 2004, Луценко В К , 2004)

В последние годы в специальной литературе появились указания, что необходимой составляющей патогенетической терапии диабетических ангиопатий является применение антиоксидантов (АО) (Кулагин О Л, 2000, Кокорева Е В , 2002, Yin X, Zhang Y, Yu J et al, 2006)

Однако, отсутствуют исследования, посвященные комплексному изучению патофизиологических и биохимических механизмов нарушений взаимосвязанных систем СРО и АОЗ клеток, их корреляционных связей, обуславливающих развитие диабетических ангио- и нефропатий

Цель исследования: изучить патофизиологические и биохимические особенности нарушений взаимосвязанных систем СРО и ферментов АОЗ клеток, обу-

сдавливающих изменения макро- и микроциркуляции, системы гемостаза, активности мембраносвязанных ферментов почечной ткани, и их роль в патогенезе диабетических ангиопатий Обосновать новые методы коррекции нарушенных механизмов регуляции, повысить эффективность лечения и профилактики сосудистых осложнений СД в эксперименте

Для достижения цели исследования решали следующие задачи:

1 Исследовать характер изменений макро- и микрогемодинамики у крыс с экспериментальным сахарным диабетом допплерографически

2 Изучить возможную роль изменений плазменного коагуляционного и тромбо-цитарного гемостаза в сочетании с нарушениями тканевой перфузии в развитии экспериментальных диабетических ангиопатий

3 Изучить при экспериментальном сахарном диабете нарушения стандартных молекулярно-клеточных механизмов оксидативного стресса мембранных механизмов трансканальцевого транспорта ионов, роль перекисного окисления липи-дов (ПОЛ) и антиокислительной системы клеток (АОС) в патогенезе диабетических нефро- и ангиопатий

4 Исследовать корреляционные взаимосвязи микроциркуляции, коагуляционных и биохимических метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете, выделив зависимости, способствующие сосудистым осложнениям

5 Используя новые знания патофизиологических и биохимических механизмов патогенеза диабетических ангиопатий, результатов корреляционного анализа, обосновать и разработать новые технологии профилактики и коррекции, используя современные антиоксиданты и мембранопротекторные вещества

Научная новизна. Впервые использован комплексный подход к анализу механизмов развития экспериментальных диабетических нефро- и ангиопатий с применением корреляционного анализа Выявлены новые звенья патогенеза, вскрыто участие нарушений метаболизма арахидоновой кислоты и АОС в нарушении эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов, макро- и микрогемодинамики, включая почечные артерии Показана роль системных нарушений коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза в развитии диабетических сосудистых осложнений На основании этих знаний разработан новый методологический подход к коррекции выявленных нарушений Доказано положительное влияние антиокси-дантов и мембранотропных веществ на состояние почечной и общей гемодинамики, активность мембранных ферментов почечных канальцев, а также ПОЛ и АОЗ клеток при экспериментальном сахарном диабете

Научно-практическая значимость. Полученные результаты дают новые

знания, углубляют и расширяют представления о патогенетических механизмах развития сосудистых осложнений сахарного диабета, обосновывают новую, более эффективную технологию коррекции системных нарушений с применением современных антиоксидантов, мембранотропных веществ и фитоадаптогенов

Практическая ценность результатов — в патофизиологическом обосновании нового методологического подхода к профилактике и лечению диабетических ан-гиопатий

Основные положения выносимые на защиту:

1 При экспериментальном сахарном диабете развиваются нарушения микро- и макрогемодинамики, что приводит к ангиопатиям Уменьшается перфузия тканей (жидкостный обмен), снижаются средняя и систолическая скорости кровотока и повышается диастолическая скорость кровотока Изменения гемодинамики в мик-роциркуляторном русле и магистральных сосудах (БА, почечные артерии) сопровождаются нарушениями коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза и торможением системы фибринолиза

2 Нарушаются водо- и электролито-выделительная функции почек, вследствие угнетения трансмембранного транспорта воды и электролитов Снижение уровня канальцевой реабсорбции Ыа обусловлено падением активности Ка.К-АТФ-азы почечной ткани

3 При экспериментальном сахарном диабете повышается интенсивность ПОЛ в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, изменяющее состояние липидного матрикса мембран клеток структур нефрона Нарушается АОЗ клеток

4 Коррекция нарушений ПОЛ и АОС клеток антиоксидантами в сочетании с мембранотропными веществами приводит к снижению степени выраженности диабетической нефропатии, нарушений гемодинамики и системы гемостаза

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались на 61-ой межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Владикавказ, 2006), научно-практической конференции южного Федерального округа с международным участием «Экстремальная медицина Проблемы экстремальных состояний» (Владикавказ, 2006), научной конференции молодых ученых СОГМА (Владикавказ, 2007), IV региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в рекомендованном ВАК РФ рецензируемом журнале // «Вестник новых медицинских технологий», т 15, №1, 2008, с 40-41

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, включая библиографию Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав изложения результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, общих выводов и списка использованной литературы и приложений Библиографический указатель включает 242 источника литературы, из них 155 отечественных и 87 иностранных авторов Работа иллюстрирована 17 рисунками и 13 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований. Исследования проводились на 249 крысах самцах линии Wistar одной возрастной группы (10-14 месяцев), массой 220-250гр интактных и с аллоксановым сахарным диабетом Моделирование алок-санового диабета производилось введением 5% водного раствора аллоксана, синтезированного в лаборатории кафедры биохимии СОГМА в дозе 15-18 мг/100гр массы на фоне 24-48-часового голодания Развитие диабета контролировали по уровню глюкозы крови, который определяли глюкозооксидазным методом Модель считали состоявшейся при повышении сахара крови и диуреза в 2 раза Животных брали в опыт по окончании остротоксического периода действия аллоксана, т е спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного диабета В качестве объектов исследования использовали кровь, плазму крови, эритроциты, гомогенаты коркового и мозгового вещества почечной ткани, микросомальную и митохондриальную фракции коркового и мозгового вещества почек, мочу Эксперименты проводили в хронических и острых опытах, в одно и тоже время суток, сезоны года, всего провели 5319 исследований, включая анализ коагулограмм, аг-регатограмм Тг и биохимические тесты

Для изучения гемодинамики исследовали кровоток в магистральных сосудах - брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НПВ), почечных артериях (ПА) и микроциркуляторном звене допплерографически с помощью ультразвукового портативного допплерографа ММ-Д-Ф фирмы «Минимакс» СП(б) у наркотизированных животных, использовали 6 основных точек локации Исследование показателей системы венозного гемостаза производили методом электрокоагулографии, АДФ- и коллаген-индуцируемую агрегацию тромбоцитов - турбидиметрическим методом Борна на анализаторе агрегации Solar Для изучения водо-выделительной функции почек, собирали 6 часовой спонтанный диурез и исследовали в моче содержание креатинина, Na и К По истечении времени эксперимента животных забивали под внутрибрюшинным тиопенталовым наркозом в дозе 20 мг/100г массы

б

тела Кровь забирали из левого желудочка, в плазме крови определяли концентрацию глюкозы, натрия, калия, активность каталазы и СОД Расчетным путем, используя формулы Наточина ЮВ (1974), вычисляли величину клубочковой фильтрации, экскрецию воды и электролитов, их фильтрационные заряды и ка-нальцевую реабсорбцию Концентрацию натрия и калия в плазме крови и моче определяли пламенной фотометрией, содержание креатинина - спектрофотометри-чески Интенсивность перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и в гомогенатах коркового и мозгового веществ почечной ткани исследовали по данным изменения концентрации малонового диальдегида колориметрическим методом с тиобарбитуровой кислотой по методу Osacawa Т, (1980) Состояние ан-тиоксидантной системы оценивали по активности каталазы в сыворотке крови методом М А Королюка и соавт , (1988) и СОД методом аутоокисления адреналина Активность Na+,K+-ATO-a3bi определяли по методу Scow JC, (1957) Удельную активность фермента рассчитывали на мг белка в час (мкмоль/Рн/мг белка/час) Белок в пробах определяли по методу Lowry ОН , (1951) Статистическую обработку результатов производили методом вариационной статистики, принимая во внимание коэффициент вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию, учитывая ее достоверность по стандартным таблицам (JI С Каминский), с использованием компьютерной программы статанализа Microsoft Excel

Результаты исследования и их обсуждение. При анализе перфузии тканей в сосудах микроциркуляторного русла при ЭСД во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (М) преимущественно за счет снижения систолической скорости (S), при менее выраженном повышении диастолической скорости кровотока (D) Реографические показатели характеризуются повышением Индекса Гослинга, отражающего повышение упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки, и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла Индекс Пурселло (реографический индекс - И), который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление, повышается Одновременно в магистральном артериальном сосуде (брюшная аорта), в отличие от сосудов микроциркуляторного русла, наблюдается, повышение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока, снижение индекса Гослинга (PI) и периферического сосудистого сопротивления, что согласуется с теорией генерализованной гиперперфузии, рассматриваемой в качестве основы патогенеза осложнений СД в виде микроангиопатии сетчатки, почечных клубочков и периферического сосудистого русла (Cuncha-Vaz JG, 1978, Дедов И И, Шестакова М В , Бондарь И А и др , 2003) (табл 1)

Таблица 1.

Динамика изменения показателей гемодинамики при ЭСД (М±т)

Точки локации Контроль (п=10) Показатели ДГ Аллоксановый диабет (п=15) Показатели ДГ

М Б Р1 М М Б Р1 во Ш

Перфузия 2,518 11,338 6,335 7,668 0,042 1,490 2,137*' 10,48* 6,25 9,504* 0,04*** 1,572

0,076 0,264 0,168 0,250 0,001 0,036 0,064 0,165 0,220 0,231 0,001 0,030

БА 13,468 38,834 2,083 2,814 0,548 0,948 15,710* 40,292 2,95*' 2,804 0,651*' 0,932

0,473 1,223 0,232 0,155 0,020 0,011 0,518 0,855 0,372 0,149 0,018 0,010

НПВ 9,420 15,868 1,223 1,692 0,118 1,042 9,871 18,204 2,162* 1,793 0,124 1,12*'

0,440 1,754 0,137 0,121 0,008 0,008 0,426 0,544 0,219 0,092 0,008 0,013

ПА лев 5,052 20,019 4,638 5,036 0,148 1,191 5,308 22,59** 4,09*' 3,746* 0,2* 1,145

0,304 0,880 0,415 0,297 0,012 0,029 0,245 0,500 0,303 0,259 0,010 0,021

ПА прав 4,377 19,599 5,651 4,830 0,127 1,24 4,946 20,025 5,495 3,973 0,15*** 1,207

0,402 1,020 0,521 0,467 0,011 0,044 0,276 0,485 0,378 0,282 0,008 0,029

Примечание

ДГ - допплерография, БА - брюшная аорта, НПВ - нижняя полая вена,

ПА - почечная артерия (правая и левая) *'р<0,001, *р<0,01, **р<0,02, ***р<0,05

Аналогичные изменения показателей системной гемодинамики происходят в почечных артериях, что характерно для ранних сроков диабета

Т о , в динамике развития сахарного диабета у экспериментальных животных развивались дизрегуляторные нарушения разнонаправленные сдвиги показателей перфузии и кровотока в магистральных сосудах

Анализ агрегационной способности тромбоцитов крыс с ЭСД в 42,4% случаев показал спонтанную агрегацию (без внесения индуктора после включения магнитной мешалки), сравнительно со здоровыми животными спонтанная агрегация у контрольных крыс отсутствовала Этот период развития экспериментального сахарного диабета, по нашим данным, характеризуется наибольшим приростом малонового диальдегида (МДА) в крови, который, как известно, может влиять на мембрану тромбоцитов, определяя их нестабильность Полученные данные созвучны с результатами исследований Степанян МЛ, 1998, Токмаковой АЮ, Староверовой ДН, Анциферовой М Б, 2004, обнаруживших увеличение концентрации МДА в тромбоцитах при СД и увеличение агрегации тромбоцитов с освобождением тромбоци-тарных факторов

Повышение степени и скорости агрегации тромбоцитов при ЭСД особенно выражено при индукции АДФ (1 мкг/мл) Ускорено время начала первичной агрегации на введение АДФ (1 мкг/мл) и коллагена - фаза набухания (на 72,5%, 98,5% и 84%, соответственно) Время максимума вторичной агрегации (после выброса БАВ тромбоцитов) при использовании АДФ (10 мкг/мл) удлинено (на 22,5% (р<0,01), тогда как при более низкой концентрации АДФ (1 мкг/мл) и коллагена, наоборот, достоверно ускорено (р<0,001 и р<0,05, соответственно) - факт, свидетельствующий о повышении чувствительности рецепторов кровяных пластинок к индукторам (табл 2)

Таблица 2.

Изменение показателей агрегатограммы интактных крыс и крыс с ЭСД.

Индукторы Показатели, статистика АДФ Коллаген Спонтанная агрегация

10 мкг/мл 1 мкг/мл 20 мг/мл

К ЭСД К ЭСД К ЭСД К ЭСД

Тг, тыс/мкл М+т 366,486 29,194 453,97 19,801 336,925 28,417 371,700 39,819 402,110 27,703 375,034 28,950 370,033 25,882

СтА, % М+т 59,617 3,319 68,433 9,024 29,567 2,782 48,25** 4,613 47,129 5,393 48,3 4,302 - 26,833 2,682

СкА, %/мин М±т 50,911 6,307 61,100 7,104 50,050 18,869 62,150 5,369 43,250 2,571 36,080 3,670 - 32,7 16,901

ВА„, сек (начало) М+т 40,433 12,729 11,250 0,250 158,000 64,354 2,600 0,245 329,286 30,662 52,8 5,276 - 15,500 4,491

ВА, сек (окончание) М+т 415,364 21,384 536,0** 30,241 373,800 51,574 116,25* 8,230 402,375 31,550 269,88*** 54,339 - 0,410 0,310

N 8 7 12 5 12 8 - 3

Примечание

*р<0,001, **р<0,01, ***р<0,05

Подобная активация тромбоцитов и повышение их чувствительности к различным индукторам при СД, по данным некоторых авторов опосредуется через увеличение образования простагландина Н2, тромбоксана А2 или их обоих (Di Mino G, 1985) и связано, преимущественно, с высокими концентрациями сахара крови (Mustard JF, 1984).

Существенно отличается характер кривых агрегатограммы здоровых и диабетических крыс. У здоровых животных после введения индуктора отмечается латентный период, затем развивается первичная агрегация, которая сразу переходит в волну вторичной необратимой агрегации. При диабете латентный период отсутствует, первичная агрегация обратима, снижение кривой характеризует выброс БАВ из тромбоцитов, и затем развивается волна вторичной агрегации (рис. 1).

f В

г А

£

s */ \ —"

' г ■ '

S а

1 1 i ■

f -J i , .. . „

Рис. Характерные агрегатограммы интактной крысы (А) и крысы

с ЭСД (Б) (индуктор коллаген — 20 иг/мл).

На фоне ЭСД в летний сезон года (табл. 3) происходит повышение коагулирующих свойств системы гемостаза (СГ), что характеризуется укорочением времени начала, продолжительности и окончания свёртывания (Ть Т2 и Т), одновременно происходит торможение фибринолиза (в 23,4% случаев)- время начала фибринолиза (Тз) - 27,78 мин, у остальных крыс он отсутствует, что существенно отягчает коагуляцию. В контрольной группе фибринолиз наступает через 8,8 мин. Скорость свертывания повышается только в первую минуту, во 2-3 минуты при СД она снижается. Снижение максимальной амплитуды (Атах), отражающей гематокрит, свидетельствует о повышении вязкости крови за счёт ухудшения её реологических свойств. Именно развивающаяся гиперкоагуляция и повреждение системы фибринолиза в сочетании с гиперактивацией тромбоцитов является одним из факторов повреждения стенки сосудов при СД (Сапт^ Р, 1992).

Таблица 3.

Изменение показателей ГКГ крыс при СД и при различных вариантах антиоксидантной терапии (лето)

8 5 Варианты АОТ

3 X >о ч н Ы ■ X я

58 СО Я V, О в и 5 И я н и о. Е о £4 сд я о а ч § 2 X в « = п ФК «Бис ритм-Эх Е в а я а ¿1 Триада

Ъ М 127,5 76,67 72,5 132,5 150 105 53,3

±т 17,4 6,423 2,5 7,5 18,23 4 13,33

т2 М 271,2 125,0 112,5 307,5 290 210 76,67

±т 23,61 7,134 2,50 22,50 19,21 5 16,66

Т М 128,0 70,0 40 175 140 105 30

±т 5,477 4,36 3,32 15 16,87 4,5 5,77

Тз М 8,83 — 16 ... ... 7,58 ...

±т 0,47 — 0,89 — — 0,37 —

Атах М 3,35 2,7 3,25 3,15 2,7 3,75 1,87

±т 0,26 0,171 0,05 0,05 0,16 0,25 0,74

п 24 17 12 12 12 12 12

Корреляционный анализ показателей перфузии тканей показал, что наиболее достоверные связи между системами коагуляции и микроциркуляторным звеном в контроле определяются между продолжительностью времени свертывания (Т), систолической скоростью кровотока (М)(г= -0,489, р>99), градиентом давления (вЭ) (г= -0,408, р>98) и реографическим индексом, определяющим общее периферическое сопротивление сосудов (Ш) - (г= -0,75, р>99), при этом наиболее сильная корреляция отмечается между Т и III, что демонстрирует у здоровых животных компенсацию между коагуляторными тенденциями и реакцией эндотелиальных клеток, направленную на расслабление сосудов При ЭСД остается достоверной только корреляционная связь между продолжительностью времени свертывания (Т) и систолической скоростью кровотока (М)(г= 0,361, р>95), но физиологическое соотношение нарушается, так как в противо-

12

положную сторону меняется взаимосвязь между явлениями - чем выше скорость кровотока, тем короче при патологии время свертывания, что существенно повышает тромбообразование Если сравнивать корреляционные связи между показателями микроциркуляции и степенью агрегации тромбоцитов в тканях (СтА), то они слабой силы и меняют направления при СД (нет достоверности коэффициента корреляции) Нужно отметить, что положительная корреляция между тонусом сосудов (М) и СтА тромбоцитов у интактных крыс (г= 0,4441, р>99), при СД становится отрицательной (г= -0,43647, р>99) - это свидетельствует о снижении реактивности тромбоцитов на вазоконстрикторные влияния

Корреляционный анализ показателей гемодинамики в артериальных сосудах (БА, ПА) показал, что при ЭСД ослабляются связи между системой коа-гуляционно - тромбоцитарного гемостаза и характером кровотока в крупных артериальных сосудах, направление связей практически не меняется

Таким образом, можно полагать, что в ранние сроки ЭСД преимущественно отмечаются нарушения тканевого (жидкостного) обмена, сопровождающие микроангиопатии, с нарушениями плазменных и клеточных звеньев СГ, тогда как изменения центральной гемодинамики носят еще компенсаторный характер, сопровождающийся гиперперфузией

Нарушение гемодинамики в почечных артериях у экспериментальных животных в хронической стадии аллоксанового диабета сопровождается статистически достоверным (р<0,001) увеличением спонтанного диуреза и экскреции электролитов, вследствие снижения уровня канальцевой реабсорбции воды и натрия (р<0,001), клубочковой фильтрации, обнаружившей тенденцию к снижению (р>0,05) Электролито-выделительная функция почек на фоне спонтанного диуреза характеризуется увеличением экскреции натрия вследствие снижения канальцевой реабсорбции его с мочой у крыс с АСД средней степени тяжести (уменьшен фильтрационный заряд Ыа) (рис 2)

Повышается и экскреция калия с мочой, хотя не выявлено статистически достоверного изменения фильтрационного заряда калия, а так же выделение калия с мочой зависит еще и от его секреции в дистальных канальцах

□ контроль ■ СД

фильтрационный заряд натрия

□ контроль Ш СД

канальцевая реабсорбция N8

□ контроль ■ СД

Рис. 2. Изменение экскреции, фильтрационного заряда и канальцевой реабсорбции натрия (%) при аллоксановом диабете.

Реабсорбция натрия в почечных канальцах является активным процессом и в нем принимает участие олигомерный мембранный фермент, локализованный в базолатеральной мембране - №+,К+-АТФ-аза Поэтому мы исследовали активность Ма+,К+-АТФ-азы в гомогенатах, митохондриальной и микро-сомальной фракциях коркового и мозгового вещества почечной ткани при ал-локсановом диабете

Анализ данных показал, что при инсулиновой недостаточности - АСД -отмечается снижение активности На+,К+-АТФ-азы не только в гомогенатах коркового и мозгового вещества почек, но и в микросомальной фракции клеток (с 4,39±0,18 Рн/мг б/час до 3,19±0,15 Рн/мг б/час (корковое в-во) и с 6,62±0,07 Рн/мг б/час до 4,69±0,08 Рн/мг б/час (мозговое в-во)) Эти нарушения активности Ыа-насоса могут быть вызваны нарушением фосфорилирования АТФазы и уменьшением субстрата АТФ (табл 4)

Учитывая тот факт, что митохондрии являются энергообразующими структурами клетки, мы определяли активность фермента в этих субклеточных структурах и выявили угнетение активности Кга+,К+-АТФ-азы, что можно объяснить нарушением энергообразования Эти данные подтверждают что при низких концентрациях АТФ На+,К+-АТФ-аза работает как набор взаимодействующих протомеров, т е дефицит АТФ является причиной отсутствия фермента как олигомерной структуры

В исследованиях последних лет выявлена важная роль процесса перекис-ного окисления липидов в структурно-функциональной модификации биологических мембран периферической сосудистой системы и структур нефрона, изменении их физико-химических свойств и проницаемости (Иванов Б Н , 1998, Агаев и др , 1992, Кубатиев А А , 1996, Флеров М А и др , 2003) О состоянии перекисного окисления липидов мы судили по концентрации МДА в эритроцитах (наиболее доступной модели тканевых клеток) и в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани

Анализ полученных результатов показал, что происходит активация системы свободно-радикального окисления, в эритроцитах и концентрация МДА в

них достоверно повышается по сравнению с контрольной группой (р<0,001) Аналогичные изменения выявлены в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани происходит значительное увеличение концентрации МДА как в корковом, так и мозговом веществе почечной ткани Исследование активности Ка,К-АТФ-азы почечной ткани показало, что в условиях инсулиновой недостаточности отмечается снижение активности энзима в обоих слоях почечной ткани, но при этом увеличиваются процессы липопероксидации, о чем свидетельствуют высокие значения МДА Изучая взаимосвязь между изменением концентрации МДА и активностью №,К-АТФазы выявили, что при аллоксано-вом диабете происходит резкое понижение активности Ыа,К-АТФазы и это сопровождается достоверным возрастанием концентрации малонового диальде-гида, конечного продукта переокисления липидов (табл 4 ) Анализ корреляционной связи между интенсивностью перекисного окисления липидов и активностью ШД-АТФазы в корковом и мозговом веществе почечной ткани выявил отрицательные связи (г соответствует = -0,8, -0,75)

В тесной связи с процессами СРО находится антиоксидантная система организма, основная функция которой заключается в ограничении процессов ПОЛ практически во всех его звеньях Чтобы оценить реакцию системы АОЗ организма в ответ на развитие оксидативного стресса при экспериментальном сахарном диабете, мы определяли активность СОД и каталазы в сыворотке крови Анализ полученных экспериментальных данных показал снижение активности СОД в крови у крыс с АСД Однако, при изучении активности каталазы в крови у крыс с экспериментальным СД обнаружили значительный прирост активности фермента, что можно считать проявлением клеточной компенсаторной реакции в условиях оксидативного стресса (см схему)

Учитывая важную роль окислительного стресса в развитии ЭСД необходимой составляющей патогенетической терапии диабетических ангио- и неф-ропатий, следует считать применение антиоксидантов (АО) (Янькова В И, Иванова И Л , Федореев С А и др , 2002, Машков Ю И , 2001, Чугунова Л А , Шамхалова М Ш, Шестакова М В , 2004)

Схема: Роль взаимосвязанных сосудистых, метаболических и коагулопатических изменений в патогенезе

экспериментальных диабетических ангиопатий.

ОКСИДАТИВНЫИ СТРЕСС

Дисциркуляторные нарушения при ЭСД

гемодинамические нарушения в макрососудах: почек, брюшной аорты, нажней полой вены и конечностей

_¡7

расстройства микроциркуляции

снижение перфузии тканей

7

эндотелиоциты Т МДА

дисфункция эндотелия -*• нарушение секреции ферментов системы ге-мокоагуляции

ТI тонус сосудов

Метаболические нарушения

дисбаланс окислительно-восстановительных процессов

I

активация ПОЛ

недостаточность АОЗ МДА

Эндотелиоцит

нарушение секреции прокоагулянтов

Iантиагрегационной способности сосудистой стенки

активация Тг

■[степени и скорости агрегации

торможение фибринолиза

коагулопатии

ДИАБЕТИЧЕСКИЕ АНГИОПАТИИ

Таблица 4.

Показатели активности №,К-АТФ-азы, ПОЛ и АОС эритроцитов и почечной ткани при экспериментальном

сахарном диабете на фоне корригирующей терапии.

Контроль эсд СД+Ь-кар СД+вит Е СД+ Милдронат

Активность ИаД-АТФ-азы, мкмоль/Рн/мг б/час корковое в-во 4,39±0,18 3,18±0,22 3,86±0,3 3,21±0,23 3,33±0,55

п=25 п=25 п=15 N=10 п=10

мозговое в-во 6,62±0,35 4,38±0,13 6,66±0,71 5,89±0,19 6,58±1,0

п=25 п=25 п=15 N=10 п=10

МДА в почечной ткани корковое в-во ЗД8±0,22 4,39±0,18 4,66±0,29 2,93±0,43 2,29±0Г34

п=25 п=12 п=15 N=10 п=10

мозговое в-во 4,28±0,13 6,62±0,17 3,86±0,23 3,57±0,33 3,86±0,35

п=25 п=12 п=15 N=10 п=10

МДА в эритроцитах 6,87±0,45 8,65±0,47 4,28±0,156 4,44±0,115 4,697±0,068

п=25 п=25 п=15 N=10 п=10

Активность СОД 2,55±0,46 1,45±0,044 1,942±0,031 1,86±0,083 1,867±0,207

п=10 п=10 п=15 N=10 п=10

Активность каталазы 225,56±29,09 345,327±3,316 302,63±1,237 316,74±2,95 32б,04±2,43

п=10 п=10 п= N=10 п=10

Исходя из этого для коррекции нарушений ПОЛ, АОС, показателей ДН, микро- и макрогемодинамики и системы гемостаза вводили крысам с ЭСД в течение месяца АО и мембранопротекторные вещества а-токоферол-ацетат, комбинацию а-токоферол-ацетата с а-липоевой и аскорбиновой кислотой, милдро-нат, Ь-карнитин и растительный препарат - ФК «Биоритм-Э» Эффекты милд-роната и Ь-кара сравнивали с действием а-токоферола По истечении периода введения исследовали показатели ПОЛ, АОС, активность Ыа+,К+-АТФ-азы, состояние микро- и макрогемодинамики, коагуляционный и тромбоцитарный гемостаз

Анализ данных выявил значительное ингибирование ПОЛ по данным МДА в крови на фоне введения витамина «Е» и его комбинации с аскорбиновой и а-липоевой кислотами, а также на фоне мембранопротекторов милдрона-та и Ь-кара Активность каталазы снижалась с повышенного уровня, поскольку один из путей генерации перекиси водорода устранялся СОД Однако, активность каталазы не снижалась до исходного уровня, что является свидетельством еще повышенного уровня пероксида (табл4) Для выявления эффективности действия антиоксидантов на интенсивность ПОЛ и активность ферментов АОЗ мы провели корреляционный анализ между концентрацией МДА, активностью СОД и каталазы Данные показали наличие выраженной обратной корреляционной связи между концентрацией МДА и активностью СОД на фоне введения Ь-кара (г=-0,59) На фоне введения милдроната выявляется прямая сильная корреляционная связь между концентрацией МДА и активностью каталазы, тогда как выявлены слабые связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД Ингибирование ПОЛ и относительное улучшение липидного микроокружения в мембранах клеток коркового и мозгового вещества привели к повышению активности Ыа+,К+-АТФ-азы в мозговом веществе, в то время как в корковом веществе наши данные показали лишь тенденцию к повышению активности энзима Действительно, выявлена выраженная обратная корреляционная связь между концентрацией МДА и активностью На+,К+-АТФ-азы в мозговом веществе на фоне введения Ь-кара (г=-0,64) и милдроната в основном в корковом веществе (г=-0,64)

На фоне АО терапии уменьшается плотность сосудистой стенки достоверно в БА, ПА пр, ПА лев Наиболее эффективны витамин «Е», милдронат, Ь-карнитин Коэффициенты корреляции между интенсивностью ПОЛ и показателем плотности сосудов на фоне витамина «Е», милдроната, Ь-карнитина сле-

дующие в БА г1=0,55, г2=0,50, г3=0,65, в почечных артериях Г1=0,49, г2=0,60, г3=0,69, т е выявляется прямая корреляционная связь

Результаты исследования МЦ (жидкостный обмен) показывают повышение перфузии, из-за снижения плотности сосудистой стенки и повышения средней и систолической скоростей кровотока Сравнительный анализ результативности влияний АО вьивил, что наиболее эффективным оказался Ь-карнитин, который ингибировал липопероксидацию и способствовал улучшению качественного состава ФЛ сосудистой стенки, в результате чего уменьшилась ее плотность С другой стороны, улучшая метаболические процессы и энергообразование в эпителиальных клетках сосудов и кардиомиоцитов препарат стимулировал макро- и микрогемодинамику

Анализ корреляционной связи между концентрацией МДА и скоростью кровотока (8) демонстрирует отрицательные сильные связи на фоне витамина «Е», Ь-карнитина (коэффициенты корреляции соответственно г=-0,71, г=-0,69), на фоне милдроната выявляется отрицательная корреляционная связь, но не сильная (г=-0,33) Что касается плотности сосудов микроциркуляции, то она не только снижается, но находится в прямой взаимосвязи с активностью ПОЛ (коэффициенты корреляции витамин Е - г=0,43, милдронат г=0,60, Ь-карнитин г=0,70)

Нормализация ПОЛ на фоне витамина «Е», Ь-карнитина и милдроната способствует угнетению активности прокоагулянтного звена системы гемостаза и нормализации фибринолитической системы крови

Таким образом, в развитии структурно-функциональных изменений, лежащих в основе диабетических ангио- и нефропатий участвует множество взаимосвязанных процессов, ведущим из которых является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов, усиление неконтролируемых свободно-радикальных реакций Процессы ПОЛ вызывают дезинтеграцию липопротеи-новых комплексов, нарушение митохондриальной биоэнергетики, активности мембранных ферментов канальцев почек Эндотелиальная дисфункция, вызванная продуктами ПОЛ, вызывает нарушение регуляции сосудистого тонуса, плотности сосудистой стенки и изменение характера микро- и макрогемодинамики, сопровождаемые нарушением коагуляционного и тромобоцитарного гемостаза

выводы

1 При экспериментальном сахарном диабете развиваются ангиопатии, нарушается микро- и макрогемодинамика Уменьшается перфузия тканей (жидкостный обмен), вследствие снижения средней и систолической скоростей кровотока при одновременном повышении диастолической скорости кровотока Отмечается повышение упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки и повышение регионарного периферического сосудистого сопротивления

2 Исследования макрогемодинамики в магистральных сосудах (БА, почечные артерии) выявили повышение средней, систолической и диастолической скоростей кровотока, нарушение реологических свойств крови, вследствие повышения активности коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, и повреждения системы фибринолиза в сочетании с гиперактивацией тромбоцитов при ЭСД

3 Нарушаются водо- и электролитовыделительная функции почек, сопровождающиеся угнетением трансмембранного транспорта воды и электролитов В механизме нарушения канальцевого транспорта Ыа принимает участие На,К-АТФ-аза, активность которой снижается в гомогенатах, митохондриальной и микросомальной фракциях клеток коркового и мозгового вещества почек у крыс с экспериментальным сахарным диабетом

4 При экспериментальном сахарном диабете происходит активация системы СРО, увеличивается концентрация МДА в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани, снижается активность перекись-продуцирующего фермента - супероксиддисмутазы (СОД), а активность ката-лазы компенсаторно повышается, что препятствует образованию радикала гид-роксила путем метаболического удаления перекиси водорода

5 Повреждение эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов связано с изменением физико-химических свойств сосудистой стенки вследствие перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) Выявлена обратная корреляционная связь между изменением концентрации МДА и активностью Ыа',К+-АТФ-азы почечной ткани, а также между показателями микро- и макрогемодинамики

6 Коррекция нарушений ПОЛ и АОС клеток антиоксидантами в сочетании с мембранотропными веществами приводит к улучшению показателей диабетической нефропатии, микро- и макрогемодинамики, системы гемостаза Это подтверждает патогенетическую роль нарушений про- и антиоксидантной систем в развитии сосудистых осложнений в ранние сроки экспериментального сахарного диабета

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Дзугкоева Ф С , Кастуева Н Э , Каряева Э А, Дзугкоев С Г Патогенетические аспекты диабетических ангиопатий и их антиоксидантная коррекция // «Успехи современного естествознания», 2006 -№6 - С 71-72

2 Дзугкоев С Г Метаболические нарушений структур нефрона и периферических сосудов при экспериментальном сахарном диабете // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований», Южный научный центр РАН, г Ростов-на-Дону, 2006 - С 23

3 Дзугкоева Ф С , Можаева И В , Дзугкоев С Г Роль метаболических нарушений в развитии нефропатии при экспериментальном сахарном диабете // Материалы XX съезда физ Общества им ИП Павлова, М 2007 -№1244 - С 504

4 Датиева Ф С , Дзугкоев С Г Особенности изменений в системах гемостаза и микроциркуляции при экспериментальном сахарном диабете // Материалы конференции молодых ученых СОГМА, 2007 - С 45-48

5 Дзугкоев С Г Активность антиокислительной системы клеток (АОС) в условиях оксидативного стресса при аллоксановом сахарном диабете у крыс // Материалы конференции молодых ученых СОГМА, 2007 - С 55-56

6 Дзугкоева Ф С , Дзугкоев С Г Патогенетические аспекты диабетической нефропатии при экспериментальном сахарном диабете у крыс // «Современные наукоемкие технологии», М 2007 - №3 - С 44-46

7 Хетагурова Л Г , Датиева Ф С , Дзугкоев С Г Комплексное исследование макро- и микрогемодинамики, системы гемостаза при экспериментальном сахарном диабете у крыс // «Загальна патологш та патолопчна фшологш», 2007 - т 2 -№1 -С 60-67

8 Дзугкоева Ф С , Кастуева Н Э , Дзугкоев С Г Роль перекисного окисления ли-пидов в патогенезе развития ангиопатий при сахарном диабете // «Успехи совре-менногаестествознания», 2005 - №6 - С 95-96

9 Дзугкоева Ф С , Логунова Л В , Дзугкоев С Г Метаболические предикторы стресс-реакций при сахарном диабете // Материалы научно-практической конференции Южного Федерального округа с международним участием «Экстремальная медицина Проблемы экстремальных состояний», Владикавказ - 2006 - с 48-50

10. Дзугкоев С.Г., Хетагурова Л.Г. Роль изменений сопряженных систем перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты, микроциркуляции и гемостаза в патогенезе диабетических ангиопатий // «Вестник новых медицинских технологий», т.15, №1, 2008, с.40-41.

Список сокращений:

1 АДФ - аденозиндифосфат

2 АО - антиоксиданты

3 АОЗ - антиокислительная защита

4 АОС - антиокислительная система

5 АСД - аллоксановый сахарный диабет

6 БА - брюшная аорта

7 БАВ - биологически активные вещества

8 ГКГ - гемокоагулограмма

9 МДА - малоновый диальдегид

10 МЦ - микроциркуляция

11 НПВ - нижняя полая вена

12 ПА - почечная аорта

13 ПОЛ - перекисное окисление липидов

14 СГ - система гемостаза

15 СД - сахарный диабет

16 СОД - супероксиддисмутаза

17 СРО - свободнорадикальное окисление

18 СРР - свободнорадикальные реакции

19 СтА - степень агрегации

20 ЭСД - экспериментальный сахарный диабет

21 ФЛ - фосфолипиды

22 Тг - тромбоциты

Информационно - издательский отдел ГОУ ВПО СОГМА Росздрава Подписано в печать 18 03 2008г Тираж 100 экз формат издания 60 х 90 уел печ л 1,0 Заказ № 14

Актуальность проблемы.

Диабетическая ангио- и нефропатия являются не только частым осложнением СД, но и его интегральным патогенетическим звеном, частота и выраженность которого коррелирует с длительностью заболевания и степенью метаболических нарушений. Микроциркуляторные изменения носят органоспецифический характер и отмечаются в различных областях. Так, поданным Дедова И.И., Сунцова Ю.И., Кудряковой С.В. и др., 1997, из 82,7% обследованных больных СД, ретинопатия у 61,1%, нейропатия' — 50,5%, диабетическая нефропатия — 28,2%. При экспериментальном» сахарном диабете отмечается нарушение кровоснабжения! нервов и уменьшение плотности сосудов (Schratzberger Р, Walker DH, Ritting К, Bahlmann FH et al; 2001). Диабетическая* нефропатия - одно из наиболее тяжелых последствий' СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И.И., Шестакова М.В., Бондарь И.А., Климентов В.В., Королева Е.А. и др., 2003) и занимающее первое место среди других ангиопатий. Каждый второй больной СД типа 1 и каждый четвертый больной СД типа 2 умирает от острой и хронической почечной недостаточности (Сунцов Ю.И., 1998; Дедов И.И., 2003).

При экспериментальном сахарном диабете на ранних стадиях его развития и в клинике у больных отмечаются функциональные нарушения основных процессов- мочеобразования и почечного плазмотока, трансканальцевого транспорта электролитов и изменение ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), которая урегулирует секрецию альдостерона (Dj Loreto V, Moreno HS, Puche RC et al, 2004; Awad AS, Huang A, Ye H, Duoung ET, Bolton WK, Linden J, Okusa MD, 2005; Pfab T, Thone-Reineke C, Theilig F et al, 2006; Caden MP, Lautenslager OS, HikLE et al, 2007; Hartner A, Cordasic N, Klanke В et al, 2007). Активация РААС и повышение в крови ангиотензина II сопровождается почечной гипертензией и клеточной пролиферацией (Hartner А,

Cordasic N, Klanke В et al, 2007). У больных с диабетической нефропатией в доклинической стадии развития патологического процесса определяется увеличение систолической скорости кровотока на фоне повышения активности РААС. Нарушение кровотока и его неоднородность Карпов Р.С., Кошельская О. А., Ефимова Е.В. и др., 2001, рассматривают как один из допплерографических признаков начальной нефроангиопатии.

В развитии структурно-функциональных аномалий, лежащих в основе диабетических ангио- и нефропатий и ассоциированных с ними патологий (изменения свертывающей системы крови, артериальной гипертензии), участвует множество взаимосвязанных между собой процессов. Одним из таких нарушений является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов и усиление ' неконтролируемых свободно-радикальных реакций (СРО), называемые окислительным стрессом (Baynes JW, 1991; Tesfamariam В, 1994; I

Van Damn PC, Van Asbeck BS, Erkelens, 1995).

Проявляются системные метаболические расстройства, характер и направленность которых позволяют предполагать, что повышение интенсивности СРО мембранных фосфолипидов, приводит к накоплению токсических продуктов» окислительной деструкции липидов, изменению проницаемости сосудов вследствие дисфункции эндотелия, нарушению функциональной способности мембранных структур, активности мембранных ферментов клеточного метаболизма (Колесниченко JI.C., Мантарова Н.С., Шапиро Л.А., 1989; Гонский Я.И., Корда М.М., Клищ И.Н., Фира Л.С., 1996; Васильева О.В., Мобицкий О.Б., Клебанова Г.К., Владимиров Ю.А., 1998).

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембранах тромбоцитов способствует повышению функциональной активности кровяных пластинок и освобождению тромбоцитарных факторов (Кретова Е.Ю., Кондратьев Е.И., Суханова Т.А., 2004; Токманова А.Ю., Староверова Д.Н., Анциферов М.Б., 2004; Remuzzi С et al, 1992; Natsumoto Н, Nakao Т, 2000). Воздействие длительной гипергликемии на эндотелиальные клетки приводит к увеличению продукции фибринолитических факторов, более активной агрегации тромбоцитов, спазму сосудов и повреждению эндотелия капилляров (Волкова А.К., Недосугова JI.B., Рудько И.А. и др., 2000; Кретова Е.Ю. и др., 2004; Kawamori R, Jmano Е, Watarai Т et al, 1994; Levin O'Neal's, 2000). Эти данные подтверждают наличие у больных с диабетическими ангиопатиями перманентного внутрисосудистого свертывания крови с участием тромбоцитарного компонента гемостаза, что и определяет риск развития тромбозов (Бондарь Т.П., Муратова А.Ю., Пол-Тарабатько Н.П., 2004; Хаютина Т.Л., Балаболкин М.И., Коновалова Г.А. и-др., 2004).

Учитывая, важную роль в развитии диабетических ангиопатий окислительного стресса, необходимой составляющей патогенетической терапии является применение антиоксидантов (АО) (Кулагин O.JL, 2000; Кокорева Е.В., 2002; Yin X, Zhang Y, Yu J et al, 2006). Исследование ангиопротекторных эффектов препаратов АО у больных с диабетическими ангиопатиями свидетельствует о перспективности данного направления. (Бобырева JLE., 1997, 1998; Машков-Ю.И., 2001; Янькова В.И., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И., 2002; Чугунова JI.A., Шамхалова И.Ш., Шестакова М:В., 2004) и о повышении факторов АОЗ и угнетении процессов ПОЛ.

Наряду с общеизвестными АО — а-токоферол, а-липоевая кислота и др., в литературе имеются- данные об успешном использовании растительных экстрактов — фитоадаптогенов (Кулагин О.Л. и др., 2001; Янькова В.И. и др., 2002). Вместе с тем, отсутствуют исследования, посвященные изучению сопряженных систем СРО и факторов* АОЗ клеток, обуславливающих нарушения макро- и микроциркуляции в периферических сосудах и структурах нефрона, сопровождающихся нарушениями в системе гемостаза, при экспериментальном сахарном диабете, а также патогенетическая их коррекция.

Актуальность настоящего исследования заключается в комплексном изучении патогенетических механизмов развития сосудистых осложнений СД, их корреляционных взаимоотношений на молекулярном, клеточном и органосистемном уровнях организации, что позволит экспериментально обосновать новые подходы к оптимизации лечения и профилактики диабетических ангиопатий.

Цель исследования: изучить патофизиологические и биохимические особенности нарушений взаимосвязанных систем СРО и ферментов АОЗ клеток, обуславливающих изменения макро- и микроциркуляции, системы гемостаза, активности мембраносвязанных ферментов почечной ткани и их роль в патогенезе диабетических ангиопатий. Обосновать новые методы коррекции нарушенных механизмов* регуляции, повысить эффективность лечения и профилактики сосудистых осложнений СД в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Исследовать характер изменений макро- и микрогемодинамики у крыс с экспериментальным сахарным диабетом допплерографически.

2. Изучить возможную роль изменений плазменного* коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза в сочетании с нарушениями тканевой перфузии в развитии экспериментальных диабетических ангиопатий.

3. Изучить при экспериментальном сахарном диабете нарушения стандартных молекулярно-клеточных механизмов оксидативного стресса: мембранных механизмов трансканальцевого транспорта ионов, роль перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокислительной системы клеток (АОС) в патогенезе диабетических нефро- и ангиопатий.

4. Исследовать корреляционные взаимосвязи микроциркуляции, коагуляционных и биохимических метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете, выделив зависимости, способствующие сосудистым осложнениям.

5. Используя новые знания патофизиологических и биохимических механизмов патогенеза диабетических ангиопатий, результатов корреляционного анализа, обосновать и разработать новые технологии профилактики и коррекции, используя современные антиоксиданты и мембранопротекгорные вещества.

Научная новизна. Впервые использован комплексный подход к анализу механизмов развития экспериментальных диабетических нефро- и ангиопатий с применением корреляционного анализа. Выявлены новые звенья патогенеза, вскрыто участие нарушений метаболизма арахидоновой кислоты и АОС в нарушении эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов, макро- и микрогемодинамики, включая почечные артерии. Показана роль системных нарушений коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза в развитии диабетических сосудистых осложнений. На основании этих знаний разработан новый методологический подход к коррекции- выявленных нарушений. Доказано положительное влияние антиоксидантов и мембранотропных веществ на состояние почечной и общей гемодинамики, активность мембранных ферментов почечных канальцев, а. также ПОЛ и АОЗ клеток при экспериментальном сахарном диабете.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты дают новые знания, углубляют и расширяют представления о патогенетических механизмах развития сосудистых осложнений сахарного диабета, обосновывают новую, более эффективную технологию коррекции системных нарушений с применением' современных антиоксидантов, мембранотропных веществ- и фитоадаптогенов.

Практическая ценность результатов — в патофизиологическом обосновании нового методологического подхода к профилактике и лечению диабетических ангиопатий.

Основные положения выносимые на защиту.

1. При экспериментальном сахарном диабете развиваются-нарушения микро-и макрогемодинамики, что приводит к ангиопатиям. Уменьшается-перфузия тканей (жидкостный обмен), снижаются-средняя-и систолическая скорости кровотока и повышается диастолическая скорость кровотока. Изменения гемодинамики в микроциркуляторном русле и магистральных сосудах (БА, почечные артерии) сопровождаются нарушениями коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза и торможением системы фибринолиза.

2. Нарушаются водо- и электролито-выделительная функции почек, вследствие угнетения трансмембранного транспорта воды и электролитов. Снижение уровня канальцевой реабсорбции Na обусловлено падением активности №,К-АТФ-азы почечной ткани.

3. При экспериментальном сахарном диабете повышается интенсивность ПОЛ в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани, изменяющее состояние липидного матрикса мембран клеток структур нефрона. Нарушается АОЗ клеток.

4. Коррекция нарушений ПОЛ и АОС клеток антиоксидантами в сочетании с мембранотропными веществами приводит к снижению степени выраженности диабетической нефропатии, нарушений гемодинамики и системы гемостаза.

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались на: 61-ой межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Владикавказ, 2006); научно-практической конференции южного Федерального округа с международным участием «Экстремальная медицина. Проблемы экстремальных состояний» (Владикавказ, 2006); научной конференции молодых ученых СОГМА) (Владикавказ, 2007); IV региональной научно-практической.? конференции «Новые технологии' в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в рекомендованном ВАК РФ рецензируемом журнале // «Вестник новых медицинских технологий», т.15, №1, 2008, с.40-41. •

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, включая! библиографию. Состоит из введения; обзора литературы, описания материалов' и методов» исследования; четырех глав изложения^ результатов исследования, обсуждения, полученных результатов, заключения, общих выводов и списка использованной литературы и приложений. Библиографический указатель включает 242 источника литературы, из них 155 отечественных и 87 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 13 таблицами.

Общие выводы.

1) При экспериментальном сахарном диабете развиваются ангиопатии, нарушается микро- и макрогемодинамика: уменьшается перфузия тканей (жидкостный обмен) вследствие снижения средней и систолической скоростей кровотока при одновременном повышении диастолической скорости кровотока, повышаются упруго-эластические свойства (плотность) сосудистой стенки t и увеличивается регионарное периферическое сосудистое сопротивление.

2) Исследования' макрогемодинамики в магистральных сосудах (брюшная аорта, почечные артерии) выявили повышение средней, систолической и диастолической скоростей кровотока, нарушение реологических свойств крови, вследствие повышения активности коагуляционного и-тромбоцитарного звеньев гемостаза, на фоне торможения, системы фибринолиза в сочетании с геперактивацией тромбоцитов при экспериментальном сахарном диабете.

3) Нарушаются водо- и электролитовыделительная функции почек, сопровождающиеся угнетением трансмембранного транспорта воды и электролитов. В механизме нарушения канальцевого транспорта Na принимает участие №,К-АТФ-аза, активность которой снижается5 в гомогенатах, митохондриальной и микросомальной фракциях клеток коркового и мозгового' вещества почек у крыс с экспериментальным сахарным* диабетом.

4) При экспериментальном сахарном диабете происходит активация системы СРО, увеличивается концентрация МДА в эритроцитах и гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани, снижается активность перекись-продуцирующего фермента - супероксиддисмутазы (СОД), а активность каталазы компенсаторно повышается, что препятствует образованию радикала гидроксила путем метаболического удаления перекиси водорода.

5) Повреждение эндотелий-зависимой регуляции тонуса сосудов частично обусловлено изменением физико-химических свойств сосудистой стенки вследствие перекисного окисления липидов (ПОЛ). Выявлена обратная корреляционная связь между изменением концентрации МДА и активностью Na+,K+-ATO-a3bi почечной ткани, и прямые — между показателями микро- и макрогемодинамики.

6) Коррекция нарушений ПОЛ и АОС клеток антиоксидантами в сочетании с мембранотропными веществами приводит к уменьшению степени выраженности диабетической нефропатии, микро- и макрогемодинамики, системы гемостаза и их корреляционных взаимодействий, что вскрывает патогенетическую роль нарушений про- и антиоксидантной систем в механизмах развития сосудистых осложнений в ранние сроки экспериментального сахарного диабета.

Заключение.

Диабетическая ангио- и нефропатия являются не только частым осложнением СД, но и его интегральным патогенетическим звеном, частота и выраженность которого коррелирует с длительностью заболевания и степенью метаболических нарушений. Микроциркуляторные изменения носят органоспецифический характер и отмечаются в разных областях. По данным Дедова И.И., Сунцова Ю.И., Кудряковой С.В. и др., 1997, из 82,7% обследованных больных СД, ретинопатия у 61,1%, нейропатия — 50,5%, диабетическая нефропатия - 28,2%. При экспериментальном сахарном диабете отмечается нарушение кровоснабжения нервов и уменьшение плотности сосудов (Schratzberger Р, Walker DH, Ritting К, Bahlmann FH et al, 2001). Диабетическая нефропатия — одно из наиболее тяжелых последствий». СД, снижающее качество и продолжительность жизни больных (Дедов И:И., Шестакова М.В., Бондарь И.А., Климонтов В.В., Королева Е.А. и др., 2003) и: занимающее первое место среди других ангиопатий. Каждый второй больной СД типа 1 и каждый четвертый больной СД типа 2* умирает от острой и хронической почечной недостаточности (Сунцов Ю.И., 1998; Дедов И.И., 2003).

При экспериментальном сахарном диабете на ранних стадиях его развития и в клинике у больных отмечаются функциональные нарушения основных процессов мочеобразования и почечного плазмотока, трансканальцевого транспорта электролитов и изменение ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), которая регулирует секрецию альдостерона (Dj Xoreto • V, Moreno HS, Puche RC et al, 2004; Awad AS, Huang A, Ye H, Duoung ET, Bolton WK, Linden J, Okusa MD, 2005; Pfab T, Thone-Reineke C, Theilig F et al, 2006; Caden MP, Lautenslager OS, Hud E et al, 2007; Hartner A, Cordasic N, Klanke В et al, 2007).

В развитии структурно-функциональных аномалий, лежащих в основе 114 •■.• диабетических ангиопатий и: ассоциированных с ними патологий (изменения? свертывающей системы крови, артериальной гипертензии) участвует множество взаимосвязанных, между собой процессов. Одним из таких нарушений является- дисбаланс окислительно-восстановительных процессов и усиление неконтролируемых • свободно-радикальных реакций- (СРО), называемые окислительным стрессом (Baynes JW, 1991; Tesfamariam В' 1994; Van Damn PC, Van Asbeck BS, Erkelens, 1995). . . ;

Проявляются системные метаболические* расстройства; характер и направленность которых позволяют предполагать, что повышение: интенсивности; СРО мембранных фосфолипидов. приводит к; накоплению», токсических продуктов окислительной деструкции? липидов, изменению проницаемости сосудов- вследствие дисфункции, эндотелия; нарушению. функциональной? способности мембранных структур, активности мембранных, ферментов- клеточного метаболизма; (Колесниченко Л.С., Мантарова Н.С., Шапиро Л.Л., 1989; Еонский Ж№, Корда1М;М., Клищ И:Н., Фира Л.С., 1996; Васильева О.В:, Мобицкий О.Б., Клебанова F.K., Владимиров Ю.А., 1998), перманентного внутрисосудистого свертывания крови? с участием, тромбоцитарного компонента гемостаза (Бондаоь Т.П., Муратова А.Ю., Пол-Тарабатько Н-Ш, 2004; Хаютина Т.Л., Балаболкин MiH., Конвалова Г.А. и др., 2004).

Учитывая важную роль в развитии диабетических ангиопатий окислительного стресса, необходимой составляющей патогенетической терапии, является- применение антиоксидантов (АО) (Кулагин- О.Л., 2000; Кокорева Е.В:, 2002; Yin X, Zhang Y, Yu J et al, 2006).

Однако, в доступной литературе отсутствуют комплексные исследования, посвященные изучению патофизиологических и биохимических особенностей нарушений взаимосвязанных систем СРО и АОЗ клеток, обуславливающих развитие диабетических нефро- и ангмопатий. Анализ результатов информационно-патентного поиска послужил основанием для изучения патофизиологических и биохимических механизмов нарушений взаимосвязанных систем СРО и ферментов АОЗ клеток, обуславливающих изменения активности мембраносвязанных ферментов почечной ткани, макро- и микроциркуляции, системы гемостаза и их роли в патогенезе диабетических ангиопатий. На основе этих знаний разработать эффективное лечение сосудистых осложнений в эксперименте.

Для решения данной цели опыты проводились на 249 крысах — самцах линии Вистар массой 200-220^ грамм, находящихся на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к воде и естественным световым режимом. Экспериментальный сахарный диабет (ЭСД), характеризующийся инсулиновой недостаточностью (ИЗСД) вызывали парентеральным введением 5% водного раствора аллоксана в дозе 150-180 мг/кг.

Аллоксановая интоксикация, повреждая Р-клетки островков Лангерганса уже через- 48-72 часа характеризовалась повышением уровня I сахара в крови. В хронической стадии аллоксанового диабета изучали состояние микро- и макрогемодинамики, сопровождаемые нарушениями в системе гемостаза, эффективность их коррекции антиоксидантами и мембранотропными веществами, показатели диабетической нефропатии — нарушения водо- и электролитовыделительной функции почек, мембраносвязанных механизмов нарушения трансканальцевого транспорта электролитов, активность №,К-АТФ-азы, процессы ПОЛ и АОЗ клеток.

Все подопытные животные были разделены на 4 группы:

1. контрольная группа

2. животные с нелеченным ЭСД легкой степени тяжести (глюкоза крови — до 10 ммоль/л)

3. животные с нелеченным ЭСД средней степени тяжести (глюкоза крови — от 10 до 20 ммоль/л)

4. животные с ЭСД средней степени тяжести, леченные антиоксидантами: а-токоферол-ацетат, комбинация (атокоферол-ацетат с витамином «С» и а-липоевой'кислотой), а также мембранотропными веществами: милдронат и L-карнитин.

Исследование характера кровотока в крупных сосудах и: в микроциркуляторном русле показало, что при анализе перфузии тканей при ЭСД; во всех- точках- локации снижается средняя? скорость кровотока (М) преимущественно за счет снижения; систолической; скорости: кровотока; (S) при повышении; диастолической скорости кровотока (D). Географические показатели характеризуются повышением индекса Гослинга, который отражает повышение упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижение градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Одновременно повышался реографический индекс (RI — индекс Пурселло), свидетельствующий о нарастании регионарного периферического сосудистого сопротивления. , '•.,/' "

В магистральных артериальных сосудах. (БА, почечные артерии) наблюдалось, повышение средней (М); систолической1 (S) и диастолической (D) скоростей кровотока, что согласуется с; теорией генерализованной гиперперфузии, рассматриваемой в; качестве основы; патогенеза осложнений СД в виде микроангиопатии сетчатки, почечных клубочков и периферического сосудистого русла (Ouncha-Vaz JG, 1978). Наблюдаемое уменьшение скорости тканевого обмена; (перфузии) можно объяснить, утолщением базальных мембран сосудов, пролифирацией и набуханием эндотелиальных клеток в начальные периоды развития СД (Петряйкина Е.Е., 2002).

У крыс с ЭСД повышается синтез в эндотелии коллагена IV типа и фибронектина (Cagliero Е, 1991; Бондарь И.А., Климентов В.В., 2005; Matsubara Т et al, 2006; Park CW et аГ, 2006; Roestenberg P et al, 2006), что и приводит к утолщению основной сосудистой мембраны.

Выявленное повышение упруго-эластических свойств? сосудистой стенки (PI) и ОПСС отчасти может быть связано со способностью АФК «гасить» NO, т.е. активные радикалы взаимодействуют с NO и приводят к его инактивации (Аметов А.С., 2005). Кроме того, повышению сосудистого тонуса способствует активизация симпатико-адреналовой и ренин-ангиотензиновой систем (Флоря B.F., Беленков Ю.Н., 1996; Кобалава Ж.Д., Котовская Ю.В.-, 2000; Watanabe К, Sekiya М, Tsuruoka Т et al, 1999):

Анализ системы гемостаза выявил повышение- степени и скорости агрегации тромбоцитов, выраженное при индукции АДФ: Латентный период, характерный для здоровых животных, на кривой агрегации отсутствует. Первичная, агрегация обратима, затем развивается волна вторичной агрегации тромбоцитов. Одновременно развивается гиперкоагуляция и торможение системы фибринолиза в сочетании с гиперактивацией; тромбоцитов:

Пусковым звеном в активации агрегации тромбоцитов очевидно является ПОЛ в мембранах тромбоцитов у крыс с ЭСД, о чем свидетельствует нарастание концентрации МДА в крови у крыс с аллоксановым диабетом. Это согласуется с данными литературы (Нелаева А.А., Трошина А.А., 1999; Кретова Е.Ю., Кондратьева Е.И., Суханова Г.А., 2004), установившими у больных ИЗСД с микроальбуминурией, нарушение коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза и их взаимосвязь с ПОЛ- в мембранах тромбоцитов. Воздействие длительной-гипергликемии-приводит к увеличению продукции фибринолитических факторов и усилению тромботической активности, вследствие активации в мембранах тромбоцитов ПОЛ, уменьшения синтеза простациклина и увеличения синтезалромбоксана А2 (Волкова А.К., Недосугова Л.В., Рудько И:А. и др., 2000; Kawamori R, Jmano Е, Watarai Т et al, 1994; Levin, O'Neal's, 2000).

Поскольку ангиопатии носят органоспецифический характер и наиболее тяжелым последствием сосудистых осложнений является диабетическая нефропатия, нами была исследована гемодинамика в почечных артериях, а также изменения электролитовыделительной функции почек, включая активность мембранных ферментов. Данные показали повышение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока,, т.е. генерализованной гиперперфузии как основы патогенеза сосудистых осложнений в почечных клубочках. Это и способствовало поддержанию уровня-клубочковой фильтрации, которая, по нашим данным, приобрела лишь, тенденцию к снижению: Вместе с тем; имело место угнетение трансканальцевого транспорта воды и электролитов, что приводило к диуретическому и натрийуретическому эффектам.

Как известно; реабсорбция натрия в почечных канальцах является активным процессом и в нём принимает участие Na,K-ATO-a3a, являющаяся составной частью' натриевого насоса. Фермент расщепляет макроэргические фосфатные связи АТФ, обеспечивает энергией активный транспорт Na+ и К+.

В доступной литературе отсутствуют данные о состоянии №+,К+-АТФ-азы в субклеточных фракциях клеток коркового и мозгового? вещества почечной ткани при экспериментамьном сахарном диабете.

Анализ данных наших исследований показал, что при инсулиновой недостаточности — аллоксановый диабет — отмечается- снижение активности Ыа+,К+-АТФ-азы в микросомальной и митохондриальной; фракциях клеток (р<0,001). Учитывая тот факт, что митохондрии: являются» энергообразующими, структурами» клетки, мы определяли активность! фермента и в этих субклеточных фракциях. Данные показали понижение активности Ыа+,К+-АТФ-азы, что свидетельствует о снижении энергообразования' и нарушении фосфорилирования; энзима: вследствие уменьшения субстрата АТФ.

Это подтверждается данными исследований Rosea MG, Mustard TG, Kinter MT et al, 2005 об изменении митохондриальной биоэнергетики на изолированной почечной корковой' митохондрии у крыс со стрептозотоциновым диабетом показали снижение активности III комплекса дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, что сыграло патогенетическую роль при поражении почек оксидативным стрессом в хронической стадии диабета.

Учитывая важную роль в развитии сосудистых осложнений при экспериментальном сахарном диабете окислительного стресса, мы исследовали концентрацию конечного продукта МДА в эритроцитах и в клетках коркового и мозгового вещества.

Анализ полученных результатов у крыс с экспериментальным' сахарным диабетом показал, что действительно происходит активация системы СРО, свидетельством чему является увеличение концентрации МДА в эритроцитах - универсальной модели тканевых клеток, основной мишенью повреждения являются почки, поэтому мы определяли интенсивность ПОЛ" в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани. Данные показали» достоверное повышение концентрации- МДА не только в эритроцитах, но. и клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани (соответственно р<0,001, р<0,05).

Поскольку ПОЛ происходит не только с фосфолипидами цитоплазматических мембран, но распространяется и на мембраны субклеточных фракций, нами производилось гомогенизирование тканей коркового и мозгового вещества в среде выделения, в. соотношении 1 объем ткани : 9 объемов среды выделения. Разрушение митохондрий и микросом проводили однократным замораживанием" проб в морозильной камере при t° 10 С с последующим оттаиванием. Определяли активность Ыа,К-АТФ-азы в микросомальной и митохондриальной фракциях клеток коркового и мозгового вещества почечной ткани. Данные показали статистически достоверное снижение активности энзима в субклеточных фракциях клеток слоев.почечной ткани (в микросомах с 4,39±0,18 Рн/мг б/час до 3,19±0,15 Рн /мг б/час (корковое в-во); с 6,62±0,07 Рн/мг б/час до 4,69±0,08 Рн/мг б/час (мозговое в-во) и в митохондриях с 2,72±0,089 до 1,90±0,053 Рн/мг б/час мозговое в-во) и с 1,89±0,058 до 1,09±0,029 Рн/мг б/час (корковое в-во).

Изучая взаимосвязь между изменением концентрации МДА и. активностью Ыа,К-АТФ-азы выявили,, что при аллоксановом диабете происходит резкое понижение активности Иа,К-АТФ-азы и это сопровождается достоверным возрастанием концентрации; малонового диальдегида, конечного продукта переокисления липидов: Анализ корреляционной связи между интенсивностью перекиснош окисления липидов и активностью Кга,К-АТФ-азы в корковом и мозговом веществе почечношткани; выявили отрицательную связь (г соответствует = -0,8; -0,75). Кроме этого;, отмечаются; однонаправленные изменения процессов; липопероксидации в эритроцитах и клетках почечной ткани, что может быть использовано в клинике для^ более ранней; диагностики оксидативного' стресса, как показателя декомпенсации сахарного диабета.

Таким образом; в г результате интенсификации; ПОЛ, происходят изменения качественного состава; липидного бислоя мембран- клеток, что сопровождается изменением; активности №,К-АТФ-азы почечной; ткани- и других мембраносвязанных ферментов.

Полученные нами данные' демонстрируют патогенетическую роль перекисного окисления липидов; в угнетении активности; Na-транспортирующего энзима, что; приводит к повышению экскрецит электролитов с мочой.

Стационарное состояние ПОЛ; поддерживается: системой-АОЗ; которая; обеспечивается ферментативными-; механизмами; (первая! линия* защиты — СОД, катал аза, глютатион-редуктаза) и .неферментативными. В; условиях оксидативного стресса у крыс с ЭСД выявлено снижение активности: СОД в крови (р<0;05), тогда, как. активность каталазы существенно возросла (р<0,01). Сравнивая: характер окислительной модификации активными; формами: кислорода СОД; и каталазы; мы предположили на- основании данных литературы, что специфика. процесса определяется; особенностью уникальной структурной организации биомолекул данных ферментов. По сравнению с СОД каталаза, содержащая 4 группы гема и 4 молекулы НАДФН, оказывается более устойчивой к инактивирующему действию Н202 и компенсаторно препятствует образованию ОН"" путем метаболического удаления перекиси водорода и может неспецифически стимулировать распад гидроперекисей липидов (Kirkman HN, Gaetani GF, 1984; Gutteridge JMC, 1991). Т.о., патобиохимической составляющей в. генезе диабетических нефропатии является активация ПОЛ, которая индуцируется активными формами кислорода: супероксидный анион радикал Ог", перекись водорода Н202,' продукт реакции Хабера-Вейса — радикал гидроксила ОН", который считается1 наиболее активным инициатором ПОЛ: Источниками АФК являются митохондрии и мембраны ЭПР, в которых одноэлектрониое восстановление кислорода с образованием супероксид аниона 02~ является результатом ответвления от основного пути переноса электронов от субстрата на кислород на уровне цх b или цх Р459, а также активация НАДНН" -оксидазы.

С другой стороны, значительное угнетение активности перекись-продуцирующего фермента СОД, что является свидетельством наличия в крови, почечной ткани высокого уровня. АФК, вызывающих^ окислительную модификацию фермента. Активность каталазы, восстанавливающей Н2©2 до воды, и< кислорода, повышена компенсаторно; но вместе с тем концентрация' конечного продукта ПОЛ - МДА остается повышенной. Т.о., нарушение стационарного состояния окислительно-восстановительных реакций вызывает изменения в митохондриальнои биоэнергетике клеток коркового' и мозгового вещества'почечной ткани из-за окислительной модификации; SH и NH2 белков, нарушения липид-белковых и липид-липидных взаимодействий, увеличения протонной проводимости, понижения процесса окислительного фосфорилирования, снижения синтеза АТФ и активности №+,К+-АТФ-азы митохондрий и микросом гомогенатов коркового и мозгового вещества почечной ткани.

Повреждающее действие ПОЛ на сосудистую стенку и форменные элементы крови приводит к целому ряду нарушений микроциркуляции, реологических свойств крови и состояния гемостаза.

Учитывая важную роль в развитии ЭСД окислительного стресса необходимой составляющей патогенетической терапии диабетических ангио-и нефропатий, является применение антиоксидантов (АО). Исследование ангиопротекторных эффектов препаратов АО свидетельствует о перспективности данного направления^ (Бобырева-Л.Е., 1997, 1998; Янькова В:И., Иванова И.Л., Федореев С.А., Кулеш Н.И., 2002; Машков*Ю.И., 2001; Чугунова Л.А., Шамхалова М.Ш., Шестакова М.В1., 2004).

Исходя из этого для коррекции» нарушений ПОЛ, АОС, показателей диабетической нефропатии, микро- и макрогемодинамики и системы гемостаза вводили крысам с ЭСД в течение месяца АО и мембранопротекторные вещества: а-токоферол-ацетат, комбинацию а-токоферол-ацетата с а-липоевой кислотой и витамином! «С», милдронат, L-карнитин и фитококтейль — ФК «Биоритм-Э». Эффекты милдроната и L-карнитина* сравнивали с действием а-токоферола. Своё физиологическое действие а-токоферол проявляет непосредственно в липидном бислое плазматических и клеточных мембран, обладает способностью прерывать цепь свободно-радикальных реакций (СРВ); Из водорастворимых соединений (аскорбиновая кислота, глутатион, а-липоевая кислота), реагирующие с водорастворимыми радикалами и восстанавливающие а-токофероксильный радикал (Афанасьев Ю.И., Боронихина Т.В., 1987; Gutteridge JMC, 1992).

По истечении периода введения исследовали показатели ПОЛ, АОС, активность №+,К+-АТФ-азы, состояние микро- и макрогемодинамики, коагуляционный и тромбоцитарный гемостаз.

Анализ полученных результатов выявил значительное ингибирование ПОЛ по данным МДА в крови на фоне введения витамина «Е» и его комбинации с аскорбиновой и а-липоевой кислотами. Поскольку витамин «Е» является ловушкой свободных радикалов, на его фоне устранялось ингибирующее влияние О2" на активность СОД и её активность повышалась. Активность каталазы снижалась с повышенного уровня, поскольку один из путей генерации перекиси водорода устранялся СОД. Однако, активность каталазы не снижалась до исходного уровня, что является свидетельством еще повышенного уровня пероксида. Для . выявления эффективности действия антиоксидантов на интенсивность ПОЛ и активность ферментов АОЗ мы провели корреляционный, анализ между концентрацией МДА, активностью СОД и каталазы. Результаты- показали наличие выраженной обратной корреляционной связи между концентрацией МДА и активностью СОД на фоне введения L-карнитина (г=-0,59). На фоне введения милдроната выявляется прямая- сильная корреляционная- связь между концентрацией МДА и активностью каталазы, тогда как выявлены слабые связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД.

Нашими исследованиями впервые установлены АО свойства у препаратов мембранопротекторов: милдроната и L-карнитина. Ингибирование ПОЛ и относительное улучшение липидного микроокружения в мембранах клеток коркового и мозгового вещества привели к повышению активности Ыа+,К+-АТФ-азы в мозговом^ веществе, в то время"как-в корковом веществе наши данные показали лишь тенденцию к повышению активности энзима. Действительно, выявлена выраженная обратная корреляционная связь между концентрацией МДА и активностью Na ,К -АТФ-азы в мозговом веществе на фоне введения L-карнитина (г=-0,64) и милдроната в основном в корковом веществе (г=-0,64).

На фоне АО" терапии уменьшается плотность сосудистой стенки достоверно в Б А, ПА пр, ПА лев. Наиболее эффективны витамин «Е», милдронат, L-карнитин.

Коэффициенты корреляции между интенсивностью ПОЛ и показателем плотности сосудов на фоне витамина «Е», милдроната, L-карнитина следующие: в БА ri=0,55; г2=0,50; г3=0,65; в почечных артериях Г]=0,49; ^=0,60; г3=0,69, т.е. выявляется прямая корреляционная связь.

Данные МЦ (жидкостный обмен) показывают улучшение перфузии, из-за снижения плотности сосудистой стенки и повышения средней и систолической скоростей кровотока.j Сравнительный анализ результативности влияний АО выявил, что наиболее эффективным оказался L-карнитин, который ингибировал липопероксидацию и способствовал улучшению качественного состава ФЛ сосудистой стенки, в результате чего уменьшилась её плотность. С другой стороны, улучшая метаболические процессы и энергообразование в эпителиальных клетках сосудов и кардиомиоцитов он стимулировал макро- и микрогемодинамику.

Анализ корреляционной связи между концентрацией МДА и скоростью кровотока (S) демонстрирует отрицательные сильные связи на фоне витамина «Е», L-карнитина (коэффициенты корреляции соответственно: г=-0,71; г=-0,69), на фоне милдроната выявляется отрицательная корреляционная связь, но не сильная (г=-0,33). Что касается плотности сосудов микроциркуляции, то она не только снижается, но находится в прямой взаимосвязи с активностью ПОЛ (коэффициенты корреляции: витамин Е — г=0,43; милдронат г=0,60; L-карнитин г=0;70).

Нормализация ПОЛ на фоне витамина «Е», L-карнитина и милдроната приводит к улучшению состояния прокоагулянтного звена системы гемостаза и фибринолитической системы крови.

Таким образом, в развитии структурно-функциональных изменений, лежащих в основе диабетических ангио- и нефропатий участвует множество взаимосвязанных процессов, ведущим из которых является дисбаланс окислительно-восстановительных процессов, усиление неконтролируемых свободнорадикальных реакций. Процессы ПОЛ вызывают дезинтеграцию липопротеиновых комплексов, нарушение митохондриальной биоэнергетики, наш - - .li ГТ А'гЧЙТМ'* fVl I I' l'l*.

Г

Г 1 i fi • f ■ •

L I J L L. 1

Дисциркулнторные нарушения при ЭСД

Метаболические нарушения: гемодинамические нарушения в макрососудах: почек, брюшной аорты, нажней полой вены и конечностей р расстройства микроциркуляции —► снижение перфузии тканей 7 Г эндотелпопиты Т МДА дисфункция эндотелия —> нарушение секреции ферментов системы гемокоагуляции тонус сосудов I метаболические нарушения дисбаланс окислительновосстановительных процессов , т активация СРО активация ПОЛ недостаточность АОЗ ^ образование избытка МДА

Эндотелиоцит нарушение секреции прокоагулянтов

I антиагрегационной способности сосудистой стенки I активация Тг степени и скорости агрегации торможение фибринолиза коагулопатии

---„------- li I Т й ч с к иЩщщЙЩ^

Схема: Роль взаимосвязанных сосудистых, метаболических и коагулопатических изменений в патогенезе экспериментальных диабетических ангиопатий.

КЛЕТКА ПОЧЕЧНОГО КАНАЛЬЦА

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ (ПОЛ)

HbFe глутатионпероксидаза

ФОСФОЛИПИДЫ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН мембранная фосфолипаза А2

ГИДРОПЕРЕКИСИ

ПОЛИЕНОВЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ

ДИЕНОВЫЕ КОНЬЮГАТЫ глутатионредуктаза

МАЛОНОВЫИ ДИАЛЬДЕГИД

ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН, МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ И МИКРОСОМ торможение ПОЛ

УМЕНЬШЕНИЕ КАНАЛЬЦЕВОЙ РЕАБСОРБЦИИ НАТРИЯ

СНИЖЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЫЭ+К+-АТФ АЗЫ ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ

СНИЖЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ БИОЭНЕРГЕТИКИ

СХЕМА 1. Молекулярно-клеточные биохимические механизмы в патогенезе экспериментальной диабетической нефропатии активности мембранных ферментов канальцев почек. Эндотелиальная дисфункция, вызванная продуктами ПОЛ, вызывает нарушение регуляции сосудистого тонуса, плотности сосудистой стенки и изменение характера микро- и макрогемодинамики, сопровождаемые нарушением коагуляционного и тромобоцитарного гемостаза.

Это согласуется с данными литературы, согласно которым супероксиданион радикал взаимодействует с оксидом азота в 3 раза быстрее, чем происходит дисмутация Ог супероксиддисмутазой с образованием пероксида. Продуктом этой реакции является пероксинитрит (ONOO"), вызывающий дисфункцию эндотелия с нарушением вазодилятации в системе микро- и макрогемодинамики при сахарном диабете (Зенков Н.К., Меншиков Е.Б., Реутов В.Г., 2000; Аметов А.С., 2005; Аметов А.С., Демидова Т.Ю., Косых С.А., 2005).